Procédures sans réveil
Microstructure du cycle veille-sommeil au cours du vieillissement chez les souris TgM83, un modèle préclinique de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de la lignée TgM83 portent une protéine humaine mutée qui déclenche chez elles, vers huit à dix mois, des troubles moteurs de type parkinsonien. 24 d'entre elles vont être utilisées, douze dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, douze dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. La moitié subit une chirurgie crânienne pouvant durer une heure, puis vit isolée une semaine sur deux pendant dix-huit semaines, le temps d'enregistrer leur sommeil de trois à dix mois d'âge. Toutes sont tuées par perfusion transcardiaque sous anesthésie terminale, pour que leur cerveau soit examiné avant l'apparition des signes moteurs de la maladie.
Objectifs
Le trouble comportemental en sommeil paradoxal anticipe d’une décennie la maladie de Parkinson dont il est considéré comme le meilleur marqueur précoce. Pendant le sommeil paradoxal, nous sommes naturellement paralysés. Cette paralysie est absente chez les patients atteints du trouble comportemental en sommeil paradoxal. Nous faisons l’hypothèse que la zone cérébrale contrôlant cette paralysie serait une cible précoce des mêmes processus pathologiques que ceux responsables de la maladie de Parkinson et qui envahiraient au cours du veillissement l’ensemble du cerveau.Notre objectif est de tester cette hypothèse sur une souche de souris de type transgénique (TgM83), fréquemment utilisée pour la recherche sur la maladie de Parkinson, qui expriment une protéine humaine mutée responsable d’une forme génétique de cette maladie neurodégénérative. Différentes études comportementales indiquent que les souris TgM83 présentent des altérations motrices sévères de type parkinsonien dès l’âge de 8-10 mois. En revanche, on ne sait pas si leur sommeil est perturbé en amont de ces signes cliniques, comme chez les patients parkinsoniens.Ce projet nous permettra de caractériser le sommeil des souris TgM83 porteuses de la pathologie, de prévoir l’émergence de la maladie de Parkinson à la détection de symptômes précoces durant le sommeil et enfin d’étudier la propagation cérébrale de la pathologie au cours du veillissement.
Bénéfices attendus
Le trouble comportemental en sommeil paradoxal est pour les médecins un symptôme neurologique précoce et fiable de la Maladie de Parkinson. En effet, il serait l’un des premiers signes visible et facilement identifiable à l’hôpital qui survient une dizaine d’années avant les symptômes moteurs invalidants bien connus. Par ailleurs, ceci suggère que ces deux pathologies sont chronologiquement liées et partageraient des mécanismes pathologiques communs qui envahiraient de façon lente, insidieuse et presqu’invisible, le cerveau au cours du vieillissement chez les patients. Notre objectif est de tester cette hypothèse en profitant de l’opportunité expérimentale que nous offre une souche de souris exprimant la protéine mutée qui est responsable de la maladie de Parkinson. Différentes études comportementales antérieures ont déjà établi que ces souris présentent des altérations motrices de type parkinsonien dès l’âge de 9-10 mois. En revanche, on ne sait pas si leur sommeil est sévèrement perturbé en amont comme il est maintenant bien décrit chez les patients parkinsoniens. Plusieurs bénéfices importants sont attendus de ce projet de recherche qui visera d’abord à caractériser finement le sommeil de ces souris, de déterminer si elles développent, comme nous le prévoyons, un trouble comportemental en sommeil paradoxal précoce, voire d’autres biomarqueurs potentiels prédictifs de la Maladie de Parkinson, et d’étudier comment la pathologie se propage dans le cerveau au cours du vieillissement. Selon les résultats obtenus, cette souche de souris pourrait alors constituer un modèle préclinique pertinent de la maladie de Parkinson, mimant précisément et chronologiquement son développement au cours du temps. Ceci ouvrirait alors de nombreuses voies de recherche pour la mise au point à moyen terme de traitements préventifs pour ralentir la maladie, voire curatifs en la stoppant complètement dès la pose de son diagnostic.
Procédures
La moitié des souris (n=12) prévues pour ce projet de recherche subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale d'une durée maximum de 60 minutes. Elles seront ensuite mises en isolement lors des phases expérimentales pendant 1 semaine toutes les 2 semaines, soit pour une durée maximale de 18 semaines. Pour le prélèvement des cerveaux en fin d’expérimentation, l’ensemble des souris (n=24) recevront successivement un traitement médicamenteux analgésique puis sédatif avant l’induction par voie intrapéritonéale d'une anesthésie chirurgicale terminale requise pour la perfusion transcardiaque de l’animal.
Impact sur les animaux
Pour l’ensemble des souris (n=24) prévues pour ce projet de recherche, de potentiels effets indésirables liés à l’aspect neurodégénératif du modèle animal sont à considérer et sont de fait attendus (objet du présent projet). Bien que les animaux soient mis à mort avant l’apparition de signes moteurs avant-coureurs de la maladie de Parkinson, il n’est pas à exclure une apparition précoce d’un trouble du comportement en sommeil paradoxal (objectif de ce projet), une perte légère de poids et quelques difficultés locomotrices à l’éveil sur certains individus. Pour la moitié de ces souris qui seront soumises à une intervention chirurgicale (n=12), les effets indésirables afférents sont très peu probables mais seront anticipés comme une hypothermie, une hémorragie locale, un arrêt respiratoire ou une infection post-opératoire entraînant une dégradation de l’état de santé. L’isolement des souris durant les phases d’enregistrement pourrait entraîner un léger stress et anxiété transitoire, sans impact sur nos paramètres d’intérêt.
Devenir
Toutes les souris prévues pour ce projet de recherche (n = 24) seront mises à mort en fin de procédure afin de prélever les cerveaux pour leur étude anatomo-pathologique et comparative.
Remplacement
L’intérêt d’étudier les mécanismes physiopathologiques responsables troubles du sommeil réside dans leur caractère prédictif et évolutif vers la Maladie de Parkinson. Or, il est encore aujourd’hui impossible d’aborder ces questions chez l’homme sain ou malade, d’autant qu’aucun marqueur spécifique des mécanismes impliqués n’est encore validé en neuroimagerie. Des contrôles anatomo-pathologiques sont souvent réalisés sur des biopsies issues de patients mais décédés des décennies après le déclenchement des processus pathologiques. Aussi, des modèles animaux demeurent essentiels pour reproduire les observations cliniques, les comprendre et les modéliser. La souris est un animal adapté aux études longitudinales (faible prise de poids et de volume corporel avec l’âge). Par ailleurs, les réseaux neuronaux responsables du sommeil sont communs aux mammifères, incluant les rongeurs et l’homme, et sont bien identifiés. Enfin, des animaux de niveau phylogénétique inférieur (drosophile, poisson rouge, vers C. elegans) sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité́/inactivité́) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal qui est spécifique aux mammifères et aux oiseaux (peut-être aux reptiles) et dont la complexité́ du système nerveux n’est en rien comparable avec celle des mammifères. D’autres méthodes prometteuses se développent régulièrement comme la modélisation in-silico, l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces et depuis peu les organoïdes cérébraux mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles pour aborder des processus neurobiologiques complexes, mimer leurs dysfonctionnements, reproduire et modéliser des observations cliniques sous-jacentes de pathologies évolutives et neurodégénératives comme la Maladie de Parkinson.
Réduction
Le nombre d'animaux est légitimé par l’organisation de l’étude autours de deux procédures expérimentales indépendantes mais conduites en parallèle. La taille de chaque lot expérimental a été calculée et optimisée sur la base de nos nombreuses études conduites chez la souris et publiées au cours de la dernière décennie par l’équipe, incluant nos travaux déjà réalisés dans le cadre de la demande d’autorisation de projet précédente sur le même sujet. Ces calculs prennent en compte les « erreurs et échecs » aux différentes étapes des deux procédures expérimentales (chirurgie sous anesthésie générale, récupération post-opératoire, survie post-traitement, comportements anormaux, état de santé général), la variabilité́ interindividuelle des paramètres physiologiques considérés, la dégradation des signaux polysomnographiques au cours du temps (procédures de plusieurs mois) pouvant dès lors rendre leur interprétation aléatoire, en enfin la nécessité de ne pas compromettre la reproductibilité et la significativité des données obtenues (utilisation systématique de tests statistiques paramétriques ou non paramétrique adaptés aux petits échantillons). Chaque animal ne sera soumis qu’à une seule procédure expérimentale avec mise à mort pour les analyses des cerveaux, éliminant toute possibilité de réutilisation.
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie de notre centre de recherche, toutes les souris (n=24) seront classiquement hébergées en respectant des conditions optimales à 4 par cage favorisant des interactions sociales normales jusqu’à ce qu’elles atteignent l’âge requis pour les expérimentations. Des enrichissements environnementaux systématiques seront mis en place pour améliorer leur bien-être, tels que des carrés de coton à déchirer pour faire le nid ou encore des batônnets de bois à ronger. Pour évaluer le bien-être, le poids et l’état du pelage seront mesurés quotidiennement. Si un animal dépasse un des points limites détaillés dans les procédures expérimentales, il sera retiré́ et euthanasié sans délai. Pour les souris qui seront soumises à une intervention chirurgicale (n=12), une attention quotidienne leur sera portée lors de la phase post-opératoire pour optimiser la récupération (ajout d’anti-inflamatoires non-stéroidiens si nécessaire, suivi pondéral, mobilité et comportements) grâce à l’utilisation d’une grille de score post-opératoire. Pendant les périodes expérimentales (1 semaine sur 2 pendant 18 semaines), notre préoccupation sera d’analyser régulièrement grâce à des fiches de scorage l’évolution des paramètres physiologiques et le comportement locomoteur pour détecter au plus tôt les perturbations caractéristiques du trouble comportemental en sommeil paradoxal. Celles-ci constitueront de-facto le point limite des expérimentations, tout en établissant la preuve de concept recherchée. Dans les cas où aucun trouble comportemental en sommeil paradoxal ne se déclencherait avant l’apparition spontanée des signes cliniques moteurs de type parkinsonien (9-10 mois d’âge), la mise à mort sera programmée pour prévenir toute souffrance.
