Procédures sans réveil

Pour cartographier les neurones de l'orientation spatiale, 480 souris vont être tuées par perfusion intracardiaque afin que leur cerveau soit prélevé. 250 d'entre elles subissent d'abord une chirurgie stéréotaxique d'une heure, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des dommages osseux et tissulaires puis une attente de deux jours à cinq semaines. Les 230 autres sont anesthésiées et tuées sans avoir rien subi d'autre, leur cerveau servant de matériel pour des enregistrements sur tranches ex vivo. Le porteur renvoie les bénéfices au diagnostic précoce de la maladie d'Alzheimer, de l'épilepsie du lobe temporal et de la sclérose en plaques, loin de l'objet immédiat du projet.

Objectifs

Une meilleure compréhension des fonctions cognitives comme l'orientation dans l'espace et dans le temps est un défi majeur en neuroscience. Le cortex, l’hippocampe, et le thalamus jouent un rôle important dans l’orientation spatiale et la mémoire. Ce circuit est une des premières régions du cerveau affectée dans la maladie d’Alzheimer, et de l’épilepsie du lobe temporale. La myélinisation du circuit peut être déficiente dans le cas de la sclérose en plaque. Ce projet vise à mieux comprendre les aires du cerveau qui sont impliqués dans l'orientation. Notamment, nous étudions ces aires au niveau cellulaire, c’est à dire, au niveau des neurones qui transmettent les signaux. On s’intéresse à leurs propriétés intrinsèques et à leurs propriétés synaptiques, qui ensemble déterminent le fonction du circuit. Notre recherche vise à élucider la connectivité anatomique et fonctionnelle. Nous souhaitons mieux comprendre comment les informations sensorielles de l’oreille interne et les informations visuelles sont intégrées pour permettre l'orientation spatiale de l'individu. Nous examinerons la contribution des interneurones inhibiteurs pour la stabilité et la flexibilité du réseau et de la mise à jour du signal de l'orientation. Et nous allons apporter un éclairage nouveau sur les mécanismes physiopathologiques de la myélinisation du circuit de l'orientation spatiale.

Bénéfices attendus

Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles qui permettent au cerveau de s'orienter dans l’environnement. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment le cerveau est capable d’intégrer les informations sensorielles venant de plusieurs modalités sensorielles, et comment s’effectue la mise à jour de ces informations du monde externe par rapport à une représentation interne. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures du circuit de l’orientation spatiale est nécessaire pour permettre un diagnostic précoce et un traitement des pathologies neurologiques liées à des dysfonctionnements moteurs et à des déficits d'orientation. Une partie du projet vise à déterminer l'impact fonctionnel des oligodendrocytes et de la myéline au niveau physiologique et cellulaire. Il permettra de mieux comprendre le rôle de la myéline pour l'intégration multisensorielle de signaux de différentes régions cérébrales. De plus, chez les patients atteints de sclérose en plaques, maladie inflammatoire démyélinisante chronique du système nerveux central, des troubles cognitifs sont associés à des lésions de régions cérébrales impliquées dans l'intégration multisensorielle. Nos travaux pourront apporter un éclairage nouveau sur les mécanismes physiopathologiques des déficits cognitifs dans la sclérose en plaques.

Procédures

Les 480 souris de cette étude subiront une perfusion intracardiaque. Une partie des animaux (250 souris en total) subiront d'abord une chirurgie (durée 1 heure, surveillance 1 à 3 jours) et après un interval de 2 jours à 5 semaines, une perfusion intra-cardiaque (durée 2-5 minutes). L'autre partie des animaux (230 souris en total) subiront uniquement une perfusion intracardiaque (durée 2-5 minutes). Dans tous les cas, la mort des animaux suit la perfusion intra-cardiaque. Les cerveaux sont prélévé sur animal mort.

Impact sur les animaux

Les injections stéréotaxiques dans le cerveau prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 1 jour, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments.

Devenir

Tous les animaux sont mise à mort par perfusion intra-cardique avec dosage des anesthésiques pour prélèvement d'organes et analyses histologiques.

