Procédures sans réveil
Rôle et mécanisme d’action de la chromogranine A dans la régulation de la sécrétion de neuropeptides hypothalamiques impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
306 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 234 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections intrapéritonéales, des prélèvements sanguins caudaux répétés six à dix fois, des mises à jeun de seize heures et des tests de tolérance au glucose, à l'insuline et au pyruvate, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur étudie le rôle de la chromogranine A dans la sécrétion de neuropeptides hypothalamiques réglant la glycémie. Les retombées contre l'obésité et le diabète, présentés comme la pandémie de "diabesity", restent lointaines, et il affirme qu'une telle approche "très intégrée" n'est possible que sur "l'animal entier".
Objectifs
Les systèmes neuropeptidergiques hypothalamiques sont récemment apparus comme des liens couplant l’équilibre énergétique et l'homéostasie du glucose. Un dysfonctionnement de l'un de ces systèmes pourrait ainsi jouer un rôle majeur dans le développement de pathologies telles que l'obésité et le diabète. En effet, l'obésité est fréquemment associée au diabète de type II, et leur progression significative et synchrone depuis 30 ans fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un véritable enjeu de santé publique. Au sein de notre Unité, le système peptidergique 26RFa/GPR103 a été identifié et démontré comme étant impliqué dans le contrôle du comportement alimentaire de par son important effet orexigène. De plus l’expression du 26RFa est augmentée chez les animaux obèses, suggérant qu’il pourrait jouer un rôle dans le développement et le maintien de l'obésité. Le 26RFa possède par ailleurs un robuste effet anti-hyperglycémiant central, conséquence de sa capacité à relayer l’action centrale de l’insuline. Au sein de notre équipe, nous avons rapporté le rôle essentiel de la protéine chromogranine A (CgA) dans la formation des granules de sécrétion, organites permettant le stockage et la sécrétion des neuropeptides. De manière intéressante, les souris dont le gène exprimant la CgA a été invalidé de manière globale sont hypertendues et obèses. Par ailleurs, nous avons observé récemment que les neurones 26RFa expriment d'autres neuropeptides ainsi que la CgA. Sur la base de ces données, nous proposons dans le présent projet d’étudier le rôle de la CgA dans les mécanismes moléculaires de la sécrétion des neurones 26RFa en analysant l’impact de la modulation de l'expression de la CgA dans les neurones 26RFa sur la sécrétion du système peptidergique 26RFa, la régulation centrale de l’homéostasie du glucose et le déclenchement de l’obésité et du diabète.
Bénéfices attendus
L’administration centrale de 26RFa a permis une première évaluation de l’effet du 26RFa central dans la régulation de l’homéostasie glucidique par le cerveau. Il a notamment été observé que le 26RFa exerce un puissant effet anti-hyperglycémiant lorsqu’il est administré en intra-cérébro-ventriculaire. Néanmoins, le rôle précis des différentes sous-population de neurones à 26RFa dans la régulation de la glycémie et les mécanismes d’action mis en jeu restent inconnus. De plus, l’interaction du système neuropeptidergique 26RFa/GPR103 avec d’autres systèmes neuropeptidergiques hypothalamiques reste également à l’étude. Nos données récentes montrant la colocalisation du 26RFa et des orexines dans les mêmes neurones de l’aire hypothalamique latérale suggèrent néanmoins que ces deux systèmes pourraient être impliqués ensemble et interagir au sein de l’hypothalamus latéral, pour réguler la glycémie. Ainsi, la caractérisation des différentes populations de granules de sécrétion, en terme de contenu en neuropeptides et granines, au sein des neurones 26RFa devrait permettre une meilleure compréhension de la capacité sécrétoire de ces neurones. Ces données, associées à l'invalidation de l'expression de la CgA au sein de cette population neuronale permettront de caractériser les rôles respectifs de ces neuropeptides dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique et des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant leur action.
Procédures
Les animaux seront soumis à divers types d'expérimentations et de prélèvements soit en condition vigile, soit sous anesthésie. Les injections intra-péritonéales durent 3sec, avec procédure globale : contention+injection ip 15-20 sec. La perfusion intra-cardiaque dure moins de 7 min ; l'anesthésie induite : 5 min, renouvelée si nécessaire. Les animaux subiront des prélèvements sanguins caudaux d'un volume total de l'ordre de 40 μL par expérimentation. Les expérimentations sont répétées 6 à 10 fois avec une semaine de repos minimum entre chacune d'entre elles. - mesure de glycémie : mise à jeun de 16h, puis prélèvements sanguins caudaux (2 prélèvements de 1 sec chacun et de 2µl, toutes les 15 min, 9 fois entre T0 et T120 min). - test de tolérance au glucose : prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 200µl de glucose à T0 (2g/kg poids corporel) - tolérance à l’insuline : mise à jeun de 6h, puis prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 225µl d’insuline à T0 (0,75UI/kg poids corporel). - test de tolérance au pyruvate : mise à jeun pendant 16h, puis prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 200µl de pyruvate à T0 (2g/kg poids corporel). - test de sécrétion d’insuline : mise à jeun pendant 16h, puis prélèvements sanguins caudaux de 10-15µl à T0, T15, T30 et T60 min après injection intra-péritonéale de 200µl de glucose à T0 (2g/kg poids corporel). L'hébergement en cage de calorimétrie indirecte permettra d'évaluer les paramètres métaboliques des animaux : 7 jours d’habituation en cage mimant la cage de calorimétrie indirecte, puis séjour de 7j en cage de calorimétrie indirecte avec 96h de mesures contrôles (prise alimentaire, hydrique, consommation d’O2, production de CO2, déplacements), puis 24h en condition de jeune puis 48h en condition de renutrition.
Impact sur les animaux
Les tests physiologiques auxquels seront soumis les animaux peuvent avoir un impact léger à modéré selon les procédures. Des signes de souffrance peuvent être observés : dégradation de l'état général de l’animal avec modifications de l’apparence physique externe (plaies, mauvais aspect du pelage, poil hérissé, dos voûté), et/ou changements du comportement (prostration, léthargie, agressivité inhabituelle lors des manipulations, vocalises), perte de poids importante.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux ne peuvent être réutilisés dans de nouvelles expérimentations sans compromettre les résultats et sont mis à mort.
Remplacement
Cette étude a l’avantage d’aborder, en parallèle, l’étude neuroanatomique de la chromogranine A (CgA) et de sa fonction régulatrice du système peptidergique 26RFa. Elle permettra la compréhension du rôle de la CgA dans la sécrétion de 26RFa, plus particulièrement par les neurones hypothalamiques, et ainsi la compréhension de la régulation centrale de l'homéostasie glucidique, en condition physiologique. Une telle approche, très intégrée, n’est rendue possible que par les études in vivo.
Réduction
Compte tenu de la variabilité inter-individuelle des processus physiologiques étudiés, nous utiliserons des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. De plus, une partie des tests physiologiques prévus pour évaluer l’homéostasie glucidique sera réalisée successivement sur une même souris et chaque souris sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d’une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précédent et de stabiliser leur poids corporel. Pour les groupes dédiés au prélèvement des explants hypothalamiques ou cérébraux, les groupes de souris pourront être réduits à 10 animaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux reproducteurs seront maintenus à trois par cage pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de matériel pour construire un nid + dôme en plastique rouge pour s'y réfugier). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par injection intra-péritonéale d'analgésiques, répétée après 4 heures si nécessaire.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre de façon globale, le rôle de la CgA dans la sécrétion des neuropeptides par les neurones 26RFa et la régulation hypothalamique de l’homéostasie glucidique. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coût d’entretien réduits, fortes performances reproductives. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude, la physiologie adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.