Choix des espèces
Nous souhaitons valider un modèle préclinique d’une pathologie neurologique prédictive de la Maladie de Parkinson, en reproduisant chez la souris les mécanismes évolutifs sous-jacents se déroulant sur plusieurs décennies chez les patients, bien avant leur décès. Aussi, les analyses anatomo-pathologiques des cerveaux de patients décédés ne permettent pas d’aborder ces mécanismes qui débutent de façon précoce, bien avant l’apparition des problèmes moteurs bien connus de la Maladie de Parkinson. Il n'existe pas de marqueurs qui permettraient l’exploration fonctionnelle par neuroimagerie. La compréhension de mécanismes à l’échelle cellulaire et moléculaire passe par la mise en œuvre de techniques inapplicables chez l’homme mais possible chez la souris présentant de grandes similitudes d’organisation de leur cerveau. Par ailleurs, le sommeil paradoxal est propre aux mammifères. Des modèles d’animaux moins évolués sont parfois utilisés pour l’étude de la vigilance mais ils ne sont pas pertinents pour ce projet. Nos travaux ont permis d’identifier chez le rongeur les structures cérébrales potentiellement ciblées par la pathologie. Ceci rend évident le choix de la souris, particulièrement la souris TgM83 pour induire l’expression de la protéine mutée impliquée dans la pathologie qui nous intéresse. Cette étude longitudinale de la période présymptomatique chez ce modèle murin durera 7 mois environ, débutant chez des souris jeunes adultes asymptomatiques âgées de 3 mois pour s’achever dès qu’apparaitront les premiers signes prédictifs de la maladie de Parkinson (mais avant la mise en place de la pathologie), à l’âge de 9-10 mois. Pour ce type d’étude physiologique et comportementale de longue durée, la souris s’avère à nouveau plus adaptée que le rat (pas de prise de poids et de volume corporel significatif avec le vieillissement, cerveau de plus petite taille avec des processus évolutifs plus rapides) augmentant la faisabilité du projet.
Formation aux tests comportementaux généraux et modèles de douleur chez la souris
- Formation professionnelle
Nés avec un génotype non souhaité ou arrivés en fin d'une autre procédure, 1 600 souris vont servir à former des étudiants, des techniciens et des chercheurs. Toutes sont tuées à l'issue, dont 450 utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 100 un niveau léger et 50 sous anesthésie sans réveil. Chaque animal subit un à trois tests comportementaux parmi les vingt-cinq enseignés, et certaines cohortes une chirurgie d'induction de douleur neuropathique ou une incision de la patte, une injection sous-cutanée d'agent inflammatoire ou une injection intrathécale. Le porteur écrit que la douleur modérée qui suit ces chirurgies "ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude", et juge l'animal vivant "indispensable" pour ressentir les différences anatomiques entre individus.
Objectifs
L’utilisation des animaux de laboratoire dans les procédures invasives est strictement encadrée par la loi. La bonne pratique d’expérimentation nécessite une bonne connaissance de la biologie des espèces utilisées et aussi la connaissance théorique et pratique des méthodes d’exploration sur le modèle animal. L’objectif de ce projet est de fournir des connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Ce projet à donc un objectif de formation, il s'agit de former des étudiants, des personnels techniques et des chercheurs à différents tests comportementaux ou différents modèles murins de douleur couramment utilisés en recherche préclinique sur la douleur chronique et ses conséquences anxio-dépressives, cognitives, motrices ainsi que sur le bien-être.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour bénéfice le maintien et l’amélioration continue du bien-être des animaux utilisés dans nos projets de recherche préclinique, grâce au maintien et au raffinement des compétences du personnel sur les tests comportementaux et gestes techniques chirurgicaux, chez la souris. L’apprentissage des compétences dans de telles conditions donne l’assurance de fournir des résultats fiables et dont la qualité et l’exactitude ne peuvent être remis en cause. L’entraînement permet d’acquérir une maîtrise des gestes permettant de réduire le temps d’anesthésie générale, ceci limite le stress chez l’animal.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests comportementaux (1 à 3 tests différents par animal) avec des délais entre les tests variant de 30 min à 48 heures (tests répartis sur 1 à 3 jours). Chaque test dure de 3 minutes à 1 heure. Certaines cohortes d’animaux subiront une chirurgie d’induction de douleur neuropathique (d'une durée de 10 min environ) ou post-chirurgicale (d'une durée de 10 min environ). Un protocole d’anesthésie s’applique dans ce cas. Certaines cohortes d’animaux subiront une injection sous-cutanée d’agent inflammatoire sous anesthésie gazeuse (d'une durée de 5 min environ). D’autres cohortes subiront une injection intrathécale d’agent anesthésiant sous anesthésie gazeuse (d'une durée de 5 min environ). Un lot d’animaux subira une surdose d’anesthésique afin de réaliser une perfusion intracardiaque (durée totale 10 min environ).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des sessions de tests comportementaux qui durent entre 3 minutes et 1h maximum, avec au moins 1h minimum de repos entre chaque test ou session. Il n’y aura pas plus de 3 tests ou sessions consécutives. Lors de ces tests, les animaux sont soumis à des stress légers, à modérés pouvant induire des réactions d’évitement, de peur, voire d’aversion. Dans les tests nociceptifs, une stimulation nociceptive mécanique ou thermique sera induite provoquant une secousse ou un léchage de la patte. Pour les formations aux modèles de douleurs (réservées aux étudiants/personnels possédant une formation règlementaire de chirurgie sur rongeur), il y a chez les animaux une présence de douleur modérée qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique ou incision de la patte, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies neuropathiques ou incisionnelles vont induire une réponse inflammatoire classique et attendue qui permet la mise en place de ces modèles. Certains animaux vont subir des injections intrathécales lombaires.
Devenir
A l’issu de chaque procédure (pouvant contenir plusieurs tests comportementaux) les animaux seront mis à mort car ce sont des animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés dans des projets ultérieurs ou bien ce sont des animaux déjà réutilisés.
Remplacement
Avant toute manipulation des animaux, les étudiants ou le personnel concerné procède à la lecture des procédures descriptives des techniques pour lesquelles il doit être formé, s’appuie sur les descriptions présentes dans la littérature scientifique et suit des démonstrations vidéos ou réalisées par le personnel compétent pour le geste technique en question. Les premières séances d’apprentissage et d’entraînement aux chirurgies d’induction de modèles de douleur sont réalisées sur animaux morts, au préalable du travail sur animaux vivants anesthésiés. Il existe peu de solution de remplacement permettant la formation et le maintien des compétences du personnel. L’utilisation de l’animal vivant est indispensable pour ressentir les différences anatomiques inter individu, la force et les réactions de celui-ci et la manipulation des êtres vivants demande de la maîtrise qui ne peut s’acquérir qu’en pratiquant avec l’animal vivant.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux nécessaire, le geste est d’abord expliqué à l’aide d’un schéma ou d’une vidéo et/ou réalisé sur animal mort. Pour la partie pratique nous n’utiliserons que des animaux qui ne peuvent pas être utilisés dans d’autres projets ou destinés à être mis à mort, par exemple parce qu’ils sont nés avec un génotype non souhaité ou car ils sont en fin de procédure expérimentale. Le nombre d’animaux inclus est fonction du nombre de compétences à acquérir et du nombre de personnes concernées. A ce jour, ce projet concerne 5 à 10 expérimentateurs par an et englobe 17 procédures avec au total 31 gestes techniques chez la souris dont les compétences sont à acquérir (25 tests comportementaux, 2 gestions d’injections spécifiques et 4 gestes chirurgicaux). 2 à 4 souris (selon les gestes techniques) sont nécessaires pour acquérir une compétence pour une personne. Au total 320 animaux seront nécessaires par an soit sur 5 ans 1600 animaux.
Raffinement
Nous incluons exclusivement des animaux en bon état général, hébergés dans des conditions respectant le bien-être animal, sous atmosphère contrôlée (température, hygrométrie, fond sonore…), avec l’enrichissement du milieu adéquat (fibre pour nidification, rouleau carton…) et en groupe sociaux harmonieux. Une phase d’acclimatation de deux semaines est appliquée avant toute manipulation des animaux. Pour les tests comportementaux, avant d’expérimenter sur des animaux vivants, le geste est expliqué par le formateur, puis l’apprenant observe des personnes expertes dans la réalisation de ces gestes. Ensuite tous les gestes seront réalisés par les étudiants ou le personnel concerné. De plus, les mêmes animaux vont pouvoir subir plusieurs tests successivement (3 au maximum); ceci est possible car les différentes procédures qui vont se succéder sur un même animal concernent la stimulation d'une partie différente du corps de l'animal (pattes ou queue) ou bien l'application d'une stimulation différente (thermique ou mécanique), et un délai de 30 minutes au minimum est appliqué entre chaque test comportementaux. Pour les chirurgies, dans un premier temps, les séances d’apprentissage à ce type d’acte sont réalisées sur animaux morts. Dans un second temps, ces actes sont réalisés sur des animaux anesthésiés. L’ensemble des gestes chirurgicaux sont réalisés en condition de stérilité afin d’éviter tout risque d’infection. Une fois anesthésiés, les animaux sont installés sur des couvertures chauffantes pour assurer le maintien de leur température corporelle. L’état clinique des animaux est évalué plusieurs fois par jour par les personnes impliquées dans ces formations. Des points limites sont établis permettant de limiter la souffrance de l’animal. L’atteinte des points limites conduit à la mise à mort des animaux concernés.
Choix des espèces
Les différents tests comportementaux et modèles de douleur qui font l'objet de cette formation ont principalement été caractérisés et validés chez la souris. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (habituation des animaux aux locaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).
Évaluation de l’impact sur les performances myocardiques de l’irrégularité ventriculaire en fibrillation atriale par analyse invasive de la courbe pression-volume à partir d’un modèle de rat stimulé
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Le cou ouvert pour canuler la carotide, une sonde de stimulation poussée par la veine jugulaire, 120 rats subissent un cathétérisme cardiaque de vingt à trente minutes, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. L'objectif déclaré est de mesurer cycle par cycle ce qu'une irrégularité du rythme ventriculaire coûte aux performances du cœur, un modèle de cœur isolé perfusé ayant montré ses limites. Le porteur reconnaît que l'animal peut mourir pendant le cathétérisme et juge "indispensable" la confirmation in vivo de cet effet délétère. Le thorax est ensuite ouvert et l'exérèse du cœur provoque la mort.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier les effets hémodynamiques délétères de l’irrégularité ventriculaire en fibrillation atriale par analyse des courbes de pression-volume à partir d’un modèle de rat stimulé.
Bénéfices attendus
Nous disposons de données provenant d’études physiopathologiques très anciennes menées chez l’homme et le gros animal (modèle canin) montrant qu’une irrégularité du rythme cardiaque pourrait être à l’origine de conséquences hémodynamiques délétères. Récemment, de nouvelles techniques ont été développées dans le domaine clinique de la stimulation cardiaque permettant de régulariser le rythme cardiaque chez les patients en arythmie cardiaque. Il existe donc un regain d’intérêt pour l’étude des conséquences de l’irrégularité du rythme cardiaque. Le projet présenté s’inscrit dans la continuité de notre thématique de recherche actuelle. Nous avons mené des premières expérimentations sur modèle de cœur rat isolé-perfusé où nous cherchons à étudier l’impact de l’irrégularité cardiaque et déterminer une valeur seuil à partir de laquelle l'irrégularité se traduit par une dégradation des performances cardiaques. Ce modèle présente des limites inhérentes aux modèles in vitro avec notamment l’absence de variation des conditions de charge du cœur. Nous souhaitons donc étudier les conséquences de l’irrégularité ventriculaire dans un modèle in vivo. L'analyse par cathétérisme cardiaque est nécessaire afin de déterminer en continu, pour chaque cycle cardiaque, les performations cardiaques. Cette nouvelle approche basée sur l'évaluation de l’irrégularité ventriculaire, et non sur le contrôle de la fréquence cardiaque seule, permettrait d'orienter vers de nouvelles approches pronostiques et thérapeutiques.
