Procédures sans réveil

93 rats porteurs de la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, 36 d'entre eux étant anesthésiés puis tués sans reprendre conscience, les 57 autres subissant des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon leur groupe, ils reçoivent jusqu'à huit injections, subissent jusqu'à deux anesthésies générales d'une heure, une pose de cathéter, une scintigraphie et une IRM. Le but est de vérifier si la fibrose du cœur, première cause de décès chez les patients, se détecte par scintigraphie avant d'être visible autrement. Le porteur écarte le chien, modèle "gros animal" jugé lourd à manipuler, et la souris, qui ne reproduit la maladie que partiellement, et retient le rat comme intermédiaire.

Objectifs

La maladie de Duchenne est une maladie incurable causée par des mutations génétiques entraînant une maladie grave et progressive affectant les muscles. Les principaux symptômes de la maladie de Duchenne sont une fonte et une faiblesse musculaire associées à des anomalies cardiaques et respiratoires, conduisant finalement au décès des patients au cours de la troisième décennie de leur vie. L'insuffisance cardiaque est la principale cause de décès chez les patients. Bien que la cause cellulaire principale soit la mort des cellules cardiaques, il devient de plus en plus évident que d’autres cellules contribuent largement à la gravité et à la progression de la maladie, en particulier les cellules de fibrose. La fibrose cardiaque, entrainant une rigidité du cœur, apparaît en effet à un stade précoce de la maladie. Dans cette étude, nous visons à évaluer si les lésions précoces associées à la fibrose du cœur dans un modèle de rat de la maladie de Duchenne peuvent être détectées par scintigraphie non invasive. L'apparition de la fibrose dans le cœur sera également suivie non invasivement par imagerie de résonance magnétique. Si l'hypothèse testée dans cette étude est confirmée, la scintigraphie pourrait émerger comme marqueur précoce pour l'évaluation de nouveaux traitements dans la maladie de Duchenne, à la fois dans les modèles animaux et chez les patients.

Bénéfices attendus

Si l'hypothèse de ce projet est confirmée, le protocole de scintigraphie développé pourrait émerger comme indication précoce pour le suivi de la fibrose du cœur et l'évaluation de nouveaux traitements à la fois dans la maladie de Duchenne, mais aussi pour d'autres pathologies cardiaques, dans des modèles animaux et chez les patients.

Procédures

Un premier groupe de rats subira : Injection sous-cutanée vigile (

Impact sur les animaux

Les rats utilisés sont atteints de la maladie de Duchenne. Cependant, les animaux utilisés auront au maximum 5 mois, donc avant l'âge critique où leur état de santé se dégrade. Les seules interventions prévues qui ne se feront pas sous anesthésie générale sont les injections nécessaires à l'anesthésie des animaux. Cela peut générer un stress du à la manipulation des animaux et de la douleur au point d'injection. Les anesthésies générales peuvent causer de la fatigue.

Devenir

A l'issue de ce projet, tous les animaux seront mis à mort afin d’obtenir des échantillons de tissus qui seront utilisés pour des analyses ex vivo nécessaires au projet.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de modèle alternatif pour tester les méthodes non invasive de détection du développement de la fibrose du cœur dans la maladie de de Duchenne. Le développement de fibrose musculaire est un processus physiologique global faisant interagir différents types cellulaires, éventuellement issus de différents organes. De plus, les méthodes de détection testées dans ce projet sont des méthodes d'imagerie médicale que nous voulons appliquer ensuite chez l'être humain. Ce projet ne peut donc pas être réalisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été évalué à l'aide d'un logiciel d'aide à l'expérimentation animale, proposant un outil de calcul statistique. Les groupes ont été établis de façon à ce que les résultats obtenus soient suffisants statistiquement pour conclure sur la bonne détection de la fibrose par nos méthodes d'imagerie. Le nombre d'animaux obtenu est cohérent avec nos expériences précédentes de protocoles d'imagerie lors desquels nous avons pu obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Les données générées seront ensuite analysées à l'aide de tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les méthodes d'imagerie que nous utiliserons dans ce projet sont non invasives et non douloureuses. Elles nécessitent l'anesthésie des animaux afin qu'ils restent immobiles pendant l'examen. Afin de prévenir au maximum la souffrance et le stress infligés aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance régulière par les expérimentateurs. Des points limites ont été établis dans les différentes procédures, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Le bien-être animal passera également par de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu.

