Procédures sans réveil

Pour vérifier si l'électrorétinogramme peut servir de marqueur des atteintes cérébrales de la myopathie de Duchenne, 1 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau et de la rétine, dans des procédures menées sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent la pose d'électrodes sur la cornée, une incision du scalp et une ou deux perforations du crâne, une injection intraoculaire et une injection intracérébrale, sous anesthésie prolongée de deux heures chez les adultes et sous hypothermie sur glace chez les nouveau-nés. Le porteur indique que les injections dans l'œil peuvent provoquer une déshydratation, un ulcère de la cornée ou une cataracte, et qualifie de légère la douleur des interventions chirurgicales. Il précise que le projet sera interrompu si aucune anomalie corticale n'est mesurable, auquel cas l'effectif déclaré serait "largement surestimé".

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est causée par des mutations d’un gène qui produit des protéines nommées dystrophines, qui conduisent à une dégradation des muscles pouvant être associée à des troubles cognitifs et divers autres troubles sensoriels et cérébraux. Les patients atteints de DMD peuvent notamment développer des rétinopathies. Nos récents travaux montrent que chez différents modèles murins de DMD, l’expression de différentes dystrophines rétiniennes, et la fonction de la rétine, sont affectées de manière variable en fonction de la position de leur mutation. Les anomalies mesurées in vivo à l’aide d’électrorétinogrammes (ERGs) pourraient refléter la sévérité des troubles cérébraux, aider à classer les patients en fonction de la sévérité de leurs atteintes centrales, voire servir de marqueur non invasif de l’évolution de la pathologie et des effets de traitements thérapeutiques. Le projet a pour but de vérifier cette hypothèse en enregistrant en parallèle les ERGs et les potentiels évoqués dans le cortex visuel (Potentiel évoqué visuel, ou PEV), chez des souris porteuses de différentes mutations. Le PEV est un outil important pour évaluer la fonction visuelle et le traitement cortical des informations visuelles, offrant une nouvelle perspective d’étude de l'impact neurologique de la maladie. La mesure synchronisée des ERGs et des PEVs permettra de vérifier l’existence d’une corrélation entre la sévérité des altérations rétiniennes et celle des altérations cérébrales. Le cas échéant, nous testerons ensuite la sensibilité de ces mesures électrophysiologiques à des traitements de thérapie génique pour déterminer si les ERGs, et/ou les PEVs, peuvent effectivement servir de marqueur d’efficacité des traitements ciblant le cerveau. Ce projet est donc important pour le diagnostic, le développement et le suivi de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles affectant le système nerveux dans la DMD.

Bénéfices attendus

L’évaluation des capacités visuelles à l’aide d’électrorétinogrammes et l’enregistrement de potentiels évoqués corticaux sont très rarement effectuées chez les patients, voire pas du tout en ce qui concerne l’activité électrique corticale. Notre étude permettra d’évaluer si ces mesures devraient être appliquées chez les patients, soit dans un but pronostique (évaluer la sévérité de futures déficits cérébraux), diagnostique (classer les patients en fonction de la sévérité des atteintes centrales présumées), ou encore pour suivre l’évolution de la pathologie ou des effets d’un traitement avec des méthodes qui seront non invasives chez l’Homme. Les approches de thérapie génique prévues dans ce projet incluent différents mode d’injections qui permettront de déterminer la réversibilité des déficits centraux en fonction de l’âge auquel le traitement est administré. Elles permettront aussi d’identifier les dystrophines qu’il faut ré-exprimer en priorité pour atteindre un objectif thérapeutique, et la fenêtre thérapeutique optimale pour ces traitements. Les découvertes issues de ces études ont un intérêt critique pour l’orientation du traitement d’un nombre important de patients atteints de DMD, et les méthodes employées pourront également être applicables à d’autres pathologies du système nerveux.

Procédures

Une anesthésie avec hypothermie transitoire (5 min) chez les nouveau-nés, ou une anesthésie profonde prolongée chez les souris adultes (2h), éventuellement répétée après un intervalle de 2 mois. Sous anesthésie générale et avec analgésie : Pose d’électrodes de contact sur la cornée de l’œil, d’électrodes sous-cutanées, incision du scalp et 1 ou 2 perforations du crâne pour électrodes corticales de surface (sans réveil), injection intraoculaire (1 œil, 1 fois, sans réveil), 1 injection intracérébrale (une seule fois) sous anesthésie générale (durée environ 5 min).

Impact sur les animaux

Les injections intraoculaires sont susceptibles d’induire une déshydratation oculaire, un ulcère de la cornée ou une cataracte. Certaines interventions chirurgicales peuvent occasionner une douleur légère pendant et après la chirurgie. L’anesthésie sur glace provoque une hypothermie.

Devenir

À la suite des enregistrements, les souris tests seront euthanasiées pour prélèvements post-mortem du cerveau et de la rétine.

Remplacement

Nos molécules thérapeutiques font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats thérapeutiques, non toxiques sur cellules, et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Ensuite, les études précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont généralement menées sur des souris modèles déficientes en dystrophine chez lesquelles les déficits sont préalablement caractérisés, afin de servir de marqueur pour évaluer l’efficacité des traitements. Notre projet implique des injections suivies de périodes de récupération, et des enregistrements électrophysiologiques qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants, mais sous anesthésie et antalgie.

Réduction

Sur la base d’études précédentes, la caractérisation des anomalies rétiniennes et cérébrales nécessite 12-15 souris par groupe, minimum nécessaire pour une démonstration statistique convaincante des objectifs. Certains groupes comprennent des souris recevant un traitement et des groupes contrôles indispensables aux analyses statistiques. Nous utiliserons préférentiellement des tests statistiques adaptés aux petits échantillons, sauf dans le cas d’analyses plus complexes d’interactions entre facteurs ne pouvant être effectuées avec ces tests. Pour les traitements, la sélection préalable in vitro, des molécules à fort potentiel thérapeutique et non toxiques, permet de limiter le nombre d’études in vivo. Le projet comprend une caractérisation préalable des dysfonctions, qui débutera avec les souris modèles connues pour exprimer les déficits les plus sévères. Si cette étude ne révèle pas de dysfonction mesurable au niveau cortical, la suite du projet sera interrompue, auquel cas le nombre d’animaux déclaré dans ce projet sera largement surestimé.