Procédures
La procédure sera effectuée sous anesthésie et analgésie. La durée de l’examen est de 20-30 minutes par animal. Sous anesthésie, une cervicotomie droite est pratiquée pour accéder à la carotide et la canuler avec une sonde hémodynamique. Une sonde de stimulation ventriculaire sera insérée par voie jugulaire. À la fin de l'examen, le thorax est ouvert et l’éxèrese du cœur provoque la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
L'analyse de l'hémodynamique cardiaque sera effectuée sous anesthésie générale. L'animal subira une chirurgie pour insertion d'un capteur de pression dans la carotide pour obtenir des courbes de pression-volume au niveau du coeur du rat et pour insertion de la sonde de stimulation par voie jugulaire. Chaque animal sera mis à mort à la fin de la procédure. Il se peut que l'animal décède lors du cathétérisme cardiaque.
Devenir
Pour l’ensemble des animaux, à la fin de l'examen, sous anesthésie générale, le thorax est ouvert et l’éxèrese du cœur provoque la mort de l’animal.
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées pour la bonne réussite de ce projet. Il est indispensable de réaliser ces expérimentations animales afin de confirmer un effet délétère de l'irrégularité ventriculaire sur les fonctions systolique et diastolique myocardiques.
Réduction
Nous avons limité les protocoles de stimulation à 4 séquences (régulière, irrégulière 30%, 50% et 70%) permettant de mimer l’irrégularité rencontrée aux cours de l’arythmie cardiaque la plus fréquente chez l’homme (fibrillation atriale). L'utilisation de rats sera limitée à l'obtention de résultats reproductibles quant à l'impact éventuel de ces différentes irrégularités ventriculaires.
Raffinement
Afin de limiter l’angoisse des animaux, une période d'acclimatation d'une semaine aura lieu après l’arrivée des rats au sein de l’animalerie afin qu’ils aient un temps d’adaptation et de repos suite au transport. L’hébergement en petits groupes sociaux (n=4) par cage sera réalisé ce qui permet, non seulement de répondre aux normes éthiques, mais également de réduire l’agressivité des animaux entre eux. Une manipulation régulière de nos animaux par une seule personne sera réalisée pour diminuer l'angoisse. L’ensemble de la procédure sera réalisée sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
Il existe du matériel de cathéterisme cardiaque adapté au petit animal. Nous avons conçu un stimulateur cardiaque avec des intervalles de stimulation compatibles avec la fréquence cardiaque intrinsèque du rat. Les rats Wistar utilisés seront des rats matures de 12 semaines. Ils auront 14 semaines au moment de leur mise à mort.
Impact d’une stratégie de ventilation apnéique comparé à une stratégie de ventilation ultra-protectrice sur l’inflammation régionale pulmonaire au cours du syndrome de détresse respiratoire expérimental chez le porc
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Vingt-quatre heures d'anesthésie profonde et de paralysie musculaire, deux séances d'imagerie TEP d'une heure et quatre scanners thoraciques : 14 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sans réveil, tués au terme du protocole. Une détresse respiratoire aiguë leur est provoquée par lésion chimique des poumons, puis chacun est réparti au hasard entre deux réglages de ventilation sous circulation extracorporelle, pour trancher un débat clinique que les études chez l'humain n'ont pas réglé. Le porteur a porté l'effectif de cinq à sept animaux par groupe en anticipant une mortalité précoce proche de 30 %. Il retient le porc pour la proximité respiratoire avec l'humain autant que pour un poids de 30 à 40 kg compatible avec le champ de vue de la caméra.
Objectifs
La ventilation artificielle, utilisée quotidiennement au bloc opératoire, est également la pierre angulaire dans le traitement des troubles respiratoires les plus sévères en réanimation. Cependant cet outil peut induire des lésions pulmonaires qui peuvent être d’origine biomécanique et conduire à une réponse inflammatoire locale (aggravant encore les lésions pulmonaires). Dans les formes les plus extrêmes de ces troubles ventilatoires aigues (comme les formes sévères de COVID-19), l’adaptation la plus experte des réglages du ventilateur peut ne pas suffire à protéger les poumons. Il est alors nécessaire de recourir à une technique d’oxygénation extracorporelle, appelée ECMO-VV (veno-venous extracorporeal membrane oxygenation). Cette technique permet d’assurer l’oxygénation du sang tout en maintenant une ventilation minimale proche de l’apnée. Le réglage du ventilateur lorsque les patients sont placés sous ECMO-VV reste sujet à débat. La littérature scientifique actuel tend à démontrer que des réglages s’approchant de l’apnée sont associés à une moindre inflammation pulmonaire. Cependant, l’impact sur l’inflammation pulmonaire d’une stratégie de ventilation en apnée sous ECMO-VV reste inconnu. Sur le plan méthodologique, notre équipe a développé des outils innovants permettant une exploration non invasive (alors que l’animal est toujours vivant) de l’inflammation pulmonaire, à l’aide de la tomographie par émission de positrons couplée au scanner pulmonaire. L’objectif principal de ce projet est de démontrer que l’inflammation pulmonaire diminue lors de l’application d’une apnée continue avec une oxygénation du sang assurée par l’ECMO-VV comparée à une stratégie de ventilation minimale également sous ECMO-VV.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus en lien avec les retombées sont de pouvoir proposé une stratégie de ventilation innovante et pertinente aux patients atteints de troubles ventilatoires les plus sévères. Si la démonstration est faite, un protocole évaluant l’application de cette stratégie chez l’homme pourrait voir rapidement le jour. En effet, à ce jour aucune étude n’a pu trancher sur la stratégie de ventilation la plus adaptée sous ECMO-VV alors même que ce sont les patients chez qui l’adaptation des paramètres du ventilateur a potentiellement le plus d’impact. Nous espérons également une amélioration de la compréhension des mécanismes physiopathologiques reliant l’agression physique/mécanique induit par la ventilation mécanique, et la réponse inflammatoire pulmonaire observée lorsque la ventilation est estimée protectrice. Cela permettrait d’envisager le monitorage de certains paramètres (notamment grâce au scanner thoracique) afin de prédire la survenue de lésions pulmonaires. Notre équipe a développé un logiciel permettant déjà de quantifier le mécanotrauma en pratique courante. Nous avons pour projet d’étudier l’association entre le contrôle des paramètres associés au biotrauma avec le pronostic des patients en SDRA afin de proposer à terme des stratégies de ventilation personnalisées.
Procédures
Le protocole débute par une prémédication réalisée en intra-musculaire. Cette anesthésie légère permet la mise en place d’une voie veineuse périphérique afin de démarrer l’anesthésie générale profonde et continue, la mise en place de la ventilation mécanique invasive, l’ECMO VV et ainsi que la mise en place des outils de monitorage. La procédure étant de type sans réveil, les sédations seront maintenues jusqu’à la mise à mort de l’animal. Voici les principales étapes de la procédure : Induction du Syndrome de Détresse Respiratoire Aigüe (SDRA) expérimental : Afin de reproduire des lésions pulmonaires similaires à celles retrouvées chez les patients ayant des troubles respiratoires sévères, un SDRA expérimental est induit par lésions chimiques. L’objectif est d’obtenir une importante chute du taux d’oxygène sanguin. Stratégies expérimentales déterminées par le groupe de randomisation (pendant 24h): Les animaux sont randomisés pour recevoir une des deux stratégies : apnée ou ventilation minimaliste sous ECMO-VV. Imageries pulmonaires : Plusieurs séries d’imageries pulmonaires seront réalisés au cours de la procédure toujours sous anesthésie générale : Imageries TEP dans l’objectif de quantifier l’inflammation pulmonaire (durée 1h) juste avant l'application de la stratégie ventilatoire (H0) et à 24h de son application (H24) Scanners pulmonaires dans l’objectif de quantifier le mécanotrauma (durée 20min) juste avant l'application de la stratégie ventilatoire (H0) et à 4h (H4), 16h (H16) et 24h de son application (H24)
Impact sur les animaux
La première étape du protocole consiste à placer l’animal dans un état de sommeil profond (inconscience de l’animal et maintien de sa respiration sans assistance) à l’aide d’une prémédication. La procédure de prémédication par injection intramusculaire génère un niveau de stress minime à moyen, inférieur à celui d’une injection sous contention physique. L’injection est réalisée par un personnel formé et connu de l’animal, dont il a pu s’habituer à la présence depuis son arrivée au laboratoire. C’est la seule procédure réalisée alors que l’animal est éveillé. La prémédication permet ensuite l’administration d’une anesthésie générale profonde et continue (inconscience complète de l’animal), durant laquelle l’animal reçoit une série d’interventions chirurgicales modérées et est placé sous ventilation artificielle. Les stratégies expérimentales sont testées sous anesthésie générale continue et peuvent se compliquer d’effets indésirables connus en lien avec la ventilation mécanique. Ces complications peuvent mener au décès de l’animal avant la fin du protocole. A aucun moment, l’animal n’est réveillé après l’induction de l’anesthésie générale, et ceci jusqu’à sa mise à mort à la fin du protocole.
Devenir
La mise à mort des animaux en fin de protocole est rendue obligatoire par la nécessité d’évaluer l’atteinte pulmonaire au laboratoire au microscope. En effet, l’objectif de notre étude est de démontrer les mécanismes responsables des lésions pulmonaires lors de stratégies de ventilation artificielle proche de l’apnée, mais aussi d’évaluer comment ceuxci peuvent être identifiés de façon non-invasive ou in vivo. La preuve de performance de ces techniques d’imagerie ne peut être fait que par leur confrontation à l’atteinte constatées sur l’organe directement visualisé au microscope. De plus, les différentes interventions réalisées durant la procédure sont responsable de lésions pulmonaires irréversibles et très probablement incompatible avec une respiration sans assistance artificielle.
Remplacement
Les stratégies de ventilation étudiées dans ce protocole nécessitent leur exploration in vivo au vu de la complexité des interactions entre les réglages du ventilateur, de la circulation extra-corporelle et leurs conséquences en termes de mécanique respiratoire, hémodynamique et inflammation pulmonaire. Cependant, ces stratégies ont été insuffisamment étudiées pour être proposées au sein d’un protocole chez l’homme. De plus, l’étude animal permettra une meilleure compréhension des déterminants de l’inflammation pulmonaire lorsqu’une stratégie de ventilation attendu comme protectrice est appliquée. Notre étude nécessite des animaux de taille suffisamment importante afin d’étudier l’hétérogénéité pulmonaire du SDRA et de permettre la mise en place de la circulation extra-corporelle. Le porc est un modèle proche anatomiquement et physiologiquement sur le plan respiratoire de l’homme.