Choix des espèces

Le rat modèle de la maladie de Duchenne possède comme les patients une mutation d'un gène essentiel au fonctionnement des muscles. Les autres espèces utilisées comme modèle de la maladie de Duchenne, la souris et le chien, présentent des limites. Le chien présente une évolution de la maladie proche de celle des patients, mais est un modèle "gros animal" lourd à manipuler. La souris ne reproduit que partiellement la maladie. Le rat est donc un modèle intermédiaire avec un bon reflet de la pathologie humaine, tout en présentant moins de limitations. Dès l’âge de 1,5 mois, les rats modèle de la maladie de Duchenne présentent les premières anomalies dans leurs muscles. A 3 mois d’âge, ces anomalies sont bien développées mais pas encore détectables sans biopsie. A 5 mois d’âge, la fibrose du cœur est suffisamment développée pour être observable en imagerie par résonance magnétique. Les catégories d'âge choisies (1,5 mois, 3 et 5 mois) devraient nous permettre d'observer la fibrose à 5 mois et de tester sa détection à des stades de développement plus précoces. Ce planning nous garantira de pouvoir effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre l'âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère (au-delà de 8-9 mois).

Quatre à huit heures d'anesthésie générale par animal, dans un même temps opératoire : 99 porcs vont être utilisés, dont 63 opérés puis tués avant tout réveil et 36 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse histologique des organes opérés. Chacun subit la pose d'un cathéter dans la veine de l'oreille, une intubation, un scanner et des endoscopies hautes ou basses. Trois dispositifs de fermeture endoscopique sont évalués en vue d'une demande de mise sur le marché et d'essais chez l'humain, le porteur rappelant que les autorités sanitaires imposent ces études animales. Il note que l'absence de réveil permet "d'augmenter le nombre d'essais sur un même sujet", et retient le porc charcutier de 30 à 50 kilos pour sa taille et parce que l'espèce est "communément acceptée par les agences de régulation".

Objectifs

L'objectif de du projet est d’évaluer la sécurité et la performance de 3 dispositifs de fermeture endoscopique permettant de traiter des lésions muqueuses et d’en favoriser la cicatrisation dans les voies gastro-intestinales supérieures et inférieures, selon différents états tissulaires, dans un modèle porcin.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons démontrer par cette étude que ces nouveaux dispositifs endoscopiques de fermeture sont au moins, si ce n’est plus, efficaces que les systèmes déjà existant sur le marché, et qu’ils peuvent être utilisé en sécurité chez le patient pour diverses applications comme la résolution de lésions muqueuses dans le traitement chirurgical de cancers digestifs, la fermeture de perforations digestives, l’ancrage de prothèses digestives et le traitement de l’obésité par gastroplastie.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents gestes, qui après l’injection intramusculaire d’anesthésiant, seront tous réalisés sous anesthésie générale dans un même temps opératoire de 4 à 8 heures : Pose d’un cathéter dans la veine de l’oreille Intubation orotrachéale Imagerie scanner Endoscopie par voie haute et/ou basse

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les animaux sans réveil sont liés à l’induction de l’anesthésie : stress à la contention, injection intramusculaire. Pour les animaux en suivi en chronique, le réveil de l’anesthésie peut s’accompagner de nausées, désorientation, hypothermie, irritation trachéale. Dans de rares cas, l’intervention endoscopique peut entrainer les complications suivantes : saignement digestif, ulcère, perforation, infection.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des analyses histologiques sur les organes opérés.