Raffinement

Dans le cas où les animaux seraient importés et non issus de nos élevages, ils auront 5-7 jours d'acclimatation à leur nouvel environnement lors de leur arrivée. Tous les tests seront effectués avant l’âge de 6 mois, donc avant apparition de la faiblesse musculaire due à la myopathie. Les injections et anesthésies, la récupération post-opératoire et les études fonctionnelles ont été optimisées en concertation avec notre vétérinaire. Elles comprennent une anesthésie/analgésie générale et locale (au niveau de l’œil et de la peau du crâne), une prévention de la déshydratation oculaire, et l’utilisation d’un tapis chauffant pendant la chirurgie (sauf pour les injection néonatales sous anesthésie par hypothermie) et pendant le réveil. Toutes les manipulations sont effectuées par des personnels qualifiés parfaitement formés aux procédures mises en place dans ce projet ; le taux d’échec sera donc faible. Les thérapies géniques ont été choisies sur la base des études antérieures pour leur efficacité, l’absence de toxicité et la possibilité de transposer les résultats à des doses applicables à des patients. Leur administration nécessitera des interventions chirurgicales qui ont déjà été éprouvées, qui sont maitrisées et associées à des anesthésies générales avec analgésie, et un suivi régulier des animaux. Le bien-être des souris au cours du traitement sera évalué par observation quotidienne par l’expérimentateur et par l’équipe zootechnique le week-end. En cas de signe de détresse ou souffrance, l’animal sera soigné, ou bien retiré de l’expérimentation et euthanasié, selon un protocole mis en place avec notre vétérinaire référent. Les conditions d’hébergement sont enrichies jusqu’à la fin du projet et les souris expérimentales sont maintenues en groupe sociaux par fratrie.

Choix des espèces

D’autres modèles animaux de la DMD existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différents modèles mutants ou transgéniques porteurs de mutations variées et représentatives des sous-groupes de patients montrant des variations dans la sévérité des symptômes. Les troubles visuels ont uniquement été étudiés chez les souris modèles. Les recherches précliniques pour ces pathologies sont donc généralement menées sur ces souris modèles, chez lesquelles les problèmes identifiés servent de marqueur pour évaluer l’efficacité des traitements. Les électrorétinogrammes ne sont pas stables avant 8 semaines, et il est important de ne pas inclure des variations liées à l’âge qui pourraient compliquer nos conclusions sur les effets des traitements. Les enregistrements seront donc effectuées chez des souris adultes (12-14 semaines), ce qui sera comparable à nos études précédentes. Les injections intraoculaires et intracérébrales seront effectuées au moins 2 mois avant, temps nécessaire pour atteindre un plateau d’efficacité des molécules thérapeutiques. Pour être en accord avec de précédentes études, les souris seront injectées à l’âge 8 semaines, excepté pour le groupe qui recevra un traitement en post-natal (nouveau-nés). L’administration du traitement dans un groupe de nouveau-nés est susceptible d’être plus efficace d’après des résultats obtenus par des collaborateurs, et pourrait avoir des effets préventifs plutôt que curatifs.

Une moitié des souris est maintenue sous anesthésie jusqu'à sa mise à mort, sans jamais reprendre conscience. 360 souris vont être utilisées, 180 dans ce régime sans réveil et 180 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur sang, le caillot et les tissus. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par une intervention chirurgicale d'environ une heure trente avec injection dans le cerveau, suivie selon les groupes d'une observation au microscope pouvant durer deux heures. Le porteur affirme que seules des souris peuvent reproduire la complexité vasculaire du cerveau et la réaction des cellules immunitaires lors d'un AVC, après des essais préalables menés sur du sang de souris.

Objectifs

Les accidents vasculaires cérébraux dits ischémiques sont dus à un caillot, qui bloque la circulation sanguine dans une artère cérébrale. La résistance de ces caillots aux traitements varie selon les individus. Ce projet étudie une protéine présente dans les vaisseaux sanguins qui, lorsqu’elle circule dans le sang, peut limiter la formation des caillots ou destabiliser les caillots. L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel de cette protéine, pour empêcher la formation du caillot, ou le déstabiliser une fois formé. Cette protéine permettra de proposer de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter les accidents vasculaires cérébraux.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre le rôle de la protéine étudiée dans la formation et la dégradation des caillots lors d’un accident vasculaire cérébral. L’ischémie cérébrale, due à l’occlusion d’une artère, endommage les tissus cérébraux et altère les fonctions cérébrales. Plus cette occlusion persiste dans le temps, plus les dommages causés au cerveau deviennent irréversibles pour les patients. Cette étude pourrait ouvrir la voie à une nouvelle stratégie thérapeutique visant à rétablir ou améliorer la circulation sanguine dans les artères cérébrales et ainsi limiter les séquelles liées à l’ischémie. À terme, cette approche pourrait contribuer à réduire la survenue des complications et la mortalité associées aux accidents vasculaires cérébraux. Les résultats obtenus dans ce projet permettront d’améliorer les connaissances sur les mécanismes impliqués dans la formation et la dégradation des caillots, et pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients.

Procédures

Les animaux seront répartis en différents groupes selon les expériences réalisées. Ils recevront jusqu’à trois administrations de traitement contre la douleur, chaque administration durant environ 30 secondes. Selon les groupes, une anesthésie générale sera réalisée soit pour une intervention chirurgicale d’une durée totale d’environ 1 heure 30 minutes, soit pour une observation au microscope d’une durée maximale de 2 heures. Une injection d’un marqueur permettant la visualisation du caillot, sera effectuée avant cette observation (environ 30 secondes). Plusieurs administrations de molécules seront réalisées à différents moments de l’étude (30 minutes avant ou après l’intervention, ou 2 heures après), chaque administration durant moins d’une 1 minute. En fin d’étude, une anesthésie générale profonde sera réalisée afin de permettre le prélèvement des tissus. Enfin, une ou deux administrations de solution physiologique seront réalisées après la chirurgie pour assurer la réhydratation, chaque administration durant environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

L’induction d’un accident vasculaire cérébral dû à un caillot nécessite une intervention chirurgicale et une injection dans le cerveau, réalisées sous anesthésie générale. Les effets indésirables attendus comprennent une douleur liée à la chirurgie, d’intensité modérée, prise en charge par un traitement contre la douleur. Selon les situations expérimentales, les animaux peuvent soit être maintenus sous anesthésie pendant toute la durée de l’expérimentation, soit être réveillés après l’intervention. Dans ce dernier cas, ils font l’objet d’un suivi attentif afin de limiter toute douleur ou souffrance.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer du sang, le caillot et les tissus.

Remplacement

Des expériences in vitro ont été réalisées permettant de réduire l’utilisation d’animaux vivants. Ces expériences, faites sur du sang de souris, ont permis d’étudier comment la protéine d’intérêt influence la formation et la stabilité des caillots. Elles nous ont aussi aidés à réduire le nombre d’animaux nécessaires, en déterminant à l’avance la dose la plus adaptée pour les études suivantes. Cependant, pour comprendre l’effet de cette protéine dans un accident vasculaire cérébral, il est indispensable d’utiliser un modèle vivant. Seules des souris peuvent reproduire la complexité vasculaire du cerveau, et des cellules immunitaires lors d’un accident vasculaire cérébral, ce qui n’est pas possible avec des tests entièrement in vitro. Ces informations nous permettent de mener les expériences dans les meilleures conditions, en appliquant la règle des 3R pour limiter au maximum l’inconfort animal.