Remplacement

L’intégration des signaux sensorimoteurs se produit à travers de nombreuses régions du cerveau et différents réseaux de neurones. Afin de comprendre les interactions au niveau neuronal, gliale, et circuit du système de l’orientation spatiale, il est nécessaire de travailler avec des neurones marqués au préalable. Il s’agit d’un projet de physiologie des neurones et des systèmes, qui ne peut être conduit que sur le tissue ex vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, cette étude prévoit d’enregistrer plusieurs neurones sur les tranches issue d’un seul animal. Nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible. Les testes statistiques que nous appliquerons seront adaptés aux analyses. Malgré le fait que nous utilisons des lignées de souris spécifiques, on doit veiller à un nombre suffisant d’animaux pour détecter des possibles sous-populations. Par exemple, deux sous-populations de neurones VIP+ sont décrit dans certaines régions corticales. Le nombre de sous-populations de neurones du thalamus anterieur n’est pas défini à priori. Néanmoins, nous allons réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire pour détecter des potentielles sous- populations.

Raffinement

Les souris sont maintenues par groupes. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est contrôlé avant et après une injection stéréotaxique. Chaque animal bénéficie tout au long de l’étude d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites objectifs sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris a été choisie car en combinant souris transgénique et injections virale nous serons en mesure de mesurer la connectivité anatomique et fonctionnelle dans des populations neurales spécifiques. Les souris transgéniques avec des déficits de la myélinisation sont disponibles, pour clarifier le rôle de la myélinisation pour la maturation des neurones et des circuits. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à l’âge où le système de la direction de la tête est en train de se développer au niveau thalamique et corticale, soit à partir de 12 jours, et jusqu’à 12 semaines (3 mois) pour les animaux les plus âgés, pour connaître les structures myelinisées et matures.

Une semaine d'habituation à la manipulation, puis quatre semaines de tests comportementaux, six ou sept selon le groupe, à raison d'un à trois par semaine. 200 souris génétiquement modifiées pour des protéines du cytosquelette neuronal y sont soumises, dont 96 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 104 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Un groupe est isolé 48 heures pour mesurer son activité individuelle et privé de nourriture quinze à dix-huit heures, l'autre isolé trois jours pour mesurer sa préférence au sucre, le porteur donnant le nombre de tests sans nommer la plupart d'entre eux. Les cerveaux sont prélevés après la mise à mort, ce que le porteur présente comme un moyen de réduire le nombre de souris utilisées.

Objectifs

Parmi les nombreux symptômes des maladies neurodégénératives et psychiatriques on retrouve des troubles de l’apprentissage, de la mémoire ou des difficultés dans la résolution de problèmes. Ces troubles appelés trouble cognitifs, ont un impact important sur la qualité de vie des patients. Il a été démontré qu’une altération des composants du squelette des neurones peut être impliqué dans ces troubles. Ce squelette donne notamment sa forme aux neurones mais participe également activement à la transmission de l’information entre neurones. Il est apparu ces dernières années comme une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour le traitement des maladies psychiatriques et neurodégénératives. L'étude des mécanismes qui régulent ce squelette est donc un sujet de recherche crucial dans le domaine de la neurobiologie. En effet, une meilleure compréhension de sa régulation pourra aider au développement de nouveaux médicaments. Notre objectif est de mieux comprendre le fonctionnement du squelette neuronal en étudiant notamment l’impact d'une très légère perturbation de ce squelette dans l’animal afin d’évaluer les conséquences comportementales et anatomiques.

Bénéfices attendus

Il est maintenant admis que des défauts de communication entre les neurones et/ou des défauts anatomiques sont impliqués dans de nombreuses pathologies neuro-dégénératives et psychiatriques. L'identification des mécanismes moléculaire impliqués apportera de nouvelle cible thérapeutique potentiel

Procédures

Les animaux subiront plusieurs tests de comportement qui permettront de détecter si ils ont des symptômes apparentés à des pathologies psychiatriques ou neurologiques. Les tests de comportements peuvent induire une légère anxiété. Les animaux utilisés pour le comportement seront séparés en deux groupes pour les différents tests. Un groupe participera à 7 tests répartis sur 5 semaines (1 semaine d'habituation puis 4 semaines de tests avec des poses de 1 à 4 jours entre les différents tests) et un second groupe participera à 6 tests également répartis sur 5 semaines (1 semaine d'habituation puis 4 semaines de tests avec des poses de 1 à 4 jours entre les différents tests). Les animaux du groupe 1 seront isolés pendant 48h pour mesurer leur activité individuelle et ceux du groupe 2 pendant 3 jours pour mesurer leur préférence au sucre. Cet hébergement isolé de quelques jours induit un léger stress social. Les animaux du groupe 1 subiront également une privation de nourriture de 15 a 18h qui induit également un léger stress.

