Procédures sans réveil
Diplome Universitaire de microchirugie et mise au point d’un modèle expérimental d’anévrisme chez le rat
- Enseignement supérieur
1 310 rats vont être utilisés et tués à l'issue, mille dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 310 en gravité modérée. Ils sont utilisés pour entraîner des chirurgiens et des internes à la microchirurgie vasculaire et pour mettre au point un modèle d'anévrisme, dans le cadre d'une formation diplômante. Le porteur décrit d'abord un apprentissage sur tubes de silicone, qu'il juge insuffisant faute de saignement réel, et affirme la "nécessité" d'un "organisme entier et vivant". Il conclut à l'absence de méthode in vitro capable de remplacer la pratique chirurgicale sur l'animal, qu'il dit "indispensable".
Objectifs
Ce projet fait d’une part suite une DAP réalisée en 2015 pour un renouvellement de l'autorisation pour le DU de microchirurgie et d’autre part, il intègre une nouvelle procédure de mise au point d’un modèle d’anévrisme. Ce dernier a pour objectif d’agrandir le panel de techniques proposées dans cette formation. D’un point de vue général, le DU de microchirurgie met à disposition des rats pour la formation de chirurgiens/ internes à la microchirurgie. Le calibre ainsi que la consistance des artères du rat sont semblables à ceux retrouvés chez l’humain et fait donc du rat un très bon modèle expérimental. L’instrumentation utilisée sur rat est également identique à celle utilisée en chirurgie humaine. La procédure 1 concerne le DU microchirurgie incluant diverses techniques de chirurgie vasculaire déjà pratiquées au laboratoire. La procédure 2 concerne la mise au point du modèle anévrisme dans l'objectif d'intégrer ce modèle dans le DU de microchirurgie et la procédure 3, le DU microchirurgie lorsque le modèle d'anévrisme sera établi.
Bénéfices attendus
Le DU de microchirurgie permet aux internes en chirurgie ou chirurgiens de se former sur des techniques spécifiques de la microchirurgie. L'intégration du modèle anévrisme permettrait d'agrandir le panel de techniques proposées dans cette formation.
Procédures
Procédures chirurgicales.
Impact sur les animaux
Durant les opérations, les animaux vont subir des actes chirurgicaux sous anesthésie profonde associée à des antalgiques. La douleur post opératoire est prise en charge par des injections d’anti-inflammatoires. Du personnel qualifié suit la profondeur de l’anesthésie et la qualité de l’analgésie durant toute l’intervention (mouvement vibrisses, reflexe oculaire, pincement de de la queue). De plus, des tapis chauffants permettent de maintenir la température corporelle de l’animal lors des chirurgies et au réveil. Enfin une fiche de suivi post- opératoire sera également remplie par les zootechniciens qui assurent le suivi des animaux mettant en œuvre des soins appropriés si nécessaire.
Devenir
Le Diplôme d’Université (DU) de microchirurgie a pour objectif de former des chirurgiens et/ou internes voulant acquérir et maîtriser les techniques de microchirurgie nécessaires à certaines spécialités chirurgicales (en discipline humaine : chirurgie des lambeaux, chirurgie de la main, neurochirurgie, chirurgie de la face, chirurgie pédiatrique, notamment et aussi dans les disciplines vétérinaires). Cette formation se déroule sur une année universitaire, chaque apprenant devant valider 25 séances d’entrainement. Les apprenants se forment d’abord sur modèles secs (petits tubes de silicone permettant de reproduire un vaisseau du diamètre d’une veine ou d’une artère). Cependant ce dispositif a ses limites, car il ne permet pas de s’assurer de la bonne perméabilité des vaisseaux ni d’appréhender la gestion du saignement. En effet, afin reproduire les techniques chirurgicales en conditions réelles et pouvoir vérifier ces dernières, il est nécessaire d’avoir un organisme entier et vivant. Le choix du modèle rat est dû au fait que le calibre des vaisseaux du rat correspond au calibre des vaisseaux humains nécessitant des techniques de microchirurgie pour être appréhendés. Ainsi les apprenants peuvent s’entrainer sur les artères (fémorales, aortes, carotides) et sur les grosses veines (jugulaires, fémorales) du rat. Les apprenants sont évalués en contrôle continus, sous la supervision d’un sénior (évaluations formatives) et d’une évaluation terminale sanctionnante permettant de délivrer ou pas le diplôme. Dans le cadre de cette formation (DU de microchirurgie), nous souhaitons également mettre en place une procédure supplémentaire pour l’entrainement de nos apprenants : le modèle anévrisme. Il s’agit d’induire sur l’artère aorte du rat un anévrisme (malformation artérielle) dont les caractéristiques sont très proches de celui de l’anévrisme des artères cérébrales chez l’Homme. Ce modèle est connu, déjà utilisé dans d’autres centres. Il permet d’entrainer un apprenant à la prise en charge microchirurgicale d’un anévrisme.
Remplacement
Nous n'avons pas les moyens techniques, à ce jour, pour remplacer cette formation par des méthodes in vitro ou artificielles. La pratique sur le vivant est indispensable pour acquérir et maîtriser les techniques de microchirurgie, nécessaires dans de nombreuses spécialités chirurgicales pour pouvoir ensuite, une fois le diplôme obtenu, les appliquer sur l‘humain. L'anatomie vasculaire du rat est un critère important afin de rendre la procédure la plus réaliste possible. Ces animaux sont opérés sous anesthésie générale.
Réduction
Le DU microchirurgie, est composé de 25 séances de TP par an par chirurgien et de maximum 10 inscrits par an. Ainsi le nombre d’animaux prévu pour cette première procédure est de maximum 1000 animaux pour 5 ans (25x10x5). Pour la mise au point du modèle anévrisme (procédure 2) nous prévoyons un total de 60 rats sur 5 ans. Pour cette procédure nous procéderons par série afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour la procédure 3, nous prévoyons 250 animaux au maximum sur 5ans. Soit au total 1310 animaux prévus pour ces trois procédures. Ceci a été calculé de sorte à réduire au maximum l’effectif tout en ayant un nombre suffisant d’étudiants pour ouvrir cette formation. Ce nombre sera revu à la baisse et uniquement à la baisse en fonction du nombre de chirurgiens inscrits à cette formation. Toujours dans l’objectif de réduire le nombre d’animaux, les chirurgiens peuvent réaliser plusieurs techniques sur un même rat anesthésié. L’espèce, le sexe ou la lignée génétique de l'animal, n’a aucun impact sur l’anatomie vasculaire. Ainsi nous priorisons les animaux de réforme. Ce sont des animaux surnuméraires, n'ayant pas été inclus dans les projets pour lesquels ils étaient déstinés.
Raffinement
Les animaux utilisés pour cette formation proviennent dun éleveur agrée. Ils sont hébergés en pré et post-opératoire en animalerie par groupe sociaux avec à minima un tunnel comme enrichissement. Afin de réduire au maximum la souffrance et douleur de l’animal lors de la chirurgie, les rats sont sous couverture anesthésique et analgésique chimique adaptée Du personnel qualifié suit la profondeur de l’anesthésie et la qualité de l’analgésie pendant l’intervention. Des tapis chauffants permettent de maintenir la température corporelle de l’animal. Un nouveau laboratoire est actuellement en construction. Nous souhaitons nous équiper de poste d’anesthésie gazeuse pour les futurs postes de microchirurgie. Ainsi, le protocole d’anesthésie pourrait être modifié afin de contrôler plus facilement et plus précisément la profondeur de l’anesthésie et surtout le réveil. De plus des points limites ont été établis pour le suivi post-opératoire en animalerie.
Choix des espèces
Le calibre des veines et des artères du rat est proche de celui des vaisseaux de petite taille chez l'homme. La carotide du rat est, par exemple, proche de l'artère digitale de l'homme, indispensable pour la chirurgie reconstructrice de la main (réimplantation de doigts). Dans l’idéal, nous utilisons des jeunes adultes de 300gr environ. Mais l’anatomie vasculaire étant presque similaire d’un jeune rat à un rat plus âgé, cela dépend plus principalement des rats de réforme qui nous sont proposés (nous avons déjà utilisé des rats plus mature pesant environ 700gr).
Etude de la réponse inflammatoire dans les modèles d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
6 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du léger au sévère, 1 200 relevant de la gravité la plus élevée. Toutes subissent une biopsie de queue pour génotypage, une partie recevant des injections intracérébrales, la pose d'une fenêtre crânienne ou des injections dans la cisterna magna, avant une perfusion intracardiaque terminale pour prélever le cerveau. Le porteur suit la douleur au moyen d'une grille d'expressions faciales et administre buprénorphine et kétoprofène. Il affirme que la réaction inflammatoire de la maladie d'Alzheimer ne peut s'étudier que dans un "organisme entier", les cultures d'organoïdes ne la reproduisant pas.
Objectifs
Les études d’analyse génomique concernant la maladie d’Alzheimer montrent l’influence de gènes intervenant dans la réponse immunitaire notamment ceux exprimés dans les cellules de la microglie. Afin de suivre cette réponse inflammatoire durant l’évolution de la maladie nous allons utiliser une souris reportrice HexdtTomato. Chez cette souris les cellules de la microglie expriment une protéine fluorescente (dtTomato) sous le contrôle de la sous-unité bêta du gène hexominidase (Hexb) facilitant la localisation et le suivie de ces cellules in vivo et ex vivo. Nous allons utiliser cette souris dans nos modèles de la maladie d’Alzheimer. Ainsi nous allons déterminer l’influence de 2 gènes d'intéret dans la réponse inflammatoire dans le modèle de souris APPSwe/Ind. La souris APP Swe/Ind exprime une forme humaine de la protéine APP (Amyloid Precusor Protein) porteuse de la mutation humaine Swedish/Indiana. Cette souris développe des plaques amyloïdes à partir de 8 mois. Nous travaillerons sur des animaux âgés de 2 à 4 mois et de 10-11 mois. Nous voulons déterminer comment évoluent les cellules de la microglie à des temps précoces de la maladie (2-4 mois) et à des temps où la maladie est installée soit 10-11 mois. Ainsi on pourra définir les rôles de nos deux gènes d’intérêt dans l’évolution de la réaction inflammatoire au sein du modèle APP Swe/Ind.
Bénéfices attendus
La mise en œuvre de ce projet provient des résultats des analyses génétiques réalisées sur des malades de la maladie d’Alzheimer. En effet de nombreux gènes liés au système immunitaire ont été retrouvés tel que Trem2. En travaillant sur 2 temps, on peut voir comment la réaction inflammatoire évolue aux cours du développement de la maladie d’Alzheimer. La réalisation de ce projet nous permettra de caractériser les différents types de microglie et nous permettra de définir la « bonne microglie » qui favoriserait la clairance et la dégradation des plaques amyloïdes.