Exploration de la dysfonction endothéliale et de ses complications vasculaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
5 274 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie opérée sans réveil. Sur les unes, les expérimentateurs prélèvent des vaisseaux sous anesthésie profonde, sur d'autres ils pratiquent des chirurgies de la patte avec pose de cathéter pour perfuser des composés et mesurer la réponse des vaisseaux. Le porteur signale peur, stress, hypothermie et douleur liés aux manipulations et aux actes chirurgicaux. Il reconnaît qu'aucun modèle in vitro ne remplace complètement un organisme vivant et annonce des études sur cellules humaines pour limiter le nombre d'animaux.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer l'impact de l'activité de certains récepteurs situés sur l'endothélium des vaisseaux qui pourraient être une cible thérapeutique pour la prise en charge des pathologies cardiovasculaires. Nous resoumettons le projet au regard des résultats obtenus. La mise à jour porte sur l'ajout des nouvelles lignées de souris ainsi que le besoin de réaliser de nouvelles procédures expérimentales. Ces ajouts tiennent compte de la règle des 3R. Le projet scientifique avait été antérieurement évalué positivement par l'ANR (Agence Nationale de la Recherche). Ce projet permettra de nouvelles avancées dans la compréhension des mécanismes de la dysfonction endothéliale qui contribuent au développement des anomalies de l'arbre vasculaire et en particulier de l'athérome. Il fournira de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de la recherche fondamentale, ce projet permet de caractériser au niveau de l'endothélium des vaisseaux, le rôle de certains récepteurs ou cibles dans le bon fonctionnement du vaisseau (état contractile nécessaire au déplacement du sang). Il permet aussi d'évaluer la contribution de ces cibles dans les modifications observées de la paroi des vaisseaux (remodelage vasculaire) au cours des variations de débit sanguin et de pression de perfusion. Sur ce terrain, il sera aussi étudié leur contribution dans le développement des lésions d'athérome au cours d'un régime gras déséquilibré. Des travaux publiés sur des cellules endothéliales en culture, montrent que l'activation de ces récepteurs favorise la production de composés/médiateurs par la cellule jouant un rôle protecteur contre les mécanismes pro-inflammatoires et pro-athérogènes. Sur ces avancées, il est attendu d'observer une amélioration des paramètres vasculaires (amélioration de la réponse vasodilatatrice, diminution des lesions sur les parois) et métaboliques (diminution de l'inflammation, amélioration du diabète,et de la lipidémie) chez les animaux recevant des composés à l'étude capables d'activer ces récepteurs. Il est aussi attendu l'absence d'amélioration voire une aggravation de la maladie (développement de lésions d'athérome, diminution de la lumière du vaisseau par développement de la paroi) chez les animaux transgéniques invalidés pour les récepteurs ou cibles moléculaires d'intérêt. Ce projet permet aussi dans le cadre de la recherche translationnelle de pré-établir des données expérimentales de sécurité et aussi d'étude des effets potentiels dans l'organisme pour la mise au point de futurs médicaments.
Procédures
Nous avons estimé un besoin de 5274 animaux dans le projet de recherche. Afin d’étudier les propriétés vasodilatatrices de nouvelles molécules synthétisées ainsi que, leurs effets sur les cellules constitutives de la paroi du vaisseau, des vaisseaux seront prélevés sur les animaux au cours d’une anesthésie profonde induite par l’administration dans l’abdomen (une piqûre) d’un mélange anesthésique (durée : quelques secondes). La durée du prélèvement est estimée à 10 minutes (1664 animaux sont concernés). D’autres animaux subiront des actes de chirurgie (décrits ci-dessous) sous anesthésie profonde réalisés par l’administration dans l’abdomen (une piqûre) d’un mélange anesthésique (durée: quelques secondes). Ils recevront aussi un analgésique puissant par voie sous – cutané (une piqûre) afin de réduire la douleur en pré-ou post-opératoire. Parmi, les chirurgies, des animaux subiront une chirurgie sur la patte arrière de durée estimée à 45 minutes, afin d’étudier, par la suite, chez l’animal vigile, la réponse vasodilatatrice du vaisseau au cours de la perfusion de composés administrés par le biais du cathéter préimplanté dans la patte arrière (640 animaux). D’autres subiront un acte chirurgical au niveau du cou d’une durée estimée de 10 minutes, au cours duquel une lésion vasculaire (brûlure) sera opérée en surface du vaisseau (1408 animaux) afin d’étudier par la suite chez l’animal vigile, la cicatrisation/régénération du vaisseau. D’autres animaux subiront une chirurgie du cou afin de réaliser une ligature sur des vaisseaux du cou pour d’étudier sur ces modèles vigiles, les effets protecteurs des composés sur la paroi du vaisseau. Le temps mis pour effectuer une ligature sur des vaisseaux du cou est estimé à 15 minutes sous anesthésie profonde (1472 animaux). Enfin, un étude de pharmacocinétique sera effectuée sur les composés à l’étude afin de connaître l’évolution des concentrations circulantes dans le temps. Les composés seront administrés à l’animal vigile à la suite d’une injection dans l’abdomen (une piqûre, durée de l’administration, de quelques secondes) et le devenir ou la concentration circulante de ces composés, sera établie au cours du temps dans le sang de l’animal. Le sang sera prélevé 5 fois à la queue et la durée du prélèvement à chaque fois (ou temps) est estimée à 1minute (90 souris vigiles).
Impact sur les animaux
Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, leur isolement dans certaines procédures, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant un acte chirurgical. Une nuisance de l'anesthésie est d'induire une hypothermie, une sensation de fatigue en période de réveil, une petite douleur au point d'injection. D'autres nuisances possibles, sont la sensation de fatigue, la douleur ou de la fièvre qui peuvent être observées au cours des actes chirurgicaux où l'expérimentateur pose à demeurre une cathéter intraveineux ou une sonde à ultrasons de mesure du débit sanguin. Les actes chirurgicaux portés sur les vaisseaux du cou (carotides) peuvent induire au réveil, une douleur locale gênant les mouvements de la tête en particulier pour la prise alimentaire. L'animal peut aussi ressentir au réveil, de la fatigue et développer une fièvre.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Ceci est nécessaire afin de prélever les tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses. Ces examens donnent des informations complémentaires aux données mesurées sur l'animal vivant. Ils permettent de comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu dans un tissu ou organe, le développement des lésions au cours du temps, et, les cellules impliquées. Ces prélèvements permettent aussi de réduire le nombre d'animaux dans les expérimentations.
Remplacement
Bien qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant, des études in vitro sur des lignées de cellules endothéliales humaines sont prévues pour comprendre les réactions biochmiques immédiates à l'échelle de la cellule et limiter dans la mesure du possible l'utilisation des animaux à cette fin (réduire). Les animaux sont prévus dans ce projet, pour explorer dans le temps, et dans un organisme vivant, les effets biologiques des molécules administrées sur les paramètres cardiovasculaires et métaboliques. C'est pourquoi, ils ne peuvent être substitués par d'autres modèles d'étude.
Réduction
1/Plusieurs données peuvent être obtenues avec un même animal : tests de tolérance au glucose, prélèvements de tissus, prélèvement de plasma pour étude des lipoprotéines (profils) prélèvement de foie ,... 2/ Une réflexion biostatique est réalisée en amont de la procédure/expérience, pour limiter le nombre d'animaux. Cette réflexion implique la recherche bibliographique et l'examen de travaux similaires avec le nombre d'animaux nécessaires pour démontrer une différence statistiquement significative. Elle implique aussi l'utilisation d'un logiciel de statistique pour estimer sur la base de précédents travaux effectués ou en cours de réalisation, le nombre d'animaux nécessaires pour chaque expérimentation à venir. 3/La formation et l'encadrement des expérimentateurs dans les procédures permet d'optimiser l'obtention de mesures/données fiables et interprétables sur un faible nombre d'animaux. 4/ Les animaux seront utilisés dans les expériences/procédures jugées indispensables en fonction de l'avancée du projet.
Raffinement
Pour optimiser l'expérimentation, la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire, voire supprimer la douleur, le stress et améliorer le bien-être des animaux seront mises en place : - les animaux seront élevés et hébergés dans une animalerie agréée - les moyens pour limiter le stress aux animaux sont appliqués: enrichissement des cages, animaux invités à coopérer dans les actes non invasifs et non douloureux (exemple: test de tolérance au glucose), expériences réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur - en cas de transport de l'animal, un transporteur agrée pour transport d'animaux sera réquisitionné - des points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure seront établis - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après l’opération (des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pour réduire /supprimer la douleur) - la réduction de la durée de certaines études (surtout toxicologiques) - la mise en place de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
Nous souhaitons d'utiliser la souris pour plusieurs raisons: Nous disposons d'une grande expertise de l'utilisation de cet animal (manipulation, procédures chirugicales, expérimentations spécifiques). Nous disposons aussi d'outils d'exploration des effets vasculaires des molécules étudiées appliqués aux vaisseaux de souris. Dans la littérature, les effets vasculaires de l'apoA-I sont pour beaucoup décrits avec les souris (sauvages et transgéniques) ce qui constitue une base pour notre recherche. Des souris transgéniques, porteuses de mutations sur des gènes qui nous interessent, sont disponibles, et, nous permettent de réaliser le projet.Les souris sont utilisées à partir de 8 semaine de vie. A cet âge, elles pourront débuter le régime gras, ce qui est classique dans les études explorant la mise en place de l'athérome au cours du développement de l'animal. Le régime gras sera maintenu sur 30 à 40 semaines maximum. Les différentes explorations sont prévues sur des animaux âgés de 8 semaines à 50 semaines maximum.