Remplacement

Les dispositifs sont destinés à fermer des incisions muqueuses et permettre la cicatrisation des lésions. De nombreux tests sur tissus synthétiques et organiques ont déjà été réalisés. Le modèle « Bloc estomac + œsophage isolé » permet de reproduire une partie de la géométrie humaine et de tester le comportement mécanique des instruments. Des lésions sous muqueuses/perforations peuvent être réalisés dans ces organes explantés, ainsi que des simulations d’ancrage et de suture. Ce modèle permet d’analyser le comportement et l’interaction des clip avec les différentes couches du tissus muqueux. Mais les études ex-vivo ne suffisent pas pour recréer l’environnement biologique exact et valider la performance et la sécurité des clips avant leur utilisation chez les patients. Le comportement mécanique du tissu digestif est très complexe in vivo, il réagit différemment à l’apposition de clip/sutures (élasticité, résistance au déchirement, rapports avec les autres organes, saignements, péristaltisme, réaction inflammatoire, présence de contenu gastrique). De plus, l'évaluation du processus de cicatrisation nécessite un organisme vivant intégré pour suivre l’évolution des tissu et la libération progressive des clips, attendue après plusieurs jours, au rythme du renouvellement muqueux naturel. Nous avons aussi une obligation réglementaire, émanant des autorités de contrôles sanitaire de réaliser des études non cliniques sur animaux lorsqu'il est prévu d’utiliser un dispositif dans un organisme humain. Les données d'études animales qui seront recueillies dans le cadre de ce projet visent à démontrer que les dispositifs sont suffisamment sûrs pour étayer une demande de mise sur le marché et pour démarrer des essais chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit eu mieux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs et conclure sur la fiabilité et l’efficacité des dispositifs. L’approche aigue permet de réaliser un grand nombre d’ablations et de démontrer la performance des dispositifs, les animaux n’étant pas réveillés, il est possible d’augmenter le nombre d’essais sur un même sujet. Les essais seront réalisés successivement sur de petits lots d’animaux sans réveil, permettant ainsi de vérifier et d’améliorer les systèmes avant d’engager les tests chroniques.

Raffinement

Les porcs sont hébergés en groupe social, dans un box enrichi de jouets, avec une période d’acclimatation avant l’opération. Ils reçoivent de l’eau ad libitum et une alimentation adaptée, ils sont mis à jeun la veille de l’anesthésie. Toutes les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale, sous couverture antalgique et monitoring des fonctions vitales. Un médecin expert en endoscopie réalise les gestes spécifiques liés au déploiement et à l’utilisation des dispositifs. Les animaux en survie seront étroitement surveillés jusqu’à leur réveil et durant les jours suivant l’intervention. Une vidéosurveillance 24h/24 permet un suivi visuel des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie. Une grille d’évaluation de la douleur est établie avec la conduite à tenir en cas de complications. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance.

Choix des espèces

Parmi les différentes espèces animales, le porc est souvent l’espèce de choix pour les études impliquant de la chirurgie en raison de sa grande taille et de ses similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme. Pour ce projet, le porc, espèce monogastrique, est un bon modèle de l’anatomie viscérale, l’accès au tractus digestif haut ou bas se fait avec le même type d’endoscope que chez les patients. Cette espèce est de plus communément acceptée par les agences de régulation et la communauté scientifique pour les études sur les dispositifs médicaux. Un porc charcutier de 3 à 4 mois, qui pèse entre 30 et 50 Kg, nous permet d’avoir un modèle digestif pertinent pour réaliser des interventions endoscopiques dans les mêmes conditions que chez le patient (taille des instruments, volumes des segments digestifs, voies d’abord, ergonomie, orientation…).

Identifiées par ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, 1 320 souris subissent ensuite jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de leur vie, sur animal vigile sous contention. 880 sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Le porteur qualifie la biopsie de phalange de non douloureuse au motif que les fibres nerveuses ne sont pas encore myélinisées à cet âge, et écrit que ces procédures n'entraînent "généralement pas de souffrance", tout en listant les signes qui déclenchent une mise à mort immédiate : posture inhabituelle, poil hérissé, dos voûté, retrait des congénères. Les souris dont le gène est inactivé dans l'intestin peuvent développer des diarrhées et des troubles de la croissance, et toutes sont tuées pour prélèvement d'organes.

Objectifs

L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.

Procédures

Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).

Impact sur les animaux

Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée, ces animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.

Devenir

Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes

Remplacement

Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.

Réduction

Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.

Raffinement

Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.

Toute souris qui montre une posture inhabituelle, le poil hérissé, le dos voûté ou un retrait de ses congénères est sortie de l'étude et tuée immédiatement. 1 320 souris vont être utilisées, 880 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Chaque animal est identifié par l'ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, puis peut subir jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de sa vie, sur animal vigile sous contention. Le porteur indique que les souris produites servent d'abord au maintien des lignées et à la fabrication des cohortes nécessaires aux expériences, pour un gène dont il annonce ne pas connaître précisément le rôle.