Procédures
En vue du génotypage des animaux, ces derniers doivent subir une biopsie de queue qui se fait sous anesthésie. Nombre 6900 fréquence une fois. Sur des animaux vigiles, nous effectuons des injections intrapéritonéales (nombre 600, fréquence 5, une fois par jour), intranasales ( nombre 800, fréquence 5 fois, une fois par jour ), intraveineuses ( nombre 800 fréquence une fois) et des gavages (nombre 600 fréquence une fois par jour pendant 30 jours ou une fois par jour pendant une semaine). Sur des animaux anesthésies avec un suivi postopératoire nous réalisons des injections intracérébrales (nombre 600 une fois Injection), injection dans la cisterna magna (nombre 200 une fois) et la pose d’une fenêtre crânienne (nombre 400 une fois). Sur des animaux anesthésiés nous les sacrifions après une perfusion intracardiaque (nombre 6900 une fois).
Impact sur les animaux
Les animaux sont suivis régulièrement. Les effets indésirables dans ce projet sont essentiellement pour les procédures qui impliquent un acte chirurgical soit les procédures 6-7-9. Un tableau de « scoring » a été établi pour suivre les animaux (tableau joint). La durée maximale avant le sacrifice est de 7 jours dans le cas de la procédure 7. La phase post opératoire est la suivante: - lors de la phase de réveil, l’animal est placé dans une cage sur du papier propre afin d’éviter des contacts entre la sciure et la suture, et sous une lampe chauffante pour éviter toute hypothermie due à l’anesthésie. Pour la réhydratation de l’animal on injecte du NaCl 0.9% glucosé à 5% (500µl). - lors du réveil, les animaux reviennent dans la salle d’hébergement. Des observations fréquentes sont réalisées (2 fois par jour sur une semaine) pour vérifier l’état de la suture. Pour réduire la douleur due à certaines procédures chirurgicales nous utilisons BUPREMORPHINE (0.1MG/KG, SC 100µL) ET KETOPROFENE (5MG/KG, SC 100µL) DEUX FOIS PAR JOUR DURANT 2 JOURS. Les animaux reçoivent une nourriture humide et du Diet Boost gel pour récupérer son poids initial. -Si la perte de poids de l’animal dépasse 15% il est euthanasié. Si les animaux présentent une activité absente, une immobilité et des déplacements difficiles dans les 24 heures postopératoire, l’animal est sacrifié.
Devenir
L'ensemble de nos procédures se terminent par le sacrifice des animaux et par la réalisation de la procédure 8. En effet nous devons prélever le cerveau ce qui implique le sacrifice de l'animal pour déterminer le nombre de plaques amyloïdes, réaliser des dosages d'Abeta42, suivre l'activité de certaines enzymes intervenant dans le métabolisme de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP).
Remplacement
Les études d'analyse génomique concernant la maladie d'Alzheimer montrent l'influence de gène intervenant dans la réponse immune notamment les cellules de la microglie. Le développement de la maladie d'Alzheimer est accompagnée d'une réponse inflammatoire. Cette réponse ne peut se faire qu'au sein d'un organisme entier de l'animal. Les techniques de culture d’organoïdes in vitro ne nous permettent pas de suivre le développement d’une réaction inflammatoire lors du développement de la maladie d’Alzheimer. Mais l'utilisation d'une souris reportrice HexbdtTomato (sous unité beta du gène codant pour l'hexosaminidase), nous permettra de limiter le nombre de souris car les cellules de la microglie pourront être suivies grâce au gène rapporteur Tomato.
Réduction
Le nombre d’animaux inclut dans ce projet a été établi par rapport à des études précédentes que nous avons effectuées. Nous utilisons les 2 sexes afin de minimiser le nombre d’animaux. Pour réduire le nombre, nous effectuons sur un hémisphère cérébral pour les analyses immunohistologiques et sur le second les extractions d’ARNm ou de protéines. Le test d’analyse de variance (logiciel Graphpad) est le test que nous avons choisi afin de comparer les différents génotypes a été déterminé à l’aide du logiciel BiostatTGV. Nous utilisons le test Man et Whiney pour les études pilotes.
Raffinement
NOUS OBSERVONS REGULIEREMENT LES ANIMAUX. NOUS AVONS INCLUS DIFFERENTS POINTS LIMITES DANS NOS EXPERIENCES (PERTE DE POIDS, PILOERECTION, DOS ROND, HYPOACTIVITE, DEMARCHE ANORMALE). NOUS AVONS ETABLI UN TABLEAU DE SCORING (NC3R) DANS LEQUEL NOUS SUIVONS LES PARAMETRES D'EXPRESSION FACIALES SUIVANTS : CONTRACTION ORBITRAIRE, GONFLEMENT DU NEZ, DES JOUES, POSITION DES OREILLES ET DES MOUSTACHES). L'EVALUATION DE LA DOULEUR PAR LE SUIVIE DES EXPRESSIONS FACIALES A ETE UTILISE DANS LE CAS DE CRANIOTOMY (SCIENTIFIC REPORTS (2019)9:359). NOUS AVONS ETABLI UN TABLEAU OU SELON L'OBSERVATION EFFECTUEE NOUS NOTONS ZERO POUR UN CAS NORMAL,1 POUR UNE ALTERATION MODEREE ET 2 POUR UN SIGNE EVIDENT. LA SOMME DES OBSERVATION NOUS DONNERA UN SCORE QUI INDIQUERA L'ETAT DE L'ANIMAL. CONTRE LA DOULEUR, NOUS ADMINISTRONS DE LA BUPREMORPHINE (0.1MG/KG, SC 100µL) ET KETOPROFENE (5MG/KG, SC 100µL) DEUX FOIS PAR JOUR DURANT 2 JOURS. NOUS AJOUTONS DANS LES CAGES DE L’ALIMENT ET DE L’EAU EN GELEE. NOUS DEVELOPPONS DES CULTURES D’ORGANOÏDE MAIS NOUS POUVONS PAS ETUDIER L’ETABLISSEMENT DE LA REACTION INFLAMMATOIRE DANS LE DEVELOPPEMENT DE LA MALADIE D’ALZHEIMER AVEC CE TYPE DE MODELE.
Choix des espèces
Dans cette espèce différents outils génétiques existent : des souris transgéniques, KO, KI permettant de réaliser des études dans des conditions physiologiques. Nous disposons donc de modèle qui développe la maladie d'Alzheimer mais également de souris reportrice nous permettant de suivre des cellules de la microglie par l'expression d'une protéine fluorescente la protéine tomato. Ainsi en utilisant ces souris nous pouvons suivre le développement de la réaction inflammatoire lors de l'établissement de la maladie d'Alzheimer. Pour cela nous travaillerons à deux temps, un temps précoce 2-4 mois et un temps plus tardif où la maladie est installée soit 10-11 mois. Au stade 10-11 mois nous pouvons observer des plaques amyloïdes dans le cerveau des souris. Grace à la souris reportrice HexdtTomato, nous pourrons déterminer le rôle de la microglie dans la formation de ces plaques (taille, forme, ...).
Étude de la microcirculation par échographie super-résolue, dite ULM chez le rongeur (rat)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
55 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, tués avant tout réveil. Tous sont anesthésiés puis imagés par échographie, quarante d'entre eux subissant en plus une opération chirurgicale sous analgésie, pour mettre au point une technique d'imagerie ultrasonore de la microcirculation. Le porteur formule l'espoir d'un futur diagnostic du diabète ou du cancer chez l'humain, sans résultat clinique à ce stade. Il affirme que les modèles physiques et les simulations ne reproduisent pas la complexité des mouvements et des artefacts observés in vivo.
Objectifs
L’échographie super-résolue est une nouvelle technique basée sur les ultrasons qui permet de visualiser de manière non invasive les vaisseaux à une échelle micrométrique, même en profondeur. La faisabilité de cette technique a pu être démontrée chez le rongeur pour visualiser le cerveau ou d'autres organes, ainsi que chez l'homme pour visualiser la circulation cérébrale. L’intérêt de cette technique est qu’elle permet de décrire l’anatomie, mais surtout la physiologie de la circulation dans de très petits vaisseaux (microcirculation). Elle consiste en une imagerie ultrasonore ultrarapide permettant de visualiser un agent de contraste ultrasonore injectable, utilisé en clinique (microbulles de gaz). L’échographie super-résolue ou plus précisément la technique d’Ultrasound Localization Microscopy (ULM) permet alors de mesurer la vitesse de microbulles individuelles dans les vaisseaux sanguins, décrivant la dynamique sanguine à des profondeurs et des précisions jusqu’ici inaccessibles. Cette technique prometteuse ouvre la voie à des applications pour diagnostiquer et caractériser des pathologies vasculaires chez l'homme. L’objectif global de ce projet est de caractériser la microcirculation à l’intérieur d’organes abdominaux de modèles animaux afin de déterminer le lien entre sa structure et sa fonction. En particulier, nous souhaitons étudier la microcirculation du rein et du pancréas pour développer un nouvel outil diagnostic.
Bénéfices attendus
L'espoir de ce protocole de recherche est de mettre au point cette technique, permettant ensuite de diagnostiquer chez l'Homme des maladies impactant la microcirculation telles que le diabète ou le cancer.
Procédures
Tous les rats seront placés en anesthésie générale, et seront imagés par une technique atraumatique (échographie) (N=55). Certains rats subiront une opération chirurgicale sous analgésie adaptée (N=40). Certains rats seront mis à jeun 4h avant la procédure d'imagerie (N=20).
Impact sur les animaux
Tous les rats seront anesthésiés dès le début de chaque procédure entrainant une perte de leur capacité à se réchauffer. Leur température sera donc suivie et les animaux seront réchauffés tout au long des expériences. Certains rats subiront une procédure chirurgicale et seront donc analgésiés, pour éviter toute douleur lors de l'expérience. Les procédures sont sans réveil, tous les animaux seront mis à mort à l'issue de l'expérience.
Devenir
Les procédures sont sans réveil, tous les animaux (55) seront mis à mort à l'issue de l'expérience. Il n'est pas prévu de suivi à long terme de ces animaux.
Remplacement
Les mises au point de la technique ULM ont été faite sur des modèles physiques ou approchés par simulation, mais ces approchent ne permettent pas de refléter la complexité des mouvements et artefacts d'imagerie in vivo.
Réduction
Le nombre de rats utilisés dans notre projet est réduit à son minimum dans la limite de ce qui est requis. Une étude statistique prenant en compte les variabilités attendues a été réalisée pour justifier l'utilisation du nombre de rats tout en obtenant des résultats valides.
Raffinement
Les procédures d'imageries seront réalisées sous anesthésie générale, pour limiter le stress. Les procédures invasives seront limitées au maximum et réalisées avec une analgésie adaptée pour éviter toute douleur.