Réduction

Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires se fonde sur des travaux précédents réalisés avec le même modèle d’AVC, sur des données de la littérature scientifique et sur l’utilisation d’un logiciel statistique spécialisé.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les interventions nécessitant une chirurgie seront faites sous anesthésie générale, avec des mesures destinées à assurer le confort des animaux avant, pendant et après l’intervention. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant. Une grille de score et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteinte d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi car il permet d’étudier les maladies cérébro-vasculaires, comme l’AVC, en reproduisant plusieurs caractéristiques observées chez l’humain, telles que les déficits comportementaux et l’évolution des lésions cérébrales dans le temps. Les mécanismes complexes impliqués dans l’AVC ischémique, incluant différents types cellulaires et des réponses immunitaires différentes, nous impose l’utilisation de modèle in vivo pour intégrer l’ensemble de ces phénomènes impliqués dans l’étude de l’évaluation d’un traitement préventif ou curatif. En sachant que les accidents vasculaires cérébraux touche principalement les adultes, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 2 à 3 mois. Ce choix garantit que les animaux sont à un stade de développement comparable à celui des patients adultes, tout en permettant une observation fiable des effets du modèle et des traitements testés.

Des souris immunodéficientes, dépourvues des cellules immunitaires qui élimineraient les cellules humaines injectées, portent l'essentiel de ce projet. 290 souris vont être utilisées, dont 50 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, les 240 autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un lot subit onze prélèvements de sang en 72 heures, dont cinq sur animal vigile, d'autres une chirurgie de thrombose ou une mesure du temps de saignement sous anesthésie. Le porteur écrit que la perte de sang et la thrombose induites ne sont pas compatibles avec le maintien en vie, ce qui vaut aux souris d'être tuées à l'issue, pour valider des plaquettes humaines produites en laboratoire.

Objectifs

Dans un contexte de besoins croissants en plaquettes pour la transfusion et de limites de leur disponibilité et durée de conservation, le développement de plaquettes humaines produites in vitro (hPLTs) sans nécessité de don représente une approche alternative prometteuse. Toutefois, avant toute utilisation chez l’Homme, il est indispensable de vérifier la bonne circulation de ces plaquettes ainsi que leurs fonctions après circulation dans un organisme vivant. L’objectif du projet est de caractériser les plaquettes humaines produites in vitro (hPLTs), tant leur capacité à circuler et à persister dans le sang, que leurs fonctions à différents temps après injection chez la souris. Il a également pour objectif de déterminer leur capacité à participer à l’arrêt du saignement et à la formation de caillot, appelée thrombose, à l’aide de modèles validés chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter des données essentielles sur la fonction et la capacité à circuler dans le sang des plaquettes humaines produites in vitro (hPLTs), constituant une étape clé de leur évaluation avant utilisation chez l’Homme. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de sources alternatives de plaquettes pour la transfusion, dans un contexte de besoins croissants et de contraintes liées à la disponibilité et à la durée de conservation des plaquettes issues de dons. Une telle approche pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients présentant un risque de saignement important, notamment chez les patients présentant un cancer.

Procédures

Un lot d’animaux sera soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie (20 minutes maximum). Un lot d’animaux sera soumis à 2 injections sous anesthésie et à 11 prélèvements sanguins sur 72 h (0 min, 3 min, 6 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 24 h, 48 h et 72 h injection des plaquettes) : 6 prélèvements sous anesthésie et 5 chez des souris vigiles de 5 minutes. Un lot d’animaux sera soumis à 2 injections et un prélèvement sanguin sous anesthésie (35 minutes maximum). Un lot d’animaux sera soumis à 2 injections et une chirurgie sous anesthésie (45 minutes maximum). Un lot d’animaux sera soumis à 2 injections et un temps de saignement sous anesthésie (40 minutes maximum).

Impact sur les animaux

Une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée transitoire). On pourra également observer une douleur localisée de courte durée au point d’injection, ainsi que d’éventuels saignements. La contention nécessaire aux injections pourra entraîner un stress chez les animaux. La déplétion des macrophages peut induire une altération transitoire de l’état général. Dans le cadre du prélèvement sanguin à la queue, l’entaille d’une veine peut provoquer une douleur aiguë et passagère, une perte sanguine transitoire. Les modèles de thrombose nécessitent des interventions chirurgicales réalisées sous anesthésie générale. Ces procédures peuvent entraîner un stress physiologique et un risque limité de saignement.

Devenir

A l’issue du prélèvement de sang en quantité importante ou répété, des thromboses et du temps de saignement, les animaux sont mis à mort car la perte de sang importante et le développement d’une thrombose ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux.

Remplacement

Le recours à l’animal ne peut pas être remplacé dans ce projet. Les objectifs nécessitent d’évaluer la circulation, la persistance et la fonction de plaquettes humaines produites in vitro (hPLTs) dans un organisme entier. Des approches in vitro et ex vivo sont utilisées en amont pour caractériser certains aspects fonctionnels. Toutefois, elles ne permettent pas de reproduire l’ensemble des paramètres impliqués après injection, notamment la circulation sanguine, les interactions cellulaires et les mécanismes d’élimination, ni d’étudier des processus dynamiques tels que l’arrêt du saignement et la thrombose. L’utilisation de souris immunodéficientes permettant la circulation de cellules humaines, est indispensable pour répondre aux objectifs du projet.

Réduction

Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum et permet l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs sont calculés par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation à la manipulation et à la contention est prévue 5 jours avant le début de l’expérimentation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : Les animaux sont hébergés en groupes sociaux. Les souris NSG seront hébergées en conditions stériles. Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de la procédure. Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffante afin de lutter contre l’hypothermie pendant la procédure Par l’injection d’analgésique et d’anesthésique local avant chaque procédure en sous-cutané. Des points limites ont été déterminés afin de soustraire les animaux à toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Des souris immunodéficientes seront utilisées pour les expériences principales, en raison de l’absence de cellules immunitaires, ce qui permet la circulation de cellules humaines sans élimination. Ce modèle est particulièrement adapté à l’étude du devenir et de la fonction de plaquettes humaines produites in vitro (hPLTs). Les expériences seront menées sur des souris adultes âgées de 8 à 24 semaines, une période idéale pour éviter les effets liés à la croissance ou au vieillissement. Seule une des procédures de thrombose nécessite l’utilisation de souris d’environ 3 semaines afin d’éviter la présence de lipides autour des vaisseaux sanguins et s’assurer de la reproductibilité du modèle.