Objectifs

L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.

Procédures

Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).

Impact sur les animaux

Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Les animaux issus des croisements sont identifiés amputation de la première phalange. Cette procédure est réalisée entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Le prélèvement de la biopsie est alors non douloureux. La phalangectomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.

Devenir

Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes

Remplacement

Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.

Réduction

Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.

Raffinement

Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.

Sous anesthésie générale, 18 lapins blancs de Nouvelle-Zélande âgés de 5 à 6 semaines subissent un lavage broncho-alvéolaire qui provoque une détresse respiratoire, pour reproduire la maladie des membranes hyalines du prématuré. Au total, 36 lapins vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, déclarées pour partie sans réveil et pour partie d'un niveau de souffrance modéré : tous reçoivent du surfactant, et des acquisitions IRM de 30 minutes sont prévues. Les essais doivent valider EndoSurf, un dispositif qui atomise le surfactant par endoscopie, face à la méthode LISA employée chez les nouveau-nés prématurés. Les lapins chez qui la maladie est induite sont tués, et les 18 autres sont gardés en vie et "proposés à l'adoption dans la mesure du possible", sans que le texte dise ce que deviennent ceux qui ne trouvent pas d'adoptant.

Objectifs

L’immaturité pulmonaire à la naissance chez les nouveau-nés prématurés (maladie des membranes hyalines) requière l’administration de surfactant exogène peu après la naissance. Les techniques actuelles d’instillation de surfactant, bien que décrites comme “moins” invasives (Less Invasive Surfactant Administration LISA), nécessitent le recours à une laryngoscopie qui reste une procédure douloureuse et traumatisante pour le prématuré et complexe à apprendre et maitriser pour le personnel soignant. La sédation-analgésie représente un challenge pour ces patients, avec la nécessité de prévenir ou diminuer la douleur générée par la laryngoscopie et le besoin de conserver une respiration spontanée efficace. Les objectifs du projet portent sur le développement et la validation d’un nouveau dispositif médical basé sur l’endoscopie et l’atomisation pour l’administration de surfactant exogène chez le nouveau-né prématuré. Les bénéfices escomptés du dispositif sont de i) diminuer la douleur et le recours à une analgésie, ii) améliorer la tolérance clinique et l’efficacité de l’administration (endoscopie et atomisation du surfactant), et iii) avoir une meilleure courbe d’apprentissage que le LISA. Le développement et la validation de l’efficacité et de la sécurité du dispositif EndoSurf repose sur une collaboration multidisciplinaire. Les différentes étapes du projet incluent i) la validation du procédé d’atomisation avec la caractérisation des particules atomisées et les propriétés physicochimiques du surfactant atomisé et l’étude de la distribution pulmonaire dans un modèle ex-vivo, ii) l’étude de la distribution du surfactant et efficacité sur un modèle animal de maladie des membranes hyalines (comparaison avec la méthode LISA), iii) le développement du prototype pour industrialisation et certification pour utilisation en clinique, iv) l’évaluation de la courbe d’apprentissage en laboratoire de simulation médicale et v) une étude clinique pilote sur 20 patients prématurés (comparaison avec une cohorte historique LISA).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la réalisation de ce projet sont la validation d’un nouveau dispositif médical pour le traitement de la maladie des membranes hyalines chez le nouveau-né prématuré. Les bénéfices escomptés de ce dispositif sont d’une part de diminuer la douleur et le traumatisme chez le nouveau-né et de réduire le recours à une analgésie et d’autre part d’améliorer la tolérance clinique et l’efficacité de l’administration (homogénéité et distalité de la distribution du surfactant). Enfin l’utilisation du nouveau dispositif devrait offrir une meilleure courbe d’apprentisassage pour le personnel soignant des services de néonatologie.

Procédures

Une partie des animaux (18) sera soumise à un lavage broncho-alvéolaire pour l’induction d’un modèle de maladie des membranes hyalines. La durée estimée de ce geste est de l’ordre de 20 minutes. L’ensemble des animaux (N=36) seront soumis à l’administration de surfactant exogène. La durée totale de ce geste est estimée à 10 minutes. La durée prévue des acquisitions IRM est de 30 minutes. Tous ces gestes sont réalisés sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont faibles. Les gestes seront réalisés sous anesthésie générale. Pour le modèle de maladie des membranes hyalines, le lavage broncho-alvéolaire induit une détresse respiratoire chez l’animal. Cette détresse respiratoire sera prise en charge aussitôt par l’administration de surfactant pulmonaire exogène. L’acquisition d’images par IRM ne présente pas d’effets indésirables notables. La charte de « transports de moins de 50 km pour les animaux vivants hébergés » sera appliquée.

