Procédures sans réveil
Développement et validation de nouveaux radioligands pour la neuro-imagerie TEP dans des souris conventionnelles et transgéniques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et l'autre sous anesthésie sans reprise de conscience. Elles subissent des examens d'imagerie répétés, jusqu'à quatre séances de TEP de trois heures et une IRM de deux heures sous anesthésie, pour développer et tester de nouveaux radioligands destinés à terme à l'imagerie cérébrale humaine. Le porteur signale que les anesthésies répétées peuvent provoquer stress, baisse de température et fausses routes respiratoires. Il conclut qu'une évaluation dans un "organisme entier" est "indispensable", les données in vitro étant jugées insuffisantes.
Objectifs
Dans le cadre d’études cliniques ou précliniques, la neuro-imagerie TEP (tomographie par émission de positons) apporte des informations essentielles puisqu’elle permet la visualisation mais surtout la quantification du niveau d’expression de protéines qui sont la cible des radioligands TEP. Ces protéines sont identifiées en amont comme ayant un rôle (direct ou indirect) dans un processus pathologique, et ont ainsi un intérêt clinique puisqu’elles peuvent renseigner sur un état pathologique. Lorsque des radioligands TEP existent pour ces protéines, l’imagerie TEP peut ainsi être un outil diagnostic ou de suivi thérapeutique. Le défi actuel est de pouvoir développer des radioligands TEP spécifiques pour ces protéines d’intérêt clinique. La découverte et le développement de radioligands est un processus très long et nombre de ces protéines n’ont toujours pas à ce jour de radioligand TEP. L’objet de ce projet est de développer et d’évaluer jusqu’à 5 nouveaux radioligands TEP pour une protéine pour laquelle il n’existe pas de ligand TEP à ce jour. Cette évaluation se déroulera dans des modèles murins conventionnels ainsi que génétiquement altérés pour modifier le niveau de la protéine qui est la cible des radioligands TEP. Cette caractérisation et cette validation incluent trois étapes : - On vérifiera que le radioligand est adapté à l’imagerie TEP, à savoir qu’il pénètre dans le cerveau, que le signal cérébral est suffisant et que le radioligand ressort du cerveau dans les 2-3h après injection. - Lorsqu’un radioligand pénètre dans le cerveau, il se fixe sur la cible d’intérêt (signal spécifique) mais peut aussi se fixer sur d’autres cibles (signal non-spécifique). Dans un deuxième temps, nous mesurerons donc la proportion du signal qui est spécifique, c’est-à-dire utile pour renseigner sur la protéine cible d’intérêt. - Enfin, nous étudierons comment le radioligand est métabolisé (c’est-à-dire dégradé) dans le corps. En effet, un bon radioligand TEP ne doit pas être dégradé trop rapidement pour permettre une imagerie TEP pendant quelques heures après injection. Toutes ces informations permettront de renseigner sur la pertinence de ces radioligands comme biomarqueurs TEP et de sélectionner les meilleurs candidats à amener à terme chez l’Homme pour des études cliniques.
Bénéfices attendus
La validation et la caractérisation préclinique des radioligands TEP est une étape essentielle avant et afin de pouvoir les amener chez l’Homme dans des études cliniques. À terme, nous disposerons de radioligands permettant la mesure non-invasive par imagerie TEP. Ces outils TEP seront utiles en clinique, par exemple pour le diagnostic, pour suivre l’évolution d’une maladie, ou pour évaluer l’impact d’une thérapie.
Procédures
Toutes les interventions sont faites sous anesthésie. -L’examen IRM dure au maximum 2h et n’est effectué qu’une seule fois par animal. -L’examen TEP dure au maximum 3h et peut être répété jusqu’à 4 fois maximum chez le même animal, avec au moins 1 semaine de repos entre chaque examen. Le dernier examen TEP se fait sans réveil pour pouvoir prélever suffisamment de sang pour étudier le métabolisme des radioligands en fin d’examen TEP. -L’examen de la distribution temporelle des radioligands dans le plasma se fait sans réveil pour prélever du sang (entre 0 et 3h après administration du radioligand) et étudier le métabolisme (dégradation) des radioligands au cours du temps.
Impact sur les animaux
Les anesthésies à répétition pour les examens d’imagerie peuvent induire un stress. Les anesthésies prolongées pendant les sessions d’imagerie peuvent induire une baisse de la température corporelle et des difficultés respiratoires (fausses routes).
Devenir
En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés pour prélever leur sang et étudier le métabolisme (dégradation) des radioligands dans le plasma. Le cerveau des animaux sera également prélevé et analysé. Cela permettra de confirmer que des métabolites (produits de dégradation des radioligands au cours du métabolisme) ne pénètrent pas dans le cerveau. En effet, ceci serait nuisible pour qu’ils soient de bons radioligands TEP.
Remplacement
Même si les ligands sont soumis à une première sélection et évaluation in vitro, ces expériences sont limitées et ne permettent pas d’obtenir toutes les informations nécessaires pour juger de leur utilité in vivo comme biomarqueurs TEP. Par exemple le passage de la barrière hémato-encéphalique, la distribution cérébrale au cours du temps, ou bien encore le métabolisme (dégradation) sont des facteurs qui ne peuvent être évalués qu’in vivo. Ainsi, une évaluation dans un organisme entier lors d’étapes précliniques in vivo est indispensable pour mieux comprendre les différentes caractéristiques des radioligands et assurer une interprétation correcte des images TEP. Les études dans des modèles animaux sont de plus nécessaires pour avoir accès à des données impossibles à obtenir en recherche clinique chez l’Homme, comme la comparaison directe des données obtenues in vivo et par immunohistochimie dans des cerveaux post-mortem .
Réduction
-Avant d’être évalués in vivo, les radioligands sont soumis à une sélection in vitro. Seuls les ligands qui présentent les meilleures caractéristiques in vitro seront testés in vivo, réduisant ainsi le nombre d’expériences in vivo nécessaires et le nombre d’animaux utilisés. -Les examens d’imagerie TEP sont non-invasives, ce qui permet de répéter l’expérience chez un même animal dans le temps, et limiter ainsi le nombre d’animaux utilisés. -Si le premier examen TEP montre des caractéristiques non concluantes, les animaux peuvent participer à l’évaluation d’un autre radioligand tout en respectant le nombre d’examens d’imagerie maximal autorisé (4). -Les expérimentations pour évaluer la distribution temporelle et le métabolisme dans le plasma d’un radioligand ne démarreront que si première évaluation in vivo TEP montre des propriétés et caractéristiques qui justifient une évaluation plus profonde du radioligand (bonne pénétration dans le cerveau, signal total TEP suffisant). Des tests statistiques specifiques seront utilisés pour une utilisation optimale du nombre d'animaux.
Raffinement
Tous les examens seront réalisés sous anesthésie générale. De plus, une anesthésie locale en instillation sera appliquée sur les oreilles avant fixation sur le cadre du lit. En effet, malgré l’anesthésie générale, la fixation sur le cadre peut occasionner une gêne pour l’animal. Des larmes artificielles seront administrées afin d’éviter le dessèchement de la cornée. Durant toute la durée de l’anesthésie, la température des animaux sera régulée. En dehors de procédures, les animaux seront hébergés en groupe, avec enrichissement de leur milieu de vie et accès à volonté à la boisson et la nourriture. Les modèles animaux utilisés présentent un phénotype modéré et permet à l’animal de se comporter normalement. Chaque animal bénéficiera d’une période d’acclimatation d’une semaine avant la première expérience, et d’un temps de repos d’une semaine minimum entre chaque examen d’imagerie. Des points limites specifiques seront determinés afin de limiter au maximum les nuisances éventuelles des animaux.
Choix des espèces
Ce projet est la première validation in vivo de nouveaux radioligands TEP puisqu’à terme ces radioligands devront être validés également chez l’Homme. Pour cette étude, le modèle murin est le plus pertinent, puisqu’il est déjà utilisé pour modéliser plusieurs maladies neurodégénératives et autres pathologies. Le modèle murin est relativement simple à modifier génétiquement pour moduler le niveau d’expression d’une protéine. Cela permet une validation de radioligands dans ces modèles, en vue d’une application clinique ultérieure. Les animaux seront utilisés au stade adulte (25-40g) lorsque le cerveau a atteint sa maturité et son développement complet.
Evaluation de la distribution tissulaire des radiotraceurs dans un modèle rongeur.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
Rats : 750
1 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance va de l'absence de réveil à modérée. Sous anesthésie, ils reçoivent un cathéter veineux et fémoral, une injection de composé radiomarqué puis jusqu'à trente prélèvements artériels au cours de séances d'imagerie de deux heures. Tous sont ensuite tués pour extraire leurs organes. Le porteur qualifie les retombées de "majeures" pour la connaissance de la distribution des médicaments et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut évaluer cette distribution tissulaire.