Jusqu'à trois séances par jour, jamais deux jours de suite, sur une période pouvant atteindre trois mois, 860 souris vont être utilisées pour contrôler par la lumière des récepteurs cérébraux, 320 d'entre elles anesthésiées puis tuées sans réveil, les 540 autres subissant des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie des animaux reçoit une chirurgie cérébrale d'une heure à une heure trente pour implanter un dispositif d'illumination, puis participe éveillée aux séances d'injections et d'illuminations locales. Le porteur reconnaît que les substances employées sont nouvelles et que des effets imprévus ne peuvent être totalement exclus, tout en qualifiant les nuisances attendues de légères à modérées et réversibles. Les retombées thérapeutiques annoncées, des traitements plus ciblés avec moins d'effets indésirables, sont renvoyées au long terme, tandis que toutes les souris sont tuées pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Le cerveau fonctionne grâce à des cellules nerveuses qui communiquent entre elles à l’aide de substances chimiques. Parmi elles, l’acétylcholine joue un rôle important dans de nombreuses fonctions, comme la motivation, l’apprentissage, l’anxiété ou encore la réponse à certaines récompenses. Pourtant, il reste difficile de comprendre précisément comment cette substance agit dans des régions cérébrales spécifiques et à des moments précis. Ce projet a pour objectif de développer une nouvelle méthode permettant de contrôler très finement l’action de certains récepteurs cérébraux de l'acétylcholine grâce à la lumière. Pour cela, nous utiliserons des molécules conçues pour rester inactives tant qu’elles ne sont pas exposées à la lumière. Une fois activées localement dans le cerveau, elles permettront de modifier de manière ciblée l’activité de certains circuits nerveux. Chez la souris, nous étudierons ainsi comment cette activation influence l’activité cérébrale et certains comportements, comme la locomotion, la préférence, l’aversion ou l’anxiété. À plus long terme, ce projet pourrait améliorer la compréhension du fonctionnement du cerveau et contribuer au développement de traitements plus ciblés, avec moins d’effets indésirables.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont d’abord scientifiques et méthodologiques. Il permettra de développer une nouvelle approche pour contrôler de façon précise, dans le temps et dans l’espace, l’activité de certains récepteurs du cerveau directement chez l’animal vivant. Ce type d’approche offre une précision supérieure à celle des méthodes pharmacologiques classiques, qui agissent de manière plus diffuse dans l’organisme. Le projet permettra également de mieux comprendre le rôle des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine dans le fonctionnement des circuits cérébraux et dans certains comportements, notamment ceux liés à la motivation, à l’apprentissage, à l’aversion ou à l’anxiété. À plus long terme, les connaissances et les outils développés dans ce projet pourraient contribuer à l’élaboration de stratégies thérapeutiques plus ciblées, avec moins d’effets indésirables que les traitements pharmacologiques agissant sur l’ensemble du cerveau ou de l’organisme.

Procédures

Les animaux seront répartis en plusieurs groupes selon la procédure. Un premier groupe d'animaux sera profondément anesthésié, sans réveil, afin de prélever le cerveau pour des analyses d'activité cérébrale réalisées en laboratoire sur tissu prélevé. Cette intervention unique dure environ 30 minutes. Un deuxième groupe recevra une injection sous anesthésie générale, suivie d'enregistrements de l'activité cérébrale avec illumination locale. Cette intervention unique, d'une durée maximale de 7 heures, est réalisée sans réveil. Un troisième groupe subira une chirurgie cérébrale d'environ 1 h 30 sous anesthésie générale, permettant la mise en place d'un dispositif dans le cerveau. Après une période de récupération d'au moins 5 jours, ces animaux participeront à des séances expérimentales chez l'animal éveillé, comprenant une ou plusieurs injections rapides (quelques secondes chacune) et des illuminations locales. Chaque séance dure entre 30 et 60 minutes. Les séances sont répétées au maximum trois fois par jour, jamais deux jours consécutifs (au moins un jour de repos entre deux journées d'expériences), sur une période maximale de 3 mois. Un dernier groupe subira une chirurgie cérébrale d'environ 1 heure pour la mise en place de dispositifs d'illumination. Après récupération, ces animaux seront soumis à différents tests comportementaux, d'une durée comprise entre 5 et 120 minutes selon le test. Chaque animal participera au maximum à six tests différents, certains pouvant être répétés sur plusieurs jours (jusqu'à cinq jours consécutifs pour les tests d'apprentissage), sur une période maximale de 6 mois.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir une douleur légère à modérée et passagère après les chirurgies, généralement limitée à quelques jours. Une fatigue passagère est également possible. Une légère perte de poids transitoire peut survenir après la chirurgie ou lors de certaines phases expérimentales. Les manipulations, les injections, le branchement aux dispositifs expérimentaux et les tests comportementaux peuvent entraîner un stress léger à modéré et de courte durée. Les illuminations locales du cerveau peuvent induire des modifications transitoires du comportement, sans effet durable attendu. Les substances utilisées dans ce projet étant nouvelles, des effets imprévus ne peuvent être totalement exclus. L'état de santé des animaux est régulièrement surveillé, et les expériences sont interrompues si des signes de souffrance apparaissent. Dans l'ensemble, les nuisances attendues sont principalement légères à modérées, limitées dans le temps et réversibles.

Devenir

À l'issue des expériences, tous les animaux sont mis à mort. Cette mise à mort est nécessaire pour permettre les prélèvements du cerveau indispensables aux analyses scientifiques : ces prélèvements permettent soit la réalisation d'enregistrements de l'activité cérébrale sur tissu prélevé, soit la vérification de la localisation des dispositifs implantés au cours de l'étude, étape essentielle à l'interprétation des résultats. Dans tous les cas, la mise à mort est réalisée sous anesthésie profonde, garantissant une perte de conscience préalable et une mort rapide et indolore.