Devenir

Dans le cas de l’évaluation de la distribution du surfactant selon la méthode d’administration, les animaux seront gardés en vie et proposés à l’adoption dans la mesure du possible. Pour le modèle de la maladie des membranes hyalines, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

La validation du dispositif expérimental d’atomisation du surfactant a été en grande partie réalisée en amont sur des modèles ex-vivo provenant de pièces (poumons de lapin) d’animaux de boucherie. Cette stratégie de remplacement réalisée sur ce modèle ex vivo a permis de valider la faisabilité et la pertinence du nouveau dispositif médical et de comparer ses performances à celles de l’approche clinique standard. Le passage aux études in vivo reste nécessaire et indispensable pour se rapprocher d’une situation clinique où l’ensemble des voies respiratoires est présent avec des poumons fonctionnels, où un modèle des membranes hyalines peut être induit et où l’administration du surfactant peut être évaluée.

Réduction

Le nombre d’animaux à utiliser a été déterminé de façon à répondre aux questions auxquelles ce projet scientifique et médical financé par l’Agence Nationale de la Recherche et soutenu par le service de néonatalogie du CHU de Bordeaux souhaite répondre, à savoir la validation d’un nouveau dispositif médical permettant d’améliorer l’administration de surfactant chez les enfants prématurés. Cette validation passe par l’utilisation de 6 groupes d’animaux. Nous estimons le nombre minimal d’animaux nécessaire à 6 par groupe pour obtenir des résultats permettant de répondre positivement ou négativement aux questions posées dans ce programme de recherche. Des tests statistiques seront utilisés pour valider les résultats. Les mesures qui ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser sont conséquentes puisque qu’un modèle ex vivo utilisant des pièces de boucherie (quarante poumons de lapin) obtenus dans des abattoirs pour l’alimentation humaine a été utilisé en amont, durant plus d’un an, pour mettre en place et valider un certain nombre de points méthodologiques et instrumentaux.

Raffinement

Afin de limiter le stress et l’inconfort de l’animal, le transport et la préhension sont assurés par la même personne et celle-ci s’assure du bien-être et du comportement de l’animal avant et pendant l’expérimentation. Les lapins, par groupe de 6, seront hébergés par deux par cage, dans une batterie de 3 cages, correspondantes aux normes en vigueurs pour des animaux de 5 semaines. La batterie est localisée dans une pièce dédiée spécifiquement, isolée de tout bruit extérieur, régulée par une ventilation adéquate assurant un bon apport d’oxygène et permettant d’éliminer les poussières et les odeurs. Une température de 19 degrés Celsius et une humidité relative comprise entre 45 et 65 % sont également assurées. Chaque cage est constituée d’un plancher à maille pour l’élimination des déjections et le respect des structures ostéo-articulaires des pattes des animaux. Les cages disposent de plates-formes rigides sous et sur lesquels l’animal peut trouver refuge. L’enrichissement est constitué de paille compactée, de barreaux de bois à ronger, et de boite en carton pour s’isoler ou se dissimuler. L’enrichissement alimentaire est constitué de fibres brutes (foin) et de pellets standards et l’eau est accessible par des biberons. L’ensemble des protocoles expérimentaux est réalisé sous anesthésie générale. Un traitement permettant de réduire la douleur ou l’angoisse des animaux sera également appliqué. Un tapis chauffant, permettant de maintenir la température des animaux pendant les procédures et les sessions d’imagerie IRM, est utilisé ainsi que l’administration de gel ophtalmique afin de compenser la sécheresse oculaire. Leurs signes cliniques (température, taux d’oxygène, fréquences cardiaques et respiratoire) seront mesurés en cours de manipulation. Les lapins destinés à l’adoption seront suivis visuellement à leur réveil (apparence physique, comportement, fréquence respiratoire) et, afin de limiter tout inconfort possible post-expérimentation, ceux-ci se verront administrer un traitement pour réduire la douleur, pendant 48h, selon les signes visibles d’inconfort.