Réduction
Nous avons évalué le nombre d’animaux nécessaire en nous basant sur la différence d’inflammation mesurée dans les précédentes études conduites par notre équipe sur le même modèle animal. Du fait que nous évaluons régionalement l’inflammation pulmonaire, 34 régions pulmonaires par groupe seront nécessaires, soit 5 animaux par groupe. Au vu du taux de mortalité attendue, 7 animaux seront inclus par groupe (total = 14). En effet, tout comme en médecine humaine, les lésions pulmonaires induite par le modèle expérimental est associé à un taux de décès précoce proche 30%. Les inclusions seront arrêtées dès l’obtention du nombre d’animaux nécessaire par groupe.
Raffinement
Les porcs seront d’abord prémédiqués après injection intra-musculaire de d’anesthésiques. L’objectif est d’obtenir une sédation légère avec persistance de la ventilation spontanée, afin de mettre en place une voie veineuse périphérique (sans contrainte). Une sédation profonde est alors débutée. Son efficacité est évaluée par l’absence de mouvements spontanés, l’absence de réaction à un stimulus douloureux , une absence de signe de lutte sous respirateur. L’anesthésie générale est maintenue pendant toute la procédure expérimentale. La paralysie artificielle (i.e. curarisation) est débutée 30 min après le début de la sédation et une fois seulement que l’efficacité de la sédation est confirmée. La curarisation est justifiée dans cette situation car elle fait partie de la prise en charge classique des patients en SDRA.
Choix des espèces
Le porc est un modèle à la fois anatomiquement et physiologiquement proche sur le plan respiratoire des primates et de l’homme. De plus, la morphométrie de l’animal permet l’utilisation de la même technique de ventilation (respirateur artificiel et ECMO-VV) et les mêmes techniques d’imagerie (TEP-CT) que chez l’homme. Porc mâle ou femelle (proportion 50/50) : le modèle expérimental de ventilation mécanique et de SDRA vise à reproduire l’épidémiologie habituelle observée chez l’humain en réanimation (soit une proportion de femmes de 40%). Stade de développement : 12-16 semaines (30-40 kg). Le stade de développement des animaux correspond à une maturation pulmonaire proche de celle du proc adulte. La taille et le poids des animaux sont compatibles avec une manutention aisée lors des expériences, et est adapté au champ de vue de la caméra TEP-CT utilisée.
Validation d’un candidat médicament dans un modèle murin exprimant le récepteur TREM-1 humain
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Chaque souris subit un unique prélèvement de sang par ponction intracardiaque, dix minutes sous anesthésie, sans jamais se réveiller. 15 souris génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur humain vont être utilisées ainsi, tuées avant tout réveil, la mise à mort servant à obtenir le volume de sang voulu. Deux expériences en laboratoire doivent vérifier que le gène humain fonctionne chez elles, l'objet réel étant de préparer des études réglementaires et une demande d'essai clinique. Le candidat médicament a déjà montré un effet sur du sang humain et du sang de singe, et le bénéfice avancé est de "limiter drastiquement" le recours aux primates non humains dans les tests de toxicité à venir.
Objectifs
Dans le contexte du développement d’un futur médicament pour le traitement de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (Maladie de Crohn et Rectocolite hémorragique), nous souhaiterions utiliser des souris génétiquement modifiées (souris exprimant un gène humain) afin d’évaluer la possibilité d’utiliser cette lignée de souris pour des futures études réglementaires. En effet, le futur médicament cible spécifiquement un gène humain et ne fonctionne pas avec ce même gène chez la souris, c'est pourquoi ces souris génétiquement modifiées ont été dévellopées. Le but de notre projet est de vérifier si le gène humain fonctionne correctement dans ces souris modifiées. Pour cela, nous avons besoin de récupérer le sang de ces souris pour isoler les cellules sanguines et réaliser des expériences au laboratoire. Les souris seront anesthésiées pour effectuer un prélèvement sanguin, un anti-douleur sera administré avant le prélèvement sanguin et le sang obtenu sera traité pour isoler les cellules sanguines (neutrophiles). Deux expériences seront realisées au laboratoire sur ces cellules sanguines pour démontrer que le gène humain fonctionne bien dans ces souris. L'objectif final de ce projet est de préparer la mise en place d'un essai clinique en Europe et aux Etats Unis pour montrer l'efficacité de notre futur médicament pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin .
Bénéfices attendus
En cas de résultats positifs avec ces souris génétiquement modifiées, nous pourrions les utiliser lors d’études réglementaires pour tester la tolérance et la toxicité de notre médicament dans le but de limiter drastiquement le recours à des singes (primates non humains).
Procédures
Injection en intrapéritonéale d'un analgésique, puis prélèvement sanguin sur animal anesthésié. Fréquence : 1 seul prélèvement sanguin par animal. Durée : 10min
Impact sur les animaux
Ces souris ne présenteront pas d'effets indésirables visibles à l'oeil. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous antalgie et anesthésie pour éviter les douleurs/souffrances aux animaux. Cependant, un analgésique sera administré en intra péritonéal aux souris 1h avant la ponction intra-cardiaque pouvant engendrer une nuisance aux souris mais la douleur sera légère et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin d'obtenir le volume sanguin nécessaire au projet.
Remplacement
L'efficacité du candidat médicament a été validé au préalable dans un modèle cellulaire humain ainsi que dans un modèle cellulaire chez le singe. En effet, des tests préliminaires ont été réalisés en utilisant du sang humain et du sang de singe montrant un effet thérapeutique. Dans le cadre de notre demande d'autorisation d'essai clinique, ces tests doivent être réitérés chez la souris.
Réduction
Le nombre de souris utilisé pour le projet principal (10 souris: 5 males et 5 femelles) a été défini en fonction du nombre de cellules pouvant être isolées par millilitre de sang et du nombre de conditions expérimentales nécessaires pour répondre aux objectifs du projet. De plus, en mélangeant le sang des souris males et femelles, nous limitons les croisements et donc reduisons le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'une période d'acclimatation de 1 semaine dans l'établissement utilisateur avant le début du projet afin de réduire le stress dû au transport et au changement d'animalerie. Les souris seront réparties en deux groupes de 5 souris par cage en fonction de leur sexe. Les cages seront enrichies avec des buchettes, du coton et de la frisure de papier craft. Afin d’appliquer le principe de raffinement, un anti douleur sera administré aux souris 1h avant le prélèvement sanguin. De plus, un anesthésique local sera également appliqué au niveau de la cage thoracique pour limiter la douleur induite par le prélèvement sanguin qui sera effectué sur un animal vivant anesthésié.
Choix des espèces
Notre molécule thérapeutique est spécifique d'une protéine humaine et n’interagit pas avec la souris. Pour palier à cela, nous avons développé un modèle de souris qui exprime cette protéine humaine afin de réaliser des études nécessaires au développement pré-clinique de notre candidat médicament. Pour ce projet, des souris adultes de 8 semaines seront utilisées car cela représente l'âge adulte. De plus, cet âge est optimum car il permet d'obtenir le volume sanguin nécessaire à la réalisation du projet avec seulement 10 souris.
Identification de nouveaux biomarqueurs pour détecter le dopage par autotransfusion dans un modèle de souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Des souris reçoivent du sang d'autres souris conservé au froid 14 jours, pour mettre au point des tests capables de détecter le dopage sportif par autotransfusion. 380 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ou menées sous anesthésie sans réveil pour une partie d'entre elles, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur sang. Le protocole comprend un prélèvement de sang dans le cœur sous anesthésie générale, une transfusion sans anesthésie et huit prises de sang en sept jours, et la transfusion peut provoquer des complications aux yeux ou une surcharge du volume sanguin avec insuffisance respiratoire. Le porteur écrit qu'une étude avec des volontaires humains est "nécessaire", que les études humaines sont "complexes et coûteuses", et que la souris permettra d'évaluer plusieurs paramètres à la fois.
Objectifs
La transfusion sanguine est un moyen interdit mais très simple et efficace d'améliorer les performances sportives. En effet, un simple don de sang, sa conservation au froid et sa réinfusion quelques semaines plus tard augmentent le volume des globules rouges et la capacité d'oxygénation. Cette transfusion est difficile à détecter car le sang du donneur et du receveur sont très souvent identiques et le volume transfusé est faible: des méthodes très sensibles sont donc nécessaires pour la détecter. Une étude de transfusion avec des volontaires humains est nécessaire pour explorer les différents paramètres chez le receveur après la transfusion. Les études humaines sont toutefois complexes et coûteuses. L'utilisation d'un modèle animal permettra d'évaluer plusieurs paramètres en même temps chez le receveur. À cet égard, le modèle de souris a déjà été utilisé pour de nombreuses études dans le contexte transfusionnel. Au cours des dernières années, de nombreuses études et diverses approches ont été testées pour identifier les marqueurs de la transfusion. Pour ce faire, il est possible de caractériser les globules rouges dans la circulation du receveur après la transfusion, à la recherche des altérations bien connues des globules rouges qui se produisent pendant le stockage au froid en banque de sang. En effet, au cours de cette période, une série de modifications qui altèrent les globules rouges ont été décrites; ce qui pourrait permettre de détecter de très faibles niveaux de globules rouges préalablement stockés dans la circulation du receveur.
Bénéfices attendus
Le dopage reste un défi majeur dans le sport. Dans ce contexte, l'identification de nouvelles méthodes de détection est une priorité de l'Agence Mondiale Antidopage pour améliorer l'efficacité de la lutte contre le dopage. Ceci est particulièrement évident dans le contexte des transfusions sanguines pour lesquelles il n'existe actuellement aucune méthode de détection directe. Ainsi, ce projet permettra de valider de nouvelles méthodes. En cas de résultats encourageants dans cette étude animale, ce projet constituera une excellente base pour des études ultérieures, notamment avec des sujets humains ayant récemment reçu une transfusion sanguine. Ces méthodes pourraient facilement être mis à la disposition des laboratoires antidopage en cas de résultats prometteurs.