Objectifs
L’objectif de cette étude est l’évaluation préclinique de la distribution tissulaire de candidats médicaments radiomarqués d’intérêt chez le rongeur en utilisant une technique d’imagerie non invasive. Cette technique d’imagerie non invasive (tomographie par émission de positons ou monophotonique) consiste à injecter un analogue de composé radiomarqué par différents isotopes utilisés en médecine humaine. La distribution tissulaire des composés radiomarqués peut ainsi être mesurée par des approches d’imagerie non-invasive correspondant aux isotopes utilisés et qui sont également utilisés en médecine humaine. Cette étude permettrait d’évaluer l’exposition tissulaire par le composé radiomarqué, en présence d’un candidat médicament. Les candidats médicaments étudiés concernent le diabète, le cancer, les pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction et également les neuroprotecteurs. Plusieurs séances d’imagerie seront nécessaires. La première imagerie permet d’établir les paramètres pharmacocinétiques initiaux des composés radiomarqués. La seconde imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqué dans des modèles d’une pathologie. La troisième imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqué en présence d’un candidat médicament. Les doses de médicament seront choisies en fonction de la littérature et du recul de l’utilisation de cette molécule chez l’homme ou chez le rongeur. Afin d’évaluer intégralement l’exposition tissulaire, la pharmacocinétique du traceur et du candidat médicament seront également étudiés.
Bénéfices attendus
Les retombées de ce projet sont majeures puisqu’elles permettront d’apporter des informations pertinentes sur l’exposition tissulaire et sur les spécificités de la distribution et de l’élimination des médicaments.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Réalisation de sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum) • Pose d’un cathéter veineux (30 secondes) et fémoral (5 minutes) • Injection d’un radiotraceur associé ou non à un candidat médicament (1min) • Réalisation de prélèvements artériels sous anesthésie gazeuse (30 prélèvements qui durés 2-3 secondes espacés sur 120 minutes au maximum)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : Les rongeurs seront anesthésiés lors des sessions d’imagerie (2h maximum). Lors du réveil les rongeurs peuvent être désorientées et stressées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Dans l’état actuel des connaissances, modéliser in vitro ou in silico des tissus complexes en prenant en compte la distribution périphérique, les transporteurs, l’élimination hépatique ou hépatobiliaire, le métabolisme etc..., afin d’évaluer l’exposition tissulaire par le radiotraceur n’est pas possible. Le recours à l’expérimentation animale est donc nécessaire pour étudier l’exposition tissulaire par le radiotraceur en présence et en absence de candidat médicament.
Réduction
L’utilisation des différentes modalités d’imagerie décrites permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique.
Raffinement
Une surveillance quotidienne des rongeurs sera pratiquée par les zootechniciens et les expérimentateurs. Une semaine d’acclimatation est prévue après à la réception des animaux. Ils seront entraînés à la manipulation avant le début du protocole ce qui permet de diminuer l’état de stress et d’améliorer leur bien-être. Ils seront hébergés en groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. Toutes les interventions invasives sont réalisées sous anesthésies générales par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions, avec un maintien et une surveillance de la température et du rythme respiratoire. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Ces espèces présentent l’avantage d’être particulièrement adaptées aux études d’imagerie par TEP (Tomograhie par émission de positons) précliniques. Un certain nombre d’étude ont déjà été publiées dans la littérature ce qui nous permettra de limiter le recours aux rongeurs. L’évaluation de la distribution tissulaire nécessite des tissus pleinement développés (récepteurs, transporteurs, fonction hépatique etc..) et donc les rongeurs utilisés seront au stade adulte (5 semaines à 8 semaines). Le projet sera conduit sur des individus adultes (maturité et développement complet atteint).
Enseignement des principes et des techniques d’anesthésie et de réanimation sur le modèle animal
- Formation professionnelle
60 cochons vont être utilisés, anesthésiés puis tués avant tout réveil. Chaque animal est sédaté, cathétérisé puis placé sous anesthésie générale avec intubation, plusieurs médecins s'exerçant à tour de rôle sur le même individu, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des anesthésistes déjà en exercice. Le porteur décrit une formation "de pointe" permettant d'acquérir des compétences sur l'animal vivant. Il indique que des mannequins et des simulateurs sont utilisés pour certaines techniques mais juge le recours à l'animal vivant "indispensable".
Objectifs
L'objectif de ce projet est la réalisation de cours d’anesthésie humaine à l’aide d’un modèle porcin. Il s'agit d’offrir un enseignement de pointe en matière d’Anesthésie et Réanimation avec la possibilité d'apprendre de nouvelles techniques et acquérir des compétences sur l’animal vivant. Les cours, pris individuellement, ont aussi des objectifs plus spécifiques et ciblés. Le niveau de formation et le profil des participants aux cours peut être très diffèrent. Les cours s’adressent notamment aux médecins anesthésistes spécialistes, désireux de perfectionner leur niveau et notamment de se familiariser avec des nouvelles technologies de pris en charge des voies respiratoires, nouvelles compétences qui bénéficieront aux patients humains anesthésiés dans nos cliniques et hôpitaux.
Bénéfices attendus
Ce projet étant à but éducatif, les bénéfices attendus concernent l’acquisition ou l’amélioration de compétences qui bénéficieront aux patients dans le cas des formations de médecins anesthésistes.
Procédures
Les porcs reçoivent d'abord une injection intra-musculaire de sédatifs. L'injection, qui a un effet antidouleur, dure moins d'une minute et permet à l'animal d'être très détendu et peu réactif à son environnement. Ensuite, chaque animal se voit poser un cathéter intraveineux dans une veine de l'oreille. La pose de ce cathéter, passe par l'introduction d'une sorte d'aiguille (le mandrin) qui accompagne le cathéter dans la veine. Cette pose de cathéter est très rapide aussi (environ une à 2 minutes). l'animal étant sédaté lors de cette intervention, il y a assez peu de réaction. une fois le cathéter posé, l'animal reçoit les agents anesthésiques induisant la perte de connaissance. L'injection se fait par le cathéter, dure 30 secondes, et ainsi n'est pas perçue par l'animal qui perd alors connaissance. Le reste de la procédure est réalisé sous anesthésie générale, qui est maintenue suite à l'introduction d'une sonde respiratoire dans la trachée en passant par la bouche. La pose de cette sonde dure environ une minute.
Impact sur les animaux
- injection intramusculaire de sédatif pour la prémédication des porcs: la douleur correcspond à l'introdroduction d’une aiguille dans le muscle de l'encolure. L'animal peut également ressentir du stress au moment de l'injection, même si elle est de courte durée (moins d'une minute) - pose d'un cathéter intraveineux sur une veine auriculaire: la pose du cathéter se fait sous sédation. L'animal n'a donc que peu de ressenti de l'introduction de l'aiguille (mandrin) du cathéter.
Devenir
Animaux mis à mort car impossibilité de les impliquer dans un autre protocole.
Remplacement
Lors de ce cours d'anesthésiologie, des ateliers n'utilisant pas d'animaux ont lieu sur certaines thématiques: la gestion des voies respiratoires ainsi que la ventilation spécifique d'un seul poumon pratiquent sur mannequins. Des simulateurs informatiques permettent également d'enseignement la bronchoscopie. Nous utilisons également des supports vidéo afin de faire des démonstrations préalables. L'utilisation d'un animal vivant pour l’apprentissage réaliste de certaines procédures techniques avancées d’anesthésie et réanimation reste indispensable.
Réduction
Le nombre des animaux utilisés durant les formations pratiques est réduit au minimum. Plusieurs participants, à tour de rôle, utiliseront le même individu afin d’apprendre une technique. Aucune étude statistique n’est prévue sur ce projet d’enseignement.
Raffinement
Les animaux sont accueillis dans l’animalerie de notre établissement dans laquelle leur séjour est associé à un niveau de stress aussi bas que possible. Un cycle jour / nuit de 12 heures est respecté et le milieu est enrichi par des jouets introduits dans les cages pour stimuler l’animal. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et ils bénéficient également d’une ambiance musicale douce. Le projet concernant de l’anesthésie, les animaux sont sédatés puis inconscients durant le projet réduisant ainsi tout stress évitant toute douleur. De plus, des produits analgésiants sont utilisés dans le protocole anesthésique. Enfin, des points limites éthiques sont mis en place.
Choix des espèces
Le modèle animal utilisé comme modèle d’entrainement à l'anesthésie pour le cours d'anesthésiologie est le porc. Ces mammifères ont en commun avec l’homme la physiologie et l’anatomie cardio-respiratoire, permettant l’évaluation des techniques d’intubation, de ventilation, etc. Le porc, en particulier, par sa grande taille offre l’opportunité d’utiliser exactement les mêmes dispositifs et techniques utilisés chez l’homme. PORC : juvénile (30 à 70 kg). La raison principale est d’avoir un modèle le plus proche possible de la taille humaine. Un animal dans cette tranche de poids correspond aux objectifs de réalisation des procédures.
Diplôme Universitaire de microchirurgie
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
500 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans le cadre d'un diplôme universitaire de microchirurgie. Chaque animal subit des sutures de nerfs ou de vaisseaux durant une à trois heures, à raison d'une dizaine de rats par étudiant, pour entraîner des chirurgiens aux micro-anastomoses. Le porteur reconnaît qu'une anesthésie ou une analgésie insuffisante peut laisser ressentir la douleur en cours d'opération. Il indique commencer l'apprentissage sur cuisses de poulet et affirme qu'aucun simulateur ne reproduit aujourd'hui ce geste chirurgical.
Objectifs
La microchirurgie permet à la fois d’augmenter la précision des gestes opératoires mais aussi de réparer des tissus de si petites tailles qu’ils ne sont visibles que sous microscope. En plus du microscope opératoire, le microchirurgien utilise des instruments spécifiques de microchirurgie ainsi que des fils de sutures souvent plus fin qu’un cheveu.L'objectif du projet pour les chirugiens sera de se familiariser avec ce matériel spécifique et de réaliser une dizaine de techniques selon un apprentissage par difficultés croissantes, techniques indispensables pour guider la dissection dans des zones anatomiques délicates, notamment dans la chirurgie des lambeaux de couvertures, techniques pour permettre la réparation des vaisseaux, artères et veines qu’il faut suturer tout en respectant l’écoulement du sang et enfin techniques pour permettre la réparation des nerfs qui assurent la transmission du signal indispensable à la sensibilité et à la motricité des membres.