Choix des espèces

Le lapin est le modèle animal habituel pour reproduire la maladie des membranes hyalines du nouveau-né prématuré. Dans ce projet, de jeunes (5 à 6 semaines) lapins blancs de Nouvelle-Zélande (poids entre 800 et 1000 grammes) seront utilisés pour se rapprocher des dimensions des poumons chez les prématurés.

Un biomatériel est implanté dans une articulation du membre postérieur de souris pour y installer une infection à Staphylococcus aureus, avec douleurs et gêne à la marche pendant trois à cinq jours. 59 souris sont utilisées, 53 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 6 sous anesthésie sans réveil, toutes tuées pour prélèvement du fémur droit. Le projet vise à comprendre comment s'installe une infection sur prothèse articulaire, complication qui touche environ 1 % des personnes opérées. La description des procédures se limite pourtant à "une seule procédure chirurgicale d'implantation de biomatériel" de trente minutes, alors que la liste des effets attendus va jusqu'à la bactériémie et à la mort prématurée de l'animal.

Objectifs

Mieux comprendre la physiopathologie du processus d’infection ostéo-articulaire tant sur le plan infectiologique que sur le plan du système immunitaire afin de proposer dans un second temps des stratégies innovantes de prévention, diagnostic et thérapeutiques. Les infections des prothèses (matériel étranger) articulaires sont de sérieuses complications qui surviennent chez environ 1% des personnes ayant bénéficié d’une chirurgie de prothèse d’articulation. Elles entraînent des problèmes de santé importants et coûtent cher à traiter, principalement en raison de leur nature chronique difficile à éliminer. De plus, avec le vieillissement de la population, ces infections deviennent de plus en plus fréquentes. Pour mieux les combattre, il est crucial de comprendre les mécanismes qui les sous-tendent, notamment la persistance des bactéries, leur résistance aux traitements et la perte osseuse associée. La recherche dans ce domaine est complexe en raison des interactions multiples entre les bactéries, l’os, les matériaux prothétiques et les cellules du système immunitaire. Il n’est pas possible d'étudier ces interactions en temps réel dans des cellules in vitro, dans des modèles ex vivo ou dans des études cliniques chez l’homme car l'environnement local joue un rôle crucial dans le développement de ces infections et il faut du temps pour confirmer la guérison, des rechutes pouvant survenir plusieurs années après le traitement initial. À ce jour, notre compréhension de la perte osseuse, de l'impact du microbiome local et des réponses immunitaires dans le contexte des infections de prothèses articulaires demeure limitée. Pourtant, développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives efficaces dépend de notre capacité à élucider ces mécanismes complexes. Ce projet va permettre de comprendre les mécanismes qui permettent la mise en place et l’évolution d’une infection sur prothèse articulaire.

Bénéfices attendus

Comprendre l'interaction entre la réponse immunitaire, la formation de biofilm et la perte osseuse impliquée dans la physiopathologie de l’infection de prothèse Générer des hypothèses pour aider à identifier les facteurs influençant le pronostic fonctionnel dans les infections de prothèse chez l’animal afin de les transposer chez homme L’utilisation de ce modèle est génératrice d’hypothèses physiopathologiques concernant les infections subaigues et chroniques de prothèse chez l’homme en vue du développement de nouvelles approches préventive, diagnostique et thérapeutique par des techniques innovantes.

Procédures

Certains animaux sont soumis à une seule procédure chirurgicale d’implantation de biomatériel sous anesthésie générale. Durée prévisible 30 minutes.

Impact sur les animaux

Douleurs du membre postérieur, gène à la marche transitoire pendant 3 à 5 jours, stress lié à la manipulation, douleur de l’introduction de l’aiguille pour l’induction de l’anesthésie, écoulement au niveau de la cicatrice, inflammation de la cicatrice, Possibles mais peu attendus : fièvre, risque d’infection disséminée (bactériémie), mort prématurée de l’animal avant la date prévue de la mise à mort

Devenir

A la fin de l’expérimentation tous les animaux sont mise à mort pour réaliser les prélèvements d’os (fémur droit).