Remplacement

Les objectifs du projet visent à étudier le rôle de récepteurs cérébraux dans le fonctionnement intégré de circuits du cerveau impliqués dans la motivation, l'aversion ou l'anxiété. Cette complexité ne peut être reproduite ni dans des cultures cellulaires, ni dans des modèles informatiques (in silico), qui ne permettent pas de préserver l'intégrité des circuits cérébraux ni d'évaluer les conséquences comportementales des manipulations expérimentales. L'utilisation de l'animal vivant reste donc indispensable pour relier l'activité cérébrale aux comportements étudiés. Lorsque cela est possible, les expérimentations sur animal vivant sont précédées d'études exploratoires en amont (caractérisation des substances en laboratoire, sélection des doses et des conditions d'illumination les plus pertinentes), afin de limiter au strict nécessaire le recours à l'animal vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est déterminé à partir de données issues de la littérature scientifique, de calculs de puissance statistique et de l’expérience acquise dans des projets similaires. Il correspond au nombre minimal nécessaire pour obtenir des résultats fiables et interprétables. Les procédures ont été conçues de manière à limiter au maximum le recours à de nouveaux animaux. Lorsque cela est scientifiquement possible et compatible avec le bien-être animal, un même animal peut participer à plusieurs phases complémentaires d’une même étude, en particulier dans les procédures comportementales, sans augmentation de la sévérité globale. Les animaux issus d’une même portée sont utilisés autant que possible, sans exclusion systématique selon le sexe, afin d’optimiser l’utilisation des animaux. Les analyses sont réalisées à l’aide de méthodes statistiques adaptées, afin de garantir la validité scientifique des résultats tout en évitant l’utilisation d’un nombre excessif d’animaux.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont mises en place afin de limiter la douleur, le stress et la détresse. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec prise en charge adaptée de la douleur. Les animaux sont habitués à la manipulation lorsque cela est nécessaire, afin de réduire le stress lié aux procédures expérimentales. Les animaux font l’objet d’un suivi régulier, en particulier après les interventions chirurgicales. Une grille d’évaluation standardisée permet de détecter précocement tout signe d’altération de l’état général. Des points limites ont été définis en amont du projet ; leur atteinte entraîne immédiatement la mise en place de mesures adaptées afin de préserver le bien-être animal. Lorsque cela est nécessaire, des ajustements des conditions expérimentales ou d’hébergement peuvent être réalisés afin de garantir la protection des animaux.

Choix des espèces

Les systèmes cérébraux cholinergiques et dopaminergiques étudiés dans ce projet sont bien conservés chez les mammifères, et en particulier chez les rongeurs. Leur organisation anatomique et leur fonctionnement présentent des similitudes importantes avec ceux observés chez l’être humain, ce qui rend la souris particulièrement pertinente pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans la locomotion, la motivation, l’aversion ou l’anxiété. Ces mécanismes ne peuvent pas être étudiés de manière adéquate chez des invertébrés, des poissons ou des oiseaux, dont l’organisation cérébrale est trop différente. La souris présente en outre l’avantage de disposer d’outils expérimentaux et génétiques particulièrement développés, permettant une étude fine des mécanismes cérébraux, ce qui n’est pas le cas de nombreuses autres espèces. Le recours à d’autres mammifères ne se justifie pas dans ce projet, compte tenu de contraintes expérimentales plus importantes et d’une moindre accessibilité à ces outils. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (> 8 semaines), lorsque le développement cérébral est achevé et que les circuits étudiés sont pleinement fonctionnels. Pour les expériences nécessitant une injection virale, les souris sont opérées à l’âge adulte, puis utilisées après un délai de 2 à 4 semaines permettant une expression suffisante du transgène. Lorsque cela est nécessaire, l’implantation des fibres optiques est réalisée au cours de la même intervention chirurgicale.

67 souris et 67 rats roussards vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, six d'entre eux étant opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque animal subit une chirurgie d'une heure trente pour implanter un capteur de télémétrie, puis vit seul en cage jusqu'à quatre semaines, un isolement dont le porteur reconnaît qu'il crée un stress. S'y ajoutent un jeûne de deux à six heures, une injection de glucose et six microprélèvements de sang par incision de la queue. Le porteur compare les effets de la lumière sur la prise alimentaire chez une espèce nocturne et une espèce diurne, et affirme que ces travaux ne peuvent se faire ni sur organes isolés, ni en culture cellulaire, ni par modélisation informatique.

Objectifs

La lumière joue un rôle majeur sur la physiologie et la santé. Ce projet de recherche vise à étudier les effets de la lumière ambiante sur la prise alimentaire et le métabolisme au cours des 24 h. Les expériences seront menées en parallèle chez un modèle animal nocturne, la souris et chez un modèle animal diurne, le rat roussard. Dans ce projet de recherche, nous proposons de tester l’hypothèse selon laquelle l'exposition à la lumière optimise les comportements de prise alimentaire chez les espèces diurnes et nocturnes, par deux processus temporellement cohérents qui sont 1) les effets dépendants des horloges circadiennes et 2) les effets directs de la lumière sur le comportement. Nous proposons que les effets directs de la lumière favorisent la prise alimentaire de jour chez les espèces diurnes et inhibent la prise alimentaire de nuit chez les animaux nocturnes.

Bénéfices attendus

L’identification des effets directs de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme pourrait permettre de participer à la prévention et le traitement des troubles liés à la prise de nourriture et des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, par des approches de photothérapie ciblée et par des recommandations sur des horaires d’exposition à la lumière qui seraient à éviter.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 1h30 réalisée sous anesthésie générale et à un prélèvement sanguin terminal réalisé également sous anesthésie générale ou MODIFICATION si la méthode raffinée permet d'obtenir le volume sanguin nécessaire à toutes les analyses biochimiques après arrêt respiratoire de l'animal. Pour toutes les procédures les animaux devront être placés en cage inviduelle pour une durée maximal de 4 semaines. MODIFICATION: Pour calibrer le dispositif expérimental utilisé pour suivre la glycémie en continu, les animaux seront soumis au maximum à un jeun de 2h ou 6h selon l'espèce considérée, puis à 1 injection d'une solution glucosée calibrée et à 6 microprélèvements sanguins (0,6µL/prélèvement) (durée des mesures 2h) . Ces mesures pourraient être répétées une fois à une semaine d'intervalle des premiers prélèvements pour vérifier cette calibration.

Impact sur les animaux

Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement social d'une durée maximale de 4 semaines. La chirurgie d'implantation du capteur de télémétrie pourrait induire de l'inflammation, une perte de poids transitoire, une infection au site des sutures. MODIFICATION: L' incision de la queue nécessaire aux prélèvements de sang induit une douleur légère transitoire (durée 2h).

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour analyse post-mortem.

Remplacement

La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme et la détection de la lumière impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, rétine, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles) et des relais nerveux et hormonaux, l’investigation des interactions entre horloges circadiennes et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro ou de modéliser in silico la réponse de ce circuit multi-organes.

Réduction

Pour les tests in vivo circadiens et métaboliques, le nombre d’animaux proposé (n=12 par condition) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales recueillies dans des études antérieures. Pour l'étude des réponses hormonales et neuronales à la lumière (post-mortem), le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire et par condition lumineuse) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures . Notre suivi systématiquement longitudinal des animaux réduit significativement le nombre d’individus utilisés.