Corrélats corticaux de l’activité oscillatoire du noyau subthalamique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
410 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, la plupart dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et quatre-vingt-dix opérés sans réveil. Ils subissent une chirurgie de quatre à six heures pour implanter des électrodes dans un noyau profond du cerveau, une partie recevant aussi un cathéter, afin d'étudier la recherche compulsive de cocaïne et ses marqueurs électriques. Le porteur évoque une gêne liée au bloc de ciment dentaire fixé sur la tête, une perte de poids et un isolement des animaux après l'opération. Il mentionne des tests comportementaux "connus et maîtrisés" sans les détailler, et affirme que l'étude de la consommation exige un animal vigile et libre de ses mouvements, jugeant le rat irremplaçable.
Objectifs
L’un des enjeux actuels de la recherche sur les addictions est de comprendre pourquoi seuls quelques usagers (15-20 %) développent des comportements de recherche/consommation pathologiques. Dès lors, identifier les individus les plus vulnérables représenterait une avancée critique en termes de politique de prévention et de prise en charge, mais de tels biomarqueurs prédictifs de l’addiction n’ont jusqu’alors pas été caractérisés chez l’homme. Nos résultats récents obtenus chez le rat indiquent que l’activité électrique oscillatoire du noyau subthalamique (NST) pourrait prédire la future émergence de la recherche compulsive de cocaïne. Toutefois, la position profonde de ce noyau, nécessitant d’y implanter des électrodes d’enregistrement, attenue le potentiel translationnel de ce biomarqueur. Il est donc nécessaire de trouver des corrélats corticaux qui refléteraient l’activité du NST, permettant ainsi d’effectuer des enregistrements non-invasifs. L’objectif du projet est de rechercher un équivalent de ces activités oscillatoires en surface, au niveau des cortex moteur et préfrontal chez le rat et de confirmer son caractère prédictif sur l’émergence de la recherche compulsive de drogue.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de déterminer s’il existe au niveau cortical un corrélat de l’activité pathologique du NST, qui permet d’identifier les futurs individus compulsifs. La caractérisation d’un tel marqueur en ‘surface’ aura de fortes répercussions translationnelles, puisqu’il permettrait de détecter les individus vulnérables à l’addiction, de manière non-invasives, avant l’apparition de comportements pathologiques de recherche et de consommation de drogues.
Procédures
L'ensemble des animaux de ce projet sera soumis au moins une fois à un acte chirurgical (4-6h). 90 animaux seront soumis à un seul acte chirurgical (implantation d'électrodes) dans le cadre d'une procédure sans réveil. 280 animaux subiront deux actes chrirurgicaux (cathéter puis implantation d'électrodes, 90-120minutes) dans le cadre d'une procédure avec réveil
Impact sur les animaux
* Durant les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. L’implantation d’électrodes peut aussi engendrer une gêne initiale, due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. Les animaux sont suivis quotidiennement les jours suivant l’opération afin d’anticiper et de soulager une nuisance potentielle. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période.
Devenir
A l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort, et leur cerveau sera prélevé pour études histologiques ou investigations électrophysiologiques
Remplacement
Ce projet a pour but d'étudier l'état fonctionnel d'un réseau cérébral dans une pathologie précise. L'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude.
Réduction
Nous utilisons le calcul de puissance lors de la planification des expériences : ce calcul permet de fixer un effectif tel que l’on ait 80% chances de vérifier notre hypothèse pour un seuil de significativité́ inferieur à 5%. Ce calcul nécessite de connaitre au préalable la taille de l’effet et la variabilité́ des mesures, ce qui n’est pas toujours possible. Il convient également de prendre en compte les aléas inhérents à ce type d’étude, tels que le risque d’infection, de cathéter bouché et/ ou de mauvais placements des électrodes, qui peuvent nous amener à exclure certains individus de l’étude. Ainsi, dans l’optique de limiter le nombre d’animaux à un strict minimum ne pas utiliser d’animaux plus que nécessaire, nous analyserons régulièrement les données expérimentales. Nous effectuerons des tests de puissance statistique a posteriori afin de calculer la robustesse statistique (puissance >0,8 pour un p < 0,05) de nos résultats. Après obtention d’un effet robuste pour une condition donnée, nous cesserons de tester cette condition expérimentale.
Raffinement
Suivant la chirurgie et pour le reste de l’expérience, les animaux seront hébergés seul, afin de limiter d’éventuelles bagarres entre congénères qui pourraient dégrader le matériel d’enregistrement préalablement implanté. Les animaux auront un accès ad libitum à l'eau. La nourriture sera contrôlée afin de garder les animaux motivés. Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton…changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). Nos expériences impliquent un contact quotidien avec les animaux (flush des cathéters, protocoles comportementaux…), facilitant ainsi le suivi individuel des animaux, nous permettant de réagir immédiatement et de manière appropriée en cas de besoin. En cas de signes de souffrance (prostration, poils hérissés, absence de toilettage, dos courbé...) et/ou de perte importante de poids, l’animal aura un accès ad libitum à une nourriture enrichie et un traitement antidouleur pourra être administré si besoin (méloxicam 0,5mg/kg, 0,25ml, sc). La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est réalisée par des personnels compétents. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. En effet, les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l'homme. Des rats adultes (9-10 semaines, environ 300-350g), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique, seront utilisés.
Surexpression de DNM2 par croisement génétique pour le traitement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth liée à DNM2.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil ou de gravité modérée. Elles subissent des tests comportementaux, suspension à une grille retournée, tapis roulant et barre crantée, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie sans réveil, pour tester une modulation génétique de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Le porteur indique que le modèle ne présente aucun signe de douleur au départ mais que la modulation du gène peut provoquer une faiblesse musculaire. Toutes les souris sont tuées à huit semaines pour une étude histologique, le porteur affirmant qu'une étude sur cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même pour évaluer force et coordination.
Objectifs
Le but de ce projet est de développer une preuve de concept thérapeutique pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) en utilisant des modèles de souris. La maladie se manifeste dans l’enfance par une faiblesse musculaire distale, une perte sensorielle et un déficit de coordination évoluant vers une incapacité motrice chez les patients adultes. La CMT est caractérisée par une faiblesse musculaire et des anomalies de gaines de myéline qui entourent et isolent les fibres nerveuses. Ces caractéristiques sont retrouvées chez les modèles souris de la CMT. Le but de notre étude est d'utiliser ces souris et de moduler l'expression du gène impliqué dans la maladie pour tenter d'atténuer les symptômes musculaires et nerveux. Nous réaliserons cette modulation par des techniques de croisement génétique.
Bénéfices attendus
Cette étude va permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques à l’origine de la maladie, causant des défauts à la fois dans le tissu musculaire et dans le tissu nerveux. Ce projet pourrait également conduire à une preuve de concept thérapeutique pour une maladie aujourd’hui incurable.
Procédures
Une partie des animaux (14) sera utilisée pour évaluer le phénotype des souris transgéniques (analyses purement observatoires de la naissance à 8 semaines). Une partie sera utilisée uniquement pour les croisements (21 ou 42). L’autre partie des animaux (entre 80 et 160 en fonction des résultats obtenus) seront soumis à une série de tests comportementaux pour évaluer la force musculaire et la coordination motrice. Pour évaluer leur force générale, leur durée de suspension à une grille retournée sera mesurée (durée 3x60s). Pour évaluer leur coordination motrice, les animaux se déplaceront sur un tapis roulant (max 60s) et une barre crantée (10x30s environ). Pour évaluer la force musculaire développée, la mesure des propriétés contractiles se fera sous anesthésie générale (procédure d’une heure, sans réveil).
Impact sur les animaux
Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Pour les animaux transgéniques, la modulation d’expression du gène d’intérêt peut engendrer une faiblesse musculaire, nous effectuerons une étude de phénotype dommageable. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : pour la mesure de force générale, le fait d’être suspendu à une grille engendre du stress physique chez l’animal.
Devenir
Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 semaines après caractérisation comportementale. Une étude histologique des tissus affectés sera ensuite effectuée.
Remplacement
Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.
Réduction
Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par sexe et par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.
Raffinement
Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement quotidiennement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. Après le sevrage, les animaux seront hébergés par groupe de 2 à 5 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. La température sera maintenue constante et un cycle de 12 heures jour/nuit sera respecté. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. La pesée des animaux sera réalisée 1 fois par semaine. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Si les animaux transgéniques sont très faibles, de la nourriture en gel leur sera procurée. La plupart des tests réalisés sur les animaux dans cette étude sont non invasifs, ce qui limite la probabilité d’apparition de douleur. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques, permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure pour maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. En cas de douleur observée au cours de l’étude, un analgésique sera administré (buprénorphine à différentes doses selon l'intensité de la douleur). L'étude sera stoppée prématurément si nécessaire pour éviter des douleurs aiguës pendant de longues périodes.