Impact sur les animaux

Les souris participant à des tests comportementaux subiront un stress léger. Ces tests se feront sur une durée de plusieurs semaines, avec un à trois tests par semaine et une période d'habituation à la manipulation avant de commencer les tests afin de diminuer l'état de stress des souris.

Devenir

Dans un soucis de réduire le nombre de souris utilisés les cerveaux des souris utilisés en comportement sera prélévé pour des études histologiques et biochimiques

Remplacement

Le cerveau étant un organe extremement complexe Il n'existe aucune alternative à l'animal pour évaluer le volume de chaque région du cerveau et les connections qui existent entre ses différentes régions. D'un point de vue comportemental Il est crucial d'analyser si l'absence, la mutation, d'un gène on un impact global sur les fonctions cérébrales, notamment les capacités de mémoire, d apprentissage, de motivation... L'animal reste actuellement la seule possibilité d'étude pour notre projet.

Réduction

Pour chaque procédure expérimentale le nombre de souris a été évalué au mieux pour permettre une analyse statique fiable et robuste. Nous nous sommes notamment basés sur la littérature. Grâce à une approche statistique le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.

Raffinement

Afin de minimiser le stress des souris impliquées dans les tests comportementaux nous mettrons en place un protocole d'habituation sur une semaine qui permet de diminuer significativement l'état d'anxiété des animaux :les animaux seront manipulés quotidiennement pendant une semaine par les deux expérimentateurs qui seront présent pour les tests afin de diminuer le stress lié à la manipulation et habituer les animaux au manipulateurs. Pour chaque test les animaux seront placés dans la pièce d'expérimentation au moins une heure avant le début des tests. Dans la mesure du possible toute la série de tests sera réalisée dans la même pièce afin de diminuer le stress dû au changement d'environnement. 15 minutes avant les anesthésies les animaux subiront une injection d'antaglique.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau anatomique et fonctionnel des circuits neuronaux. Au niveau des mammifères, l’inactivation de gène ou l’introduction de gènes mutés humains sont classiquement effectuées chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes pour les différents tests de comportements. Pour les études biochimiques et histologiques nous étudierons également des animaux jeunes et âgés, en effet des différences peuvent apparaitre sur des cerveau immature ou au contraire au cours du vieillissement.

Une partie des souris utilisées porte des modifications qui les font développer spontanément des tumeurs : mélanomes chez 25 à 60 % d'entre elles à partir de deux mois, tumeurs de l'ensemble des glandes mammaires après une latence moyenne de 92 jours. 4 372 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour la quasi-totalité, 54 étant tuées sans réveil. Elles reçoivent quatre à six injections sous anesthésie, trois à six injections intrapéritonéales vigiles, des prélèvements de sang à la queue ou en rétro-mandibulaire, et une irradiation de 2 grays ou une injection de busulfan, avec nécrose, ulcération et saignements des tumeurs annoncés. L'élevage croise des femelles sauvages avec des mâles qui ne développent leurs tumeurs mammaires qu'après leur période de reproduction, ce que le porteur compte au titre du raffinement.