Raffinement

Les souris issues d'un fournisseur agréé seront soumies à deux semaines d'acclimatation aux nouvelles conditions d'animalerie avant le début des procédures. Le rongeur diurne est quant à lui hébergé dès le sevrage en cage individuel car les mâles de cette espèce sont très territoriaux et donc agressifs entre eux. Les souris seront ensuite placées en cages individuelles pour la durée des procédures ce qui genèrera un stress d'isolement social que nous limiterons par ajout de frisure en plus de l'enrichissement classique des cages à savoir bâton à ronger et coton pour faire un nid. La frisure permettra de soutenir la thermorégulation de la souris individualisée notamment tout en apportant un enrihcissement supplémentaire pour la construction du nid. La procédure invasive de chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie adaptée et la température corporelle des animaux est maintenues grâce à un tapis thermostaté relié à une sonde rectale durant toute la procédure. Dès l'anestéhsie et ensuite jusqu'au réveil les animaux sont maintenus sous lampe chauffante. L'état de santé des animaux est évalué une fois par semaine avant la procédure de chirurgie puis au minimum quotidiennement à l'aide d'une grille de score adapatée après. Des points limites spécifiques ont été établis pour limiter la souffrance animal en arrêtant la procédure dès que nécessaire. En post-chirurgie pour aider la récupération de l'animal de la nourriture gélifiée sera ajoutée au fond de la cage pour faciliter la prise de nourriture et hydrique. MODIFICATION: Après chaque prélèvement de sang, la queue des animaux sera tamponnée avec une compresse stréile imbibée d'anesthésique local ce qui permet de prendre en charge la douleur induite. Nous n'avons jamais observée d'inflammation ou de mutilation de la queue sur les deux espèces incluses dans le projet.

Choix des espèces

Pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, notre projet repose sur l’analyse comparative des réponses comportementales, physiologiques et neuronales entre un modèle animal nocturne et un modèle animal diurne. La souris est une espèce nocturne devenue un modèle classique en nutrition et en chronobiologie. C’est aussi un modèle incontournable en recherche animale par l’existence de nombreuses lignées transgéniques (y compris celles porteuses de mutations, celles avec gènes invalidés, ou avec gènes-rapporteurs). Une fois ce projet achevé, nous envisageons de rechercher les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris transgéniques exposées aux mêmes procédures expérimentales. Le modèle rongeurs diurnes sont des modèles expérimentaux appropriés pour la recherche biomédicale. Leur utilisation dans le projet présent est pertinente pour comprendre les différences de réponses entre espèces nocturnes et diurnes. C’est pourquoi les mêmes expériences seront faites en parallèle chez un rat diurne, et la souris nocturne. Jeunes adultes (2-4 mois) pour étudier un système circadien et un métabolisme matures et non-sénescents.

3 570 souris vont être utilisées, 2 380 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 1 190 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit jusqu'à cinq injections abdominales, porte un capteur de télémétrie implanté sous la peau et parfois une pompe délivrant un médicament en continu, passe trois échographies cardiaques sous anesthésie générale et vit jusqu'à huit semaines seul en cage. Toutes sont tuées pour des analyses post-mortem du cœur, l'étude portant sur les canaux ioniques du nœud sinusal et la bradycardie. Le porteur signale que l'implant de 1,6 gramme irrite parfois la peau et que l'isolement stresse les animaux, tout en affirmant qu'aucune des cinq libertés fondamentales n'est affectée.

Objectifs

La fréquence et le rythme cardiaque sont des facteurs très importants pour la qualité de la vie et la santé humaine. Définies comme des dysfonctions du rythme cardiaque, les arythmies sont des maladies très répandues avec des degrés de sévérité et gravité très variables, pouvant aller jusqu’à la mort subite. La bradycardie fait partie des arythmies les plus fréquentes. Elle se caractérise par une fréquence cardiaque trop basse (avec risque de syncope) pour répondre à la nécessité physiologique de l'organisme notamment face à l’effort. Elle est plus répandue chez la population âgée, mais peut aussi affecter de jeunes individus. La fréquence cardiaque est générée au niveau de l’oreillette droite du cœur dans la zone que l’on appelle « nœud sinusal ». Notre projet vise à mieux comprendre le rôle de protéines spécifiques, appelées canaux ioniques. Ces canaux ioniques assurent le transfert des particules chargées positivement ou négativement entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule. Ils sont impliqués au niveau du nœud sinusal dans la genèse et la régulation de la fréquence cardiaque. Ces canaux ioniques pourraient constituer de nouvelles cibles thérapeutiques dans la prise en charge de la bradycardie. En utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées qui impactent plusieurs canaux ioniques différents, nous allons étudier la génération et la régulation de la fréquence cardiaque. Cette étude se fera par la combinaison de mesures in vivo (électrocardiogrammes et échographies cardiaques) et d’études sur des prélèvements d’organes (cœur). Dans ces différentes approches, nous effectuerons divers traitements pharmacologiques connus pour réguler la fréquence cardiaque. Notre programme de recherche a trois objectifs : (i) Identifier le rôle de ces canaux ioniques dans la régulation de la fréquence cardiaque (ii) Comprendre la fonction de ces canaux dans la bradycardie et les troubles du rythme cardiaque (iii) Proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour corriger ces dysfonctions

Bénéfices attendus

L’intérêt de ce projet est de comprendre les mécanismes à la base de la génération et de la régulation cardiaque pour pouvoir à plus long terme proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la prise en charge de la bradycardie et des troubles du rythme cardiaque.

Procédures

Injections abdominales (injection hebdomadaire, durée de l'injection, environ 30 s). Chaque souris recevra au maximum 5 injections Implantation de capteurs permettant d'enregistrer la fréquence cardiaque, la température corporelle et l'activité. Ces capteurs seront implantés par chirurgie, sous anesthésie générale pour les placer sous la peau (implantation unique, durée totale de l'intervention : 30 minutes), Implantation de pompes permettant la délivrance chronique de médications. Ces pompes sont implantées par chirurgie, sous anesthésie générale pour les placer sous la peau (une fois, durée totale de l'intervention : 15 minutes) Echographies cardiaques réalisées sous anesthésie générale (3 échographies de 15 minutes environ / souris). Ces échographies sont réalisées à différents stades du protocole. Hébergement individuel maintenu pour une durée maximale de 8 semaines. 2 Injections d’anesthésiques plus une injection létale (durée de l'injection, environ 30 s)

Impact sur les animaux

Pour le premier lot d’animaux : L’implantation du transmetteur, en sous-cutané, dure approximativement 40 minutes. Cette intervention est réalisée une seule fois par souris. Au réveil, la souris doit s’habituer à la présence permanente d’un implant de 1.6 g placé dans son dos mais aucune des 5 libertés fondamentales n’est affectée. L’implant en sous-cutanée induit parfois des irritations au niveau de la peau située au-dessus du dispositif. La mise en place de la pompe osmotique peut également induire de légers problèmes cutanés et une faible inflammation. Chaque injection va induire une légère douleur liée à la piqure de l'aiguille. L'hébergement individuel des animaux, suite à l'implantation des capteurs de télémétrie, va causer du stress pour l'animal. Pour le deuxième lot d’animaux : L'injection de l’anesthésique va induire une légère douleur liée à la piqure de l'aiguille. Le prélèvement final peut entrainer une douleur qui est prise en charge par l’analgésie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