Bénéfices attendus
L’ensemble des objectifs validés permettra à l’Etudiant de réaliser des interventions chirurgicales où des micro anastomoses artérielles et veineuses ou nerveuses s’avèrent nécessaires en clinique humaine.
Procédures
Les procédures chirurgicales peuvent être des sutures nerveuses (de 30 à 45 min) ou des sutures de vaisseaux sanguins (durée de 1 à 3 heures en fonction du type de sutures).
Impact sur les animaux
L'anxiété est un effet indésirable prévisible.En per-opératoire, si l'anesthésie n'est pas assez profonde et l'analgésie trop faible, la douleur peut être ressentie. On peut rencontrer des problèmes d'insuffisance respiratoire et/ou d'hemorragie.
Devenir
L’ensemble de l’effectif est destiné à être euthanasié
Remplacement
Certes, la formation chirurgicale utilise d’autres méthodes d’apprentissage comme les TP de dissection sur cadavres et la formation par simulation, ou l'apparition de solutions technologiques de plus en plus performantes permettent de simuler de nombreuses situations de soins, mais actuellement, aucun simulateurne permet de reproduire ce type de geste chirurgical.
Réduction
Concernant le nombre d'animaux utililisés,on constate qu'il faut une moyenne de 10 rats par étudiant afin de maîtriser les differentes techniques microchirurgicales. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés,les premiers pas s'effectuent sur cuisses de poulet qui ont l'avantage de disposer dans un plan profond d'artéres et de veines d'un calibre équivalent à une artère aorte de rat ainsi que de nerfs. L'étudiant ne commencera les sutures sur rat uniquement quand sa gestuelle sur cuisse de poulet sera jugée satisfaisante par le tuteur
Raffinement
L’environnement du rongeur est enrichi, il a un accès illimité à l’eau et la nourriture .Les rats seront hébergés par 2 dans des cages de tailles adaptées et disposeront dans leurs cages de modules de cœur de bois de peuplier qui permettent de développer l’activité d’exploration de l’animal et de participer à son bien être. L'environnement du rongeur est également enrichi avec frisottis de papier qui stimule les instincts de nidification et d'exploration de jeu. Le rythme circadien des rongeurs sera respecté. Les procédures ne débuteront que sept jours après réception des animaux pour diminuer le stress lié au changement d’environnement.Visites quotidiennes par le personnel qualifié de l’animalerie. Utilisation d'un anesthésique local en début de toute chirurgie .Mise en place d’un protocole antalgique adapté .Mise en place d’une grille de score ,utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance .
Choix des espèces
Le diamètre des vaisseaux du rat (fémorale,carotide…) est sensiblement équivalent au diamètre des vaisseaux sur lesquels les chirurgiens travaillent au bloc opératoire, nottament sur les réimplantations de doigts. Les rats males adultes présentent ces caractéristiques.
Développement d’un modèle murin sur rat Fischer de lambeau libre perforant ostéo-cutané par ingénierie tissulaire pour la reconstruction des pertes de substances osseuses interruptrices
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
96 rats Fischer vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va de légère à sévère, huit étant opérés puis tués sans réveil. Ils reçoivent des implants osseux vascularisés maintenus huit semaines sous la peau, puis transférés dans un défaut creusé dans la mandibule ou le fémur, avec un suivi allant jusqu'à douze semaines avant la mise à mort pour analyse. L'objectif est de mettre au point un lambeau bi-tissulaire évitant les prélèvements osseux lourds pratiqués aujourd'hui en chirurgie reconstructrice humaine. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux n'est possible, les bioréacteurs in vitro n'étant selon lui pas assez avancés, et conclut à la "nécessité" du rat comme bioréacteur in vivo.
Objectifs
Les pertes de substances pluritissulaires ostéo-cutanées ou ostéo-muqueuses suite à un traumatisme, une chirurgie cancérologique ou une infection représente un défi pour la chirurgie reconstructrice du fait des différents types de tissus à reconstruire et régénérer. Ces pertes de substance peuvent être accompagnées de séquelles fonctionnelles, sensorielles, sensitives, ou esthétiques non négligeables avec des conséquences multiples pour la victime (intégrité physique et morale affectée). Ceci étant d’autant plus vrai pour les pathologies maxillo-faciales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer un modèle de lambeau chez le rat, ce lambeau se voudra bi tissulaire (osseux et cutané) et autorisera des reconstructions complexes de la mandibule en s’affranchissant de prélèvements séquellaires. En effet, les reconstructions actuelles passent par des prélèvements osseux conséquents (autogreffe osseuse nécessitant un apport de tissus mous secondaire ou alors des prélèvements libres ostéocutanés tels que une fibula avec une palette cutanée). Ces prélèvements sont lourds, responsables de douleurs, boiterie, troubles neurologiques, instabilité de cheville. Ce projet associe reconstruction osseuse par ingénierie tissulaire osseuse (impression 3D avec ensemencement cellulaire et reconstruction des parties molles par lambeau perforant (prélèvement uniquement de peau et de son pédicule vasculaire respectant les structures nobles telles que les muscles, nerfs et os). Cette construction néoformée permettra de reconstruire en un seul temps opératoire des pertes de substances complexes bi tissulaires sans séquelle sur la zone donneuse.
Procédures
Expérimentation animale préliminaire (14 rats, deux semaines) Expérimentation animale avec réalisation d’une construction osseuse vascularisée avec implants mis en place 8 semaines (4 groupes de 8 rats et 6 rats permettant le prélèvement de moelle). Le geste de mise en place d’un implant ayant pour durée 20 minutes. Pour la preuve de concept de réparation de substance ostéo-cutanée mandibulaire, une construction osseuse vascularisée pendant 8 semaines, puis transférée dans un défaut mandibulaire de taille critique lors d’une intervention chirurgicale de 2 heures. La consolidation de la réparation sera évaluée à une durée allant jusqu'à 8 semaines post transfert. De la même façon, l’extension de nos procédés de reconstruction aux membres inférieurs passera par une expérimentation en région fémorale avec mobilisation d’un lambeau bitissulaire ostéo-cutané pédiculé. Les implants seront ensemencés par de la moelle osseuse totale et de la RhBMP2 30ug/mL. Après une implantation pendant 8 semaines, les lambeaux seront transférés en région fémorale après création d’un défect osseux, et monitorés pendant 12 semaines.
Impact sur les animaux
Les conséquences de ces études sur les animaux seront potentiellement les suivantes : - Douleur faible lors de la première expérimentation (dissection du lambeau perforant) et deuxième (mise en place de l’implant autour du pédicule in situ) - Pas de limitation de mobilité attendue, ni de stress particulier - Les éventuels effets dureront 2 semaines lors de la première procédure, 8 semaines pour la moitié de chaque groupe dans la deuxième procédure et deux semaines supplémentaires pour l’autre moitié de chaque groupe. Concernant la chirurgie maxillo-faciale, une gêne à l'alimentation pourrait être observée et sera strictement monitorée. Concernant la chirurgie des membres inférieurs, une gêne à la mobilisation et des douleurs peuvent être attendues et seront strictement monitorées.
Devenir
L’euthanasie des animaux est nécessaire afin d’analyser les implants mis en place autour du pédicule vasculaire du lambeau.
Remplacement
L’utilisation de rongeurs reste nécessaire afin de valider les propriétés des matériaux avant d’envisager des expériences sur de plus gros animaux et l’ultime but : l’utilisation chez l’homme. Aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux n’est possible; les systèmes de bioréacteurs in vitro n'étant pas assez avancés pour réaliser le projet. Seul un modèle animal vivant permet de nos jours la génération d'une construction osteo-cutanée transplantable selon les principes du bioréacteur in vivo.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, l’utilisation de rat Fischer mâles permet un prélèvement de moelle osseuse plus important sans devoir prélever sur tous les rats. Une analyse statistique a été réalisée afin de déterminer le nombre minimal de rats nécessaire pour obtenir un effet statistique : afin d’obtenir une puissance statistique pertinente (P = 95%, alpha 1%), le nombre d’animaux pour les procédures 1 et 2 a été évalué à à 14 et 8 par groupe (4 groupes soit 32 rats). Un animal supplémentaire par groupe est requis afin de pallier les possibles complications expérimentales. 3 groupes de 10 rats avec 6 rats pour le matériel médullaire seront nécessaires pour la procédure 4 afin d'atteindre une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans un cycle jour/nuit un cycle jour/nuit saisonnier (e.g., 12h/12h/ été, 8h/14h hivers) avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 2 pour limiter le stress de la surpopulation ou de l’isolement. Des tunnels pour les rats seront placées dans la cage pour permettre aux animaux de s’enfouir et se cacher. Chaque protocole a été choisi pour répondre à une question précise, par sa reproductibilité afin de réduire la variabilité expérimentale et par conséquent le nombre d’animaux utilisés par expérience. Le protocole sera interrompu le plus tôt possible en accord avec des points limites définis et réalisés sur le plus petit nombre d’animaux possible suffisant pour obtenir une différence statistiquement significative. La fréquence des inspections sera faite tous les jours pour ce protocole. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des animaux. La prise en charge de la douleur des animaux sera réalisée par injection en sous cutanée de lidocaïne et de buprénorphine dès l’anesthésie et ceci avant le geste opératoire (injection répétée toutes les huit heures pour la buprénorphine pendant deux jours si besoin). Des AINS seront administrés de manière systématique pendant au moins deux jours.