Objectifs

L’immunothérapie connaît un grand essor depuis ces dernières années et est de plus en plus utilisée pour traiter différents cancers. Cette thérapie consiste à réactiver le système immunitaire du patient afin qu’il puisse lui-même reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Malgré de nombreux succès cliniques, l’efficacité des immunothérapies est encore limitée à un sous-ensemble de patients répondeurs. Une des principales limites réside dans l’infiltration de la tumeur par les cellules immunitaires. En effet, un faible effet thérapeutique corrèle avec une tumeur dite « froide », c’est-à-dire peu infiltrée et pauvre en cellules immunitaires. Il est donc crucial de comprendre les mécanismes permettant l’infiltration des cellules immunitaires au sein de ces tumeurs et de développer des stratégies pour manipuler ce processus afin de contourner la résistance thérapeutique aux points de contrôle immunitaire (ICB). Ce projet a pour but de développer de nouvelles thérapies capables de remodeler le microenvironnement tumoral afin de rendre répondante une tumeur qui ne l’est pas initialement. Utiliser ces nouvelles thérapies en combinaison avec les immunothérapies déjà existantes pourrait ainsi permettre de surmonter la résistance primaire observée chez de nombreux patients. Ce projet nécessite la modélisation du contexte immunitaire dans des modèles vivants. Au fur et à mesure de l’avancement du projet, des modèles pré-cliniques (tumeurs endogènes et souris humanisées) seront utilisés afin d’imiter au mieux les effets présents chez l’Homme. Ainsi les modèles précliniques permettent de sélectionner les stratégies immuno-thérapeutiques les plus efficaces à tester dans le cadre d'essais cliniques et par conséquent réduire les risques associés aux essais cliniques infructueux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif fondamental d'approfondir notre compréhension des mécanismes sous-jacents à l'infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs solides. En parallèle, il cherche à développer des thérapies innovantes capables de réguler et de maîtriser ce processus complexe. En réalisant cette double démarche, nous espérons ouvrir de nouvelles perspectives dans le domaine de la lutte contre les tumeurs solides, en exploitant ces connaissances pour élaborer des approches thérapeutiques plus efficaces et ciblées. Ces traitements seront conçus pour surmonter la résistance initiale souvent observée vis-à-vis des immunothérapies. Ils agiront en transformant une tumeur qui, au départ, ne répondait pas favorablement envers ces traitements en une tumeur réceptive, permettant ainsi une meilleure efficacité des immunothérapies. Cette approche novatrice vise à contourner les obstacles initiaux et à ouvrir la voie à des réponses positives là où elles étaient auparavant limitées, potentiellement révolutionnant ainsi le traitement des tumeurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à ces types d’interventions : - 4 à 6 injections en intraveineuse/sous-cutanée/intra-tumoral, sur animaux anesthésiés. Cet acte ne dure que quelques secondes. - 3 à 6 injections en intra-péritonéal, sur animaux vigiles. Cet acte ne dure que quelques secondes. - 1 à 3 prélèvements sanguins au niveau de leur queue, sur animaux vigiles. Cet acte dure quelques minutes. - 1 à 3 prélèvements sanguins en rétro-mandibulaire, sur animaux anesthésiés. Cet acte dure quelques minutes. - 1 prélèvement sanguin en rétro-orbital ou rétro-mandibulaire, sur animaux anesthésiés. Cet acte dure quelques minutes et est sans réveil. - 1 injection intra-péritonéale de buprénorphine. Cet acte dure quelques secondes. - 1 à 3 injections intra-péritonéales d’un anesthésique. Cet acte dure quelques secondes. - 1 anesthésie locale par injection sous cutanée d'une solution d’anesthésique. Cet acte dure quelques secondes. - 1 irradiation (générateur X, dose 2 Gy) ou 1 injection de busulfan dilué en solution saline. Cet acte dure quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont particulièrement liés à la croissance tumorale. En effet, l’ensemble des traitements utilisés sur les animaux ont été déjà publiés dans la littérature comme étant bien tolérés par les animaux dans les lignées de souris que nous utilisons. Ainsi, hormis les nuisances sporadiques parfois observées sur les animaux saints, l’initiation des possibles nuisances se fera à partir du début des expériences et pourra donc être promptement suivie. Certaines souris sont viables et fertiles, mais 25 % à 60 % ou plus développeront spontanément des mélanomes avec un début à l'âge de 2 à 12 mois. L'application topique d’une molécule entraîne le développement de lésions cutanées pigmentées en 21 à 28 jours, qui évoluent en mélanomes. D’autres souris développant des tumeurs mammaires spontanément, les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et poursuivre les éventuels signes de souffrance ou de stress. Les souris femelles d’un certain génotype développent des tumeurs au niveau de toutes les glandes mammaires (m1 à m10) avec un temps de latence moyen de 92 jours. Les tumeurs apparaissent progressivement à partir de 15 semaines jusqu’à un point limite vers 25 semaines. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales en sous-cutanées (cancer du sein, mélanome) sont : nécrose, uclération et saignements de la tumeur, gène à la locomotion et baisse de la tonicité générale dans les derniers stades de la maladie, perte de poids. Les nuisances attendues en lien avec les croissances tumorales du cancer du poumon sont : perte de poids, difficultés respiratoires, baisse de la tonicité dans les derniers stades de la maladie. Les nuisances liées aux injections des thérapies et aux prélèvements sont égales à la douleur causée par l’insertion d’une aiguille. Cet inconfort est léger et passager. Les traitements utilisés n’induisent pas de réaction adverse chez la souris. Une autre lignée (phénotype dommageable) sera hébergée dans des conditions la protégeant de toute infection, dans une cage individuelle sur portoir ventilé, la litière sera autoclavée, l’eau et les aliments irradiés, le matériel en contact avec les animaux sera au préalable autoclavé ou décontaminé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car la plupart d’entre eux seront porteurs de tumeurs. De plus les animaux “contrôles”, non porteurs de tumeur, devront être mis à mort car nous nous intéressons aux cellules présentent dans les organes et nous devons absolument mettre les animaux à mort pour récupérer ces organes.