Choix des espèces
Nous avons choisi le rat pour des raisons proximité avec la physiologie humaine et d'échelle anatomique. En effet, si la technique ULM permet d'obtenir une anatomie des vaisseaux inégalée, le positionnement de la sonde d'imagerie ultrasonore se fait en utilisant des modes d'échographie conventionnels, et il faut pouvoir visualiser les organes de manière correcte avec une sonde qui n'autorise qu'une résolution de 300µm dans ce mode. Dans toute cette étude, des rats adultes (8 à 12 semaines) seront utilisés afin de s'assurer que l'imagerie sera effectuée sur des pancréas pleinement développés.
Endothélium, un nouvel acteur de la neuroplasticité.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Rats : 1283
1 991 animaux non-humains, 708 souris et 1 283 rats, vont être utilisés et tués à l'issue, en majorité dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Ils sont soumis à un exercice imposé sur tapis roulant ou à une électrostimulation musculaire, puis, sous anesthésie, à une laparotomie, une thoracotomie, un prélèvement de sang intracardiaque et une perfusion transcardiaque qui provoque leur mort, avant décapitation et prélèvement du cerveau, des muscles et des vaisseaux. Le porteur affirme n'attendre aucune nuisance hormis l'inconfort de l'exercice imposé, et vise l'endothélium comme cible thérapeutique et l'électrostimulation comme alternative à l'exercice pour les personnes peu mobiles. Il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut remplacer le modèle rongeur.
Objectifs
La neuroplasticité (capacité du cerveau à moduler le nombre et l’efficacité de ses synapses) est dépendante de l’activation des récepteurs TrkB (tropomyosin related kinase B) neuronaux par le BDNF (brain-derived neurotrophic factor). Alors qu’il est bien admis que la principale source cellulaire du BDNF est le neurone, nos récents travaux supportent l’hypothèse originale selon laquelle l’endothélium serait également un acteur clé de la neuroplasticité. En effet, nous avons montré que : -l’endothélium (périphérique ou cérébral) exprimait fortement BDNF -50% du BDNF cérébral correspondait à du BDNF endothélial -la synthèse endothéliale de BDNF était corrélée positivement à la production d’oxyde nitrique(NO) et qu’il existait un feedback positif entre productions endothéliales de NO et de BDNF. Enfin, les pathologies associées à une dysfonction endothéliale, connues pour affecter négativement la santé cérébrale, réduisent l’expression endothéliale et les taux cérébraux de BDNF. A l’opposé, l’exercice physique (EX), reconnu pour induire la neuroplasticité et améliorer les capacités cognitives, les augmente. De façon intéressante, bien que peu nombreux, de récents travaux montrent que l’électromyostimulation (EMS) reproduit les effets de l’EX sur la fonction endothéliale et les taux cérébraux de BDNF. Cette analogie entre EX et EMS pourrait s’expliquer par la capacité des muscles squelettiques à sécréter une hormone: l’irisine; l’inactivation de l’irisine circulante réduisant les bénéfices cognitifs de l’EX chez la souris Alzheimer. Mais quelle est la cible cellulaire de l’irisine circulante : le neurone ? la cellule endothéliale cérébrale ? Par ailleurs, alors que nous avons récemment démontré que les effets salutaires de l’EX sur la santé cérébrale pouvaient également s’expliquer par son impact positif sur le système cardiovasculaire (voie hémodynamique), à ce jour il n’existe que peu de données sur les effets de l’EMS sur le débit sanguin cérébral (DSC). Dans ce contexte, les objectifs sont : 1) de montrer que le BDNF endothélial est un acteur clé de la neuroplasticité grâce aux caractérisations biochimique et cognitive d’une souris génétiquement modifiée incapable d’exprimer BDNF au niveau endothélial (endoBDNF-/-), 2) d’explorer la connexion existante entre irisine musculaire et BDNF endothélial, 3) d’étudier le rôle du BDNF endothélial sur la cognition 4) de connaître les effets de l’EX et l’EMS sur les paramètres cérébro-vasculaires.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à tester, d’une part, l’hypothèse selon laquelle la cellule endothéliale est une composante majeure de la neuroplasticité et, d’autre part, de comprendre comment la contraction musculaire (induite via l’EX ou l’EMS) impacte la santé cérébrale via l’étude du BDNF, de l’irisine et plus largement de la cognition. La compréhension des mécanismes impliqués nous permettrait : - De définir la cellule endothéliale comme une cible thérapeutique prometteuse aisément accessible dans la lutte contre les maladies neuro-cardio-vasculaires. En effet, l’endothélium est impliqué dans bon nombre de pathologies, soit comme déterminant physiopathologique, soit comme sujet à des dommages collatéraux. - De définir l’EMS comme une alternative au protocole d’EX chez les personnes n’ayant pas la motivation ou la capacité physique permettant de réaliser des séances régulières. Le but ultime étant de préserver et améliorer la cognition et donc la santé cérébrale.
Procédures
Tous les prélèvements effectués sur nos animaux (n=1991) se feront sous anesthésie générale (aucun prélèvement sur animal vigile). L’administration des substances pharmacologiques (Procédure 4, n=688) sera réalisée par voie injectable (Intra-péritonéale ou sous-cutanée) sur des animaux vigiles (1 seule administration/animal). L’ensemble des animaux (708 souris + 1011 rats) inclus dans les procédures 1, 2 (EMS Chronique), 4 (Point 2 –Impact de l’EX ou l’EMS sur la cognition), 5 et 6 seront soumis aux interventions suivantes : -Anesthésie générale de l’animal -Laparotomie, thoracotomie -Prélèvement intracardiaque de sang (~2 ml/rat et prélèvement des structures cérébrales ou cerveau entier -Prélèvement des muscles squelettiques (soléaires et gastrocnémiens) -Prélèvement des vaisseaux (aorte thoracique et abdominale). Concernant les animaux inclus dans les procédures 3 (32 rats) et 4 (Point 1-Impact de l’EMS sur la FC, PA et DSC, 240 rats): -Anesthésie générale -Contrôle et maintien de la température rectale à 37.5/38.5°C jusqu’à la mise à mort -Cathétérisme de la veine du pénis pour administration d’héparine et d’agents vasopresseurs si la pression artérielle est inférieure à 60 mm Hg. Cathéter mis en place en moins d’une minute. Durée entre 60 et 90 minutes. - Cathétérisme de l’artère carotide commune gauche en vue de la mesure de la PA et des prélèvements sanguins (mesure des GDS). Cathéter mis en place en moins de 10 minutes. Durée entre 60 et 90 minutes. - Intubation trachéale, mise sous respiration assistée et curarisation. Intubation mise en place en moins de 5 minutes. Durée 60 et 90 minutes. - Placement de l’animal sur l’appareil stéréotaxique - Incision du crâne et trépanation à l’aide d’un fraisage doux. Durée 5-10 minutes. - Placement de la sonde doppler sur la dure mère. Durée 5-15 minutes. - Mesure du DSC. Durée 30 minutes. - Mise à mort par décapitation => prélèvement cerveau - Laparotomie, thoracotomie => prélèvement d’organes A noter également que l’administration des substances pharmacologiques (Procédure 4, n=688) sera réalisée en subchronique par voie injectable (Intra-péritonéale ou sous-cutanée).
Impact sur les animaux
Aucune nuisance, ni effet indésirable est attendu sur nos animaux, tout au plus un inconfort lié au caractère imposé de notre protocole d’EX sur tapis roulant (procédure 1). Par ailleurs, afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, - Les actes chirurgicaux seront réalisés après prémédication à la buprénorphine (30 minutes avant induction de l’anesthésie afin d’en potentialiser ses effets) et sous anesthésie générale par du personnel statutaire qualifié et/ou par des étudiants en recherche préalablement formés. La profondeur de l’anesthésie sera contrôlée pour chaque animal afin d’éviter tout réveil pendant la chirurgie. - Les injections sous cutanées et intrapéritonéales seront réalisées avec des aiguilles 25G chez le rat et 27G chez la souris. - Le réveil des animaux anesthésiés sera réalisé en cage individuelle dans une salle de repos sous surveillance de l’expérimentateur et contrôle de la température corporelle. - Le stress des animaux dû à la nouveauté (expérimentateur, tapis roulant) sera prévenu par une phase préalable « d’habituation ». Dans la mesure du possible, les animaux d’une même expérience seront en contact avec un expérimentateur unique.
Devenir
L’intégralité des animaux inclus dans les 6 procédures seront mis à mort pour prélèvement des tissus (cerveau, muscles squelettiques, vaisseaux).
Remplacement
L’absence de méthodes substitutives (in vitro ou in silico) pour étudier : 1) l’influence des variations du flux sanguin (induites par l’EX ou l’EMS) sur la neuroplasticité et la cognition et, 2) l’étude des interactions entre les différents éléments intervenant dans la connexion muscle/cerveau, ne nous permet pas de remplacer le modèle rongeur (souris et rats).
Réduction
Une première approche nous permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés est de travailler avec des procédures standardisées - de la réception des animaux jusqu’à leur mise à mort. Ces procédures, disponibles au laboratoire sous forme de documents écrits précisant tous les détails pratiques, sont maitrisées par du personnel statutaire ; les souches d’animaux, leur âge et le nombre/groupe sont appropriés à la validation/invalidation de notre hypothèse. Par ailleurs, les expériences du projet tiennent compte des facteurs reconnus pour influencer la cognition (interaction sociale, poids corporel, prise de nourriture, cycle nycthéméral, hormones sexuelles). Une seconde approche est de soumettre les animaux d’un même groupe à 2 ou 3 procédures différentes. Concernant les analyses statistiques, nous utiliserons des tests adaptés aux petits échantillons et aux types de comparaison (multigroupes ou 2 groupes, analyses variable continue ou pas, mesures appariées ou pas). Les groupes à comparer sont déterminés avant de conduire les expériences et le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe tient compte : - de l’obligation de réduire le nombre d’animaux utilisés - de la variabilité interindividuelle quant à la réponse des animaux - de la possibilité d’échec dans la réalisation de certains gestes chirurgicaux - de la nécessité de conduire une étude statistique de qualité Ce nombre sera raisonnablement compris entre 8 (pour la mesure des paramètres cérébro-vasculaires et les analyses biochimiques) et 16 (pour l’étude de la cognition), compromis entre limitation du nombre d’animaux et obtention d’une analyse statistique fiable.