Procédures
Analgésie pendant 20min, puis anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée une seule fois. Prélèvement intracardiaque d'une souris analgésiée sous anesthésie générale pendant 1 minute, effectuée une seule fois. Transfusion sanguine sur animal vigile pendant 5-10 secondes, effectuée une seule fois. Anesthésie générale pendant 5 minutes, effectuée une seule fois. Prélèvement de sang sous anesthésie générale pendant 1 minute, effectué 1 seule fois. Prélèvement de sang sur animal vigile pendant quelques secondes, effectué 8 fois sur 7 jours.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables des procédures sur les animaux sont modérés. Stress induit par la contention, l'analgésie, la piqûre d'anesthésie, la mise en anesthésie, la transfusion et les prélèvements sanguins. L'anesthésie peut causer une hypothermie. La transfusion peut entraîner des complications oculaires et correspond à un apport aigu d’un volume circulant supplémentaire pouvant entraîner une surcharge volémique avec insuffisance respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de prélever du sang qui sera analysé.
Remplacement
Veille bibliographique permanente pour éviter toute expérimentation inutile ou redondante. L’expérimentation animale est indispensable pour évaluer in vivo, dans un modèle préclinique, l’impact de la transfusion sur les paramètres sanguins et biochimiques et les propriétés des globules rouges du receveur. Les expérimentations sur animal vigile ne peuvent pas être substituées par des approches in vitro, qui par ailleurs ne peuvent reproduire les conditions de dopage par réinfusion de sang.
Réduction
Le nombre de souris utilisé sera réduit au minimum tout en permettant une analyse statistique fiable des résultats. Les tests statistiques utilisés rigoureusement permettent l’analyse d’échantillons de petites tailles. Notre expertise des modèles de transfusion sanguine chez la souris ainsi qu’un test statistique nous informent que des groupes de 12 souris sont nécessaires pour générer des résultats robustes. Pour chaque souris transfusées le sang sera analysé par de multiples paramètres pour obtenir un maximum d'informations (numération formule sanguine, plusieurs marqueurs biochimiques, plusieurs propriétés du globule rouge). Certaines méthodes ont été optimisées afin d'être réalisées sur de très faibles volumes de sang prélevé, permettant un suivi longitudinal sur le même animal.
Raffinement
Les transfusions et prélèvements de petits volumes de sang (5µl) sur souris vigiles seront prélevées par du personnel expérimenté qui maîtrisent les gestes techniques. Hébergement adapté des animaux, enrichissement de l’environnement. Lorsque la procédure expérimentale le permet, l'analgésie et l'anesthésie est utilisée pour réduire l'inconfort de l'animal. Un protocole de surveillance du bien-être est défini a priori et appliqué pour chaque procédure, avec définition de points-limites basés sur un score composite d’items d'observations cliniques (apparence physique externe, changement de comportement des animaux, complications liées à la transfusion).
Choix des espèces
L'utilisation du modèle de banque de sang de souris déleucocyté et stocké pendant 14 jours reproduit les conditions de stockage d’une banque de sang chez l’homme et ceci est transposable aux dommages observés lors du stockage à froid pendant 42 jours d’une poche de sang humaine. Des souris jeunes adultes âgées de 6 à 8 semaines seront utilisées comme "receveuses" dans tous les modèles de transfusion permettant d’homogénéiser les groupes en terme de volume circulant et d’âge. Des souris adultes âgées de 10 à 12 semaines seront utilisées comme "donneuses" pour la réalisation des banques de sang maximisant le poids des souris et le volume à prélever.
Rôle de l’activateur tissulaire du plasminogène au cours de l’allaitement et son importance au cours du développement post-natal.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
3 750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures allant de l'anesthésie sans réveil à un niveau de souffrance sévère. 720 souriceaux subissent une chirurgie de 45 minutes destinée à poser des prothèses de contention qui immobiliseront leur tête pendant l'imagerie, puis jusqu'à 50 minutes d'IRM et une heure d'échographie fonctionnelle. Pour injecter l'agent de contraste, 600 d'entre eux reçoivent une piqûre intracardiaque sous anesthésie, 960 autres souriceaux étant utilisés uniquement pour des prélèvements de tissus entre le 7e et le 60e jour de vie. Les 750 femelles allaitantes comptées dans le projet ne subissent aucune intervention, le porteur ne retenant pour elles que le stress de la séparation répétée d'avec leurs petits. Le bénéfice annoncé reste d'acquérir des données fondamentales sur l'influence du lait maternel sur le développement du cerveau.
Objectifs
Des études chez l’Homme mettent en évidence une expression variable des protéines du système d’activation du plasminogène (tel que l’activateur tissulaire du plasminogène) dans le lait maternel selon que la naissance des enfants ait lieu prématurément ou à terme. Ces protéines sont connues pour être exprimées dans certaines cellules du système nerveux central et peuvent jouer un rôle important dans le neurodéveloppement. Par exemple, elles peuvent jouer un rôle important dans la mise en place du cortex cérébral. Notamment, l'absence de l'activateur tissulaire du plasminogène au cours du développement entraine des altérations de la compaction de la gaine de myéline qui entoure les neurones, sous-jacents à des troubles moteurs et cognitifs. Ainsi, l’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de cette protéine présente dans le lait maternel, au cours de l’allaitement, sur le développement cérébral post natal. Pour ce faire, des souriceaux déficients en activateur tissulaire du plasminogèneseront adoptés et élevés dès leur naissance (jour post natal 0 ; P0) par une mère ayant conservé le gène codant la protéine. De la même façon, nous utiliserons également des souriceaux nés d’une mère exprimant l'activateur tissulaire du plasminogène, élevés par une mère déficiente en cette protéine. Deux groupes de souriceaux contrôles seront également utilisés : un groupe de souriceaux exprimant l'activateur tissulaire du plasminogène et un groupe ne l'exprimant pas resteront avec leur mère biologique respectives. Des analyses comportementales, en imagerie par résonnance magnétique anatomique ainsi qu’en imagerie fonctionnelle échographique seront réalisées à plusieurs stades de développement post-natal, jusqu’à l’âge adulte. Des études transcriptomiques et protéiques seront également conduites à partir de prélèvements de tissus.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales pour mieux comprendre l’influence de la composition du lait maternel sur le développement cérébral. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude du rôle des protéines du système d’activation du plasminogène doit se faire au cours de la phase d’allaitement sur des souriceaux in vivo, afin d’observer leur trajectoire neurodéveloppementale, d’un point de vue fonctionnel et morphologique.
Procédures
L’anatomie du système nerveux central sera observée en imagerie par résonance magnétique (50 minutes maximum, n = 720) et en imagerie fonctionnelle échograpghique (1 heure maximum, n = 720) aux jours post-nataux (P) 7, 10, 15, 21, 30 et 60. Cette dernière technique nécessitera l’administration d’un agent de contraste par voie intra veineuse. La méthode la plus efficiente pour cette administration jusqu’à P30 est en intracardiaque, sous anesthésie (n=600), et par pose d’un cathéter sur la veine caudale de la queue à P60 (n=120). Une procédures chirurgicale d’une durée de 45 minutes sera réalisée afin de poser des prothèses de contention qui permettront d’éviter les artéfacts mouvements de la tête lors des acquisitions en imagerie (n = 720). Le développement des capacités sensorimotrices, cognitives et émotionnelles sera également évalué, de manière longitudinale à P7, P10, P15, P21, P30 et P60 (n = 600). 960 souriceaux serviront uniquement à prélever des tissus à P7, P10, P15, P21, P30 et P60. Les 750 gestantes ne subiront aucune intervention et la seule nuisance qu'elle pourraient recevoir serait liée à un éventuel stress lors de la séparation avec leur souriceaux lors des évaluations comportementale de ces derniers.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : Pour toutes les procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observation des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être (grimace scale, prise alimentaire et boisson).
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. De plus, nous disposons au laboratoire d’une souche de souris très bien caractérisée, qui sont déficientes en activateur tissualire du plasminogène, ce qui en fait le modèle le plus adapté à ce projet. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies neurodéveloppementales humaines.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le minimum d'animaux a été prévu afin d'arriver à des résultats qui soient en adéquation avec ceux prévus lors de ce projet. Le nombre d’animaux pour chaque étude a été défini à partir de l’expertise au sein du laboratoire et des données de la littérature. De plus, afin de ne pas biaiser les résultats, les analyses comportementales ne seront pas suivi d’analyses morphologiques afin d’éviter les effets de la récupération fonctionnelle en réponse à la plasticité cérébrale. Dans la même idée, aucune évaluation comportementale ou histolgique ne sera réalisé consécutivement aux imageries qui nécessitent une anesthésie générale. En effet, des travaux récents mettent en évidence que l’anesthésie agit sur l’intégrité cérébrale, surtout lorsqu’elle est pratiquée précocement au cours du développement. Ce point limitera l’utilisation d’animaux pour des expériences qui ne marcheraient pas. Enfin, l’effet sexe sera observé, ce qui permettra de limiter l’utilisation d’animaux pour des résultats qui seraient biaisés par ce paramètre.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant, pendant et après chaque procédure le nécessitant. Au cours de l’intervention chirurgicale, les paramètres vitaux de l’animal seront surveillés et optimisés tout au long de la procédure. Les yeux des souris seront couverts de gel oculaire afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du développement et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme. Par ailleurs, l’utilisation des souris comme modèle d’étude permet l’utilisation de nombreuses souches génétiquement modifiées disponibles au laboratoire comme celles déficientes en activateur tissulaire du plasminogène. Ces éléments positionnent alors ce modèle comme le plus en adéquation avec le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au sein de l’unité et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les procédures sont basées sur l’étude du neurodéveloppement post-natal, il est donc nécessaire de se procurer des femelles allaitantes avec leurs souriceaux. Le stade de développement de ces femelles est de 2 à 5 mois car nous devons attendre leur maturité sexuelle. De plus, au cours du développement physiologique et pathologique chez la souris, les changements fonctionnels, morphologiques, comme les processus cellulaires et moléculaires en jeu s’opère très rapidement. De ce fait, une analyse à de nombreux stades de développement (P7 / P10 / P15 / P21 / P30 / P60) est nécessaire afin d’identifier des différences significatives dans la trajectoire développementale des différents groupes.
Travaux pratiques pour des sessions de formations règlementaires pour l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques (modèle rongeur).
- Formation professionnelle
Rats : 1470
Issus pour partie d'animaux de réforme de l'établissement, 1 550 souris et 1 470 rats vont être utilisés dans des travaux pratiques de formation réglementaire, tous tués à l'issue, 2 100 opérés sous anesthésie sans réveil et 920 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal peut être contenu cinq fois dix minutes, recevoir cinq injections et subir deux prélèvements, puis une anesthésie de trente minutes à trois heures et une craniotomie, une laparotomie ou une cathétérisation. Ces séances servent à délivrer l'attestation de compétence exigée par la directive 2010/63/UE, avec un animal pour la démonstration de l'intervenant et un animal par binôme ou trinôme de stagiaires. Le porteur indique recourir à des rats inertes de type Koken, à un tapis de peau artificielle et à une vidéo pour certaines démonstrations, avant que les stagiaires ne passent aux animaux vivants.