Remplacement

Il n’existe pas de modèle non animal permettant d’étudier la physiopathologie de l’infection de prothèse articulaire, en raison de la complexité du microenvironnement infectieux sur matériel et des interactions entre hôte et pathogène spécifique qui s’exercent sur l’os, le biomatériel et le biofilm bactérien. En effet, l’étude de la mise en place et de l’évolution d’une infection sur un os vivant, vascularisé avec un matériel en place et du biofilm en constitution et engageant un dialogue constant avec le système immunitaire ne peut pas se mimer dans un modèle in silico ou in vitro sur des cellules cultivées ou des fragments osseux. Par ailleurs, l’étude des tissus ex vivo chez l’homme ne permet pas d’analyser en profondeur la physiopathologie pas de l’infection de prothèse articulaire et la mise en place des mécanismes responsables de la chronicisation des infections et de la perte osseuse en raison d’une part de l’hétérogénéité clinique et microbiologique des infections de prothèse articulaire et de la pauvre qualité des prélèvements réalisés lors de chirurgie de lavage ou reprise de prothèse articulaire infectée. De plus, l’utilisation d’un modèle invertébré n’est pas envisageable pour modéliser une infection osseuse sur prothèse car ceux-ci ne disposent pas du système osseux ni immunitaire permettant les analyses nécessaires (cytométrie de flux, histologie) à la compréhension de la physiopathologie de l’infection osseuse sur matériel chez l’homme. De la même manière, l’utilisation d’un modèle d’animaux aquatiques (amphibiens ou poissons) n’est pas envisageable pour modéliser une infection osseuse sur prothèse car ceux-ci ne disposent pas d’un système osseux articulaire ni immunitaire suffisamment proche à l’homme pour permettre une modélisation adéquate.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé pour être le minimum requis pour obtenir des données scientifiquement exploitables en se fondant sur l’étude de la littérature dans les modèles d’infection de prothèse articulaire murin et les données préliminaires du projet PROTHEE Pilote réalisé sur des prélèvements d’os et de membrane chez des patients humains avec des infections de prothèse. Soit un total de 59 animaux. Le calcul des animaux a été réalisé afin d’avoir un nombre représentatif d’animaux dans chaque groupe avec des prélèvements pour l'étude des cellules de l'os d’une part (une partie des animaux) et des prélèvements pour l'étude des bactéries.

Raffinement

Le milieu de vie des animaux sera enrichi par la présence de tube de carton et de matériel pour la confection de nids (coton et igloo), ainsi que par des buchettes en bois à ronger Les souris sont hébergées 6 animaux par cage dans une animalerie spécialisée. Afin de réduire la souffrance animale, les douleurs et l'inflammation après le geste chirurgical le protocole prévoit une administration de médicaments antidouleurs jusqu’à la fin de l’expérimentation. Les animaux seront examinés quotidiennement (matin et après-midi) pour la recherche de points limites nécessitant des actions correctives. Nous avons défini les points limites suivants permettant de noter un score associé aux actions correctives suivantes : 0 Pas d’action 1 Adaptation des pellets , changement / ajout de nourriture pour les animaux au besoin 2 Enrichissement du milieu par ajout d’une structure en plastique (maison ou cube) et de matériel de nidation (serpentin en coton ou lamelles de carton) 3-4 Administration d'antidouleurs >5 Mise à mort Ces points limites et actions correctives sont regroupés en Annexe (Tableaux 1 et 2). Enfin, nous utilisons le plus petit inoculum bactérien possible pour s’assurer que l’impact sur la qualité de vie de l’animal soit minimal et n’entraine pas d’infection disséminée ni de fièvre.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour sa capacité à représenter une alternative représentative et validée d’infection de prothèse [Bernthal et al. PloSOne 2010], et est un des modèles les mieux documentés pour l’analyse de la réponse immunitaire. 12 semaines, il s’agit du stade de développement habituellement utilisé dans la littérature, à cet âge le système immunitaire est suffisamment développé pour être considéré comme mature. [ Bernthal et al. PLoS One 2010; Marriott et al. Bone. 2005; Sokhi et al. J Bone Miner Res. 2022; Prabhakara et al. Infect Immun. 2011; Yang et al. J Bone Joint Surg Am. 2015; Thompson et al. J Bone Joint Surg Am. 2017; Masters et al. PLoS Pathog 2020]