Raffinement
Afin de raffiner au maximum notre projet, Avant l’expérimentation Les rats et souris seront respectivement hébergés au nombre de 5 et 10 par cage afin de maintenir une interaction sociale et demeureront avec les mêmes congénères tout au long des procédures afin de ne pas rompre la hiérarchie intra-cage. Afin de déceler toute souffrance physique ou psychologique conduisant à un inconfort, les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Par le biais d’une phase d’habituation (4/5 jours), les animaux seront entraînés à coopérer (renforcement positif) de manière à diminuer au maximum le stress de l’animal engendré par l’expérimentateur et/ou l’appareillage (tapis roulant). Pendant l’expérimentation La majorité des procédures utilisées nécessitera une anesthésie générale dont les effets seront potentialisés par une prémédication à la buprénorphine. Nos procédures seront pour la grande majorité « sans réveil », il n’en demeure pas moins qu’une vigilance particulière sera accordée aux soins pré- et per-opératoires. Nos procédures ne nécessiteront pas d’établir des points limites néanmoins, en ultime recours, nous prendrons les dispositions nécessaires afin de limiter toute souffrance animal par le biais d’une mise à mort par injection i.p. d’Euthasol. Après l’expérimentation Afin d’exploiter au mieux les résultats obtenus lors de notre expérimentation, une analyse statistique rigoureuse sera effectuée (cf point 3.3.6.2.).
Choix des espèces
Pour le Rat : -Forte analogie dans l’organisation des vaisseaux cérébraux homme/rat -Volume du cerveau et taille des vaisseaux appropriés aux techniques de dosages utilisées. Néanmoins, pour valider notre hypothèse selon laquelle l’endothélium est une source importante de BDNF cérébral, nous nous sommes orientés vers la fabrication et la caractérisation sur les plans cardiovasculaire et cérébral d’une souris génétiquement modifiée incapable de fabriquer du BDNF endothélial (endoBDNF -/-). Bien que les tailles du cerveau et des vaisseaux de souris soient plus petits, il n’en demeure pas moins que la morphologie du réseau vasculaire cérébral est hautement conservée entre rats et souris. La fabrication de la souris endoBDNF-/- a été financée par le Projet Structurant d’Envergure Région Bourgogne France Comté « BDNF cardiovasculaire et fonction cognitive » (106 364€) et sera valorisée par 3 équipes de recherche: INSERM U1093 CAPS(Dijon), EA4267 PEPITE(Besançon) et EA-481(Besançon). Les rats (Wistar) et les souris (C57BL/6J, endoBDNF-/- et littermates) seront utilisés au stade jeune adulte soit entre 7 et 9 semaines afin de s’affranchir des effets de l’âge sur le système cardiovasculaire et le système nerveux central.
Rôle des changements épigénétiques liés à l’âge dans les cellules oligodendrogliales sur la cognition des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1734 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à modéré, les cohortes expérimentales tuées à l'issue et une lignée conservée pour de futures études. Elles subissent un génotypage par prélèvement d'oreille ou de queue, des injections répétées de tamoxifène, une chirurgie stéréotaxique du cortex moteur et des tests d'apprentissage moteur sur roue à échelons, une perte de poids atteignant 20 % déclenchant la mise à mort. Le projet vise à décrire le rôle de cellules de la myéline dans le déclin cognitif lié à l'âge, le porteur renvoyant au conditionnel et au long terme l'espoir de "rajeunir" ces cellules chez l'humain. Il affirme que les organoïdes "ne suffisent pas" et présente le recours à la souris comme "nécessaire".
Objectifs
La cognition et son déclin avec le vieillissement font partie intégrante des maladies psychiatriques et neurodégénératives liées au développement et à l'âge. Si les circuits neuronaux sont à la base de l'organisation cérébrale, une accumulation de preuves a désormais mis en évidence le rôle potentiel des cellules oligodendrogliales dans la plasticité cérébrale et la cognition. Notre équipe a récemment découvert un activateur épigénétique dépendant de l'âge (enzyme Ten-Eleven Translocation 1 (TET1)), nécessaire à la différenciation et à la remyélinisation des oligodendrocytes, mais défaillant dans le vieillissement. Nous avons développé une lignée de souris, dans laquelle l'ablation de Tet1 dans la lignée oligodendrogliale (lignée de souris Tet1cKO) imite un phénotype myélinisant semblable au vieillissement, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier le rôle des cellules oligodendrogliales dans le vieillissement. Nous avons également identifié une cible TET1 spécifique à l'oligodendrogliale : le symporteur SLC12A2, dont l'expression à l'interface neurogliale diminue avec l'âge, entraînant directement une myélinisation défectueuse (caractérisée par un gonflement). Dans ce projet, nous allons 1/ Caractériser le rôle du vieillissement oligodendroglial sur la mémoire et l'apprentissage et sur la fonction neuronale, en utilisant notre modèle de souris Tet1cKO ; 2/ Identifier les gènes cibles TET1 réactivés lors de tâches d'apprentissage moteur ; 3/ Caractériser le rôle de l'ablation de Slc12a2 sur la mémoire et l'apprentissage et sur la fonction neuronale, à l'aide d'un modèle de souris (Slc12a2icKO) et d'un lentivirus Scl12a2KO. En caractérisant mieux le rôle dépendant de l'âge des cellules oligodendrogliales sur la fonction neuronale et les capacités comportementales, notre projet aborde pleinement le rôle de la myélinisation sur la cognition, ce qui pourrait donner lieu à des développements cliniques à fort impact.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet répondra aux besoins scientifiques suivants. À court terme : une meilleure compréhension du rôle des oligodendrogliaux dans le vieillissement, en particulier autour de la compaction de la myéline, et l'identification des voies spécifiques aux oligodendrogliaux nécessaires aux fonctions cognitives. À long terme : développer des stratégies pour rajeunir les cellules oligodendrogliales, pour favoriser les fonctions cognitives dans le vieillissement et les maladies liées à l'âge. Le déclin de la cognition cérébrale représente un problème majeur de santé publique, car les déficits d'apprentissage développemental et la démence liée à l'âge peuvent fortement affecter la qualité de vie des personnes et les dépenses de santé globales.
Procédures
Les souris seront soumises à un bref (5 secondes, une fois) punch d'oreille pour le génotypage. Certains peuvent être génotypés de manière non invasive (lampe UV, 5 secondes, une fois). D'autres devront être génotypés avant sevrage, en prélevant un échantillon de queue (sous anesthésie, 5 secondes, une fois). Les souris seront soumises à des tests comportementaux (1 à 2 semaines, une fois). Les souris seront injectées en IP pour la recombinaison du tamoxifène (4 fois par semaine, une fois). Des souris seront injectées chirurgicalement dans la zone corticale motrice (chirurgie de 30 minutes, comprennat le temps pré- et post-opératoire, une fois). Les souris seront anesthésiées avant d'être sacrifiées (1 minute, une fois).
Impact sur les animaux
Au cours de cette DAP, les animaux subiront les différents génotypages soit par punch à l'oreille pour les adultes ou le prélèvement d'un bout de queue pour les souriceaux. Il subiront, en fonction de la procédure, ou de l'anesthésie à l'isoflurane (en induction (4%) et/ou en entretien (2 à 3%)) ou de l'anesthésie injectable kétamine - Xylazine. Les animaux seront soumis à différents tests d'apprentissge, et de mémorisation. Lors du test d'apprentissage moteur dependant de la plasticité myélinique, à l'aide de dix cages équipées d'un roue à 38 échelons, les animaux seront hébergés à un animal par cage. Quelques animaux pourront recevoir du Tamoxifène en injection intrapéritonéale. Enfin certains animaux subiront une chirurgie stéréotaxique d'une durée de 30 minutes.
Devenir
Toutes les cohortes expérimentales seront euthanasiées à la fin de l'étude, afin de corrélerer l'analyse comportementale par une anlayse au niveau moléculaire et/ou cellulaire. Une cohorte des lignées de souris générées sera conservée dans notre animalerie, pour des études ultérieures.
Remplacement
Si des progrès ont été réalisés pour modéliser les pathologies et la connectivité neuronale dans les cultures (organoïdes par exemple), ces modèles ne suffisent pas à appréhender pleinement les fonctions et dysfonctionnements cognitifs au niveau de l'organisme. À l'heure actuelle, il est nécessaire d'utiliser des modèles de souris pour mieux aborder le rôle de cellules spécifiques et de voies moléculaires dans la mémoire et l'apprentissage. En parallèle, nous exploitons des modèles in vitro de co-cultures primaires, de lignées cellulaires et d'iPSCs. En effet, pour notre approche lentivirale Slc12a2KO, nous allons d'abord optimiser notre protocole sur des lignées cellulaires (Olineu), afin de limiter les étapes d'optimisation sur des cultures cellulaires primaires.
Réduction
Afin de calculer au plus juste le nombre d'animaux nécessaires dans chaque procédure expérimentale afin de détecter un effet statistiquement pertinent, nous avons effectué une analyse de puissance grâce à plusieurs tests statistiques. En raison de la variabilité interindividuelle, nous avons prévu d'inclure 9 ou 10 souris par groupe, pour chacun des essais comportementaux. Nous n'avons remarqué aucune différence de comportement entre les sexes lors de nos études précédentes, nos cohortes seront donc composées de souris des deux sexes. Pour les animaux sacrifiés pour les cultures de tissus, nous devons mettre en commun 3 tissus de souris par expérience. Notre expérience avec ce modèle de co-culture suggère de prévoir 4 répétitions par test in vitro, pour chaque analyse (immunohistochimie, électrophysiologie,...).
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un cycle obscurité-lumière de 12h à 21°C(±1°C) dans des cages ventilées (12vol/h), sous environnement contrôlé et enrichi (alternance entre dôme en carton et en plexiglax, coton Nestlets). Les animaux sont sous la surveillance et l'observation quotidiennes de soigneurs animaliers dévoués et formés, chargés de veiller à leur bien-être. Lors de l'apprentissage face à une roue complexe, les animaux seront hébergés individuellement jusqu'à 7 jours dans une cage enrichie, dans laquelle nous n'observons normalement aucun phénotype d'isolement social. Cependant, si nous observons un changement de comportement ou un manque d'intérêt pour la roue, l'animal sera exclu de la procédure et replacé dans sa cohorte de groupe. Pour les injections IP, nous alternerons les côtés et les souris seront surveillées pour détecter toute perte de poids, éruption cutanée ou infection. Pour la chirurgie stéréotaxique, les souris recevront une injection de buprénorphine (0,5-1 mg/kg, IP), le jour de la chirurgie et deux fois par jour les 2 jours suivants. Pendant la chirurgie, nous appliquerons une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée et couvrirons les yeux pour éviter une exposition intense à la luminosité pendant la procédure, nous procéderons à une infiltration de lurocaïne avant incision de la peau. La chirurgie sera réalisée dans des conditions stériles (gants, outils, instruments,...). Après la chirurgie, l'animal sera placé sous une lampe chauffante jusqu'au réveil anesthésique avant de retourner dans la pièce d'hébergement. Des granulés alimentaires ramollis et de l'eau supplémentaires seront fournis à l'intérieur de la cage pour les animaux, afin de fournir un soutien trophique général et de garantir que la perte de poids est contenue (inférieure à 20 % du poids corporel d'origine). Si l'état général du corps semble médiocre (perte de mobilité, dos arqué, incapacité à se toiletter) ou si la perte de poids est égale ou supérieure à 20 %, les souris auront atteint des points limites et seront euthanasiées et retirées de l'étude.