Objectifs
Cette série de travaux pratiques a vocation d’enseigner les bonnes pratiques en expérimentation animale sur modèle rongeur (contention, préhension, prélèvement, analgésie, soins …) dans le but de minimiser les contraintes exercées aux animaux. Cet enseignement est dispensé pour des formations spécifiques destinées aux personnes concevant et réalisant des procédures expérimentales sur modèle rongeur mais également aux personnels appliquant des procédures chirurgicales. Il prend place dans la règlementation (Directive 2010/63/UE Article 23 relatif à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques) qui définit l’adéquation des compétences du personnel par rapport à la fonction exercée et délivre une attestation valable pour le suivi des compétences.
Bénéfices attendus
Le but de ces formations est d'acquérir une qualification rendue obligatoire par la règlementation européenne dans l'exercice de ses fonctions. Ces formations permettent aux stagiaires d’acquérir, au travers de sessions de TP sur modèles inertes et modèles animaux, les bonnes pratiques en chirurgie expérimentales chez le rongeur de laboratoire (notamment : maintien d’une asepsie, mise en place et monitoring d’une anesthésie générale, gestion de la douleur et des soins pré, per et post opératoire...), et ce, dans diverses approches chirurgicales (laparotomie, craniotomie...) Toutes ces formations sont agréées par le ministère de l’agriculture et de la souveraineté alimentaire.
Procédures
Contention des animaux (rat et souris) : 5 fois par animal, pendant 10 minutes. Injection/administration : 5 fois par animal, environ 5 minutes Prélèvement : 2 fois par animal pour les souris, environ 10 minutes. Anesthésies (30 minutes à 3 heures). Interventions chirurgicales (craniotomie, laparotomie, cathétérisation) (30 minutes à 3 heures).
Impact sur les animaux
Le nombre d’étudiants peut entraîner un stress pour les animaux vigiles. De la même manière l’apprentissage de la contention et de la manipulation des animaux vigiles peut générer un stress pour les animaux tout comme les prélèvements et injections intrapéritonéales et intraveineuses. Les animaux subiront une anesthésie et des interventions chirurgicales (craniotomie, laparotomie) et lors des procédures chirurgicales vasculaires, nous ne pouvons exclure un risque hémorragique.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les animaux utilisés dans les procédures seront euthanasiés avant le réveil afin d’éviter toute douleur post-opératoire. Ils ne seront pas ré-utilisés pour éviter un effet cumulatif.
Remplacement
Cette série de travaux pratiques répond aux exigences des programmes de formations règlementaires (Concepteur/Opérateur et Chirurgie). Pour faciliter l'approche de certaines techniques de contention et voies d'administration, les modèles d'animaux inertes (rats Koken) seront utilisés. Les étudiants ne seront confrontés qu’ensuite aux animaux vivants. Avant le TP de télémétrie, une vidéo est présentée aux étudiants pour rappeler les bonnes pratiques et les étapes critiques, en insistant sur l’asepsie, la qualité de l’anesthésie, et la gestion de la douleur. Une approche similaire est en cours de mise en place pour les autres TP de chirurgie. Pour les techniques de suture, nous utilisons un tapis de peau artificielle.
Réduction
Le nombre de rongeurs utilisés est calculé à ce que nous estimons être le strict nécessaire pour un bon apprentissage : 1 animal pour l’intervenant à chaque TP pour la démonstration de l’intervention ainsi qu’1 animal par binôme/trinôme de stagiaires pour l’apprentissage. Nous privilégions systématiquement l’utilisation d’animaux de réforme issus de notre établissement utilisateur. Le recours à l'utilisation d'un support vidéo pour la partie démonstration de certains TP de chirurgie, en lieu et place d'un animal, sera un moyen de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de minimiser l’angoisse de certains animaux due au contexte d’une activité de formation (nombreuses personnes présentes), ceux-ci sont familiarisés à la manipulation par un technicien avant le déroulement de la procédure. Ils sont isolés dans une pièce annexe et sont amenés dans la salle d'expérimentation au fur et à mesure des besoins. Afin de réduire la douleur lors des actes chirurgicaux, des injections de solution d'anesthésique local sont réalisées systématiquement sur les trajets des incisions 5 minutes avant ouverture de la peau. Les rats et les souris seront anesthésiés en veillant bien à ce que le niveau d’anesthésie obtenu corresponde bien à une anesthésie chirurgicale, et que tous les réflexes (retrait membres, retrait queue..) soient effectivement abolis. Une analgésie sera mise en place 30 minutes avant chaque induction d’anesthésie. Le maintien de la température sera garanti par l’utilisation de couvertures chauffantes thermostatées. Pour les souris, la manipulation et la contention se fait en évitant la prise par la queue, et en privilégiant la prise par la paume de la main ou l’utilisation de tunnels de contention. Pour les rats utilisés dans le TP "contentions et administrations", pour limiter le stress associé à des manipulations multiples, une sédation légère sera réalisée.
Choix des espèces
Les animaux utilisés sont des rongeurs (rats et souris) et répondent à la catégorie d’animaux des formations règlementaires agréées. Les animaux utilisés dans le cadre de ces TP sont des animaux adultes car ce sont majoritairement des animaux adultes qui sont impliqués dans les procédures expérimentales que réaliseront les stagiaires dans leurs laboratoires.
Mise en place des vaisseaux sanguins et de l’hématopoïèse chez la souris au cours du développement embryonnaire et chez l’adulte
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Pour suivre l'origine des cellules souches du sang depuis l'embryon jusqu'à l'âge adulte, 440 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 380 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles gestantes reçoivent deux injections intrapéritonéales à 24 heures d'intervalle, vigiles et contenues, avant d'être tuées aux stades voulus pour prélever les embryons. D'autres subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie de vingt minutes, puis sont tuées pour récupérer fémur, rate et thymus. Le produit injecté peut rendre la mise bas difficile, et le porteur indique alors que la mère sera tuée et les embryons collectés.
Objectifs
Le projet consiste à étudier l’origine et la mise en place du système sanguin (vaisseaux et sang), et en particulier des cellules souches hématopoïétiques (CSH), au cours du développement embryonnaire, foetal, ainsi que son déploiement dans la moelle osseuse après la naissance. Cette approche nécessite l’utilisation de 2 types de souris transgéniques capables de marquer (par une protéine fluorescente) de façon indélébile certaines cellules embryonnaires cibles qui sont à l’origine des cellules des vaisseaux sanguins de l’embryon et suivre leur devenir. L’ensemble des connaissances acquises au cours de cette étude visent à mieux comprendre l’origine et la génération des CSH à partir des cellules des vaisseaux sanguins dérivés de cellules embryonnaires. Cette étude permettra de dégager des mécanismes de production des CSH et de les transposer à des systèmes de culture in vitro à des fins thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Il est critique de bien comprendre comment les cellules souches hématopoïétiques se forment au cours du développement normal. En effet, ces cellules sont d’une très grande importance en clinique car elles sont utilisées pour transplanter des patients atteints de maladie du sang. Bien connaitre leur mode de formation nous permettra de manipuler ces cellules à façon, par exemple de les générer en culture a des fins de transplantations. Dans cette étude nous voulons démontrer que certaines cellules endothéliales issues de cellules mésodermiques sont capables de générer des cellules souches hématopoïétiques sous certaines conditions (selon leur origine, leur localisation [foie foetal, moelle osseuse…]). Déterminer quels sont ces facteurs (origine cellulaire, contact avec d’autres cellules au cours du développement et en condition homéostatique) et caractériser (au niveau moléculaire) les étapes de formations des cellules souches hématopoïétiques nous permettra de manipuler cesdernières à des fins cliniques.
Procédures
Une partie des souris subiront une injection par voie intra-péritonéale 2 fois à 24h d'intervalle, les animaux seront vigiles au moment de l'injection, la contention et l'injection durent moins d'une minute. Ils seront ensuite euthanasiés aux différents stades requis pour le projet. Une autre partie sera anesthésiée pour effectuer un prélèvement de sang avant d'être euthanasiée. L'endormissement dure environ 20 minutes, le prélèvement sanguin 30 secondes.
Impact sur les animaux
Pour induire la recombinaison, les souris gestantes recevront à un stade précis une injection intrapéritonéale entrainant un stress lors de la contention et une douleur légère de courte durée au moment de l’introduction de l’aiguille. Le produit peut entrainer une difficulté de mise bas, ce qui peut entrainer une douleur à la femelle. Dans certains cas, nous serons amenés à faire des prélèvements sanguins (uniquement chez le jeune adulte/adulte) sous anesthésie générale avant euthanasie. Cette anesthésie peut induire un léger stress et dans de rare cas peut provoquer un arrêt cardio-respiratoire
Devenir
Les femelles gestantes seront euthanasiées aux stades définis par le protocole expérimental afin d'analyser les embryons par des expériences immunohistologiques et de cytométrie en flux. Les souris ayant subi un prélèvement sanguin, seront euthanasiées afin de récupérer les organes hématopoïétiques (fémur, rate et thymus) pour analyse.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe aucun système de remplacement (autre que le modèle murin) permettant de suivre comment certaines cellules de l’embryon s’organisent pour former un organe ou un système biologique chez l’adulte. Pour notre étude, il nous est nécessaire d’utiliser des souris modifiées génétiquement afin de suivre le devenir de cellules spécifiques depuis le développement de l’embryon jusqu’au stade adulte pour comprendre en détail comment les vaisseaux sanguins et le sang se mettent en place
Réduction
Pour cette étude nous utiliserons 440 animaux. Nous utilisons des animaux transgéniques homozygotes ce qui nous permet de nous assurer que tous les embryons de la portée ont le même génotype et peuvent donc tous être analysés, ce qui réduit le nombre de femelles gestantes à induire. Le nombre de souris utilisées a été calculé au mieux pour limiter au maximum le nombre d'animaux tout en permettant d'avoir des analyses statistiquement correctes. Pour cela nous utiliserons des tests quantitatifs de comparaison de 2 échantillons indépendants.
Raffinement
Les souris sont placées dans des cages adaptées à leur nombre, ces cages seront enrichies par du matériel de nidification (sizzle-dri kraft). La nourriture et l'eau de boisson sont fournis ad libidum. Les cages des mâles isolés servant aux accouplements contrôlés seront enrichies en buchettes en bois. Les femelles gestantes qui auront été injectées seront observées quotidiennement selon l'évaluation des expressions faciales. Les souris pour lesquelles nous souhaitons une mise bas seront surveillées 2 fois par jour à l'approche du terme, si elle s'avère trop difficile la mère sera euthanasiée et les embryons collectés. Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie générale (comportant une valence analgésique) avant euthanasie. Le projet comportera la mise en place de points limites définis.