Choix des espèces
Le rat permet une première approche in vivo avant de tester les hypothèses confirmées avec ce modèle sur des animaux plus similaires à l’Homme, puis chez l’Homme. C’est un modèle de référence pour la recherche fondamentale dans le cadre d’implantation allogénique afin de se concentrer sur l’effet propre des biomatériaux évitant toute réponse immunitaire non désirée et permet de sélectionner les méthodes efficaces de réparation au sein d’un grand nombre de conditions expérimentales. Les études seront réalisées avec des rats adultes, c'est-à-dire, âgés de 10 semaines (300g), ce qui correspond au modèle validé et développé depuis plusieurs années dans notre laboratoire et dans la littérature.
Effet de l’inactivation du GPR18 sur le vieillissement cardiovasculaire et métabolique au cours du diabète et de l’obésité
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
114 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre elles tuées sans réveil. Génotypées par prélèvement du bout de la queue à sept jours, elles reçoivent un régime gras et sucré induisant obésité et diabète, des mesures de glycémie répétées et, en fin d'étude, une chirurgie de la carotide sous anesthésie. Le porteur indique que la pose d'un cathéter dans la carotide empêche tout réveil, l'animal ne pouvant en être privé sans se vider de son sang, d'où une mise à mort sous anesthésie. Il affirme que l'étude d'un régime mimant le syndrome métabolique impose le passage par un modèle in vivo.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la cause la plus fréquente de décès en Europe et dans le monde. Elles sont associées au vieillissement, à l’obésité, au diabète, et à l’inflammation chronique, accélérant ainsi le vieillissement cardiovasculaire et contribuant à la mortalité et à la morbidité chez les patients âgés. Les résolvines, dérivés des acides gras polyinsaturés oméga-3 considérés comme bénéfiques dans la prévention des maladies cardiovasculaires, sont des substances lipidiques induisant une résolution de l’inflammation. Les résolvines agissent via des récepteurs spécialisés. La résolvine D2 et son récepteur GPR18 sont encore très peu étudiés dans le domaine de la résolution de l’inflammation et des conséquences sur les maladies cardiovasculaires. Notre hypothèse est que la résolvine D2 et son récepteur GPR18 pourraient contribuer à limiter l’inflammation et le vieillissement cardiovasculaire. Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer si l’absence du récepteur GPR18 produit l’effet inverse à savoir prolonge et/ou accentue ces phénomènes. Nous souhaitons identifier les mécanismes impliqués. Pour cela, nous utiliserons un modèle de vieillissement cardiovasculaire et métabolique induit par un régime riche en graisse et en fructose (sucre) qui provoquera une inflammation, une obésité, un diabète et altèrera les fonctions cardiovasculaires. Ce régime sera administré à des souris sauvages ayant GPR18 ou des souris dépourvues de ce récepteur. Une exploration des fonctions cardiovasculaires sera faite dans les deux groupes.
Bénéfices attendus
La réussite de cette étude permettra de montrer qu'un échec dans la résolution de l'inflammation induit par des changements métaboliques provoque une accélération des maladies cardiovasculaires. A plus long terme, nos travaux pourront soutenir l'emploi de supplémentation en résolvine pour prévenir ou améliorer l'état vasculaire des patients en situation de syndrome métabolique et réduire le vieillissement artériel lié à l'âge.
Procédures
A 7 jours de vie, 1 mm de l'extrémité de la queue (non ossifiée) est prélevé pour le génotypage et les souriceaux sont tatoués. Ceci dure environ 5 min. Les souris vigiles subiront une très légère piqûre au bout de la queue pour prélever une goutte de sang (5 µl) (comme chez les diabétiques) 1 fois par mois pendant 3 mois (en tout moin de 1 min), puis à la 30 ème semaine et 31 ème semaine 7 fois (à T0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 min) donc en cumulé, 1min sur 2h). Dans tout le protocole, le temps de piqure pour prélever 5 µl de sang représentera 3 min. A l'age de 8 semaine, une contention de 7 min de la souris sera réalisée. En point finale, l'anesthésie pour la chirurgie et l'examen durera 1h en tout. A la fin de l'expérience, 1 ml de sang sera prélevé sur animal anesthésié qui sera mis à mort sans réveil préalable. L'animal subira la totalité de la procédure sur 16 semaines.
Impact sur les animaux
Le régime riche en graisse et en fructose induit un syndrome métabolique avec une prise de poids important pouvant générer un inconfort de la souris. Les mesures de glycémie via une goutte de sang à la queue seront répétées toutes les 4 semaines, une infection ou un comportement de grattage, léchage exagéré peut apparaitre.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort après les 2 procédures car les animaux auront un cathéter dans la carotide à la fin des 2 procédures. Il n’est pas possible d’enlever ce cathéter sans que l’animal ne se vide de son sang. Donc la mise à mort de l'animale se fera sur animal inconscient par injection sous anesthésie gazeuse.
Remplacement
Le profil des cellules impliquées dans l’inflammation et des cellules de la paroi artérielle, l'étude des mécanismes d'action de la résolvines D2 et de son récepteur GPR18 se font déjà in vitro au laboratoire. Nous avons également mis au point l'étude de la contraction et dilatation des artères isolées par une methode ex-vivo. Cependant, pour étudier l'effet d'un régime qui induit un changement de métabolisme et qui mime le syndrome métabolique, sur le système cardiovasculaire et les paramètres métaboliques comme la glycémie, de la tolérance au glucose et de la résistance à l’insuline, nous sommes obligés de passer par un modèle in vivo. Le remplacement dans ce cas n'est pas possible.
Réduction
Nous faisons toutes les mesures sur un même animal. Des calculs statistiques permettent de prédire le nombre minimal d'animaux à utiliser pour avoir des résultats significatifs et limiter le nombre d’animaux.
Raffinement
Une anesthésie sera pratiquée pendant la chirurgie et l’examen cardiovasculaire. Du gel ophtalmique est déposés sur les yeux pour éviter le dessèchement. La mise en place de points limites est adaptée à chaque étapes de la procédure : perte de poids maximale de 20% par rapport à la dernière pesée, l’animal sera sorti de l’étude et remis sous régime normal. Si des signes de stress trop importants sont observés pendant la contension de la souris (pression trop élevée), elle sera remise dans sa cage d’origine. Pour la zone une piqûre à la queue : la zone sera surveillée activement tous les jours pendant les 4 jours suivants. Si une infection ou un comportement de grattage, léchage exagéré apparait, la plaie sera désinfectée avec de la bétadine. Un spray peut être appliqué pour aider à la cicatrisation et à la diminution de la démangeaison. Un anti-douleur local en badigeon sera également administré pour diminuer la douleur. Si une fausse route survient cela peut percer l’œsophage, l’animal sera mis à mort. Pour l'examen cardiovasculaire final, les points limités déterminés sont : -les signes de réveil (changements rapides de pression artérielle ou de fréquence cardiaque donnée par échographie suite au pincement des pattes et souffle dans les vibrisses), le % de l'anesthésiant sera modifié pendant le temps nécessaire. - la diminution de la température corporelle en dessous de 36°C, la température de la platine sera remontée. - Fréquence cardiaque anormale sous anesthesiant (différente de 350-400 battements par minute), le % d’anesthesiant sera adapté. Si aucun des ajustements ci-dessus n’améliore ni l’état hémodynamique ni le bien-être de l’animal, celui-ci sera mis à mort.
Choix des espèces
Les souris sauvages sous régime riche en graisses et en fructose développent une obésité, une insulino résistance et une rigidité artérielle proche de celle de l’homme. Il est plus facile de réaliser une invalidation génique chez les souris. Des souris adultes mâles et femelles de 18 semaines seront utilisées pour la réalisation de ce projet, âge adulte où l'appareil vasculaire a atteint sa pleine maturité.
Caractérisation des cellules immunitaires néonatales et de leur rôle dans le développement de maladies chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système respiratoire
2 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, une partie d'entre elles tuées sans réveil. Elles reçoivent des injections de cellules et d'antibiotiques, puis des molécules induisant une colite ou une réaction allergique de type asthme, avec perte de poids et inflammation intestinale ou pulmonaire déclarées. Les stimulations sont appliquées au stade néonatal et les effets étudiés à l'âge adulte. Le porteur décrit ces modèles comme reproduisant les maladies inflammatoires humaines et affirme que le modèle animal est "incontournable", aucun modèle cellulaire ne reproduisant la résidence des cellules immunitaires pendant cette période.
Objectifs
Les objectifs du projet sont : -Identifier des nouveaux types de cellules immunitaires adultes établissant résidence dans les tissus muqueux pendant la période néonatale par injection de cellules marquées chez la souris. - Identifier la capacité des cellules immunitaires adultes établissant résidence dans les tissus muqueux pendant la période néonatale à être régulées par le microbiote sur le long terme par administration d’antibiotiques. -Caractériser la fonction des cellules immunitaires adultes établissant résidence dans les tissus muqueux pendant la période néonatale dans des modèles expérimentaux murins de colite et d’asthme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet expérimental sont doubles : caractériser des nouvelles cellules immunitaires participant à l’inflammation des muqueuses et identifier de nouveaux marqueurs cellulaires pour prédire, diagnostiquer et traiter les maladies inflammatoires chroniques intestinales et l’asthme chez l’homme.