Choix des espèces
Les modèles de souris sont pertinents car ils sont couramment utilisés dans les études comportementales portant sur les fonctions et les déficits cognitifs. Notre modèle Tet1cKO, que nous allons recréer dans notre installation, combine les lignées Olig1-cre et Tet1-flox, induisant une ablation constitutive de Tet1 dans la lignée oligodendrogliale (cellules Olig1+). Le modèle Slc12a2icKO sera créé dans l'institut en combinant les lignées Plp-creERT et Slc12a2-flox, induisant une ablation inductible par le tamoxifène de Slc12a2 dans les oligodendrocytes matures (cellules PLP+). La lignée transgénique PDGFRa-eGFP est une lignée, dans laquelle la fluorescence GFP imite le schéma d'expression de PDGFRa, permettant la détection et l'isolement de cellules progénitrices d'oligodendrocytes. Pour études comportementales, des souris adultes seront utilisées à l'âge de 2 mois, âge idéal pour cette approche, puisque les souris sont jeunes et actives. Pour établir des modèles in vitro, les souriceaux de 7 jours et des animaux de 2 mois et 12 mois seront utilisés pour collecter les tissus cérébraux, nécessaires à une culture tissulaire efficace et viable.
Altération de l’activité corticale et maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie sous anesthésie sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau, reçoivent des injections pendant sept jours et passent des tests comportementaux, dont un conditionnement par la peur, pour étudier les altérations précoces de la mémoire dans la maladie d'Alzheimer. Le porteur qualifie le conditionnement par la peur de peu stressant en s'appuyant sur des projets antérieurs, et reconnaît un inconfort modéré et une perte de poids possible après la chirurgie. Il affirme qu'aucun modèle in silico ne reproduit le cerveau entier et que seule la souris réunit les critères recherchés.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie progressive, mortelle et est la cause principale de syndrome démentiel et en représente au moins deux tiers des cas la plus courante. MA commence bien avant le stade démentiel par l’apparition de troubles cognitifs donc le diagnostic précoce est un objectif important pour la recherche préclinique et clinique sur la MA. Il peut représenter une fenêtre thérapeutique critique où les interventions peuvent être initiées avant que ne se produise un déclin cognitif sévère. Une accumulation de peptide bêta-amyloïde (Aß) dans le cortex préfrontal est corrélée à un oubli rapide. Ensable, ils constituent un symptôme précoce de la MA qui peut être détecté par des mesures d'évaluation cognitive expérimentale et clinique bien avant l'apparition d'une démence sévère. En effet, les déficits d'apprentissage et de mémoire sont parmi les premiers symptômes rapportés par les familles de patients. Aβ a des effets sur les signalisations impliquées dans la régulation des diverses formes de plasticité corticale et donc la formation de la mémoire. L'objectif de notre projet actuel est d'aboutir à une meilleure compréhension des processus neurobiologiques qui sous-tendent les mécanismes sous-jacents de la formation de mémoire altérée aux premiers stades de la maladie. Nous proposons d'explorer les altérations corticale en tant que marqueur précoce de l'oubli anormal dans la MA.
Bénéfices attendus
La diagnose précoce de la maladie d`Alzheimer est l'étape la plus importante dans l'identification : i) de l'altération cérébrale initiale et par conséquent ii) des thérapies possibles. L'oubli précoce pourrait représenter une cible pour des études précliniques visant à prévenir ou retarder l'apparition de formes plus sévères de la MA. Notre projet vise à relier l'oubli précoce aux changements moléculaires responsables de l'altération de l'activité corticale en offrant une nouvelle voie pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent les interventions chirurgicales (< 40 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Ils sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportementale se compose de deux épreuves, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque épreuve dure 6 à 7 minutes). Ils reçoivent également des injections pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent un ou deux brèves procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces procédures sont un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Les autres procédures expérimentales de ce projet comprennent des tests comportementaux : conditionnement par la peur (CdP) et procédure sans reveil. Le conditionnement par la peur peut être un événement stressant pour les souris. Afin de réduire le stress, nous gardons le groupe d'animaux en cage, ce qui leur permet d'exprimer leur comportement social naturel et nous permet de suivre le toilettage mutuel et la nidification des animaux après l'exécution de la tâche. Les projets précédents qui ont utilisé cette tâche comportementale ont montré que les animaux expriment leur comportement naturel dans les 15 minutes qui suivent la tâche, ce qui signifie que cette procédure n'entraîne pas une augmentation significative du niveau de stress. Le test est également effectué dans une pièce différente, avec des odeurs différentes de celles de la cage, afin de désactiver le lien entre la cage d'origine et l'événement redoutable.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.
Remplacement
Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la mémoire dans le néocortex et leur changement dans MA. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) adapté à la réalisation de tests cognitif, iii) pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique, iv) qui se prête facilement à la modification de son génome, v) possédant un néocortex, vi) adapté aux approches expérimentales invasives. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possibles. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent à tous ces critères. Bien que des tests comportementaux simples soient possibles chez des espèces moins sensibles, ces animaux ne possèdent pas la structure cérébrale ciblée et par conséquent ne sont pas adaptés à l'objet de notre étude. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones et leur altération dans MA. Les modèles in silico actuellement disponibles ne permettent pas la modélisation au niveau du cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.
Réduction
Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. les expériences réalisées au fur et à mesure sur de petits lots de 4-6 animaux). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant. Approche statistique : Selon les caractéristiques de nos données (normalité, variance, cohérences avec les critères de chaque test), nous appliquons les tests statistiques. Selon les caractéristiques de nos données certains tests supplémentaires seront effectués.
Raffinement
i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Manipulation quotidienne des animaux avant les expériences pour réduire le niveau de détresse. iv) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que NC3R. vii) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives avec l'enrichissement et le matériel pour la nidification.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car nous voudrions exploiter certains modèles transgéniques impliquant la production d’amyloïde beta. À ce jour, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, d'une manière routine, de modifier le génome et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés au niveau comportemental et moléculaire. Selon les données précédemment rapportées et les données sur le développement de la pathologie, nous les utilisons à l'âge auquel les animaux commencent à développer les premiers signes de la maladie avant l'apparition de la maladie grave.
Evaluation de la douleur chez le poisson dans le but de créer une grille de score
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Autres poissons : 636
636 poissons zèbres et 636 autres poissons vont être utilisés, une partie tuée et une partie remise en élevage, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à sévère. Ils sont plongés dans un bain de substances provoquant douleur ou anxiété, puis isolés pour un test comportemental d'une heure, avant de recevoir un analgésique ou d'être tués. Le porteur reconnaît que la douleur est attendue et inévitable, l'objectif étant de bâtir une grille d'évaluation de la douleur chez le poisson. Il affirme que les comportements observés ne sont ni prévisibles ni reproductibles autrement que sur l'animal vivant.
Objectifs
L’objectif de ce projet consiste à mettre au point une grille de score de la douleur chez le poisson. En effet, chez l’Homme ou chez les autres modèles animaux, on utilise des grilles de score basées notamment sur les expressions faciales, afin d’évaluer la douleur ; une telle grille n’existe actuellement pas chez les poissons, bien qu’ils soient de plus en plus étudiés en recherche. L’objectif de ce projet est donc de trouver d’autres critères afin de pouvoir créer une grille de score de la douleur chez le poisson, facilement utilisable par tous. Afin d’établir une grille de score qui soit représentative des différents niveaux de douleur et comportements associés, nous réaliserons ces tests sur 2 espèces de poissons modèles : le poisson zèbre (Danio rerio) et le médaka (Oryzias latipes). Dans un premier temps, nous souhaiterions comparer l’effet de la phéromone d’alarme fraiche (Schreckstoff) et de son substituant chimique sur les comportements associés au stress des poissons. Des études préliminaires nous ont permis de voir que le substituant chimique de la phéromone d'alarme ne permettrait pas d’obtenir un panel complet des comportements observés lors des situations de stress ou de douleur. Il est donc important de pouvoir terminer cette étude préliminaire afin de comparer les deux molécules et de caractériser tous les comportements à inclure dans la grille de score. En effet, le stress a un impact important sur le comportement et la physiologie des poissons et est une composante à part entière de la douleur, il est donc difficile de les différencier. C’est pourquoi le stress doit donc être pris en compte dans la création de cette grille de score de la douleur afin de discriminer les deux états. Lors de la phase 1, nous déterminerons par des tests la molécule la plus pertinente pour mesurer le stress. Puis, lors de la phase 2, nous établirons la grille de score en applicant sur les poissons les différentes combinaisons de molécules (dont celle déterminée en phase 1), connues pour induire ou réduire le stress ou la douleur, et en analysant leur comportement à travers différents tests.
Bénéfices attendus
La création d’une grille de score de la douleur est un atout pour la bonne utilisation du modèle poisson à des fins d’utilisation scientifique. Celle-ci permettra de mieux évaluer la douleur du poisson aussi bien lors des pratiques utilisées en conditions d’élevage que lors de la réalisation des projets scientifiques. Une meilleure compréhension de la douleur chez le poisson permettrait d’améliorer le raffinement des procédures.
Procédures
Les poissons serons soumis à un bain contenant un principe actif provoquant ou stoppant la douleur ou l’anxiété pendant maximum 5min. Ils seront ensuite transférés dans un aquarium de test afin de réaliser un test comportemental dont la durée maximale sera d’une heure. Lors de ce test il est isolé de ces congénères. A la suite de ce test, le poisson recevra une dose d’analgésique ou sera euthanasié.
Impact sur les animaux
Cette étude vise à évaluer les différents signes de douleurs aussi bien comportementales que physiologiques. Une douleur est donc attendue et inévitable dans ces procédures. Nous veillerons à ce que celle-ci soit la plus courte possible et les poissons seront sous surveillance constante pendant la procédure. A la fin de la procédure la douleur sera stoppée à l’aide d’analgésique ou par la mise à mort de l’animal.
Devenir
A l’issu de chaque procédure et en fonction de l’avis vétérinaire les animaux seront soit récupérés et remis en élevage, soit mis à mort.