Remplacement

Dès qu’il est possible de remplacer un modèle murin par une approche in vitro, comme la culture cellulaire ou la création d'organoïdes en 3D, nous opterons pour cette solution, comme nous l'avons déjà fait par le passé. Les diverses thérapies cellulaires seront systématiquement soumises à une validation in vitro avant toute autre étape. Cependant, il est important de noter que ni les modélisations mathématiques ni les systèmes in vitro ne permettent actuellement d'étudier de manière exhaustive l'infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs ainsi que les réponses immunitaires anti-tumorales qu'elles déclenchent. Par conséquent, le modèle murin demeure un élément incontournable de ce projet, puisqu'il est le seul à permettre l'étude approfondie de l'infiltration immunitaire au sein des tumeurs et des réponses anti-tumorales qu'elle engendre. L'utilisation de souris s'avère essentielle pour tester de nouvelles thérapies anti-cancéreuses qui réactivent le système immunitaire, ouvrant ainsi la voie à des avancées significatives dans le domaine de la lutte contre le cancer.

Réduction

Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces expériences permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animaux. Les expériences de croissance de tumeurs seront effectuées avec 7 animaux en accord avec les calculs de puissance statistiques. Les résultats seront analysés par tests statistiques non paramétriques ou l’analyse de la variance . En outre, nous utiliserons des animaux mâles et femelles pour réduire le nombre d’animaux respirant non impliqués dans des expérimentations dans les lignées de souris génétiquement modifiées.

Raffinement

Une lignée de souris étudiée développe des tumeurs mammaires très progressivement sur 5 mois. La stratégie d’élevage participe au raffinement du projet, elle repose sur le croisement de femelles sauvages avec des mâles hétérozygotes qui développent tardivement des tumeurs mammaires (donc sans phénotype dommageable pendant la période d’utilisation comme reproducteurs. Les expérimentations avec une lignée de souris seront réalisées avant que les tumeurs se développent spontanément (à partir de 2 à 12 mois). Dans ce cadre nous utiliserons les souris mâles et femelles pour l'expérimentation. Les animaux seront régulièrement surveillés, et en cas d'apparition inattendue de tumeurs, ils serviront à standardiser

Choix des espèces

La souris se révèle être le modèle privilégié pour les expérimentations dans le domaine de l'onco-immunologie et de la thérapeutique du cancer. Ceci est principalement dû à la connaissance approfondie du génome murin, ce qui permet de tirer parti de nombreux outils soigneusement caractérisés. Parmi ceux-ci figurent les souris génétiquement modifiées pour exprimer des protéines spécifiques d'intérêt, ainsi qu'une variété étendue de modèles de tumeurs transplantées. La souris présente des avantages pratiques significatifs. Elle est aisément manipulable, dispose d'une courte période de gestation et peut donner naissance à plusieurs individus par portée, ce qui crée des conditions d'élevage optimales pour les expériences. Grâce à sa grande similitude génétique avec l'Homme, il est envisageable de transférer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Cette corrélation renforce la pertinence des découvertes réalisées avec les souris, ouvrant la voie à des avancées cliniques prometteuses dans la lutte contre le cancer. Les animaux seront mis en expérimentation entre 8 et 14 semaines après leur naissance, car c’est l’âge à partir duquel ils auront atteint le stade « adulte » et que leur système immunitaire sera pleinement développé.

Prélever du sang et du liquide céphalo-rachidien pour valider des appareils de mesure et fournir des produits sanguins à d'autres laboratoires : la finalité déclarée relève de la mise au point de méthodes d'analyse pour des études réglementaires. 500 souris, 500 rats, 200 chiens, 100 lapins, 200 ouistitis et tamarins et 200 macaques à longue queue vont être utilisés, 1 360 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 340 sous anesthésie sans réveil. Les ponctions de liquide céphalo-rachidien se font sous anesthésie profonde, avec un risque de hernie par hypertension intracrânienne ou de destruction de la moelle que le porteur qualifie de négligeable chez des animaux en bonne santé. 1 320 animaux repartiront vers d'autres projets, 10 chiens et 10 lapins seront adoptés et 20 macaques rendus à l'élevage, le projet servant aussi à faire pratiquer des prélèvements d'organes à des collaborateurs en formation.