Procédures
Des cellules seront injectées aux souris pendant 10 secondes. Les antibiotiques seront administrés dans l’eau de boisson pendant 14 jours. Une molécule permettant de générer une colite sera administrée dans l’eau de boisson pendant 7 jours. Une molécule préparant une réaction du système immunitaire sera appliquée sur la peau pendant 60 secondes. Une molécule provoquant une réaction du système immunitaire sera injectée pendant une durée de 60 secondes sous anesthésie générale. Une molécule provoquant une réaction allergique sera injectée pendant une durée de 60 secondes pendant 20 jours répartis sur 4 semaines sous anesthésie générale. Un prélèvement unique de sang sera effectué et durera approximativement 10 secondes avec analgésie locale.
Impact sur les animaux
5 nuisances : (1) Les traitements antibiotiques peuvent engendrer des diarrhées modérées. Durée : 14 jours (2) Les injections de cellules peut provoquer un stress modéré et bref. Durée : 10 secondes (3) L’administration orale de molécule irritante par l’eau de boisson entraine une réaction inflammatoire de l’intestin et une perte de poids. Durée : 7 jours (4) L’application cutanée suivi de l’injection d’une molécule provoquant une réaction du systéme immunitaire entraine une réaction inflammatoire de l’intestin et une perte de poids. Durée : 8 jours (5) L’administration d’une molécule provoquant une réaction allergique entraine une réaction inflammatoire des poumons. Durée : 28 jours
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de prélever des tissus pour analyse.
Remplacement
Il n’existe aucun modèle cellulaire pertinent pour étudier la résidence tissulaire pendant la période néonatale. Le modèle animal est incontournable à l’heure actuelle. Les modéles et injections prévues dans notre projet ont été préalablement étudiés et validés chez la souris. Dans ce contexte, le modèle animal le plus couramment utilisé en première intention est le modèle murin. Les modèles experimentaux murins d’inflammation intestinale utilisés miment les maladies inflammatoires chroniques intestinales humaines. Le modèle murin d’allergie utilisé provoque une réaction inflammatoire mimant l’asthme humain.
Réduction
Les différentes étapes du projet seront suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats. Des analyses de données de groupe et des expériences antérieures nous ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Nous utilisons des lots d’animaux homogènes pour réduire la variabilité et les expériences seront réalisées en aveugle pour éviter les biais. Les modéles d’inflammation intestinale et d’allergie seront utilisés en fonction de l’identification des cellules cibles. Si un ou plusieurs de ces modèles ne correspondent pas aux critéres d’activation des cellules d’intérêt, ils seront abandonnés. Les mêmes souris seront utilisées pour la préparation des injections pour réduire le nombre de souris utilisé.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans une cage contenant une litière de sciure de peuplier dépoussiérée ainsi qu’un tunnel en carton, un cylindre de cellulose et un bout de bois favorisant l'expression de comportements et d'activités mentales qui sont appropriés à l'espèce murine. Dans ces expériences, les souches de souris et les âges de prélèvement ont été choisies en fonction de l’objectif de l’expérimentation. L’état sanitaire et le bien-être des animaux sont évalués tout le long de l’expérience par des personnels formés. Des mesures seront prises pour réduire au minimum les nuisances: anesthésie lors de l’instillation intranasale, anesthésie avec analgésie lors de l’injection intrarectale, limitation au minimum des temps de contention et surveillance accrue après chaque geste. Une grille de scoring sera utilisée pour évaluer le stress. La procédure sera arrétée et les animaux mis à mort lorsqu’un des points limites sera observé.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de choix pour l’étude des cellules immunitaires en raison de i) l'excellente caractérisation du développement immunitaire murin, ii) la prédominance des outils d'analyse (réactifs immunologiques disponibles) par rapport aux autres espèces envisageables, iii) la validation et publication des modéles experimentaux chez la souris mimant les pathologies humaines de maladie inflammatoire chronique et d’asthme. Les souris sont stimulées au stade néonatale et étudiées au stade adulte car ceux sont deux périodes liées au développement de maladies inflammatoires chroniques intestinales et d’asthme chez l’homme.
Electrorétinographie et thérapie génique chez des souris modèles de myopathie de Duchenne
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
744 souris modèles de la myopathie de Duchenne vont être utilisées, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés et sans réveil pour une partie. Sous anesthésie, elles reçoivent des injections intraoculaires et intraveineuses et des enregistrements d'électrorétinogrammes par électrodes posées sur la cornée, après un test comportemental en environnement nouveau, pour étudier les troubles visuels de la maladie et une thérapie génique. Le porteur indique que les injections oculaires peuvent provoquer déshydratation, ulcère de la cornée ou cataracte, et que les souris sont tuées pour analyser leurs rétines, 80 individus surnuméraires étant gardés pour la reproduction. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico pour ces tests fonctionnels.
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est causée par des mutations du gène DMD qui conduisent à une dégénérescence musculaire pouvant être associée à des troubles cognitifs et divers autres troubles sensoriels et cérébraux. Les patients atteints de DMD peuvent notamment développer des rétinopathies. Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle des protéines de la famille des dystrophines, qui sont impliquées dans cette maladie et présentes dans la rétine, d’étudier les conséquences pathologiques de leur perte chez des souris modèles de la DMD, et les possibilités de traitement basés sur des approches de thérapie génique. Ce projet est important pour le diagnostic et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles affectant le système nerveux dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD).
Bénéfices attendus
Les patients atteints de DMD peuvent développer une rétinopathie proliférative, une cataracte, des anomalies de l'électrorétinogramme (ERG), une altération de la sensibilité aux contrastes, des pertes de vision des couleurs et des seuils élevés de détection des stimuli visuels dans l'obscurité. Ces troubles ont été très peu étudiés mais ne peuvent plus être aujourd’hui considérés comme secondaires, car vu l’évolution des thérapies et prises en charge dans cette maladie, la durée de vie des patients s’accroit considérablement et les troubles affectant le système nerveux prennent progressivement une place de plus en plus importante dans la vie des patients. La présence et la sévérité des troubles sensoriels et cérébraux semblent liées à la position des mutations dans le gène et au nombre de protéines impactées (plusieurs protéines dystrophines sont produites par ce gène), et une meilleure connaissance des effets de différentes mutations a donc un intérêt diagnostique majeur qui permettra d’anticiper la sévérité et l’évolution des troubles sensoriels et cognitifs dans cette maladie. Ces évaluations sont très rarement effectuées chez les patients, d’où les connaissances très parcellaires de ces dysfonctions. De plus, les approches thérapeutiques développées ces dernières années et actuellement en phase d’essai clinique ont principalement été validées pour leurs effets sur les muscles, mais leur capacité à améliorer les fonctions liées au système nerveux restent très peu étudiée. Il est donc important d’apporter des réponses à ces questions au cours d’études précliniques sur des modèles animaux de la maladie, porteurs de différentes mutations. Les résultats de ce projet permettront ainsi de préciser les relations entre mutations et sévérités des déficits visuels. Nous évaluerons également si ces troubles sont sensibles aux thérapies géniques actuellement disponibles et s’ils peuvent servir de marqueur, non seulement pour le diagnostic, mais aussi pour suivre de manière peu invasive l’impact d’un traitement sur le système nerveux. Le cas échéant, ce projet aura démontré que l’évaluation des fonctions visuelles a un intérêt majeur en clinique pour cette maladie.
Procédures
Test comportemental : 3 essais quotidiens de 10 min espacés d’une heure, pendant 3 jours – Animal placé dans un environnement nouveau et libre de ses mouvements sur une surface de 8 cm2 au cours de chaque essai. Anesthésie générale et placement d’électrodes (lentilles de contact sur la cornée et électrode sous-cutanée), enregistrement d’électrorétinogrammes (30 min). Anesthésie générale et analgésie pour injections intraoculaires (intra-vitréennes) : durée de l’injection inférieure à 3 min. Anesthésie générale pour injections intraveineuses (sinus retro-orbitaire) : durée de l’injection inférieure à 1 min.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable potentiel dans ces lignées à cet âge est de l’anxiété et une plus forte réactivité au stress, de manière temporaire en fonction des conditions et évènements. Le test comportemental peut potentiellement induire un léger stress, dû à l’introduction dans un environnement nouveau et à la surface limitée de mouvement (8 cm2). Les injections intraoculaires et les enregistrements électrophysiologiques sont susceptibles d’induire une déshydratation oculaire, un ulcère de la cornée ou une cataracte.
Devenir
A la suite des tests comportementaux et des électrorétinogrammes, et après une période de récupération (1 semaine) les animaux seront euthanasiés pour prélèvements et analyses de leurs rétines pour préciser les bases cellulaires des altérations visuelles. Suite aux expériences incluant un traitement par thérapie génique, et après une période de récupération (1 semaine) les animaux seront euthanasiés pour prélèvements et analyses de leurs rétines pour vérifier et quantifier la réexpression des dystrophines induites par les traitements. Une partie des femelles et mâles surnuméraires sera gardée en vie et utilisée pour former de nouveaux accouplements (n=80), les autres seront euthanasiées.