Remplacement
Dans le cas de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives. Les comportements observés sur les animaux aquatiques sont non prévisibles ou reproductibles. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les études comportementales se font directement sur l’animal vivant. De plus elles peuvent apporter des informations fondamentales en relation avec de grandes questions biologiques.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chacune des procédures. Pour cela nous avons limité précisément le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses . De plus des expériences précédentes nous ont permis de valider ce nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats. Le groupe contrôle de la phase 1 sera soumis à tous les tests comportementaux afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé lors de l’élevage. Si les animaux montrent des signes de mal-être lors de l’élevage, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Pour vérifier le bien-être lors de l’élevage nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, rétraction des pigments. Afin de prévenir le stress dû à l'isolement de l'animal en plus de celui du nouvel environnement, l'animal aura accès à l'espace de test. Des tests préliminaires ont montré qu'une habituation à l'isolement s'effectue au bout d'une semaine. La surveillance des animaux sera réalisée visuellement par du personnel compétent et de façon constante lors des traitements et des tests de comportements jusqu’à ce que la douleur ou le stress soit supprimé par l’application de médicaments.
Choix des espèces
Les poissons téléostéens ont été cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses comportementales, aussi bien pour des comportements « innés » (fonctions motrices et sensorielles) que pour des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces comportements ont été observé chez plusieurs espèces de poissons. De plus la croissance rapide du poisson-zèbre et du médaka, son développement externe dans un oeuf avec tous les stades de développement directement accessibles et sa facilité de modification génétique en font des modèles de choix. Ces modèles étant de plus en plus utilisés, il est alors important de pouvoir établir une grille de score de la douleur. Les poissons seront étudiés au stade adulte, soit à partir de 6 mois qui correspond à la maturité sexuelle et jusqu’à deux ans qui correspond au maximum de ses capacités de reproduction. Ces stades de développement nous permettent d’effectuer les différents tests de comportement pour évaluer les critères de la douleur.
Effet cardioprotecteur de la clusterine dans l’ischémie/reperfusion myocardique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
189 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 165 dans des procédures de gravité sévère et 24 opérées puis tuées sans reprise de conscience. Elles subissent une chirurgie d'infarctus par ligature d'une artère coronaire, avec des douleurs post-opératoires possibles pendant plusieurs jours, puis des injections et des prélèvements de sang répétés. Le projet teste l'effet protecteur de la clusterine après un infarctus, sur des souris génétiquement modifiées et leurs congénères. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise l'ischémie-reperfusion et que seul un système intégré in vivo reproduit la pathologie.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d'étudier l'effet protecteur de la clusterine au cours de l'infarctus. La clusterine est une molécule capable de neutraliser les signaux de danger libérés par les cellules mortes au cours de l'infarctus. Nous utiliserons pour cela un modèle de souris déficientes en clusterine et leurs congénères contrôles. Nous utiliserons un modèle d'infarctus chez la souris, nous permettant d'étudier l'effet de la clusterine sur la taille d'infarctus après 7 jours. Nous étudierons également la cinétique de libération dans le sang de la clusterine et des signaux de dangers qu'elle neutralise, les niveaux d'expression de clusterine et des marqueurs de l'inflammation dans le tissu cardiaque ainsi que le rôle protecteur de la clusterine in vitro sur des cellules isolées de coeur de souris.
Bénéfices attendus
L’infarctus du myocarde aigu est aujourd’hui une cause majeure de mortalité et morbidité dans le monde.. Malgré les progrès réalisés ces dernières années dans la prise en charge précoce de l’infarctus du myocarde, qui a permis de diminuer considérablement la mortalité aigue grace à la revascularisation, il existe toujours un risque élevé pour les patients de développer une insuffisance cardiaque dans le long terme. L’arsenal thérapeutique disponible actuellement a permis des progrès cliniques mais la morbi-mortalité reste élevée (50 % de mortalité à 5 ans) et les traitements ne sont pas curatifs. A ce jour, le remodelage du myocarde après un infarctus constitue un problème majeur de santé publique en France et il apparait indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Cela nécessite de mieux comprendre les mécanismes qui régissent l’altération de la fonction cardiaque post-infarctus à partir de modèles expérimentaux qui reproduisent les différentes composantes de la pathologie humaine. Ceci est un gage d’une meilleure transposition vers la clinique dont le besoin de nouveaux traitements est urgent. Le but du présent projet est de démontrer que la clusterine pourrait constituer une stratégie thérapeutique prometteuse et originale pour le traitement de l'infarctus du myocarde.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'infarctus du myocarde par ligature coronaire. La durée totale de l’intervention est d'environ 60 min, dont 15 min entre l’intubation oro-trachéale et l’accès au coeur, 30 min de ligature coronaire et 15 min pour la fermeture du thorax. 3 injections iv (dans la veine caudale) de clusterine (avant la ligature coronaire, à J2 et à J3) et/ou 1 injection de molécules neutralisées par la clusterine (avant la ligature coronaire) seront réalisées. 4 prélèvements de sang seront réalisés (avant l’occlusion, à H4, H24 et J7).
Impact sur les animaux
Au cours de la procédure chirurgicale, les nuisances ou effets indésirables (qui seront surveillés) sont l’hypotension et le refroidissement corporel pouvant causer un stress modéré. Après la chirurgie thoracique (thoracotomie), d’éventuelles douleurs post-opératoires modérées pendant plusieurs jours au niveau des nerfs intercostaux pourront avoir une incidence sur le bien être des animaux. Ces douleurs pourront être réduites par injection d’analgésiques.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux sous anesthésie profonde pour récupérer les tissus cardiaques pour les analyses de protéines et ARN, pour l'analyse de la taille d'infarctus et l'isolement des cardiomyocytes.
Remplacement
Le développement des pathologies est un processus complexe et intégré qui est mieux reproduit dans un modèle animal. Par exemple, les lesions d'ischémie-reperfusion myocardique mettent en jeu, entre autres, des systèmes hormonaux, neuro-humoraux, des adaptations des systèmes circulatoire, rénal, central si bien que seul un système intégré in vivo permet de reproduire toutes les composantes. Ainsi, le remplacement d'animaux ne sera pas possible dans cette étude car actuellement, il n’existe pas de méthode alternative ni de modélisation possible pour l’ischémie-reperfusion myocardique. De plus, les études in vivo répondent mieux au potentiel thérapeutique de la cible même si elles ne présagent pas des résultats qui vont être obtenus dans d’autres espèces ou en clinique.
Réduction
Dans le respect de la règle des 3R, nous réduirons le nombre d'animaux à maximum 12 souris par groupe. Ce nombre est basé sur notre expérience. C’est le nombre minimal qui permet d’assurer la robustesse des résultats pour évaluer au mieux le rôle de protéines dans l'ischémie-reperfusion myocardique , sans qu’il soit excessif en terme d’animaux à inclure. Une analyse statistique des résultats sera ainsi réalisée. Seules les expériences indispensables seront réalisées et il n’y aura pas de répétition inutile d’expérience. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, nous réaliserons toute une série de collecte de données sur une même souris: prélèvement sanguin, histologie, expression génique et protéique.
Raffinement
Nous raffinerons cette étude par un hébergement des animaux selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les animaux sont élevés avec une attention particulière (passage du personnel minimum 2 fois/jour et observation de l'état général). Les manipulations sont réduites au minimum afin de limiter le stress des animaux. La souffrance de l’animal sera réduite au maximum ou supprimée par l’utilisation d’anesthésique avant la chirurgie et d’analgésique à différents temps (avant la chirurgie, après la chirurgie et si l'animal montre des signes de douleurs). Notre objectif est d’offrir aux animaux la meilleure qualité de vie possible et de garantir que toute nuisance ou souffrance due aux procédures scientifiques soit détectée et réduite le plus rapidement possible. Une période d’acclimatation d’au moins 7 jours sera respectée après réception des animaux. Pour éviter tout stress, les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur : - dans des cages aux normes suivant leur âge et leur poids - en groupe social au sein de l’animalerie - en leur mettant à disposition un enrichissement du milieu (cabannes, tunnels, papier, coton pour la confection de nids). Une grille d’évaluation des points limite sera mise en place pour évaluer l’état de l’animal après la chirurgie et mettre en évidence un éventuel point limite. La décision de garder en vie les souris sera prise par le responsable du projet en concertation avec la structure de bien-être animal (SBEA). La mise à mort sera réalisée par un protocole adapté en vue des prélèvements post-mortem.
Choix des espèces
Le modèle d’infarctus du myocarde chez la souris est parfaitement maitrisé au laboratoire et mime le développement de la pathologie humaine. Il existe dans cette espèce une grande disponibilité d’outils d’étude biologiques nécessaires à l'évaluation de la cardioprotection. La souris est ainsi un excellent modèle pour la maladie humaine, car l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme. De plus, une partie du projet utilisera des souris génétiquement modifiées (CLU). C'est le seul modèle animal disponible qui présente une déficience en CLU. Les souris génétiquement modifiées sont des outils précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permettent d'étudier des mécanismes cellulaires et moléculaires. Nous utiliserons des souris de 3-4 mois (jeunes adultes) pour réaliser les interventions chirurgicales de manière optimale chez des animaux matures et pour éviter la sensibilité accrue à l'ischémie-reperfusion liée au vieillissement.
Altération de l’activité corticale et maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines menées sous anesthésie sans réveil. Ces souris transgéniques produisant du peptide amyloïde subissent une ou deux chirurgies cérébrales, des injections pendant sept jours et des tests de mémoire, dont un conditionnement par la peur qui les expose à un stimulus redouté. L'objet est de relier l'oubli précoce d'Alzheimer à des changements de l'activité corticale, l'espoir d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques restant au conditionnel. Le porteur affirme que seule la souris réunit tous les critères recherchés et que les modèles in silico ne modélisent pas le cerveau entier.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie progressive, mortelle et est la cause principale de syndrome démentiel et en représente au moins deux tiers des cas la plus courante. MA commence bien avant le stade démentiel par l’apparition de troubles cognitifs donc le diagnostic précoce est un objectif important pour la recherche préclinique et clinique sur la MA. Il peut représenter une fenêtre thérapeutique critique où les interventions peuvent être initiées avant que ne se produise un déclin cognitif sévère. Une accumulation de peptide bêta-amyloïde (Aß) dans le cortex préfrontal est corrélée à un oubli rapide. Ensable, ils constituent un symptôme précoce de la MA qui peut être détecté par des mesures d'évaluation cognitive expérimentale et clinique bien avant l'apparition d'une démence sévère. En effet, les déficits d'apprentissage et de mémoire sont parmi les premiers symptômes rapportés par les familles de patients. Aβ a des effets sur les signalisations impliquées dans la régulation des diverses formes de plasticité corticale et donc la formation de la mémoire. L'objectif de notre projet actuel est d'aboutir à une meilleure compréhension des processus neurobiologiques qui sous-tendent les mécanismes sous-jacents de la formation de mémoire altérée aux premiers stades de la maladie. Nous proposons d'explorer les altérations corticale en tant que marqueur précoce de l'oubli anormal dans la MA.