Objectifs

Ce projet a deux objectifs principaux : 1- Prélever des échantillons biologiques afin de valider au sein de notre établissement l’utilisation d’appareils de mesure plus performant, et de développer et d’optimiser des méthodes d’analyses de biomarqueurs d’intérêts majeurs. En effet, afin de garantir la qualité des résultats et la validité des études, un objectif synergique des exigences 3Rs, le développement et la validation de méthodes d’analyses des échantillons biologiques sont nécessaires pour la bonne réalisation des études de sécurité et d’efficacité pré-clinique de médicaments régies par les BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoires). A terme, dans le cadre de ces exigences 3Rs, des appareils et des méthodes d’analyses plus performantes permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour un objectif scientifique donné et de raffiner les procédures expérimentales (par exemple, en réduisant les volumes sanguins prélevés, ou en déterminant des points limites plus précoces). 2- Fournir à la communauté scientifiques des produits biologiques (comme des produits sanguins) pour des études in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet assure le développement et la validation de méthodes d’analyses ou d’identifications de biomarqueurs analytiques d’intérêt majeur dans les études pré-cliniques et indispensables à l’élaboration de tout nouveau médicaments actuellement. Il permet la mise en application dans le cadre d’études réglementaires régies par les BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoires) d’appareils ou de méthodes d’analyses biochimiques, hématologiques, histologiques ou encore immunologiques plus fiables et plus précises. Il permet d’assurer un suivi plus spécifique des effets d’un produits en cours d’essai chez l’animal, ce qui apporte au moins deux bénéfices majeurs : 1) détecter plus rapidement les effets délètères pour la santé des animaux modèles (et donc anticiper des lésions sévères avant que l’impact sur le bien être devienne significatif) et 2) augmenter notre capacité à détecter de potentiels effets toxiques en amont des phases de test cliniques chez l’humain. De plus, il permet de développer des méthodes réduisant les volumes prélevés nécessaires lors des analyses de biomarqueurs, ainsi que les fréquences de prélèvement chez l’animal. Enfin, en particulier dans le cadre des prélèvements d’organes, il permet d’assurer une formation sous tutorat de collaborateurs ayant acquis les bases théoriques des gestes techniques mais nécessitant de pratiquer ces gestes et ce sans utiliser d’animaux à dans ce seul but. Ainsi, ce projet permet l’optimisation continue de la qualité des données expérimentales des études précliniques et les respects des exigences 3Rs de réduction (liées à la qualité des études) et de réduction et de raffinement (réduction de la fréquences et des volumes d’échantillons biologiques nécessaires).

Procédures

Les animaux sont soumis à des prélèvements sanguins vigiles ou anesthésiés ainsi qu'à des prélèvements de liquides céphalo-rachidien sous anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins (majoritaires au cours de ce projet) ne constituent pas de risque sévère pour la santé des animaux, d’autant plus car ils sont effectués dans le cadre des lignes directrices EFPIA / ECVAM (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations / European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development. Le prélèvement de LCR, lorsqu’il est effectué par un personnel qualifié sur un animal en bonne santé ne présente que peu de risques de complications sévères. Les complications les plus susceptibles d’avoir lieu sont celles lié à l’anesthésie (prévenu en utilisant un protocole d’anesthésie mis en place par un vétérinaire), et le risque d’une hernie en cas d’hypertension intracrânienne (risque négligeable lorsque le geste est pratiqué sur des animaux en bonne santé). Les complications plus rares peuvent apparaitre (une destruction accidentelle de la moelle ou du rachis cervical rostral lors de ponction par voie haute et une infection du système nerveux central par introduction de germes lors de l’acte) mais ne sont pas attendus en raison de la réalisation du geste par un personnel compétent.

Devenir

Les animaux seront soit utilisés dans d'autres projets autorisés par le MERS, soit adoptés lorsque cela est possible (sur avis vétérinaire).

Remplacement

Lorsque cela est possible, le développement et la validation d’appareils ou de méthodes analytiques sont faits en utilisant des substitues au sang. Ces substitues peuvent être des solutions de contrôles chimiques reconstitués (surtout dans le cadre de dosages biochimiques), ou encore des contrôles humains délivrés par le fournisseurs des appareils. Ces échantillons reconstitués permettent de remplacement les échantillons de sang frais prélevés chez l’animal.