Choix des espèces
Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur le la coordination motrice et la force musculaire seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice sur les paramètres décrits ci-dessus ne peut être mesuré. Pour moduler l'expression du gène d’intérêt, nous ferons un croisement génétique de souris et nous étudierons les effets de ce croisement à 8 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts moteurs et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si la modulation de ce gène est bénéfique.
Formation interne des équipes de recherche aux administrations, prélèvements et chirurgies sur les modèles rats et souris
- Formation professionnelle
Rats : 750
2 750 rongeurs, 2 000 souris et 750 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet forme les équipes aux administrations, prélèvements et chirurgies, avec jusqu'à trois gestes par séance et deux tentatives autorisées en cas d'échec. Le porteur indique que les chirurgies entraînent l'euthanasie de tous les animaux concernés et qu'un entraînement préalable a lieu sur "animaux factices". Aucune connaissance n'est produite, l'objet étant l'acquisition et l'entretien de gestes techniques, le porteur affirmant qu'il est "indispensable" que le personnel se forme et s'entraîne régulièrement.
Objectifs
Le projet regroupe l’ensemble des techniques pour lesquels les personnels des laboratoires de recherche peuvent être formés. Il s’agit de techniques d’administrations, de prélèvements, ainsi que de chirurgie (en complément et à la suite de la formation règlementaire de chirurgie). La formation sera encadrée et réalisée par des personnes compétentes et expérimentées et fera l’objet d’une attestation de formation après validation de maitrise du geste technique. La mise en œuvre du geste technique dans le cadre d’une procédure expérimentale d’un autre projet ne sera possible qu’après cette validation.
Bénéfices attendus
Afin de réaliser les projets de recherche utilisant des animaux dans de bonnes conditions et en respectant les 3 R’s, il est indispensable que le personnel mettant en œuvre les procédures soit correctement formé (formation règlementaire initiale suivi d’un tutorat), mais également qu’il s’entraine régulièrement. Ce projet participe à cette formation et cet entrainement.
Procédures
Toutes les formations s’effectuent sous tutorat d’une personne formée et compétente. Différents prélèvements, injections ou chirurgies seront effectuées dans le respect de la règlementation et des bonnes pratiques en vigueur. Tous les actes d’administration et de prélèvement s’effectuent en quelques minutes et en respect de l’animal. Les animaux pourront être soumis à 3 gestes maximum par séance de formation. Les animaux pourront être gardés pendant une semaine de formation. Une réutilisation des animaux pour un deuxième geste technique sera permise dans certains cas. En cas d’échec lors d’une administration ou d’un prélèvement, un second essai peut être autorisé par l’encadrant sur le même animal, mais pas au-delà. (Nombre de tentatives = 2 maximum)
Impact sur les animaux
Il n’y a pas d’effets indésirables attendus avec les administrations et/ou les prélèvements, hormis le stress possible lors de la contention et l’inconfort transitoire pouvant se produire à la suite des gestes. De plus, les animaux seront observés quotidiennement. De plus, en cas de chirurgie, une anesthésie et une analgésie adaptées seront mises en œuvre, ainsi qu’un suivi post opératoire. Tout signe de prostration 48h post chirurgie entrainera l’euthanasie de l’animal.
Devenir
Les règles de réutilisation des animaux sont clairement décrites. Dans le cas des chirurgies, tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Une collecte d’échantillons post-mortem sera envisagée.
Remplacement
La formation des gestes techniques nécessite un apprentissage sur animaux vivants sous la supervision d’une personne compétente. En complément des formations règlementaires (niveau concepteur, applicateur ou chirurgie) l’entrainement pratique reste un élément clé pour acquérir les bons gestes à développer par la suite pour garantir le raffinement des procédures expérimentales que le technicien ou le chercheur aura à mettre œuvre. Un entrainement sera proposé au préalable sur animaux factices.
Réduction
La formation pratique sera précédée des formations règlementaires (niveau concepteur, applicateur ou chirurgie) et des documents qualité seront étudiés avant toute mise en pratique (Mode opératoires ou fiches reflexe). Tous les moyens seront mis en œuvre pour réduire le nombre d’animaux, à savoir recherche et développement de modèles alternatifs, réalisation de plusieurs gestes sur un même animal, collecte d’organes pour formation ex vivo. Dans la mesure du possible les animaux surnuméraires des élevages internes seront prioritairement utilisés. Un entrainement sera proposé au préalable sur animaux factices.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages ventilées et enrichies, dans un environnement contrôlé en température et hygrométrie. L’alimentation et l’eau seront proposés à volonté et la litière est également adaptée à la procédure (cellulose en post opératoire). Tous les prélèvements le nécessitant se feront sous anesthésie générale. Toutes les chirurgies se feront sous anesthésie générale ; l’analgésie et la réhydratation des animaux sera assurée lors de la chirurgie ainsi qu’en post-opératoire. Les animaux seront surveillés deux fois par jour par du personnel compétent et formé. La maitrise de la contention sera vérifiée avant tout essai de technique d’administration réalisée sous contention.
Choix des espèces
Les projets réalisés dans nos laboratoires ont recours aux rongeurs de laboratoire (rats et souris). Ces projets mettent en jeu différentes techniques. Les animaux utilisés seront au stade adulte. Si pour les besoins d’un projet particulier des animaux plus jeunes ou âgés doivent être utilisés pour la formation préliminaire, cette utilisation particulière sera également tracée.
Formation aux techniques d’administration et de prélèvement sur souris et rats.
- Formation professionnelle
Rats : 200
800 rongeurs, 600 souris et 200 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil ou de gravité légère. La moitié des animaux passe sous anesthésie sans réveil, l'autre subit des gestes sur animal vigile, pour entraîner du personnel aux techniques d'administration et de prélèvement. Aucune connaissance n'est produite, l'objet étant la vérification et le maintien de compétences. Le porteur indique que ces animaux sont "de réforme", surnuméraires d'élevages, et conclut que le recours aux animaux est "indispensable".
Objectifs
Ce projet est un projet éducatif qui intègre différentes techniques d'administration et de prélèvement dont les utilisateurs peuvent avoir régulièrement besoin. Ces formations s'adressent aux concepteurs et aux personnels appliquant des procédures expérimentales et/ou souhaitant s'entrainer pour un ou des gestes techniques. Ces techniques sont utilisées à la demande des utilisateurs et ils doivent en avoir le besoin dans le cadre de leur projet.
Bénéfices attendus
Ce projet permet pour les personnes n’ayant jamais pratiqué ces techniques de se former et de s’entrainer avant l’expérimentation ; pour les personnes n’ayant pas réalisé ces techniques récemment de se remettre à niveau. Pour cela elles sont encadrées et conseillées par des personnes maitrisant les gestes.
Procédures
Les animaux soumis à des procédures sans réveil de type administration ou prélèvement de substance sont sous anesthésie générale et sous analgésie adaptée tout au long de la procédure (Durée de la séquence : 20 minutes maximum). Pour les administrations et le prélèvement en vigile, les animaux auront au maximum 1 séance d’entrainement (durée de chaque séquence 5 minutes).
Impact sur les animaux
En théorie, les animaux étant mis à mort à la fin des expériences et ces expériences étant effectuées sous anesthésie et analgésie, aucune nuisance particulière n’est attendue pendant ces phases du projet. Néanmoins, concernant les administrations à l'aide d'une aiguille, les animaux peuvent subir un léger stress et une douleur très légère suite à la piqûre. Concernant les gavages par voie orale, une douleur, un stress ou un inconfort léger peut être ressenti par les animaux.
Devenir
Ces animaux sont des animaux de réforme issus d’élevages qui ne peuvent donc être replacés, les procédures étant sans réveil ou de sévérité légère avec mise à mort à la fin.
Remplacement
Cette demande d’autorisation de projet a pour objectif de former les concepteurs et les personnels appliquant des procédures expérimentales souhaitant s'entrainer pour un ou des gestes techniques. Nous n'avons pas les moyens techniques, à ce jour, pour remplacer cette formation par des méthodes in vitro ou artificielles. L’utilisation d’animaux est donc indispensable.