Bénéfices attendus
La diagnose précoce de la maladie d`Alzheimer est l'étape la plus importante dans l'identification : i) de l'altération cérébrale initiale et par conséquent ii) des thérapies possibles. L'oubli précoce pourrait représenter une cible pour des études précliniques visant à prévenir ou retarder l'apparition de formes plus sévères de la MA. Notre projet vise à relier l'oubli précoce aux changements moléculaires responsables de l'altération de l'activité corticale en offrant une nouvelle voie pour l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent les interventions chirurgicales (< 40 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Ils sont soumis à une tâche comportementale classe de sévérité modère. La tâche comportemental se compose de deux épreuves, l'apprentissage de la mémoire associative et le rappel (chaque épreuve dure 6 à 7 minutes). Ils reçoivent également des injections pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux subissent un ou deux brèves procédures chirurgicales sous anesthésie. Les effets indésirables potentiels de ces procédures sont un inconfort modéré, une perte de poids potentielle et un risque d'infection. Les autres procédures expérimentales de ce projet comprennent des tests comportementaux : conditionnement par la peur (CdP) et procédure sans reveil. Le conditionnement par la peur peut être un événement stressant pour les souris. Afin de réduire le stress, nous gardons le groupe d'animaux en cage, ce qui leur permet d'exprimer leur comportement social naturel et nous permet de suivre le toilettage mutuel et la nidification des animaux après l'exécution de la tâche. Les projets précédents qui ont utilisé cette tâche comportementale ont montré que les animaux expriment leur comportement naturel dans les 15 minutes qui suivent la tâche, ce qui signifie que cette procédure n'entraîne pas une augmentation significative du niveau de stress. Le test est également effectué dans une pièce différente, avec des odeurs différentes de celles de la cage, afin de désactiver le lien entre la cage d'origine et l'événement redoutable.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.
Remplacement
Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la mémoire dans le néocortex et leur changement dans MA. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) adapté à la réalisation de tests cognitif, iii) pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique, iv) qui se prête facilement à la modification de son génome, v) possédant un néocortex, vi) adapté aux approches expérimentales invasives. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possibles. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent à tous ces critères. Bien que des tests comportementaux simples soient possibles chez des espèces moins sensibles, ces animaux ne possèdent pas la structure cérébrale ciblée et par conséquent ne sont pas adaptés à l'objet de notre étude. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones et leur altération dans MA. Les modèles in silico actuellement disponibles ne permettent pas la modélisation au niveau du cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.
Réduction
Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. les expériences réalisées au fur et à mesure sur de petits lots de 4-6 animaux). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant. Approche statistique : Selon les caractéristiques de nos données (normalité, variance, cohérences avec les critères de chaque test), nous appliquons les tests statistiques. Selon les caractéristiques de nos données certains tests supplémentaires seront effectués.
Raffinement
i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Manipulation quotidienne des animaux avant les expériences pour réduire le niveau de détresse. iv) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que NC3R. vii) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives avec l'enrichissement et le matériel pour la nidification.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris car nous voudrions exploiter certains modèles transgéniques impliquant la production d’amyloïde beta. À ce jour, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, d'une manière routine, de modifier le génome et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés au niveau comportemental et moléculaire. Selon les données précédemment rapportées et les données sur le développement de la pathologie, nous les utilisons à l'âge auquel les animaux commencent à développer les premiers signes de la maladie avant l'apparition de la maladie grave.
Comprendre le role des lymphocytes T résidents mémoires dans l’encephalomyélite autoimmune expérimentale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
3 318 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 120 dans des procédures classées sévères. Une encéphalomyélite auto-immune, modèle de la sclérose en plaques, leur est induite et provoque une paralysie ascendante progressive, évaluée sur une échelle de 0 à 5 dont le dernier stade entraîne l'euthanasie, après des injections, des gavages, des prélèvements de sang et une irradiation. Le porteur écrit que le projet ne prévoit pas l'utilisation d'analgésiques ou anti-inflammatoires, au motif qu'ils risqueraient d'interférer avec les processus inflammatoires étudiés. Il affirme que le remplacement n'est pas applicable car les études in vitro ne reproduiraient pas la pathologie.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique qui affecte le système nerveux central (SNC) qui touche 2,5 millions de personnes dans le monde, environ 80 000 patients en France et représente ainsi la première cause de handicap chez les jeunes adultes. Les traitements de fond de la SEP reposent sur des molécules immunosuppressives, qui restent incomplètement efficaces sur le long terme en particulier contre les formes progressives de la maladie. Il est donc urgent de trouver de nouvelles options thérapeutiques permettant d'enrayer le caractère chronique et progressif de la SEP. Dans ce projet nous utiliserons un modèle expérimental de SEP chez la souris appélé encéphalite autoimmune expérimentale ou EAE, pour identifier les mécanismes sous-tendant la chronicité de la maladie et en particulier nous cherchons à comprendre le rôle d'un sous-type de cellules immunitaires résidant stablement dans le SNC appelé lymphocytes T résident memoires ou TRM. Notre objectif central est de definir le rôle des TRM dans la progression de l'EAE chez la souris et identifier les mécanismes moléculaires par lesquels les TRM soutiennent l'inflammation chronique et potentiellement d'identifier des stratégie thérapeutiques visant à cibler les TRM.
Bénéfices attendus
Les traitements de fond de la SEP sont incomplètement efficaces sur le long terme et sont associés à de nombreux effets secondaires. Ce projet a le potentiel d’identifier de nouvelle voies thérapeutiques via la compréhension du role joué par un sous-type de lymphocytes T (LT) sur l’environnement inflammatoire cérébéral et ses conséquences sur la sévérité et le chronicité de la maladie. Il permettra aussi de mieux comprendre les voies moléculaires impliquées qui pourraient constituter de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections (intraveineuse, intrapéritonéale et sous-cutanée) et à des gavages, d'une durée de quelques secondes. Les injections sous-cutanées et intraveineuses seront réalisés sur animaux anesthésiés tandis que les injections intrapéritonéales et les gavages sont réalisées sur animaux vigiles. Les animaux subiront aussi des prélèvements de sang (3 maximun d'une durée de quelques secondes) sur animaux anesthésiés. Enfin certains groupes d'animaux subiront une irradiation qui sera realisée sur animaux vigiles et d'une durée de 6min57s.
Impact sur les animaux
Les souris subiront des injections intrapéritonéales, sous-cutanées, intraveineuses et des gavages ainsi que des prélèvements de sang. Ces manipulations peuvent potentiellement induire un stress, une angoisse ou un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et de manière transitoire. L'EAE induit une paralysie ascendante progressive. La douleur est absente ou faible jusqu’au stade de paralysie du train arrière et modérée au stade de paralysie des trains arrière et avant. Les souris peuvent aussi connaître une perte de poids à ce stade avancé de l'EAE.
Devenir
Tous les animaux intégrés dans chaque procédure expérimentale seront mis à mort en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de cette pathologie humaine.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Nous avons également pu valider certaines approches expérimentales in vitro permettant d’optimiser l’utilisation des animaux. Afin d’assurer la fiabilité de nos résultats, nous travaillerons avec des groupes tests et contrôles d’au minimum 5 animaux et répéterons nos experiences 3 fois. Le nombre d’animaux utilisés correspond dans nos expériences et dans celles des groupes travaillant sur des modèles équivalents au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Nous analyserons aussi le nombre de LT par organes et leurs niveaux d'expression de marqueurs spécifiques.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux qui évaluera leur état général (suivi du poids, prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Le modèle de l’EAE est classiquement utilisé comme le modèle murin de la SEP. La douleur est absente ou faible jusqu’au stade 3 et modérée voire sévère au stade 4 et 5. A partir du stade 3, de la nourriture et de l’eau sous forme gélifiée sont placées quotidiennement dans la cage pour éviter la déshydratation. L’incidence et la sévérité de la maladie seront suivies quotidiennement. Les signes cliniques de l’EAE seront évalués sur une échelle de 0 à 5 en fonction du handicap moteur. 0 : aucun signe ; 1 : faiblesse de la queue ; 2 : faiblesse de la queue et difficulté à se remettre sur ses pattes après retournement ; 3 : paralysie du train arrière ; 4 : paralysie du train arrière et perte de tonus du train avant ; 5 : paralysie du train arrière et avant, euthanasie. Si immédiatement après ou le lendemain d’un gavage ou d’une injection ip ou iv, un animal cesse de s’alimenter et devient prostré, il sera euthanasié. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ils risquent d’interférer avec les processus inflammatoires au cours de notre expérimentation. Même les anti-douleurs de type morphinique ont des propriétés immunomodulatrices.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée dans ce projet (souris de 7 à 8 semaines, 23-25g au début de l'expérience) offre la possibilité unique d’étudier une pathologie d’inflammation du SNC (l’EAE) mimant la pathologie humaine de la SEP, comme en témoigne les nombreuses références bibliographiques publiées utilisant ce modèle d’expérimentation animal. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. La complexité des systèmes immunitaires et nerveux, et du tissu cérébral, autant dans sa composition cellulaire que son architecture, fait qu’il est impossible de simuler (sous forme de modélisation informatique ou d’expériences en culture cellulaire) la ‘connectique’ des populations cellulaires mises en jeu. Il n’est donc actuellement pas possible de répondre aux objectifs proposés par des méthodes excluant totalement l’utilisation du modèle animal. Des souris adultes seront utilisées afin de pouvoir étudier les effets des manipulations sur un système nerveux central et immunitaire mature. Les souris sont considérées comme adultes entre 6-8 semaines d’âge. Avant toute procédure elles auront une semaine d’acclimatation. Dans le cas de la production de souris chimères la reconstitution du système immunitaire par la moelle osseuse injectée prend 8-10 semaines, puis les souris subiront la procédure d'EAE et seront suivies jusqu’à 50-70 jours (7-10 semaines) après induction de la maladie, donc l’âge maximal d’utilisation des souris sera de : 8 (âge des souris receveuses)+1 (semaine d’acclimatation)+10 (temps necessaire à la reconstitution du système immunitaire) +10 (temps de suivi de la procédure d’EAE)=29 semaines.
Rôle pathogène des auto-anticorps dans les dermatoses bulleuses auto-immunes
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
838 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 615 dans des procédures menées sans réveil et 223 en gravité modérée. Elles reçoivent des injections de protéines pour rompre la tolérance immunitaire, subissent jusqu'à neuf prélèvements de sang sur 56 jours, et certaines, gestantes ou nouveau-nées, reçoivent des anticorps destinés à provoquer un décollement de la peau. Le porteur indique que les animaux développent des érosions cutanées ou orales et une image comparable à celle des patients, une échelle de gravité servant à fixer un point limite. Il précise avoir observé la pathogénicité in vitro mais affirme que sa confirmation ne peut être envisagée que chez l'animal.