Réduction

Dans le cadre des études pré-cliniques, des prélèvements sanguins sont nécessaires avant que ne commencent l’étude, c’est-à-dire avant l’administration du produit testé. Lorsque les volumes de sang prélevés le permettent, le sang (et ses dérivés : plasma, sérum) non utilisé dans le cadre de l’étude est récupéré pour ce projet, réduisant ainsi le nombre d’animaux naïfs nécessaire. De plus, l’utilisation d’échantillons chimiques reconstitués (voir 3.3.6.1 Remplacement) en lieu et place de sang frais permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Lors des prélèvements d’organes, les animaux utilisés seront le plus souvent des animaux ré-utiliser d’autres procédures (après validation par un vétérinaire), afin de ne pas sacrifier un animal uniquement pour récupérer ces organes.

Raffinement

Le prélèvement sanguin est une procédure peu invasive et peu douloureuse d’autant plus lorsqu’elle est effectuée par du personnel expérimenté selon les lignes directrices EFPIA / ECVAM (European Federation of Pharmaceutical Industries Associations / European Center for the Validation of Alternative Methods), et de l’International Consortium for Innovation and Quality in Pharmaceutical Development.. De plus, un prélèvement sous sédation peut être effectué, afin de limiter le stress induit par la contention manuelle ou des lésions vasculaires lorsqu’un animal est agité. Dans le cas de prélèvements sanguins répétés, une crème anti-hématome ou analgésie peut être utilisée. Dans la cadre des prélèvements de LCR, une anesthésie générale (avec une analgésie adaptée mise en place par un vétérinaire) est nécessaire et un suivi post-prélèvement est mis en place : évaluation de son état de santé, surveillance de l’animal jusqu’à son réveil complet, mis à disposition de dispositifs chauffants (tapis, lampe) lors de la phase de réveil, administration d’une analgésie adéquate si nécessaire. En cas de doute sur l’état de santé de l’animal prélevé, un examen clinique évaluant spécifiquement les fonctions neurologiques de l’animal est mis en place à son réveil par un vétérinaire afin de prendre en compte le plus tôt possible l’apparition de complications impactant le bien-être et de mettre en place une stratégie adaptée. Pour ces procédures, un suivi vétérinaire dans la cadre de la Structure en charge du Bien-Etre animal est effectué sur les animaux utilisés, afin de s’assurer de lors bon état de santé. Si animal voit son état de santé se dégrader, indépendamment ou non des procédures, il est immédiatement exclu des procédures de prélèvements et un traitement adéquat est mis en place sous la responsabilité d’un vétérinaire.

Choix des espèces

Les études de sécurité et d’efficacité pré-clinique sont des études réglementaires (régies par les lignes directrices ICH M3(R2) et ICH S3A) in vivo qui nécessitent l’utilisation d’au moins deux espèces différentes (rongeur et non rongeur). Les études visant en particulier le système immunitaire sont réalisées chez le primate non humain pour sa proximité avec l’homme et donc la fiabilité des résultats obtenus. Ce projet est destiné à développer et optimiser des appareils et méthodes d’analyses utilisés dans le cadre de ces études pré-cliniques. Ainsi, les espèces choisies dans le projet sont les animaux utilisés dans le cadre de ses études et choisis comme étant le modèle le plus pertinent pour évaluer la toxicité de la candidat médicament testé. Les animaux utilisés seront les mêmes que les animaux ensuite utilisés en études. Pour les rongeurs et lapins, à partir de 6 semaines. Pour les chiens, à partir de 6 mois. Pour les macaques, à partir de 2 ans et pour les marmousets à partir d’un an.

714 souris vont être utilisées, dont 414 anesthésiées puis tuées sans réveil pour prélever une partie de leur système nerveux central, les autres passant 75 minutes par jour, deux jours de suite, dans une enceinte hermétique de mesure respiratoire. Juvéniles puis adultes, elles reçoivent deux solutions par le nez sous anesthésie, à 48 heures d'intervalle, alors que le porteur reconnaît chez ces mutantes du syndrome d'Ondine une sensibilité accrue à l'anesthésie et un risque accru de défaillance respiratoire. Une biopsie de la queue leur est prélevée pour génotypage. Les bénéfices sont renvoyés à l'identification de "nouvelles pistes thérapeutiques" pour les personnes atteintes, l'objectif immédiat restant de mesurer l'effet de la leptine sur la commande respiratoire.