Réduction
Dans l’objectif de réduire le nombre d’animaux, les apprenants réaliserons plusieurs gestes sur un même animal. Le sexe ou la lignée génétique de l'animal, n’a aucun impact pour les gestes effectués. Ainsi nous priorisons les animaux de réforme. Ce sont des animaux surnuméraires, n'ayant pas été inclus dans les projets pour lesquels ils étaient destinés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en animalerie par groupe sociaux avec de l’enrichissement (tunnel, frosottis, papier craft...). Afin de réduire au maximum la souffrance, la douleur et l’angoisse de l’animal lors des gestes techniques, les animaux sont sous couverture anesthésique et analgésique chimique ou gazeuse adaptée. Du personnel qualifié suit la profondeur de l’anesthésie et la qualité de l’analgésie pendant l’acte. Des tapis chauffants permettent de maintenir la température corporelle de l’animal.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les modèles d'étude des utilisateurs de l'animalerie. Ces derniers souhaitent donc légitimement être formés et/ou se ré entrainer sur ces modèles. L’utilisateur ne pourra être formé que sur la technique d’intérêt de son étude et dans l’espèce concernée. Les animaux sont utilisés à partir de 4 semaines et jusqu'à une 30aine de semaines en fonction des mises à mort programmées dans l'animalerie (animaux de réforme issus des élevages).
Formation aux techniques d’administration et de prelevement sur souris
- Formation professionnelle
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil ou de gravité légère. 200 subissent un prélèvement sanguin rétro-orbitaire sous anesthésie sans réveil et 300 des gestes de contention, d'administration et de prélèvement sur animal vigile. Ces gestes n'ont pas pour objet de produire des connaissances mais d'entraîner et de réentraîner du personnel déjà habilité. Le porteur indique que les animaux sont "de réforme", issus d'élevage, et affirme que mannequins, cadavres et vidéos ne suffisent pas et que le recours aux animaux est "indispensable".
Objectifs
Ce projet éducatif intègre différentes techniques de préhension/contention, d'administration et de prélèvement dont les utilisateurs peuvent avoir fréquemment besoin. Ce sont des formations qui s'adressent aux concepteurs et au personnel appliquant des procédures expérimentales, soit pour la vérification de compétences ou de leur maintien, soit un réentrainement sur un ou plusieurs gestes techniques nécessaires à l'exécution optimale des procédures expérimentales. Ces techniques sont utilisées à la demande des utilisateurs en fonction de leurs besoins dans le cadre de leur projet ou selon une procédure définie par le responsable de validation des compétences (sur les fréquences nécessaires pour des réentrainements). En somme, ce projet est destiné à des personnels qui sont déjà titulaires d'une habilitation en expérimentation animale, il permettra de les former et de les ré-entrainer à des techniques bien spécifiques que nous utilisons au sein de notre laboratoire.
Bénéfices attendus
Ce projet aide à former les nouveaux arrivants, à actualiser les compétences ou à raffiner les techniques existantes. Il permet d'acquérir les bonnes méthodes, homogènes et reproductibles d'une personne à une autre et d'un projet à un autre.
Procédures
Les animaux soumis à des procédures sans réveil de types prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire sous anesthésie générale et locale tout au long de la procédure (durées séquence : 20 minutes maximum). Cette technique concernera 200 souris. Pour les contentions, administrations et prélèvements en vigile les animaux auront au maximum 3 gestes techniques (durée de chaque geste : 1-2 minutes) avec des temps de pause entre les gestes. Ces techniques concerneront 300 souris. Pour les souris qui seront utilisées pour les administrations en sous-cutanée sous anesthésie générale, la durée totale du geste sera d'une dizaine de minutes.
Impact sur les animaux
La préhension/contention peut induire un stress chez l’animal. De la même façon, un stress peut être induit lors de l’induction de l’anesthésie gazeuse lors du placement des animaux dans la boîte d’induction. Pour les administrations et prélèvements, une douleur peut être induite par la piqûre de l’aiguille, particulièrement lorsqu’ils sont faits sous anesthésie à l'isofluorane sans analgésie préalable. Ces administrations et/ou prélèvements peuvent également générer un stress chez l’animal.
Devenir
Ces animaux sont des animaux généralement de réforme, issus d'élevage qui ne peuvent pas donc pas être replacés, les procédures étant sans réveil ou de sévérité légère avec mise à mort une semaine après.
Remplacement
Ce projet vise à former les concepteurs et le personnel appliquant des procédures utilisant des animaux à des fins scientifiques souhaitant s'entrainer ou se ré-entrainer sur un ou plusieurs gestes techniques. L'utilisation de mannequins, de cadavres, d'organes ou visualisation de vidéos à elles seules ne permettront pas de se rendre compte de toute la complexité des gestes à devoir pratiquer. L'utilisation d'animaux est donc indispensable.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les animaux non utilisés dans nos procédures (surnuméraires, âgés) issus de notre élevage externalisé. Si aucun animal n'est disponible, nous achèterons exceptionnellement chez des fournisseurs agrées. Les animaux seront utilisés une fois mais plusieurs gestes peuvent être effectués sur eux en cours d'utilisation, ce qui limiterait le nombre de souris à devoir utiliser. Nous pouvons aussi être amenés à réutiliser des animaux issus d'expériences non concluantes (pas assez de cellules injectables, pas assez de produits d'induction de la pathologie etc…) afin d'éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux homogènes et harmonieux à raison de 5 souris maximum par cage. Un enrichissement permettant l'expression de leur comportement naturel (nidification, enfouissement cachette...) sera mis dans la cage. Les souris seront hébergées en portoir ventilé. Elles seront manipulées sous hottes pour reproduire les conditions réelles d'expérimentation. Toutes ces conditions d’hébergement et de manipulation militeront en faveur d’un maintien de leur statut sanitaire et de la non-manifestation d’un phénotype dommageable. Nous n'utiliserons que du matériel stérile pour éviter toute contamination surtout pour les souris qui doivent attendre une semaine après les prélèvements submandibulaires avant la mise à mort. Les animaux seront acclimatés et habitués au moins une semaine avant le début des formations. Cette pratique est importante pour l'animal ainsi que pour les opérateurs. Pour la procédure de prélèvement terminal de sang par voie rétro-orbitaire, les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane (gazeux) et en anesthésique local (tétracaïne).
Choix des espèces
Dans notre animalerie tous les projets utilisant des animaux à des fins scientifiques se font avec des souris. Les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines jusqu'à plus de 30 semaines en fonction des disponibilités et des mises à mort programmées par notre fournisseur sur notre souche de souris en reproduction chez eux.
Impact du diabète maternel sur la fonction cardiaque
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
6 474 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Un diabète est induit chez les mères par injection sous-cutanée, avec prélèvements sanguins hebdomadaires à la queue pendant la gestation, échographie des descendants sous anesthésie sans réveil puis mise à mort pour prélever les cœurs. Le porteur indique qu'aucun analgésique ni anesthésiant ne peut être administré pendant la gestation car ces molécules perturbent le développement cardiaque, et classe en souffrance sévère les douleurs liées au diabète maternel et à la cardiopathie des descendants. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet d'étudier une surcharge en glucose sur le cœur en développement et conclut à la nécessité d'un modèle animal.
Objectifs
Le diabète maternel augmente le risque de malformations cardiaques chez l'enfant de 5 fois. Cependant, les mécanismes par lesquels le glucose maternel perturbe le développement cardiaque reste encore largement méconnu. Le but de notre travail est d'acquérir une meilleure compréhension des cardiopathies induites par le diabète en utilisant des souris génétiquement prédisposées aux malformations cardiaques.
Bénéfices attendus
La connaissance des mécanismes impliqués dans les cardiopathies induites par le diabète permettra de mieux prédire les risques afin de personnaliser la prévention et d'identifier des cibles thérapeutiques pour des thérapies individualisées. De plus, nous serons en mesure de présenter une gamme plus large d'outils de diagnostic pour l'identification et la quantification des facteurs environnementaux contribuant aux cardiopathies.
Procédures
L’élevage de souris génétiquement modifiées nécessite de vérifier la présence ou absence de la modification génétique qui est effectuée grâce à une biopsie au niveau de la queue. L’induction du diabète est conditionnelle et inductible. Elle est obtenue via une seule injection sous cutanée d’un composé chimique particulier, qui n’induit pas de toxicité au stade où il est administré. Dans cette étude, nous ne pouvons pas administrer d’analgésiants ni d’anesthésiants, car ces molécules ont un impact sur le développement cardiaque. Les prélèvements sanguins nécessaires aux mesures de la glycémie chez les mères diabétiques, sont limités à un volume de 10 microlitres par animal et réalisés au niveau de la queue, une fois par semaine pendant la durée de la gestation. Les descendants issus de mères diabétiques ou non diabétiques seront échographiés sous anesthésie. Après l’échographie, les souris seront mises à mort afin de prélever les cœurs.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables causées durant les actes expérimentaux sont : 1) des nuisances légères. Tous les animaux issus des croisements sont marqués à l’aide d’une bague d’oreille à 3 semaines de vie. Dès le 7ème jour après l’induction de diabète chez les femelles, le taux de glucose sanguon sera mesurée 1 fois par semaine pendant la durée de la gestation jusqu’au sevrage de la deuxième portée. 2) des nuisances sévères : douleurs liées à 2 types de maladies : diabète maternel et cardiopathie des descendants.