Remplacement
Les recherches précliniques pour ces pathologies n’ont pas de modèle in silico ou in vitro et sont initialement menées sur des souris. Notre projet a pour but d’effectuer des tests fonctionnels qui nécessitent l’utilisation d’animaux vivants. Les traitements les plus prometteurs sont habituellement testés dans une seconde étape sur de plus gros mammifères, par nos collaborateurs ou d’autres laboratoires, avant d’envisager leur entrée en phase d’étude clinique si on pense qu’ils peuvent conduire à de nouveaux médicaments.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration statistique convaincante des objectifs. Sur la base de nos récentes études, la réussite des expériences nécessite 12 souris par groupe expérimental. Nous utilisons des tests statistiques adaptés aux petits échantillons et des analyses statistiques régulières en cours d’expérience permettent d’interrompre éventuellement l’expérience avant d’atteindre l’effectif maximal. De plus, nous utilisons une approche longitudinale permettant d’obtenir les données comportementales, électrophysiologiques et morphologiques à partir d’un même groupe expérimental ; pour les injections intra-vitréennes, un seul œil est traité par souris, l’autre œil servant de contrôle interne non-injecté pour évaluer les effets de l’injection en évitant un groupe supplémentaire ; la répétition des mesures qui sont ensuite moyennées au sein de chaque expérience permet de réduire encore la variabilité et donc le nombre d’animaux. Un nombre réduit de souris non atteintes par la pathologie sera utilisé dans des groupes servant à contrôler les effets des injections. Alors que certaines procédures impliquent la comparaison de 4-5 modèles porteurs de mutations différentes, l’approche thérapeutique se focalise sur 2 souris modèles, l’une présentant les altérations les plus sévères, l’autre étant représentatives d’une importante population de patients. Enfin, l’expérience basée sur l’administration périphérique du traitement ne sera effectuée que si la procédure précédente a montré des effets thérapeutiques encourageants. L’ensemble de ces mesures permet de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés dans l’ensemble du projet.
Raffinement
Les injections/anesthésies, la récupération post-opératoire et les études fonctionnelles ont été optimisées en concertation avec notre vétérinaire. Elles comprennent une anesthésie/analgésie générale et locale au niveau de l’œil, une prévention de la déshydratation oculaire et un collyre cicatrisant antibactérien et anti-inflammatoire en fin d’expérience pour éviter notamment les risques d’ulcères cornéens. Toutes les manipulations sont effectuées par des personnels qualifiés parfaitement formés aux procédures mis en place dans ce projet, et le taux d’échec des expériences est très faible. Afin d’évaluer si un animal présente néanmoins des signes de souffrance ou d’inconfort, nous avons prévu un suivi quotidien et post-opératoire avec des grilles d’observations spécifiques, et mis en place des critères d’arrêt précis avec prise en charge des animaux le cas échéant (arrêt de la procédure, soins, ou euthanasie) en concertation avec notre vétérinaire, la cellule bien-être animal et l’équipe zootechnique. Les conditions d’hébergement sont enrichies jusqu’à la fin du projet et les souris expérimentales sont maintenues en groupe sociaux par fratrie. L’état général des animaux est suivi quotidiennement et en cas de signes de souffrance ou d’inconfort, des mesures correctives sont prévues selon un protocole mis en place avec notre vétérinaire référent.
Choix des espèces
Les explorations précliniques dans le cadre de cette pathologie sont menées sur des souris. D’autres modèles animaux de la DMD existent (rat, chien, porc), mais seule l’espèce souris permet actuellement de disposer de différents modèles mutants ou transgéniques porteurs de mutations variées et représentatives des sous-groupes de patients montrant des variations dans la sévérité des symptômes. Les souris modèles dans ce projet sont toutes sur un fond génétique spécifique, nous utiliserons donc aussi des mâles de cette souche provenant d’un éleveur agréé afin d’effectuer des croisements en « backcross » pour éviter toute dérive génétique au cours du projet. Les souris jeunes adultes seront étudiées (minimum 6-8 semaines). Des résultats récemment publiés montrent par exemple qu’en injection intraoculaire, l’ensemble de la rétine est ciblé par nos outils de thérapie génique après injection chez des jeunes adultes. Les électrorétinogrammes en condition basale ne seront pas effectués avant 8 semaines, car les réponses ne sont stables qu’à partir de cet âge, et il est important de ne pas inclure des variations liées à l’âge qui pourraient compliquer nos conclusions sur les effets des traitements.
Evaluation de la perfusion hypothermique oxygénée et des « transporteurs d’oxygène » comme modalité de préservation des transplants rénaux et utérins dans un modèle porcin
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
42 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale profonde, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque intervention, jusqu'à trois heures, comprend une laparotomie, la préparation vasculaire des organes, un prélèvement de sang puis la mise à mort et le prélèvement des reins et de l'utérus, pour tester des méthodes de préservation des greffons rénaux et utérins. Le porteur décrit une procédure unique sans réveil pouvant causer un stress lié à l'anesthésie prolongée, et indique regrouper sur un même animal le prélèvement de plusieurs organes. Il affirme que ce modèle porcin "pré-clinique" est "indispensable", son anatomie étant présentée comme proche de celle de l'humain.
Objectifs
En transplantation d’organes, la période entre le prélèvement du transplant chez les donneurs et sa revascularisation chez le receveur est une période particulièrement critique. La préservation des organes est principalement basée sur la mise en hypothermie des organes afin de diminuer le métabolisme à 4°C. Cependant, la préservation en hypothermie statique n'est pas encore optimum. Ainsi, il existe actuellement un développement des techniques de préservation visant à apporter de l’oxygène aux transplants tout au long de la préservation. Ainsi l’objectif de notre étude est d’évaluer l’impact de la perfusion hypothermique 1) oxygénée et 2) avec des « transporteurs d’oxygène » au cours de la préservation des transplants rénaux et utérins dans un modèle porcin, organes qui répondent à des problématiques de conservation bien différentes.
Bénéfices attendus
L’évaluation de modalités innovantes de préservation dans ce modèle pré-clinique porcin permettra de proposer à la fois en transplantation rénale et utérine de nouvelles modalités en clinique humaine avant une éventuelle autorisation d’application en clinique par l’Agence de BioMédecine.
Procédures
Procédure unique sous anesthésie générale profonde, Procédure sans réveil (maximum 3h)- Anesthésie générale (30min)- Laparotomie (30 min)- Préparation vasculaire des transplants (1h)- Prélèvement de sang (30 min)- Mise à mort sous anesthésie générale profonde (10 min)- Puis prélèvements multi-organes
Impact sur les animaux
Procédure sans réveil, après anesthésie profonde longue (3h maximum) pouvant causer un stress
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, sous procédure complète d’anesthésie profonde, pour prélèvements multiorganes.
Remplacement
L'étude des paramètres de perfusion/évaluation d’un organe, compatibles avec une transplantation ne peut se concevoir que dans un modèle animal pré-clinique (donneur), il n’existe pas de remplacement possible pour ces expérimentations qui répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement. Cependant, de façon à réduire le nombre d’animaux utilisés, l’étude de la revascularisation des organes après la préservation hypothermique ne sera pas réalisée dans un modèle d’allo transplantation avec utilisation de sujets supplémentaires (receveurs) mais par la mise des organes sur machine de perfusion normothermique oxygénée.
Réduction
Ce protocole de recherche a été réalisé pour optimiser le prélèvement des organes sur chaque animal. Ainsi l’utérus et les reins de chaque animal seront prélevés pour inclusion dans les projets de recherche pour 30 animaux femelles. Bien qu’à ce jour, il ne soit pas retrouvé dans la littérature de données en faveur d’un impact du sexe du donneur sur la préservation des transplants, nous souhaitons pouvoir inclure des mâles dans l’analyse des transplants rénaux afin d’évaluer tout effet lié au sexe. 12 animaux « mâles » avec un prélèvement rénal bilatéral simple seront inclus pour mener à bien le protocole de recherche sur la transplantation rénale. Les groupes de 5 organes semblent suffisants pour permettre une analyse statistique des résultats. Cependant l’ensemble des reins seront inclus avec au total 10 reins dans chaque groupe pour augmenter au maximum la puissance statistique et utiliser au mieux de matériel biologique disponible.
Raffinement
Avant protocole, selon leur taille et leur comportement, les animaux peuvent être hébergés par 1, 2 ou 3 par boxes, au sein d’une même pièce. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est apporté quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est apporté en rotation dans les boxes selon un programme hebdomadaire. Au moment du protocole : de façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures de ce projet seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie générale et un traitement analgésique est donné en per-opératoire . Une table chauffante est utilisée lors de l’anesthésie générale et des procédures suivantes.
Choix des espèces
L’anatomie abdominale et pelvienne ainsi que la physiologie du porc jeune adulte de 100 kg (5-6 mois) sont proches de celles de l’homme adulte et font donc de cette espèce un excellent modèle pré-clinique. Toutefois, bien que l’anatomie de l’utérus porcin (bifide) diffère de celui de la femme, il reste cependant un bon modèle dans notre projet de préservation de transplants vascularisés. Effectivement, le modèle porcin a précédemment été évalué pour étudier la vascularisation de l’utérus en vue d’une transplantation chez l’Homme.