Objectifs
L'objectif général de notre programme de recherche est d'améliorer la compréhension de la physiopathologie des DBAI. Plus spécifiquement, nous viserons à : i) évaluer les nouveux antigènes cibles identifiés dans les DBAI dans le déclenchement d’une DBAI par des immunisations chez la souris. ii) établir si des auto-anticorps exercent un rôle pathogène direct par transfert passif, chez la souris grestante ou néonatale, d’immunoglobulines de patients atteints de DBAI ou de souris (avec des anticops monoclonaux d'hybrdiomes générés issus des souris immunisées) . L’étude des animaux se fera donc par (i) une observation clinique de la peau, (ii) une analyse sanguine et iii) une étude histologique des tissus cutanés prélevés post-mortem
Bénéfices attendus
La méconnaissance des processus physiopathologiques conduisant à la survenue des DBAI est un frein au diagnostic et à la mise en place d’une thérapeutique adaptée. Des études récentes suggèrent fortement que la diversité des antigènes cibles au cours des DBAI est plus hétérogène. L’évaluation du rôle de ces auto-anticorps dans les processus physiopathologiques permettra un diagnostic plus précis et la mise en place d’outils thérapeutiques plus adaptés et de potentiellement réduire les effets secondaires des thérapies actuellement utilisées.
Procédures
Injections de protèines recombinantes (immunisation) : injection en sous-cutanée entre les 2 omoplates. Les souris seront injectées au moins une fois voire 3 fois, à 15 jours d'intervalle. Chaque injection dure moins de 10 secondes. Prélèvement de sang sur animal anesthésié (suivi longitudinal ). Les souris seront prélevées 9 fois sur une période de 56 jours. Les prélevements de sang durent moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
L'objectif de l'immunisation est de promouvoir une rupture de la tolérance immunitaire comme un auto-antigène chez les patients atteints de DBAI afin d’évaluer la pathogénicité des anticorps. L’injection de la protéine chez les animaux entrainera l’apparition d'anticorps pouvant être à l'origine de signes d'érosions cutanés ou orales . Les tests de tansfert passsif ont pour objectif de confirmer le rôle pathogène des différents auto-anticorps par l’induction de l’acantholyse. Les animaux développeront des signes cutanés et l’image histologique devrait être caractéristique du phénomène d’acantholyse observé chez les patients. L’apparition d’éventuelles érosions cutanées ou orales autour du museau mesurée par un examen visuel effectué par deux observateurs indépendants permettra d’évaluer l’évolution de la maladie et le niveau de souffrance des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever en post mortem la peau pour une analyse histologique ou de réaliser des analyses biologiques permettant d'évaluer la pathogènicité des anticoprs.
Remplacement
Nous avons réalisé une étude préalable in vitro de l'activité des auto-anticorps sur les kératinocytes par un test dispase et par des tests d’immunofluorescence sur de la peau. La pathogénicité, in vitro, est observée de ces nouveaux auto-anticorps. Cependant, la pathogénicité réelle de chaque auto-anticorps ne peut être envisagée que chez l'animal car ils pourraient agir en synergie avec des cellules du système immunitaire in vivo et contribuer ainsi au phénotype complexe des DBAI.
Réduction
Le recours au modèle murin étant absolument nécessaire, le modèle murin de DBAI par transfert des auto-anticorps chez la souris néonatale est déjà connu et a déjà permis de confirmer la pathogénicité de certains auto-anticorps. Ainsi, l’utilisation du même modèle permet de réduire le nombre de souris pour la mise au point pour tester rapidement l’implication de ces nouveaux auto-anticorps. Le nombre d’animaux nécessaires est réduit au minimum en tenant compte de la variabilité de l’induction de l’acantholyse. Le nombre d’animaux à inclure par lot, ne peut pas faire l’objet d'une justification par une étude statistique. En effet, il va s'agir d'une part, d’un protocole d’immunisation, la quantité de souris est le juste nombre défini d’après l’expérience du laboratoire sur ce type de procédure et dont on sait qu’il permettra de tester et de produire des hybridomes en aval. D'autre part, pour les autres procédures, pas de test statistique puisqu’il s’agit d’une observation qui doit répondre à un effet pathologique ou non des Ac. Le nombre juste de souris permet de pallier aux fluctuations expérimentales inhérentes à la variabilité des réponses, notamment immunologiques, entre les animaux et pour pallier la variabilité du nombre de petits par portée.
Raffinement
Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie (perte ou hérissement des poils, lésions du museau, posture inhabituelle pour les souris immunisées et uniquement la peau pour les souris néonatales) et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Elle permettra d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. Enfin, l’ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées dans des cages enrichies avec du papier, du coton (cell-nest) et un abri de cellulose. Une crème anesthésique sera appliquée sur les souris néonatales avant l’injection des immunoglobulines et elles seront immédiatement remises en présence de leur mère après l’injection afin de réduire le stress.
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivie des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés permettant d’étudier les mécanismes immunologiques mise en œuvre lors des pathologies auto-immunes. Animaux âgés de 6-8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature pour l’immunisation des auto-antigènes des DBAI. Femelles gestantes datées à 15 jours de gestation pour permettre l'accueil et l'injection soit des mères à la fin de la gestion (étude du transfert transplacentaire ) ou des petits âgés de 1 jour ( âge requis) pour suivre le phénomène d’acantholyse cutanée suite à l’injection des auto-anticorps.
Evaluation de l’efficacité des ondes magnetiques sur l’ouverture de la barrière hématoencéphalique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
100 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs viraux couplée à une ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ondes magnétiques, puis sont tuées aussitôt ou une à quatre semaines plus tard pour prélèvements. Le porteur présente un procédé "confidentiel" relevant à la fois de la recherche et d'une "prestation de service" pour des entreprises, avec des applications cliniques renvoyées à des étapes ultérieures sur de plus grands animaux. Il indique qu'aucun modèle cellulaire n'existe pour cette étude et revendique le "besoin" d'un modèle animal.
Objectifs
Notre équipe est impliquée dans le developpement d’approches de thérapies géniques innovantes dans le domaine des maladies neurodégénératives avec à la fois de la recherche et du développement mais aussi de la prestation de service pour des entreprises. Ici nous voulons tester la capacité des vecteurs à permettre une expression significative dans les differentes zones du cerveau suite à un nouveau mode d’ouverture de barrière hématoencéphalique confidentiel afin d’etablir des voies d’administration de thérapie non invasives pour l’application en santé humaine. Au total le projet utilisera 100 souris sur les 5 prochaines années avec des groupes de 5 individus.
Bénéfices attendus
La barrière hématoencéphalique est une protection du système nerveux central (SNC) des pathogènes et virus mais est pour la même raison une limite à l’atteinte efficace du SNC par les composés injectés en intraveineux Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de la faisabilité de l’ouverture de la barrière hématoencéphalique par une nouvelle technologie chez la souris. Puis de coupler cette ouverture de barrière à l’injection en intraveineuse de nos vecteurs viraux thérapeutiques, afin d’amener nos vecteurs au niveau cérébral. Lorsque nous aurons validé ces étapes chez la souris nous pourrons mener les étapes translationnelles sur des modèles animaux plus grands et plus proches de l’Homme. Ces étapes sont impératives avant la mise en place des essais cliniques de phases I et II chez le patient
Procédures
- Les animaux seront utilisés pour une injection intraveineuse sous anesthésie générale (durée 5min) couplée à une ouverture de leur barrière hématoencéphalique là aussi sous anesthésie générale et analgésie (1h) Les animaux seront euthanasiés soit immédiatement après l’exposition aux ondes devant conduire à l’ouverture de cette barrière et entre 1 et 4 semaines après la procédure (ouverture de barrière avec injection de notre vecteur thérapeutique) pour évaluer l’efficacité.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : - Une injection intraveineuse sous anesthésie avec un risque de décompensation respiratoire et un risque de saignement - un risque respiratoire ou d’hypothermie à l’anesthésie - un risque hémorragique lors de l’ouverture de barriere hémato-encéphalqique Un risque de non récupération suite à l’anesthésie Tous ces actes peuvent conduire à un stress de l'animal et possiblement une malnutrition mais pas de douleur liée à la procédure.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données de bio distribution et de tolérance.
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle de culture ou de système cellulaire pour étudier l’efficacité de l’ouverture de la barrière hématoencéphalique, encore moins pour évaluer l’efficacité de l’expression de la protéine thérapeutique grâce au vecteur viral consécutive à l’ouverture de cette barrière. Notre étude dans l’espèce murine nous permet de vérifier la faisabilité de notre procédé couplant injection intraveineuse d’une thérapie génique (vecteur viral) et l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique. Une fois cette faisabilité vérifiée, les données de bio-distribution que nous récoltons nous permettent d’avoir une connaissance de la diffusion au niveau de la cible thérapeutique visée (cerveau) et également à l’ensemble de l’organisme (organes périphériques) pour vérifier la tolérance de ce nouveau procédé (effets secondaires, toxicité).
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe mais conservons un nombre suffisant de façon à obtenir des résultats fiables et robustes. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 5 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Nous commençons par une étude pilote sur 20 animaux et poursuivrons une fois cette étape validée par de groupes de 5 à 1 animaux en fonction des thérapies géniques à tester. Un nombre total maximal de 100 souris sera donc nécessaire pour ce projet.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, la procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress.. Les animaux seront hébergés en groupe dans des conditions sanitaires contrôlees Les animaux disposent de nourriture adaptée à leur stade physiologique (gestation/allaitement ou animaux de stock) et d’eau ad libitum. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne y compris le weekend en plus de la zootechnie si besoin (points limites) et de soins adaptés. Les animaux seront hébergés par 3 à 5 souris par cage ventilée au maximum, si nécessaire en cas d’agressivité les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge). Les procédures sont effectuées sous anesthésie avec la mise en place de moyens pour venir contrecarrer les risques liés à cette anesthésie (monitoring respiratoire et de la température, utilisation de tapis chauffant, de couverture à circulation d'eau chaude, chambre de réveil thermostatée, alimentation gélifiée mis à disposition lors du réveil, gel oculaire pour éviter la sécheresse cornéenne). Un antidouleur est prévu lors de notre phase pilote concernant l'ouverture de barrière hémato-encéphalique par ondes magnétiques, et en amont du moment de l'euthanasie. Les gestes techniques sont réalisés par du personnel compétent et des points limites suffisamment prédictifs sont établis afin de limiter tous stress, souffrance ou douleur.
Choix des espèces
Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la faisabilité de l’ouverture de barrière ainsi que pour connaître la biodistribution et l’expression des vecteurs adeno-associés recombinants suivant leur mode d’administration et ceci ne peut se faire que chez la souris contrôle comme petit animal qui nous permet de prédire le pattern d’expression et anticiper les études d’efficacité dans le modèle murin des pathologies concernées. Les souris sont utilisées à 8 semaines en rapport avec les étapes suivantes qui seront menées dans le modèle murin de la pathologie, afin d’utiliser des animaux d’âges comparables.