La génération et la régulation de la fréquence cardiaque sont des phénomènes complexes encore mal élucidés. L’activité du système nerveux et la tension artérielle font partie des multiples facteurs pouvant moduler le rythme cardiaque. Par conséquent, pour étudier le rôle des canaux ioniques impliqués dans la détermination de la fréquence cardiaque, nous sommes obligés de recourir à des êtres vivants. La souris est l'organisme modèle permettant ce genre d'étude. L'utilisation d'animaux demeure donc, à ce jour, la seule option pour évaluer avec précision et pertinence les mécanismes associés aux modifications de la fréquence cardiaque.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé grâce à un logiciel statistique, à notre expertise et aux données bibliographiques. Chaque animal servira à l’acquisition de plusieurs données à la fois afin de diminuer le nombre d’animaux utilisé dans les protocoles.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des environnements enrichis (paille en carton, igloo ou maison en carton). . Un suivi régulier sera appliqué dès le début de nos expériences par du personnel qualifié. Afin de diminuer le stress, les souris seront manipulées quotidiennement par les expérimentateurs avant chaque procédure expérimentale. La douleur induite par la chirurgie est prise en charge par un analgésique pendant et après l'anesthésie. Afin de garantir le bien-être des animaux, des points limites seront appliqués.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les techniques de modification génétique qui nous intéressent. Ces modifications génétiques sont l’outil qui nous permettra d’identifier les mécanismes qui nous intéressent dans ce projet. Bien que la fréquence cardiaque de la souris soit significativement plus élevée de celle chez l’humain, il a été montré que les modifications génétiques utilisées dans ce projet reproduisent fidèlement certaines maladies congénitales de l’automatisme cardiaque et du rythme. Le choix de l’espèce est donc approprié pour conduire le projet. Nos études seront réalisées avec des souris adultes. Bien que les bradycardies affectent aussi les enfants et les jeunes adultes, nos approches sont optimales uniquement sur des souris adultes (à partir de 2 mois). De plus, limiter l’étude au stade adulte permet l’observation de la fréquence cardiaque après la fin de croissance, sur un modèle stable.

Tués une heure ou une semaine après la manipulation, 70 porcs de 40 à 100 kg vont être utilisés, 50 dans des procédures menées sous anesthésie sans aucun réveil et 20 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie puis une ventilation liquidienne totale, ses poumons remplis d'un liquide destiné à refroidir l'organisme, avec des prélèvements sanguins tout au long de l'intervention. Le porteur signale l'insuffisance respiratoire comme principal effet indésirable possible, tout en indiquant qu'elle n'est pas attendue avec les versions actuelles du dispositif. L'essai clinique chez l'humain a commencé en 2025 avec 24 patients prévus, et ces 70 porcs servent à former les praticiens hospitaliers à l'appareil et à valider d'éventuelles modifications demandées par l'agence du médicament.

Objectifs

L’arrêt cardiaque extra-hospitalier est à l’origine d’environ 700 000 décès chaque année en Europe et aux Etats-Unis. Afin d’améliorer la prise en charge de ces patients, une piste thérapeutique prometteuse est le refroidissement rapide de l’organisme après la réanimation d’un arrêt cardiaque. Le laboratoire conduit depuis plusieurs années un projet visant à développer une stratégie de ventilation liquide hypothermisante (VLT), qui consiste à ventiler les poumons avec des liquides permettant des échanges gazeux après un arrêt cardiaque. Récemment, un dispositif de ventilation liquidienne a été développé par le laboratoire et l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) a autorisé la conduite d’un essai clinique chez l’humain (essai Overcool) qui a débuté en 2025 et prévoit d’inclure 24 patients. Il est donc nécessaire de former les praticiens hospitaliers de chaque centre référent pour l’utilisation du ventilateur liquidien chez les patients. En parallèle de l’essai clinique Overcool, des tests pré-cliniques pourront être aussi nécessaire de façon à tester d’éventuelles modifications du dispositif suites aux premiers résultats cliniques et à d’éventuelle préconisations de l’ANSM ou du comité scientifique supervisant l’essai clinique. Ces modifications sont pour l’instant inconnues mais pourraient concerner des modifications de fréquence respiratoire ou de volume courant utilisé pendant la procédure.

Bénéfices attendus

Nous évaluerons la capacité des praticiens hospitaliers à se familiariser avec la procédure de VLT qui est spécifique et différente avec les procédures usuelles de ventilation conventionnelle en service de réanimation. Ainsi nous permettrons au praticien de gérer de manière autonome le ventilateur. Suite aux inclusions de patients dans l’essai clinique, il est envisagé de réajuster divers éléments du dispositif qui nécessiteront une validation in vitro et chez l’animal avant implémentation sur le dispositif clinique.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale et à une ventilation liquide. Des prélèvements sanguins à l'état anesthésié seront réalisés tout le long de la procédure. Les animaux seront mis à mort après 1 heure ou 1 semaine de suivi au décours de la ventilation liquidienne

Impact sur les animaux

Le principal effet indésirable susceptible d’être provoqué par la ventilation liquidienne totale est une insuffisance respiratoire. La fréquence respiratoire des animaux sera contrôlée durant le suivi. Cet effet indésirable n’est pas attendu avec les versions actuelles qui contrôlent précisément les paramètres ventilatoires.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole.

Remplacement

Dans le cadre de la formation des praticiens, le dispositif de ventilation liquide doit être utilisé in vivo pour évaluer l’ensemble de ses performances et la sécurité d’emploi. En effet, les effets du dispositif sont très intégratifs avec l’induction d’une hypothermie par l’intermédiaire du poumon et la nécessité d’un maintien des échanges gazeux. Le suivi des échanges gazeux, des paramètres hémodynamiques et des échanges thermiques entre les différents compartiments de l’organisme ne peut se faire que in vivo.

Réduction

Ce projet est basé sur la formation des praticiens hospitaliers et l’évaluation de validation technologique du ventilateur nous prévoyons d’utiliser un total de 70 animaux. Afin de limiter le nombre de tests sur les animaux, la plupart des évaluations sont effectuées in vitro pour valider les performances du dispositif sur tous les éléments possibles dans ces conditions.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés dans des boxes avec des copeaux de bois au sol et enrichissement avec des jouets en plastique. Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques puissants, tout au long des procédures. Les animaux réveillés seront surveillés quotidiennement.

Choix des espèces

Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme au vu de sa masse corporelle, de son anatomie cardiaque et des valeurs usuelles des paramètres hémodynamiques systémiques et cérébraux. Porcs de 40 à 100 kg afin de disposer d’un volume pulmonaire comparable à des patients humains adultes.