Utilisation d’une lignée de souris transgénique AARE-LUC pour identifier les inducteurs et les tissus cibles de la voie eIF2α-ATF4
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 035 souris transgéniques vont être utilisées, dans des procédures déclarées sévères pour 780 d'entre elles et sans réveil pour 255, alors que la partie sur les effets attendus ne décrit que des interventions légères, piqûre d'aiguille, jeûne de 16 h et isolement de courte durée. Les animaux reçoivent de la luciférine puis sont anesthésiés pour une imagerie de bioluminescence, avec des prélèvements sanguins submandibulaires, afin de visualiser l'activation d'une voie de signalisation selon le régime nutritionnel ou un traitement. Une partie est tuée pour prélever les organes et une autre réutilisée dans d'autres expériences, le porteur gardant vivantes les souris dont le transgène est fonctionnel. Il indique tester d'abord l'effet des inducteurs sur cellules en culture, mais justifie le recours à la souris par l'étude au niveau de "l'animal entier".
Objectifs
Afin de pouvoir étudier le rôle joué par la voie de signalisation eIF2α/ATF4 au niveau de l’animal entier, nous avons généré une lignée de souris transgénique qui exprime le gène rapporteur luciférase sous le contrôle de séquences de fixation du facteur de transcription ATF4. Cette lignée de souris a été breveté et constitue un outil de choix pour visualiser le stress nutritionnel ou pharmacologique au niveau de l'animal entier. Notre objectif avec cet outil murin transgénique est de mieux caractériser les conditions d’activation de cette voie de signalisation dans l’espace et dans le temps en fonction du régime nutritionnel ou du traitement pharmacologique.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre chez les mammifères les effets de la consommation d’un régime déséquilibré en acides aminés ou d’un traitement avec un inducteur pharmacologique. Dans ce but, les souris transgéniques bioluminescentes sont un outil de choix pour situer dans l’espace (identification des tissus et cellules cibles) et dans le temps (chronologie d’activation en fonction des sites) l’activation de la voie eIF2α-ATF4 dans des conditions de carences nutritionnelles en acides aminés ou lors d’un traitement pharmacologique par la mesure de la bioluminescence au niveau du corps entier de l’animal vigile, de l’expression (immuno-histochimie) et/ou de l’activité de l’enzyme codée par le gène rapporteur luciférase dans les tissus cibles.
Procédures
Des prises de sang pourront aussi être réalisées sur animal vigile au niveau de la veine submandibulaire (1 min par souris) à l'aide de microlancettes spécifiques. Elles seront réalisées avant et après le protocole nutritionnel en alternant le côté du prélèvement. Pour visualiser l’activité luciférase en utilisant un appareil d’imagerie bioluminescente (10 min par souris), les animaux seront injectés avec de la luciférine (10 sec par souris), anesthésiés sans effets indésirables (15 min par souris). Pendant toute la durée d'adaptation au régime contrôle (7 jours) et d'expérimentation (96h maximum), les souris seront hébergées individuellement avec un accès libre à l’eau et à la nourriture.
Impact sur les animaux
Les 2 lignées de souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Les expériences réalisées ne vont pas engendrer d’effets indésirables sévères : piqûre d’aiguille, transport des souris, anesthésie gazeuse, jeûne de 16h maximum et isolement de courte durée.
Devenir
Les animaux dont le transgène n’est pas fonctionnel seront mis à mort (105 souris). Les autres animaux dont le transgène est fonctionnel sont gardés en vie (930 souris). Pour tester la réponse à différents inducteurs nutritionnels déséquilibrés en acides aminés, une partie des animaux sera mise à mort avant la fin de la procédure (100 souris) pour prélever les organes et tissus afin d’identifier précisément où la voie eIF2α/ATF4 est activée. Les autres animaux pourront être réutilisés dans d’autres expériences (680 souris). Pour tester la réponse à différents inducteurs pharmacologiques, une partie des animaux sera mise à mort avant la fin de la procédure (50 souris) pour prélever les organes et tissus afin d’identifier précisément où la voie eIF2α/ATF4 est activée. Les autres animaux pourront être réutilisés dans d’autres expériences (100 souris).
Remplacement
De nombreuses expériences préliminaires réalisées in vitro sur des lignées de cellules en culture permettent d'abord de tester l'efficacité de carence en un acide aminé ou d’inducteurs pharmacologiques sur l’activation de la voie eIF2α-ATF4. Ces expériences permettent dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience est calculé au minimum en fonction du test statistique retenu. Cependant, étant donné l'hétérogénéité inter-animal de l’induction de la bioluminescence, il s'avère indispensable de répéter les expériences. Etant donné que les procédures sont légères, une même souris pourra être réutilisée pour tester l’effet de plusieurs régimes après une période de récupération d’une semaine.
Raffinement
Durant l'étude, tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition (tube plastique rouge et/ou bille métallique). Par ailleurs, l'utilisation d’un transgène exprimant la luciférase nous permettra de suivre l’activation de la voie eIF2α-ATF4 à l'aide d'une méthode non invasive (bioluminescence).
Choix des espèces
Les deux lignées homozygotes de souris transgéniques bioluminescentes (fond génétique C57 Bl/6), ont été générées par notre équipe. Les croisements pour amplifier ces deux lignées seront réalisés avec des souris âgées de 4 à 6 mois, âge où le taux de fécondité est optimum. Pour toutes les procédures, les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 2 à 24 mois. L'âge pourra dépendre de l'objectif de l'expérience réalisée.
Enseignement pratique de la chirurgie urologique sur modèle porcin.
- Formation professionnelle
200 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal subit une intervention chirurgicale unique pouvant durer jusqu'à sept heures, non pour produire des connaissances mais pour entraîner de jeunes chirurgiens et des infirmiers de bloc à la chirurgie urologique. Le porteur décrit ces séances comme une "offre de formation" fondée sur le principe "jamais la première fois sur le patient". Il justifie le recours au porc par une anatomie "très proche" de celle de l'humain, après un apprentissage préalable sur simulateurs et pièces anatomiques.
Objectifs
A l’heure où les recommandations de bonnes pratiques nous interdisent, à juste titre, l’enseignement initial de la chirurgie sur les patients, nous organisons des travaux pratiques en chirurgie et pratiques interventionnelles pour les jeunes chirurgiens et les infirmiers de bloc opératoire en proposant un apprentissage intégré. L’objectif est de faciliter l’acquisition des techniques et des gestes opératoires à la fois par voie abdominale ouverte (laparotomie) et par cœlioscopie (ou laparoscopie), répondant parfaitement aux besoins de simulations nécessaires à une formation pratique initiale et continue. La formation s’effectue de façon progressive et intégrée au sein de 1) le laboratoire de simulation, qui offre un entrainement sur simulateurs de chirurgie. Ce laboratoire permet un apprentissage préalable de la gestuelle sur simulateur. 2) le laboratoire d’anatomie complète l’offre de formation en permettant un apprentissage dans de véritables conditions anatomiques humaines. 3) Enfin, le laboratoire de chirurgie ouverte et de laparoscopie sur porcs, permet la formation initiale des internes, et continue des chirurgiens praticiens sur un modèle permettant un enseignement des techniques chirurgicales et interventionnelles dans des conditions physiologiques quasi équivalentes à la clinique humaine.
Bénéfices attendus
Ces sessions de formation répondent au rapport aux objectifs de la mission de la Haute Autorité de Santé sur l’état de l’art (national et international) en matière de pratiques de simulation dans le domaine de la santé : « La formation par les méthodes de simulation en santé doit être intégrée dans tous les programmes d'enseignement des professionnels de santé à toutes les étapes de leur cursus (initial et continu). Un objectif éthique devrait être prioritaire : « jamais la première fois sur le patient ». Ces sessions permettent la formation initiale des internes, et continue des chirurgiens praticiens sur un modèle permettant un enseignement des techniques chirurgicales et interventionnelles dans des conditions physiologiques quasi équivalentes à la clinique humaine.
Procédures
Procédure unique de chirugie sous anesthésie générale profonde et analgésie- Durée maximale 7 heures
Impact sur les animaux
Procédure chirurgicale, sous anesthésie générale longue (7h maximum) pouvant causer un stress et de la douleur.
Devenir
L’ensemble des procédures chirurgicales réalisées lors de cet enseignement ne permettant pas un réveil et un maintien en vie dans de bonnes conditions, aussi l’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, sous procédure complète d’anesthésie profonde.
Remplacement
Préalablement à l’accès à la formation chirurgicale sur modèle porcin, différentes phases de l’apprentissage sont développées en amont aux laboratoires de simulation et d’anatomie.
Réduction
Le nombre maximum estimé d’animaux (porcs) nécessaire à cet enseignement est de 200 animaux pendant 5 ans. De façon à réduire le maximum d’animaux nécessaires les différentes procédures d’apprentissage sont réalisées le même jour sur un même animal par plusieurs infirmiers ou chirurgiens en formation. De même des sessions de formation commune aux infirmiers de bloc et chirurgiens seront organisées
Raffinement
Avant la procédure, les animaux peuvent être hébergés par 1, 2 ou 3 par boxe, au sein d’une même pièce, selon leur taille, le sexe et leur comportement, permettant une communication entre congénères. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est apporté quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est apporté en rotation dans les boxes selon un programme hebdomadaire. Une table chauffante est utilisée lors de l’anesthésie générale et des procédures suivantes. De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures de ce projet seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie générale et un traitement analgésique sera donné de façon adaptée à chaque procédure. Un suivi des points limites strict et spécifiques au projet est réalisé tout au long de la procédure.