Objectifs

Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration, ils surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré). Cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. Elle est produite par les neurones du cerveau qui composent la commande centrale respiratoire. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie, ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide respiratoire dès qu’elles s’endorment. Le bon fonctionnement des cellules de la commande centrale respiratoire, sensibles aux variations de CO2, dépend de l’expression d’un gène codant pour une protéine spécifique. Si le gène est muté, la protéine a une mauvaise structure et devient non fonctionnelle. Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC, le syndrome d’Ondine et leurs souris contrôles (sauvages). Une approche utilisée chez des souris nouveau-nées permettra d’étudier la commande centrale respiratoire et de déterminer la concentration de leptine, un stimulant respiratoire, la plus efficace, capable d’augmenter l’activité du réseau neuronal respiratoire qui compose la commande. Chez des mêmes souris juvéniles puis adultes, l’approche utilisée est non invasive. Elle permettra de déterminer l’effet bénéfique de la leptine, à la concentration la plus efficace sur la ventilation et la réponse respiratoire au CO2. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment la leptine impacte la respiration. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC.

Bénéfices attendus

Les souris mutantes modèles de la maladie que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie. A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie. Cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. L’utilisation de la leptine, connu comme stimulant de la respiration pourrait : 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cellules et les molécules cibles de la leptine au niveau de la commande respiratoire localisée dans le cerveau et 2/déterminer si ces cellules et molécules cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment la leptine impacte la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.

Procédures

Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité du modèle animal à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. Les souris mutantes et contrôles nouveau-nées sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées par une méthode réglementaire afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. D’autres souris juvéniles puis adultes seront anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant (pendant 10 minutes maximum) puis recevront l'administration par voie nasale deux solutions (faible volume par narine ; en 10 minutes par souris). 48 heures séparent les deux administrations. D’autres souris juvéniles puis adultes recevront par nébulisation les deux solutions. 48h sépareront les deux administrations. La mesure des variables respiratoires chez les souris juvéniles et adultes sera réalisée de façon non invasive pendant 75 min (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu. Une biopsie caudale (au niveau de la queue, inférieure à 2 mm) est réalisée chez les souris nouveau-nées/juvéniles pour génotypage.

Impact sur les animaux

Le prélèvement caudal réalisé une unique fois chez l’animal pour la détermination de son génotype apparaît comme une source de douleur et de stress. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale des deux solutions peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements post-mortem et analyses nécessaires.

Remplacement

L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur des souris vivantes. L’étude de l’influence des systèmes leptinergiques sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par la leptine ne peut être réalisée que sur des souris vigiles, non contraintes et non anesthésiées.

Réduction

Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles (714 animaux au total) dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux mutants et sauvages (contrôles). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et permet de mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes. L'isolement est évité au maximum. Le milieu des animaux est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Cependant il est possible que certains animaux se retrouvent isolés pour des contraintes zootechniques (agression entre congénères, etc...). Dans ce cas, la structure chargée du bien-être animal sera toujours sollicitée pour trouver la solution la plus adaptée et la moins contraignante pour les animaux (enrichissement supplémentaire si l’isolement est validé, possibilité de rassemblement, etc.). L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des administrations intranasales sous anesthésie. De ce fait, lors de ces administrations sous anesthésie, une surveillance accrue en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris. En cas de défaillance cardiorespiratoire, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée si nécessaire. Les points limites sont les suivants : -tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire -modification du comportement caractéristique d’une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et ou terne, prostration, dos voûté) -anomalies pouvant entraîner une douleur intense ou une souffrance, par exemple un amaigrissement de l’animal par constat visuel, plaies et ulcères, tumeurs, fractures… Les points limites définis ci-dessus sont assortis d’une surveillance adaptée des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la respiration par la commande centrale respiratoire. Le modèle animal de la pathologie sur laquelle nous travaillons, n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour un gène, présent sur des neurones impliqués dans la sensibilité au dioxyde de carbone (hypercapnie). Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues que par un travail sur les souris mutantes et leur contrôle, des souris sauvages ; étude de l’influence de la leptine sur la commande centrale respiratoire ex vivo ; étude de la ventilation chez l’animal juvénile et adulte vigil et de l’influence de la leptine appliquée par administration intranasale et par nébulisation.