Réutilisées d'une gestation à l'autre, 42 femelles macaques de cette colonie enchaînent jusqu'à six césariennes chacune, à raison d'une tous les onze à quinze mois. 59 macaques à longue queue sont comptabilisés au total, quinze opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 44 soumis à des procédures d'un niveau de souffrance modéré, deux rendus à l'élevage. Les fœtus, 75 en tout, sont tués pour prélever leur cerveau et étudier la formation du cortex. Ceux de moins de 105 jours de gestation ne sont pas comptés dans les effectifs du projet, ce que le porteur justifie par leur utilisation avant le dernier tiers du développement.

Objectifs

Nous avons pour but de caractériser les mécanismes biologiques qui contrôlent la mise en place les caractéristiques structurelles uniques du cerveau humain. La compréhension de ces processus biologiques fondamentaux est un pré-requis pour progresser dans l'étiologie des pathologies neuro-développementales qui sont à l'origine de troubles invalidants (épilepsie, autisme, schizophrénie, etc). Le matériel histologique humain prénatal est rare et la préservation des tissus souvent non optimale, rendant l'interprétation des résultats difficile. Le singe représente un maillon préclinique incontournable. Des travaux récents ont en effet montré que certains mécanismes gouvernant le développement du cerveau sont communs au singe et à l’homme.

Bénéfices attendus

Le bénéfice est de permettre d’avancer dans la compréhension du développement du cortex cérébral de l’homme. Notre projet constitue une étape incontournable pour faire avancer la recherche clinique sur les pathologies neurodéveloppementales chez l’homme.

Procédures

Les femelles auront plusieurs anesthésies générales pour les échographies et les césariennes. Les femelles participeront à un maximum de 6 césariennes selon l’avis de notre vétérinaire référente. En moyenne une femelle subit une césarienne tous les 11 à 15 mois

Impact sur les animaux

L'anesthésie générale provoquera en elle-même un inconfort au réveil avec d'éventuelles nausées. La césarienne pourra susciter des douleurs post-opératoires pendant le temps de la cicatrisation, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens.

Devenir

Nous avons une colonie de reproduction de Macaques cynomolgus composée d’environ 44 femelles pubères âgées de 4 à 8 ans et 4 mâles qui nous permettront d'obtenir 75 embryons (mis à mort pour recuperer leur cerveau), 45 (9/an) utilisés pour l'étude des précurseurs de la corticogénèse à différents stades embryonnaires (de E35 à E120) et 30 (6/an) utilisés pour des analyses génétiques (sc RNA-Seq, miRNA-Seq). A la fin de la procédure, les animaux pourront être réutilisés pour d’autres procédures ou placés dans des structures d’accueil appropriées.

Remplacement

Le macaque cynomolgus possède un cortex cérébral gyrencéphalique dont l’organisation anatomique et l’ontogénèse présentent des similitudes importantes avec le cortex humain, contrairement à d’autres espèces de primates (marmoset, microcèbe). Le génome du macaque est bien décrit et des atlas neuroanatomiques et d’expression de gènes sont disponibles pour cette espèce. La corticogénèse du macaque est bien caractérisée et a des caractéristiques communes avec le développement du cortex cérébral humain, notamment en ce qui concerne l’organisation des zones germinales. Le macaque constitue donc un modèle de prédilection pour étudier les mécanismes de spécification des aires corticales et les mécanismes développementaux responsables de la mise en place de la connectivité des aires corticales.

Réduction

Les femelles pourront être utilisées pour des gestations successives sauf avis contraire du vétérinaire. En moyenne une femelle subit une césarienne tous les 11 à 15 mois (estimations statistiques réalisées sur une vingtaine d'années). Nous utilisons des tranches organotypiques de cerveaux embryonnaires que nous maintenons en culture pendant 8 à 15 jours pour des observations de la prolifération et de la migration en cinétique videomicroscopique. Afin de minimiser le nombre d’embryons nous avons fait réaliser sur mesure une platine d'observation du microscope biphotonique nous permettant de doubler le nombre de tranches organotypiques observées (48 tranches) ce qui permet de réduire le nombre d’embryons utilisés d'un tiers. Nous menons en parallèle des recherches sur les capacités de différenciation neuronale des cellules souches pluripotentes (cellules souches embryonnaires et cellules souches pluripotentes induites) de primate ce qui permet d'étudier certains aspects de la différentiation des neurones du cortex de primate, ce qui permet de ne pas avoir recours à des tranches organotypiques issues de fœtus.

Raffinement

Nous entrainons les animaux à coopérer (conditionnement par renforcement positif) pour certaines procédures de manière à diminuer le stress de l’animal (déplacement en cage de transfert pour mise au mâle ou changement de volière) et pour des actes non invasifs et non douloureux comme les échographies de contrôle de manière à éviter le recours à l’anesthésie. Actuellement un tiers des femelles sont suffisamment conditionnées pour réaliser cet acte en vigile. Les femelles subissent une anesthesie générale pour la réalisation des césariennes et une fiche de suivi après la chirurgie nous permet d’évaluer en fonction de critères spécifiques les signes indicateurs de gêne ou de souffrance et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire.

Choix des espèces

Nos travaux sur la corticogénèse chez le primate non-humains nécessite un accès à des embryons d'âge précis. Les techniques de substitution (organoïdes cérébraux) ne peuvent remplacer le tissu vivant pour l’analyse des mécanismes cellulaires et moléculaires qui opèrent in vivo. En effet, les organoïdes obtenus in vitro permettent d’obtenir un échantillon de tissu cérébral sans identité régionale particulière, déconnecté de son environnement physiologique (par ex structures sous corticales, tronc cérébral) et maintenu dans des conditions artificielles qui induisent un stress cellulaire important. Ceci conduit à des anomalies de l’identité des progéniteurs corticaux et de leur différenciation dans les organoïdes. De plus, l’expression des gènes dans les organoïdes cérébraux varie en fonction de la composition du milieu et des conditions de culture, conduisant à des résultats qui ne reflètent pas la situation in vivo. Animaux matures: Femelles de plus de 4 ans et mâles de plus de 5 ans. Les mâles sont utilisés uniquement comme reproducteurs lors des reproductions naturelles et ils ne sont pas comptabilisés dans les animaux utilisés. Fœtus âgés de 35 à 130 jours embryonnaires (durée gestation 165 jours). Comme indiqué en 3.4.10, les fœtus âgés de 105 jours et moins (dans les deux premiers tiers de gestation) ne sont pas comptabilisés dans le nombre d'animaux car ils sont utilisés avant le dernier tiers de leur développement. Nous projetons d’étudier 15 fœtus âgés de plus de 105 jours (dans le dernier tiers de gestation) pour les analyses moléculaires in situ.