Devenir
Les croisements seront arrêtés lorsque les objectifs du projet seront atteints. Les mères diabétiques et non-diabétiques et les pères prédisposés aux maladies cardiaques seront mis à morts selon la réglementation : les femelles après le sevrage des descendants, et les mâles à l’âge de 7 à 8 mois. Les descendants seront mis à mort selon la réglementation afin de prélever le cœur et de réaliser toutes les analyses moléculaires. L’échographie sera menée intégralement sous anesthésie générale au terme duquel les souris ne reprendront pas conscience. Après échographie, les souris seront mises à mort selon la règlementation afin de prélever les cœurs pour des analyses d’histologie. Les souris n’ayant pas le génotype désirable seront mises à mort selon la réglementation. Les souris ayant le génotype désirable seront gardées et transférées en zone d’expérimentation à l’âge de 8 semaines.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici, car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude d’une surcharge en glucose sur le développement du cœur. Nous ne pouvons pas expérimenter chez l'être humain les maladies cardiaques liées à une dérégulation du métabolisme du glucose. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle d'étude de la pathologie. Nous mettrons en croisement deux lignées de souris génétiquement modifiées pour générer un modèle unique permettant une surcharge en glucose chez des femelles susceptibles de donner naissance à des individus prédisposés génétiquement à développer une malformation cardiaque congénitale.
Réduction
Pour la première procédure, le nombre d’animaux utilisé par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour le maintien des différentes lignées et pour générer un nombre suffisant de souris afin de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. L’effectif n requis est basé sur notre expérience, nos statistiques effectuées précédemment ainsi qu’une vérification réalisée à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Pour la deuxième procédure, le nombre d’animaux nécessaire a été calculé grâce à un logiciel d’analyse statistique afin d’obtenir des résultats significatifs. Pour la troisième procédure qui concerne l’élevage d’animaux génétiquement modifié, le nombre d’animaux a été fixé selon les recommandations européennes en lien avec la création de lignée.
Raffinement
Un suivi journalier et un scoring au minimum deux fois par semaine seront réalisés sur les animaux afin d’établir les niveaux de douleurs, de souffrance et d’angoisse éventuellement générés lors du projet. Les souris dont les paramètres physiologiques seront modifiés seront mises à mort. Nous suivrons les descendants issus de mères diabétiques afin d'identifier le plus précocement possible l'apparition de phénotypes délétères (anomalies cardiaques congénitales). Ces cardiopathies sont détectables par échographie, une procédure classée sans réveil. Il est possible d’observer directement certains indices physiologiques de détresses liés à ces cardiopathies. L’accélération du rythme respiratoire, cyanose et perte de poids sont des signes communs de ces états qui peuvent facilement être observés. Si ces signes d’inconfort anormalement élevés étaient observés, l’étude serait limitée à l’analyse cardiaque des nouveau-nés faisant l’objet d’une DAP précédemment autorisée. Nous nous assurerons qu’aucun animal ne présente de signe d’infection (rougeurs, saignements, suintements).
Choix des espèces
Notre sujet de travail porte sur les malformations cardiaques causées par un diabète maternel. A ce jour, les souris génétiquement modifiées sont les seuls modèles animaux permettant de mimer assez fidèlement ces pathologies. En effet, il existe une excellente homologie des gènes cardiaques chez l'humain et chez la souris. Les cœurs humains et murins ont un développement anatomique remarquablement similaire. Par ailleurs, des outils génétiques robustes ont été développés chez la souris ce qui en fait l’un des meilleurs modèles d’étude pour comprendre la formation du cœur. Nous utiliserons des mères reproductrices âgées de 12 à 14 semaines afin d’exclure l’impact de l’âge maternel sur l’apparition d’anomalies cardiaques. Les souris issues de mères diabétiques et de pères susceptibles de transmettre une malformation cardiaque seront analysés à l’âge de 3 mois par échocardiographie. L’identification des souriceaux se fera après le sevrage (vers l’âge de 21 à 28 jours) et les souriceaux ayant le génotype désirable seront utilisés jusqu’à l’âge de 6 à 8 mois.
Prélèvement d’éléments biologiques chez le chien, le cochon et le primate anesthésié en vue de récupérer des cellules ou des tissus destinés à la recherche et au développement de médicaments.
- Production de routine
- Tests réglementaires
Cochons : 25
Macaques à longue queue : 50
125 animaux non-humains, 50 chiens, 25 cochons et 50 macaques à longue queue, vont être utilisés, tués sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sans réveil. Issus d'autres études et destinés à être mis à mort, ils sont anesthésiés pour le prélèvement d'organes et de fluides avant leur mise à mort, ces éléments étant fournis à des sponsors pour fabriquer des lignées cellulaires et des kits in vitro. Le porteur présente le projet comme un moyen de développer des méthodes sans animaux tout en évitant d'utiliser des animaux dédiés à ce seul usage. Il décrit un stress de contention et une douleur "brève et légère" liée à l'anesthésie.
Objectifs
Ce projet a pour but de prélèver des fluides biologiques et des organes chez des animaux arrivés en fin d'étude et devant être euthanasié. Ces prélèvements seront envoyés à des sponsors pour fabriquer des gammes de cellules, de tissus ou fluides dérivés d'organes. Ce projet s'inscrit dans l'objectif du point (27) de la directive 2010/63/UE.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont de réaliser in vivo des prélèvements d'organes en anté-mortem sans utiliser des animaux spécifique à cet usage afin de préserver la viabilité cellulaire pour permettre au sponsor d'avoir un large panel de cellules ou tissus pour fabriquer des kits in vitro. Les bénéfices attendus sont une amélioration des connaissances scientifiques pour l'espèce utilisée (chien, cochon ou primate) grâce au développement d'outils in vitro.
Procédures
Une anesthésie avec analgésie sera réalisé sur les animaux puis des prélèvements d'organes seront réalisés sous anesthésie. Les animaux seront euthanasiés puis d'autres prélèvements seront réalisés. (2h30 au total).
Impact sur les animaux
Dans ce projet, un stress lié à la contention ainsi qu'une douleur bréve et légère liée à l'anesthésie seront préalablement réalisés avant d'effectuer les prélevements.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d'organes / fluides corporels à un volume ne permettant la survie de l'animal.
Remplacement
Ce projet pratiqué sur l'animal cherche à développer d'autres méthodes expérimentales (in vitro et ex vivo) par la fourniture de lignées cellulaires ou d'organes provenant d'espèce proche de l'Homme. Le remplacement des animaux par des méthodes alternatives est limité de par la difficulté de tirer les mêmes conclusions à partir d’un modèle imaginé par les chercheurs sur un être vivant autonome par rapport à une méthode in vitro ou ex vivo. Afin de développer les méthodes alternatives à l'utilisation des animaux en recherche et développement de médicament, il est nécessaire de créer des lignées cellulaires ou des organes ex-vivo issues d'animaux. Pour obtenir ces éléments, il est intéressant de réutiliser les animaux issus d'études ne pouvant pas être replacés afin de réduire le nombre d'animaux total utilisé en expérimentation.
Réduction
Lors de ce projet, les animaux utilisés seront exclusivement issus de la réutilisation. Ces animaux seront des animaux ne pouvant etre ni replacés ni réutilisés
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • La détermination des points limites, • Une anesthésie/analgésie maitrîsée tout au long de la procédure.
Choix des espèces
A ce jour, le chien, le porc et le primate non humain sont parmi les espèces les plus adaptée au développement et à la fourniture de matériel biologique pour ce type de modèle in vivo et ex vivo car elle présentent de fortes similitudes avec l'Homme. Il y a de fortes ressemblances anatomiques, physiologiques et les organes présentent des mécanismes d'action fortement similaire à ceux de l'Homme. La fabrication de cellules à partir de ces organes permet d'obtenir des cellules saines pouvant être comparées à des cellules humaines saines. Des animax adultes seront utilisés pour ce projet, ce projet n'a pas pour objectif de fournir des fluides biologiques et des organes de l'animal à d'autres stades de développement.