Choix des espèces
A l’heure actuelle, il n’existe aucun système de remplacement (autre que le modèle murin) permettant de suivre comment certaines cellules de l’embryon s’organisent pour former un organe ou un système biologique chez l’adulte. Pour notre étude, il nous est nécessaire d’utiliser des souris modifiées génétiquement afin de suivre le devenir de cellules spécifiques depuis le développement de l’embryon jusqu’au stade adulte pour comprendre en détail comment les vaisseaux sanguins et le sang se mettent en place. Pour cela des femelles gestantes seront utilisées pour collecter les embryons à différents stades de développement, ce qui nous permettra d’étudier la mise en place des vaisseaux sanguins et du sang au cours du temps. Des souris jeunes adultes (6 semaines) et adultes (4mois) seront également analysées pour vérifier comment les cellules se maintiennent au cours du temps ou s'il y a un remodelage post-natal
Formation du personnel sur les administrations et les prélèvements sur carnivores domestiques
- Formation professionnelle
Chiens : 140
Former du personnel aux prélèvements et aux administrations sur carnivores domestiques : 160 chats et 140 chiens vont être utilisés, 40 d'entre eux anesthésiés puis tués avant tout réveil, les 260 autres subissant des procédures d'un niveau de souffrance léger avant d'être gardés vivants pour être réutilisés. Les stagiaires s'exercent à la contention, aux prises de sang et aux injections sous-cutanées, intrapéritonéales, intraveineuses, orales, intranasales, oculaires et auriculaires, à raison d'une à trois séances par semaine. Un même animal peut être utilisé jusqu'à trois fois par geste, cinq fois pour la voie auriculaire, et la voie intracardiaque sert à la fois au prélèvement et à l'injection du produit qui le tue. Le porteur affirme qu'aucun effet insupportable n'est prévu, tout en décrivant les gémissements, les sursauts et les hématomes possibles quand une technique n'est pas encore maîtrisée.
Objectifs
Il est essentiel que toute personne travaillant avec des animaux suive un programme de formation initial, ainsi qu'une formation continue régulière. Cette approche garantit que les individus sont qualifiés et compétents dans leur manipulation des animaux, ce qui est crucial pour assurer leur bien-être. De plus, toute nouvelle technique ou procédure requiert une formation spécifique avant sa mise en pratique, afin de maintenir des normes élevées de compétence et de qualité dans les gestes réalisés. Ces pré-requis sont indispensables pour garantir le respect et le bien-être des animaux impliqués.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ces formations sont étroitement liés aux principes des 3R : 1- Raffinement : La formation du personnel permettra de réduire le stress, l'inconfort et la durée des manipulations sur les animaux. En acquérant des compétences techniques solides, le personnel sera en mesure d'effectuer les gestes de manière plus douce et précise, ce qui contribuera au bien-être des animaux impliqués. 2- Réduction : En assurant que le personnel est qualifié dès le départ et en maintenant leur compétence tout au long de leur carrière, on maximise les chances que les études soient menées correctement du premier coup. Cela réduit la nécessité de répéter les expériences, ce qui entraîne une limitation du nombre d'animaux utilisés à des fins expérimentales. Ces bénéfices se traduiront par une amélioration globale de la qualité des études menées, avec des résultats fiables et reproductibles. De plus, en mettant l'accent sur la qualification du personnel, on garantit une approche plus éthique et responsable dans l'utilisation des animaux à des fins de recherche.
Procédures
Dans le cadre de la formation du personnel, les animaux seront utilisés pour l'apprentissage, la manipulation, la contention, l'administration de substances par différentes voies, et les prélèvements sanguins. Le personnel se formera également à l'anesthésie et à l'euthanasie des animaux. Les animaux seront vigiles pour les prélèvements ou les administrations dont l’injection d’anesthésique serait plus douloureux que le geste technique lui-même (prélèvement sanguin ou administrations sous-cutanée par exemple. Les séances de formation seront de 1 à 3 par semaine avec les temps par geste techniques suivants: Pour les prélèvements de sang: 5 min par prélèvement, un même animal pourra être utilisé au maximum 3 fois en respectant les volumes (24h), administration intra-péritonéale: 10 min par administration, un même animal pourra être utilisé au maximum 3 fois en respectant la récupération d’une semaine entre 2 prélèvements, administration intra-veineuse: 10 min par administration, un même animal pourra être utilisé au maximum 3 fois en respectant les temps de récupération (>24h), administration orale: 5 min par administration, un même animal pourra être utilisé au maximum 3 fois en respectant les temps de récupération (>24h), administration intra-nasale: 10 min par administration, un même animal pourra être utilisé au maximum 3 fois en respectant les temps de récupération (>24h), administration dans le cul-de-sac conjonctival: 10 min par administration, un même animal pourra être utilisé au maximum 3 fois en respectant les temps de récupération (>24h), administration intra-auriculaire: 1 min par administration, un même animal pourra être utilisé au maximum 5 fois (1 fois par jour). Pour la voie intracardiaque, 10 min pour le prélèvement et l'administration de l’euthanasiant. Chaque administration ou prélèvement par cette voie se fera de façon unique.
Impact sur les animaux
Il est essentiel de souligner qu'aucun effet insupportable pour l'animal n'est prévu lors des formations. Cependant, il est possible qu'au cours de l'apprentissage, une technique non encore maitrisée provoque un inconfort chez l'animal. Cela peut se manifester par des signes de stress (comme des gémissements), des comportements anormaux (comme des sursauts) ou des manifestations physiques (comme des hématomes). Dans ce cas, le formateur a l'autorité d'interrompre immédiatement la séance pour le bien-être de l'animal. Une attention particulière et un suivi rigoureux, avec des limites clairement définies, sont mis en place pour prévenir toute souffrance inutile et assurer le bien-être des animaux tout au long de la procédure.
Devenir
Les animaux dans la procédure sans réveil sont mis à mort à la fin de la procédure. Tous les autres animaux sont gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, après avis du vétérinaire désigné et de la structure chargée du bien-être animal, prenant en compte un temps de repos suffisant en fonction de la procédure qui a été effectuée sur l'animal, ainsi que leur état de santé et des possibilités de réutilisation.
Remplacement
Bien que les méthodes alternatives telles que les vidéos de contention et de manipulation, les planches anatomiques, les mannequins ou les peluches apportent une valeur éducative importante, elles ne peuvent pas toujours reproduire les réactions comportementales spécifiques ou les particularités anatomiques d’un animal vivant. Nous reconnaissons la nécessité d'utiliser des animaux vivants dans certaines formations pour assurer que le personnel soit bien préparé à répondre aux besoins réels et variés qu'ils rencontreront. Cela permet de former les personnes dans des conditions réalistes et comparables à celles rencontrées lors des futurs besoins en étude, assurant ainsi une formation adéquate et efficace.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu pour ce projet a été déterminé avec une précision rigoureuse, en s'appuyant sur une analyse rétrospective de la dernière autorisation de projet et des projections quantifiées concernant les besoins de formation pour les cinq prochaines années. Dans un souci d'éthique et de responsabilité scientifique, nous nous engageons à réduire au maximum l'utilisation des animaux. Pour optimiser cette réduction, chaque acte technique pourra être répété sur le même animal, à condition que celui-ci satisfasse à tous les critères de bonne santé et de récupération complète après les interventions antérieures. Cette méthodologie vise à minimiser la souffrance animale tout en assurant la validité scientifique et la qualité des formations dispensées.
Raffinement
Nous mettons tout en œuvre pour garantir le bien-être des animaux impliqués dans nos formations. Seuls des animaux en bonne santé sont inclus, et ils vivent dans des conditions optimales respectant les plus hauts standards de bien-être animal, incluant une température contrôlée, des espaces adéquats, et des groupes sociaux harmonieux. Nous leur offrons un environnement enrichi qui répond à leurs besoins comportementaux naturels, leur permettant de mordre, de grimper, se cacher et jouer ensemble via des périodes allouées aux jeux. Avant toute manipulation, nous instaurons une phase d'acclimatation pour réduire le stress des animaux. Durant cette période, les animaux et les formateurs apprennent à se connaître, favorisant une socialisation bénéfique. De plus, lors des procédures, la santé des animaux est surveillée quotidiennement par du personnel qualifié, avec des analgésiques disponibles si besoin et des points limites précis et spécifiques mis en place pour garantir leur bien-être. Lors de la formation aux techniques d'administration de produits, nous commençons toujours par utiliser des produits neutres, comme du sérum physiologique, avant de passer à d'autres substances telles que les anesthésiques. Cette méthode garantit non seulement la rigueur scientifique de nos procédures, mais aussi le respect et le bien-être des animaux tout au long du projet
Choix des espèces
Il s'agit de toutes les espèces de carnivores domestiques notées dans l'agrément et utilisées au sein de l'unité animale. Animaux sevrés (à partir de 8 semaines d’âge) et adultes peuvent être utilisés car représentés dans les études. Il est utile de se former sur de jeunes animaux sevrés, car les techniques de prélèvement, notamment, peuvent être plus difficiles à réaliser du fait du petit format des animaux
Développement de la thermométrie ultrasonore en vue des traitements par ultrasons focalisés à haute intensité des tumeurs cancéreuses
- Recherche appliquée
- Cancers
12 cochons de 40 kg vont être anesthésiés quatre heures durant, l'abdomen ouvert, et tués avant tout réveil. Une sonde à ultrasons est mise en contact direct avec le foie, le pancréas et la rate, puis chauffe les tissus jusqu'à provoquer une nécrose locale, l'objectif étant de valider un thermomètre pour les traitements par ultrasons focalisés. Le porteur qualifie ces traitements d'indolores et situe le risque du côté de l'anesthésie et des troubles du rythme cardiaque. Le développement du dispositif a été mené par simulation informatique, essais in vitro et essai sur cadavre de porc, mais il affirme qu'une vérification in vivo reste "indispensable" parce que la circulation sanguine modifie la température des tissus.
Objectifs
La destruction de tumeur par application d’ultrasons focalisés existe depuis les années 80 et est largement utilisée pour le cancer de la prostate par exemple. Ce projet vise à créer une technique de vérification du traitement par ultrason de haute intensité utilisé pour détruire les tumeurs cancéreuses. Ce traitement fait augmenter la température localement pour tuer les cellules cancéreuses. Cette technique permettra de vérifier que la température est suffisamment élevée dans la zone ciblée pour s’assurer de l’efficacité du traitement.
Bénéfices attendus
En cas de succès, les résultats de ce projet permettront un contrôle sûr du ciblage et de l’avancement d’un traitement des tumeurs par ultrasons et de l’étendu de la zone traitée. Il permettra à moyen terme d’être implémenté sur les traitements déjà réalisés en clinique ou en cours de développement (traitement du cancer de la prostate, des tumeurs pancréatiques ou des métastases hépatiques par exemple). Ainsi, ces traitements pourront être améliorés de manière à éviter les surtraitements, améliorer leur sécurité et à s’assurer en temps réel de la destruction complète de la tumeur. Cela devra permettre une amélioration globale de leur efficacité et d’ouvrir la voie à des traitements de nouvelle génération.