Choix des espèces
L’anatomie du porc au niveau thoracique, abdominal et pelvien, ainsi que sa physiologie sont très proches de celles de l’homme, et de ce fait représente un très bon modèle vivant d’apprentissage et d’entrainement des diverses procédures chirurgicales avant d’approfondir l’apprentissage en chirurgie humaine. Jeune adultes, 4-6 mois, 80-100Kg, similitude anatomique et physiologique avec un homme adulte au niveau thoracique, abdominal et pelvien.
Thérapie métabolique cardioprotectrice par le nicotinamide riboside en transplantation
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
26 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit une intervention unique de 90 minutes reproduisant un état de mort encéphalique par hypertension intracrânienne ou un arrêt circulatoire, avant le prélèvement du cœur pour une perfusion ex vivo. L'objectif est de tester si le nicotinamide riboside protège les greffons cardiaques en transplantation, la perspective clinique étant renvoyée à un éventuel essai chez l'humain. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit ces conditions et qu'un "gros animal" est requis pour l'instrumentation chirurgicale.
Objectifs
Le cœur est un organe très sensible aux lésions causées par l’arrêt et la reprise de la circulation sanguine (ischémie-reperfusion). En transplantation cardiaque, ces lésions peuvent se compliquer d’une défaillance primaire du greffon dans plus de 20% des cas. Or il s’agit de la première cause de mortalité précoce chez les patients transplantés. Le prélèvement d’organe puis son transport exposent le cœur à une période inéluctable d’ischémie. La reperfusion du cœur au moment de la transplantation entraîne un redémarrage brutal du métabolisme avec une carence en substrats énergétiques. Notre étude a pour objectif de développer une nouvelle approche pharmacologique métabolique de cardioprotection en transplantation en restaurant les réserves cellulaires de nicotinamide adénine dinucléot (NAD), un élément indispensable pour la synthèse de substrat énergétique, après exposition à un stress ischémique. La restauration des taux de NAD (via son précurseur le nicotinamide riboside –NR) a récemment émergé comme une cible thérapeutique dans différentes pathologies cardiovasculaires chroniques. Nos résultats préliminaires sur modèle murin d’infarctus du myocarde montrent, que le maintien du niveau normal de NAD dans le cœur préserve la fonction mitochondriale des cardiomyocytes ce qui permettrait de limiter les conséquences de l’ischémie-reperfusion en optimisant la fonction myocardique. La perspective clinique à court terme est d’appliquer cet agent pharmacologique en transplantation cardiaque chez l’homme pour diminuer l’incidence et la sévérité de la défaillance primaire du greffon, non seulement pour les cœurs prélevés sur donneur en état de mort encéphalique, mais également sur donneur décédé après arrêt circulatoire contrôlé. Dans ces deux situations, le cœur est exposé à une succession ischémie chaude, puis ischémie froide, puis reperfusion, autant de séquences à risque d’induire une carence profonde en substrats énergétiques pour le myocarde. Notre projet vise à établir si la restauration des pools de NAD pourrait constituer une nouvelle approche pharmacologique de cardioprotection en transplantation cardiaque afin d'améliorer la survie précoce des patients.
Bénéfices attendus
Les effets de l’administration du NR n’ont jamais été rapportés à ce jour dans un modèle aigu d’ischémie-reperfusion tel que la transplantation cardiaque. Notre projet vise à évaluer l’effet cardioprotecteur du NR pour limiter les conséquences fonctionnelles de l’ischémie-reperfusion du greffon en transplantation cardiaque. Les bénéfices attendus sont une meilleure protection des greffons cardiaques destinés à la transplantation, et par conséquent une diminution de l’incidence et de la sévérité de la défaillance primaire du greffon, première cause d’échec et de mortalité précoce en transplantation cardiaque. Notre étude pourrait également ouvrir à moyen terme la voie aux thérapies pharmacologiques de réhabilitation cardiaque ex vivo afin de pouvoir proposer des greffons jusqu’alors récusés pour la transplantation car à haut risque d’engendrer une défaillance primaire du greffon.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention de 90 minutes, réalisée sous anesthésie générale, consistant en la modélisation d’un état de mort encéphalique par hypertension intracrânienne aiguë ou d’un arrêt circulatoire contrôlé. Aucun animal ne sera par définition réveillé à l'issue de de ces procédures. Il n'y a aucune intervention prévue sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie générale avec traitement hypnotique et analgésique. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. Aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal puisqu’il s’agira de procédures sans réveil avec euthanasie de l’animal en fin de procédure. La seule nuisance sera l'injection intra musculaire permettant d’obtenir une sédation vigile et une tranquiliation avant de réaliser l'anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort au terme de chaque procédure, le cœur étant prélevé pour être analysé durant une perfusion d’organe ex vivo. La finalité de l'étude est de d’étudier l’impact d’un agent thérapeutique ciblant le métabolisme énergétique afin d’optimiser à très court terme la fonction cardiaque en prévision d’une transplantation.
Remplacement
Il n’existe pas, à notre connaissance, de modèle expérimental alternatif, in silico ou in vitro, permettant de reproduire les conditions du métabolisme myocardique sur un cœur soumis à une séquence d’ischémie-reperfusion. Il ne peut s’agir que d’un cœur provenant d’un système vivant reproduisant des conditions anatomiques et physiologiques proches de celles d’un cœur humain. L’évaluation de l’agent pharmacologique que nous étudierons (Nicotinamide Ribonucléotide, NR) ne peut se faire que sur un organe d’une espèce animale dont le métabolisme énergétique consomme du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD). Enfin seul un modèle sur gros animal permettra une instrumentation chirurgicale adaptée pour réaliser la perfusion cardiaque isolée ex vivo sur machine pour évaluer la fonction cardiaque par échographie de surface et cathétérisme intracardiaque.
Réduction
Une échographie cardiaque sera réalisée chez tous les animaux au moment de leur inclusion dans l’étude afin de dépister toute malformation cardiaque ou toute défaut de contractilité qui pourrait compromettre le bon déroulement du protocole expérimental. En cas d’anomalie anatomique ou fonctionnelle constatée à l’échographie cardiaque (moins de 2 % des cas dans notre expérience), l’animal sera sorti de l’étude et ne sera donc pas mis à mort pour les fins de ce protocole dans un principe de réduction du nombre des animaux. Le nombre d’animaux par groupe sera fixé à 6 afin de pouvoir réaliser des tests de comparaison statistique entre les groupes. Nous utiliserons des modèles d’analyse de la variance pour nos analyses statistiques. Nous prévoyons 2 animaux supplémentaires en cas de sortie prématurée d’étude d’un animal en cas d’échec de réanimation du cœur sur machine de perfusion ex vivo. Ce qui risque est de l’ordre de 5% dans notre expérience portant sur 64 cœurs porcins et 10 cœurs humains perfusés ex vivo par notre équipe depuis 2019. Les expérimentations seront réalisées par des chirurgiens cardiaques expérimentés formés au prélèvement cardiaque et à la perfusion d’organe isolé sur machine afin de réduire le risque d’échec de procédure par défaillance technique des expérimentateurs. Au total 26 animaux au maximum (4 groupes de 6 + 2 animaux supplémentaires) seront utilisés pour cette étude. Dès que le nombre de 6 animaux par groupe sera atteint, aucune autre inclusion ne sera nécessaire.
Raffinement
Dans un principe de raffinement, nous appliquerons les points suivants : - Respect d’une période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche - Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères - Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention) - Procédures expérimentales réalisées par du personnel qualifié et expérimenté (chirurgiens séniors, techniciens anesthésistes) permettant un temps interventionnel réduit au maximum - Privilégier les ponctions vasculaires percutanées échoguidées artérielles et veineuses, pour mise en place des cathéters de surveillance hémodynamique continue : moins de souffrance, moins de saignement. Avant l'anesthésie générale, les animaux auront une injection intra musculaire afin d’obtenir une sédation vigile et une anxiolyse. S'agissant de procédures expérimentales réalisées sous anesthésie générale balancée (narcose, analgésie et curarisation) sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure ou en cas d'échec de l'anesthésie.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le porc. Le porc présente une physiologie circulatoire proche de celle de l’homme : fréquence cardiaque proche de 100/min, débit cardiaque entre 3,5 et 4 L/min pour un poids de 50 kg. Par ailleurs son anatomie cardiovasculaire facilite la modélisation chirurgicale des procédures avec une applicabilité rapide des résultats à la pratique clinique. Cette convergence permet une adaptation optimale de l’espèce aux expérimentations et limitera au minimum le nombre d’animaux tests, ce d’autant que notre équipe a une expérience de ce modèle avec plus de 60 procédures réalisées depuis 2019. Enfin notre protocole prévoit des prélèvements sanguins et des biopsies myocardiques répétées sur le cœur perfusé ex vivo avec respectivement un volume (10 mL) et un poids (20 mg) de prélèvement minimum afin de pouvoir réaliser les analyses métabolomiques. L’expérimentation sur le porc se prête à ce type de prélèvements répétés, contrairement à un modèle rongeur qui permettrait un recueil plasmatique et tissulaire de plus faible quantité. Les animaux de ce protocole sont des porcs de 50kg (environ 90 jours) afin d’avoir un gabarit proche de celui d’un homme. A ce stade, ils ont une anatomie cardiovasculaire semblable à l’Homme avec des diamètres d’aorte et d’artère pulmonaire compatible avec l’instrumentation du cœur sur module de perfusion isolé ex vivo.