Enseignement au prélèvement multi-organes sur modèle porcin
- Formation professionnelle
100 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sans réveil. Chaque animal sert de support à une séance de chirurgie de quatre heures au cours de laquelle de jeunes chirurgiens, des chirurgiens confirmés et des infirmiers s'exercent au prélèvement de plusieurs organes, non pour produire des connaissances mais pour la formation. Le porteur présente ces séances comme une "offre de formation" répondant à l'objectif "jamais la première fois sur le patient". Il indique s'appuyer d'abord sur des simulateurs et sur des corps humains, la formation sur le cochon en constituant l'étape finale.
Objectifs
A l’heure où les recommandations de bonnes pratiques nous interdisent, à juste titre, l’enseignement initial de la chirurgie sur les patients, nous organisons des travaux pratiques en chirurgie et pratiques interventionnelles pour les jeunes chirurgiens, chirurgiens seniors et les infirmiers de bloc opératoire en proposant un apprentissage intégré. L’objectif est de faciliter l’acquisition des techniques et des gestes opératoires à la fois par voie abdominale ouverte (laparotomie) et par cœlioscopie (ou laparoscopie), répondant parfaitement aux besoins de simulations nécessaires à une formation pratique initiale et continue. La formation s’effectue de façon progressive et intégrée au sein de 1) le laboratoire de simulation, qui offre un entrainement sur simulateurs de chirurgie, permattant un apprentissage préalable de la gestuelle. 2) le laboratoire d’anatomie complète l’offre de formation en permettant un apprentissage dans de véritables conditions anatomiques humaines. 3) Enfin, le laboratoire de chirurgie ouverte et de laparoscopie sur porcs, permet la formation initiale des internes, et continue des chirurgiens praticiens sur un modèle permettant un enseignement des techniques chirurgicales et interventionnelles dans des conditions physiologiques quasi équivalentes à la clinique humaine. Dans ce cadre, et dans un contexte plus général de transplantation d’organes, l’objectif est la formation au prélèvement de greffons.
Bénéfices attendus
Ces sessions de formation répondent au rapport et aux objectifs de la mission de la Haute Autorité de Santé sur l’état de l’art (national et international) en matière de pratiques de simulation dans le domaine de la santé : « La formation par les méthodes de simulation en santé doit être intégrée dans tous les programmes d'enseignement des professionnels de santé à toutes les étapes de leur cursus (initial et continu). Un objectif éthique devrait être prioritaire : « jamais la première fois sur le patient ». Ces sessions permettent la formation initiale des internes, et continue des chirurgiens praticiens sur un modèle permettant un enseignement des techniques chirurgicales et interventionnelles dans des conditions physiologiques quasi équivalentes à la clinique humaine.
Procédures
Procédure chirurgicale unique sous anesthésie générale (4h) sans réveil
Impact sur les animaux
Procédure de chirurgie sans réveil, sous anesthésie générale longue (4h maximum) pouvant causer un stress et de la douleur.
Devenir
L’ensemble des procédures chirurgicales réalisées lors de cet enseignement ne permettant pas un réveil et un maintien en vie dans de bonnes conditions, aussi l’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, sous procédure complète d’anesthésie profonde.
Remplacement
Préalablement à l’accès à la formation chirurgicale sur modèle porcin, différentes phases de l’apprentissage sont développées en amont aux laboratoires de simulation et d’anatomie. 1) le laboratoire de simulation, offre un entrainement sur simulateurs de chirurgie (peau artificielle et vaisseaux synthétiques (entrainement à la suture par voie ouverte), pelvi-trainer (entrainement à la coelioscopie), et simulateur robotique (entrainement à la coelioscopie robot-assistée), permattant un apprentissage préalable de la gestuelle. 2) le laboratoire d’anatomie complète l’offre de formation en permettant un apprentissage dans de véritables conditions anatomiques humaines.
Réduction
Le nombre maximum estimé d’animaux (porcs) nécessaire à cet enseignement est de 100 pendant 5 ans. De façon à reduire le maximum d’animaux nécessaires, les différentes procédures d’apprentissage sont réalisées le même jour sur un même animal par plusieurs infirmiers et/ou chirurgiens en formation et un minimum de 3 organes seront prélevés par session de formation. De même, des sessions de formation commune aux infirmiers de bloc et chirurgiens seront organisées.
Raffinement
Avant la procédure, les animaux peuvent être hébergés par 1, 2 ou 3 par boxe, au sein d’une même pièce permettant la communication entre congénère selon leur taille, le sexe et leur comportement. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est apporté quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est apporté en rotation dans les boxes selon un programme hebdomadaire. Une table chauffante est utilisée lors de l’anesthésie générale et des procédures suivantes. De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures de ce projet seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie générale et un traitement analgésique sera donné de façon adaptée à chaque procédure. Un suivi des points limites stricts et spécifiques au projet est réalisé tout au long de la procédure.
Choix des espèces
L’anatomie du porc au niveau thoracique, abdominal et pelvien, ainsi que sa physiologie sont très proches de celles de l’homme, et de ce fait représente un très bon modèle vivant d’apprentissage et d’entrainement des diverses procédures chirurgicales avant d’approfondir l’apprentissage en chirurgie humaine. Jeune adultes, 4-6 mois, 80-120Kg, similitude anatomique et physiologique avec un homme adulte au niveau thoracique, abdominal et pelvien.
Compréhension de la physiopathologie des calcifications vasculaires cérébrales de modèles de souris pour la maladie Calcification Cérébrale Familiale Primaire (PFBC)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
192 souris vont être utilisées, tuées sans reprise de conscience à l'issue d'une procédure sous anesthésie. Génétiquement modifiées pour développer des calcifications cérébrales, elles sont anesthésiées puis mises à mort par perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur affirme que ces calcifications n'affectent pas le comportement des souris, tout en reconnaissant que le phénotype d'une partie d'entre elles ne peut être prédit et impose une surveillance. Il indique qu'aucune approche in vitro ou in silico ne reproduit les interactions des unités neurovasculaires, ce qui justifie selon lui le recours à l'animal.
Objectifs
La calcification cérébrale familiale primaire (maladie PFBC pour Primary Familial Brain Calcification) est une maladie neurologique génétique rare associée à des symptômes psychiatriques et moteurs qui représente la principale cause génétique de calcification cérébrale. Elle est caractérisée par des dépôts de phosphate de calcium dans les cellules vasculaires du cerveau. Six gènes responsables de PFBC ont été identifiés. Malgré cette découverte, les connaissances actuelles sur les mécanismes responsables de la calcification restent limitées, ce qui constitue un obstacle important au développement de stratégies thérapeutiques et de prévention. L’objectif de notre projet est de comprendre le rôle de deux protéines dans le développement de la PFBC en utilisant des modèles murins pertinents mutés sur deux gènes dont on sait qu’ils sont à l’origine de la maladie PFBC chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont attendus à la fois dans le domaine de la recherche fondamentale et dans le domaine médical. En effet, cette étude intégrée permettra d'élucider les bases cellulaires et moléculaires de l'altération des unités neurovasculaires et devrait apporter de nouvelles connaissances sur la PFBC avec la possibilité de transposer ces informations à la compréhension de la calcification vasculaire observées dans d’autres types de pathologies.
Procédures
Anesthésie profonde par injection intrapéritonéale. Perfusion intracardiaque. Le temps d’intervention entre l’induction de l’anesthésie et la réalisation de la perfusion (donc la mort de l’animal) est de 10 min. Les prélèvements sont ensuite réalisés post-mortem
Impact sur les animaux
Les nuisances prévues pour les animaux utilisés dans ce projet correspondent à la présence de calcifications vasculaires cérébrales qui n’ont pas de conséquences négatives sur la physiologie et le comportement de ces souris (prise de nourriture et d’eau normale, locomotion non modifiée, pas de signe de stress ni de détresse, masse des tissus adipeux réduite, mais tissu sain et fonctionnel, longueur des os réduite et moins minéralisés sans apparition de fracture). Le phénotype d’une partie des animaux utilisés pour ce projet ne peut pas être prédit. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour détecter un éventuel phénotype dommageable.
Devenir
cette procédure décrit un prélèvement terminal
Remplacement
Les unités neurovasculaires, calcifiées dans la pathologie PFBC, sont constitutées de différents compartiments cellulaires (cellules vasculaires musculaires lisses, cellules endothéliales, cellules neuronales). Il n’existe pas d’approche expérimentale in vitro, ex vivo ou in silico pour appréhender la complexité des interactions entre ces différents types cellulaires et pour décrypter les mécanismes physiopathologiques de cette maladie. C’est pourquoi nous avons recours à l’expérimentation animale.