Procédures
Une anesthésie avec une injection dans le muscle de la cuisse de quatre heures aura lieu (45 min de préparation de l’animal, 10 minutes pour l’ouverture de l’abdomen, trois heures pour les positionnements de la sonde, les mesures). Lors de cette anesthésie une chirurgie sera pratiquée : une ouverture de l’abdomen pour mettre la sonde en contact avec des organes (foie, pancréas, rate, ). Ces interventions sont réalisées dans le cadre de procédures sans réveil.
Impact sur les animaux
Au moment de la prémédication, certains porcs sont stressés. Lors des chirurgies, des troubles du rythme cardiaque pourraient être observés à cause d’hémorragie (très peu probable) ou à cause de mauvaises réactions médicamenteuses. Les traitements ultrasonores envisagés dans le pancréas, dans le foie et la rate sont indolores et génèrent une nécrose de coagulation locale mais sans générer de lésion des tissus avoisinants.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car les organes seront prélevés pour des tests ex vivo.
Remplacement
Toute la partie développement du système de monitoring de la température a été effectuée grâce à des simulations informatiques et des essais in vitro. Cependant, l’hémodynamique de la perfusion qui n’est pas possible de recréer in vitro ou ex vivo actuellement, a un effet important sur la température des tissus. Il est donc indispensable de vérifier le dispositif in vivo.
Réduction
Un essai sur cadavre de porc a permis d’affiner la stratégie de positionnement de la sonde avant d’avoir recours à des animaux vivants. Il est possible d’effectuer 3 traitements (sites) sur le foie, 1 sur le pancréas et plusieurs sur la rate. Les organes d’intérêt étant le foie et le pancréas (car organes touchés par le cancer), le nombre d’animaux a été déterminé sur la possibilité de lésions de ceux-ci. Ce projet ne nécessite pas d’étude statistique car c’est une preuve de concept. Les dates de réalisation des procédures expérimentales seront décalées dans le temps pour améliorer le dispositif si nécessaire. La procédure sera arrêtée dès que l’objectif sera atteint.
Raffinement
Une analgésie est appliquée en combiné avec l’anesthésie. L’anesthésie est réalisée via un prolongateur ce qui évite d’avoir à effectuer une contention de l’animal. Outre la mise à disposition d’objets à mâchouiller et d’un ballon, les techniciens animaliers disposent d’un temps de jeu, d’échange avec les porcs, leur mettent à disposition des friandises dans la litière pour qu’ils puissent exprimer leur comportement naturel de fouissage. Ils sont régulièrement sortis de leur box pour pouvoir courir dans un plus grand espace de l’animalerie. Lors de l’ouverture de l’abdomen, une combinaison d’anesthésique et d’analgésique sera administrée en intraveineux. Des points limites détaillés et clairs sont définis.
Choix des espèces
La taille du porc permet l’utilisation de dispositif médicaux adapté à l’homme ce qui est le cas ici. Les porcs pèseront 40 kg, ce qui correspond à une taille suffisante par rapport à la taille de la sonde qui est prévue pour l’homme.
Formation et validation de la méthode de prélèvement de liquide synoviale et d’administration intra-articulaire chez le rat et le chien pour une application dans des études de toxicologie réglementaire
- Formation professionnelle
Chiens : 10
40 rats et 10 chiens vont être utilisés dans ce projet, les rats opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les chiens réutilisés ensuite dans d'autres procédures. Chaque chien peut subir quatre prélèvements de liquide synovial au genou, deux par articulation, plus deux injections intra-articulaires par genou, le tout sous anesthésie, avec un risque de gonflement, de douleur articulaire et d'infection. L'objectif déclaré est de former le personnel à ces gestes pour des études de toxicologie réglementaire préalables à la mise sur le marché de médicaments et de dispositifs médicaux. Le porteur ajoute que l'apprentissage sur ces deux espèces permet de transposer les compétences aux primates non humains, dont l'utilisation à des fins de seule formation n'est pas réglementaire.
Objectifs
L’établissement utilisateur est spécialisé dans la recherche pré-clinique et effectue des études de toxicologie et pharmacologies réglementaires (Bonnes Pratiques de Laboratoire, textes ICH M3(R2) et ICH S3A) indispensables à la mise sur le marché de médicaments, vaccins, dispositifs médicaux, thérapies, etc. Ce type d’études requièrent une qualification au poste et aux gestes techniques réalisés, afin de garantir la qualité des résultats et la validité des études, un objectif synergique des exigences 3Rs. Pour que ces études soient menées par du personnel qualifié, la formation initiale et continue du personnel aux nombreuses techniques de prélèvements et d’administration est primordiale. Ce projet a pour objectif de valider la faisabilité de l’administration intra-articulaire et du prélèvement de liquide synoviale chez le rat, ainsi que former le personnel à ces deux actes chez le chien afin de pouvoir l’effectuer dans le cadre d’étude de toxicologie et de pharmacologie réglementaire.
Bénéfices attendus
Ce projet assure la validation de l’injection intra-articulaire et du prélèvement de liquide synoviale chez le rat et la formation pratique à ces 2 gestes chez le chiens pour personnel concepteur et/ou réalisateur de procédures expérimentales afin de garantir la maitrise des gestes techniques nécessaires à la qualité des données expérimentales (précision, reproductibilité) et les respects des exigences 3Rs de réduction (liées à la qualité des études) et de raffinement (impact minimum des gestes techniques sur le bien-être des animaux : en particulier stress, anxiété, douleur) dans le cadre d’études pré-cliniques.
Procédures
Dans ce projet, les chiens peuvent être soumis à 4 prélèvement de liquide synovial (2 par articulation du genou), avec au moins 3 jours de repos entre 2 prélèvements et jusqu'à une semaine pour une même articulation. Ces prélèvements se font systématique sous anesthésie. Les rats peuvent être soumis à des prélèvements intra-articulaires terminaux uniquement (sous anesthésie, sans réveil) Chez ces deux espèces, deux injections intra-articulaire sous anesthésie par articulation du genou peuvent être faite avec au moins 1 semaine d'intervalle pour une même articulation et 3 jours entre 2 articulations afin de s'assurer de l'absence d'effets délétères de l'injection.
Impact sur les animaux
L’injection ou le prélèvement de liquide synovial peut entrainer un gonflement, une douleur au niveau de l’articulation, ou encore une infection si les conditions d’asepsie ne sont pas respectées.
Devenir
La procédure est une procédure légère : les animaux peuvent donc être ré-utilisés dans d'autres procédures, afin de réduire le nombre total d'animaux utilisés. Cette re-utilisation se fait sur décision vétérinaire prenant en compte l'ensemble des procédures dans lesquels l'animal a été et va être impliqué.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles satisfaisants des articulations des rats et des chiens qui permettraient de ne pas utiliser d’animaux pour pratiquer ces deux gestes. Le recours à l’utilisation d’animaux de formation est donc nécessaire afin de maitriser les bons gestes in-vivo avant la manipulation et la réalisation d’actes sur des animaux d’étude. Cela permet également de suivre l’état clinique de l’animal à postériori de la formation, indiquant la bonne réalisation du geste ou non. L’utilisation de rats euthanasiées dans le cadre d’autres procédures ou une procédure sans réveil seront faites avant le passage à l’animal vivant.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux à commander spécifiquement en vue d’être utilisé pour ce projet, les animaux non euthanasiés ou non utilisés en fin d’étude et les animaux sentinelles seront réutilisés en 1er intention. De plus, afin d’optimiser l’utilisation de chaque animal et de réduire le nombre d’animaux de formation, les deux articulations du grasset pourront être utilisées deux fois chacune, avec au moins 3 jours d’intervalles entre 2 articulations et 1 semaines pour une même articulation afin de s’assurer de l’absence d’effet délétère. Enfin, lorsque cela est possible, les 2 gestes techniques (prélèvement de liquide synoviale et injection intra-articulaire) seront réalisés sur la même articulation, réduisant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Tout lot de rats ou tout chien inclus dans ce projet fait l’objet d’un examen et d’une approbation du service vétérinaire afin de s’assurer du bon état de santé de chaque individu et, si besoin, d’exclure du projet ceux jugés inaptes à une utilisation en formation. Une traçabilité des animaux utilisés en formation est assurée, comme pour toute autre utilisation, et enregistrée comme toute autre utilisation des animaux sur le site, ce qui en permet le suivi et l’analyse en réunion SBEA. Chaque animal utilisé possède une fiche individuelle sur laquelle est documentée, à chaque utilisation, le(s) type(s) de gestes techniques pratiqué(s) en précisant les volumes d’administration et de prélèvement, les produits administrés, etc), ainsi que l’identification du collaborateur en formation et du tuteur présent lors de la session. Ces fiches individuelles sont consultables par le service vétérinaire et la SBEA dans le cadre du suivi de l'utilisation des animaux en formation. La ré-utilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales de gravité réelle ‘’légère’’ ou ‘’modérée’’ permet l’utilisation d’animaux habitués à la contention et à la réalisation des gestes techniques, ce qui contribue à une diminution du stress de l’animal avant sédation. Enfin, le passage à la réalisation d’un geste technique sur l’animal vivant peut d’abord se faire sans réveil (pour les rats), afin de s’assurer de la bonne maitrise du geste et réduire au maximum le risque d’apparition de nuisances au réveil de l’animal. Les animaux sont hébergés collectivement. Cependant, un isolement pourra être effectué pendant 24h suivant la réalisation des gestes techniques afin de mieux observer l’apparition d’effets délétères. Cet isolement ne sera que physique, et fera l’objet d’enrichissement supplémentaires (ajout d'un jeux/objet supplémentaire non présent au quotidien dans les box d’hébergement, ainsi que des friandises cachées dans des copeaux propres). Tous les animaux hébergés dans l’établissement font l’objet d’un suivi quotidien. Les chiens font l’objet de sessions régulières d’habituation aux manipulations et contentions effectuées dans le cadre des études pré-cliniques, encadrées par un programme de training mis en place et suivi par la SBEA.
Choix des espèces
Ce projet est préliminaire à la réalisation d’études de toxicologie réglementaires (ICH M3(R2) et ICH S3A) in vivo chez le rat et le chien, il est donc important que le personnel soit formé sur ce type d’espèces. De plus, l’apprentissage de gestes techniques sur ces espèces permet ensuite de transposer les compétences acquises à d’autres espèces comme les primates non humains qui sont essentiels dans la recherche biomédicale mais dont l’utilisation dans un cadre de formation uniquement n’est pas règlementaire. L’âge des animaux utilisés dans la formation sera proche de l’âge des animaux lors des études. Pour les Rongeurs, à partir de 8 semaines, et pour les chiens à partir de 6 mois.