Réduction
La caractérisation détaillée des unités neurovasculaires des différents modèles murins pour la PFBC fait partie d’un programme de recherche plus large dont l’objectif est d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la physiopathologie de la maladie PFBC. Ce projet utilise plusieurs types de modèles cellulaires (cellules souches pluripotentes induites humaines, cellules murales primaires humaines) qui permet de réduire le nombre d’animaux. Nos travaux précédents, ceux publiés dans la littérature et l’utilisation de l’outil statistique G*Power montrent que 16 souris par génotype est suffisant pour les analyses que nous proposons. Les souris mutées seront comparées aux souris contrôles des mêmes portées. Nous utiliserons le test statistique de student ou celui de Mann-Whitney pour l’analyse de nos résultats.
Raffinement
Les conditions d'hébergement sont adaptées aux besoins des souris : hébergement par groupe de 5 souris maximum, température contrôlée, enrichissement de la cage avec du frisottis permettant aux souris de se fabriquer un nid. Une analgésie sera réalisée 20 minutes avant l’expérimentation.
Choix des espèces
Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques. Ce projet est basé sur le phénotypage de souris mutantes sur 2 des 6 gènes responsables de la maladie PFBC chez l’homme. Nous utilisons différents types de modifications génétiques sur ces deux gènes : l’invalidation dans tout l'organisme, l’invalidation conditionnelle spécifiquement dans les cellules vasculaires musculaires lisses et une souris porteuse d’une mutation ponctuelle identifiée chez les patients PFBC. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte de 8 semaines (stade théorique auquel apparaissent les premiers signes de calcification) jusqu’à 48 semaines (calcifications cérébrales visibles par microtomographie).
Etude de la fonction électrique cardiaque d’un modèle murin de desminopathie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
136 souris vont être utilisées, tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie étant opérée sans réveil. Porteuses d'une mutation de la desmine, elles subissent une biopsie de la queue au sevrage, des électrocardiogrammes et échographies sous anesthésie, et pour vingt d'entre elles un cathétérisme intracardiaque par ponction de la veine jugulaire, afin d'étudier des troubles du rythme cardiaque. Le porteur indique que le cathétérisme peut léser une valve du cœur et provoquer une insuffisance à long terme, ce qui justifie leur mise à mort, leur cœur étant ensuite prélevé. Il ajoute que les souris surnuméraires de génotype sauvage seront mises à disposition d'autres équipes.
Objectifs
Les objectifs du projet sont de déterminer si les souris porteuses de la mutation p.R405W sur le gène de la desmine, un filament intermédiaire des cellules myocardiques, présentent des anomalies de la conduction de l'influx électrique cardiaque, voire des arythmies ventriculaires. Les patients porteurs de la mutation équivalent p.R406W présentent en effet des blocs de conduction auriculo-ventriculaire et /ou des tachycardies ventriculaires sévères responsables de morts subites. De façon surprenante, bien que les souris KI p.R405W-Desmine aient été explorées sur le plan structural et contratile cardiaque, par échographie notamment, elles n'ont pas été explorées sur le plan électrocardiographique.
Bénéfices attendus
Cette étude devrait permettre d'identifier des anomalies de l'activité électrique cardiaque, en particulier de la conduction de l'influx électrique cardiaque, secondaires à la désorganisation du cytosquelette induite par la mutation p.R405W de la desmine (p.R406W chez l'humain).
Procédures
Au cours de l'élevage des animaux, au moment de leur sevrage, les petits seront identifiés par une bague numérotée au niveau d'une oreille puis biopsiés au niveau de la queue (1 mm) afin de déterminer leur statut génétique. Cette double intervention, d'une durée inférieure à 5 min, sera réalisée sous anesthésie générale. Dans une première étape d'exploration fonctionnelle cardiaque, 40 souris seront soumises à un enregistrement de l'électrocardiogramme (durée de 15 min) suivi 2 jours plus tard d'un examen échocardiographique (15-20 min) qui seront réalisés à l'âge de 10 semaines, puis de 30 semaines (total de 2 ECG et 2 échographies), réalisés sous anesthésie générale. Dans une seconde étape, 20 autres souris seront soumises à une exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque, d'une durée de 15-30 min, réalisée sous anesthésie générale et analgésie.
Impact sur les animaux
En ce qui concerne l'élevage, il n’y a pas de nuisance prévue. Néanmoins il est possible d’observer des cas de cannibalisme des parents sur leur petits ou agressivité dans le couple. Dans ce cas, les animaux sont isolés avec un enrichissement adapté et peuvent être exclus de la reproduction. De plus, des cas de dystocies peuvent être observées chez les femelles qui doivent alors être euthanasiées. En ce qui concerne le phénotype des souris mutées, celles-ci se développent normalement et ne montrent pas de signes notables de souffrance. L'enregistrement de l'ECG et l'échographie ne sont pas des techniques générant de la douleur mais ces examens seront cependant réalisés sous anesthésie générale pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable. Pour les mêmes raisons, l'exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque sera également réalisée sous anesthésie générale. Cette procédure entraine une douleur au niveau du point de ponction cutanée pour cathétériser la veine jugulaire ; celle-ci sera prévenue par une analgésie locale.
Devenir
Les souris seront mises à mort à la fin de leur seconde échocardiographie, à l'âge de 30 semaines, afin de prélever leur coeur pour des examens histologiques et moléculaires. A l'issue de l'exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque, les souris seront mises à mort parce que cette procédure peut avoir des conséquences néfastes sur la souris à long terme (perturbations du retour veineux depuis la tête de l'animal et lésion possible de la valve tricuspide pouvant induire une insuffisance cardiaque droite). La mise à mort des souris permet en outre de prélever le coeur pour des études moléculaires. En ce qui concerne l'élevage, les souris utilisées pour former les couples de reproducteurs seront euthanasiées à la fin de leur utilisation. Les souris de génotype sauvage surnuméraires issues des portées seront mises à disposition des autres équipes de l'établissement.
Remplacement
Cette étude fait suite à des études in vitro réalisées avec des cardiomyocytes différenciés à partir de cellules souches pluripotentes induites d'une patiente porteuse de la mutation p.R406W de la desmine et de cellules contrôles qui ont permis d'identifier des anomalies de l'activité électrique cellulaire et leurs mécanismes moléculaires. Cependant, les arythmies cardiaques sont des maladies complexes résultant des interactions entre les cardiomyocytes (30-40% des cellules cardiaques), dont l'activité électrique est altérée, les autres cellules cardiaques (fibroblastes, cellules endothéliales, neurones intracardiaques et cellules du système immunitaire) et le système nerveux autonome. Ce niveau d'intégration ne peut être obtenu que sur un modèle animal.
Réduction
Le projet est organisé en deux étapes successives. La seconde étape ne sera réalisée que si la première démontre que les souris KI préentent des anomalies de l'ECG susceptibles de favoriser la survenue d'arythmies cardiaques. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. Leur taille a été déterminée statistiquement sur la base de notre expérience antérieure.
Raffinement
Lors de la mise en accouplement, l’alimentation des mères est enrichie. Pour enrichir le nid, du Nestlet (coton) est ajouté en plus de frisottis. Afin de ne pas perturber les relations parents-petits, le change est décalé à minimum J+3 après la mise bas ; une étiquette est apposée pour signaler ce report. De plus, pour limiter le stress, le nid parental est conservé pendant le change. Afin de faciliter l’accès à la nourriture aux petits lors des sevrages, des croquettes sont mises directement dans la cage. Les gestes invasifs tel que bagage et biopsie sont réalisés sous anesthésie générale. Après sevrage, les souris sont hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels ou de cabanes pour se camoufler et/ou de frisottis pour fabriquer des nids. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Lors des examens électrocardiographiques et échographiques, ainsi que lors de la mise à mort, les animaux sont sous anesthésie générale. L'exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Lors des anesthésies, la température corporelle est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant rétrocontrôlé par une sonde rectale. A l'issue des procédures nécessitant une anesthésie, les souris sont placées dans des cages placées sur des tapis chauffants et surveillées de façon accrue jusqu'à leur réveil complet. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance des souris, des signes cliniques (avec score de gravité) ont été définis pour chaque procédure et définissent les points limites au-delà desquels l’expérimentation est arrêtée et l’animal euthanasié.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus utilisée en recherche, notamment pour étudier les mécanismes de pathologies génétiques. De plus, notre équipe possède une expertise avec ce modèle sur l’ensemble des procédures nécessaires au projet (ECG, échocardiographie, cathétérisme intracardiaque). Enfin, plus spécifiquement dans le cadre de ce projet, le modèle existe déjà et a été utilisé pour étudier les conséquences de la mutation de la desmine sur la fonction musculaire squelletique, ainsi que sur la fonction contractile cardiaque mais pas sur la fonction électrique, bien que les patients porteurs présentent des troubles du rythme cardiaque. Cette étude sera réalisée sur des animaux mâles et femelles âgés de 10 et 30 semaines.