Procédures sans réveil
Evaluation de l’effet de la photobiomodulation sur la viabilité et la fonctionnalité des îlots pancréatiques (NIRILO)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
115 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie réutilisée pour la formation de personnels, le reste tué. Ils reçoivent une ou deux injections de streptozotocine pour les rendre diabétiques, de nombreux prélèvements sanguins, une greffe d'îlots pancréatiques par chirurgie dorsale puis un prélèvement terminal, pour tester si la photobiomodulation améliore la survie des greffons. Les rats ne devenant pas diabétiques sont réaffectés à l'enseignement de techniques expérimentales, et une quarantaine d'autres sont ouverts puis tués sans réveil pour prélever leur pancréas. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" d'étudier l'effet sur un "organisme entier" avant tout usage chez l'humain.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer si la photobiomodulation présente un intérêt thérapeutique dans le contexte des greffes d’îlots de Langerhans, et si oui quelles en seraient les modalités (mode d’illumination, dose, profil et timing d’illumination, etc..) dans le cadre d’un éventuel essai clinique.
Bénéfices attendus
Si les résultats sont positifs et mettent en évidence un avantage thérapeutique de la photobiomodulation (lumière de basse énergie), nous prévoyons de proposer une suite au projet à travers la continuité de tests précliniques ainsi que des validations réglementaires en vue d’un essai clinique (first in man), pour évaluer la sécurité et la fiabilité de cette approche thérapeutique innovante. De plus, le mécanisme biologique d’effet de la photobiomodulation étant assez générique, on peut imaginer, si les résultats sont concluants, le transposer à d’autres organes éligibles à la greffe, permettant ainsi d’augmenter le pool de greffons disponibles, et de réduire le nombre de patients en liste d’attente.
Procédures
40 à 75 rats seront recevront 1 ou 2 injections d’une molécule (la streptozotocine) les rendant diabétiques (30 sec). Afin de suivre leur glycémie et donc leur état diabétique, une goutte de sang sera prélevée de façon bi-quotidienne la première semaine puis toutes les semaines pendant 2 semaines, soit 14 prélèvements sanguins d’une durée de 1 minute chacun. Lors de la greffe d’îlots, les animaux seront anesthésiés, recevront un analgésique par injection et auront une chirurgie dorsale (30 min). La glycémie sera de nouveau suivie quotidiennement. 10 gouttes de sang seront prélevées toutes les semaines pendant 8 semaines, soit 8 prélèvements sanguins d’une durée de 3 minutes chacun. Un test de tolérance au glucose sera réalisé durant 120 minutes. Cela consiste à injecter du glucose (30 sec) puis à mesurer la glycémie à différents temps (13 gouttes de sang prélevées durant les 120 minutes du test). Les animaux seront enfin anesthésiés pour un prélèvement terminal. 40 rats seront anesthésiés et recevront un analgésique. Leur ventre sera ouvert pour prélever le pancréas puis l’animal sera mis à mort sans réveil. Durée totale de la procédure 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les inconforts prévisibles liés à la technique est le risque d’hypoglycémie pouvant survenir dans les 48h suivant l’injection de la streptozotocine suivie d’une hyperglycémie apparaissant dans les suites de l’injection de streptozotocine. La mesure de glycémie, l’injection de streptozotocine et la greffe d'îlots sera réalisée par une personne formée à l’expérimentation animale et à la chirurgie.
Devenir
Les rats non répondant à l'injection de streptozotocine ne seront pas considérer comme naïfs, ils permettront l'enseignement de techniques expérimentales au sein du laboratoire par et pour les personnes formées à l'expérimentation animale. Les 40 animaux ayant suivit l'étude (10 contrôles, 10 diabétiques, 10 diabétiques greffés d'îlots et 10 diabétiques greffés d'îlots pré-illuminés) seront mis à mort à la fin de celle-ci pour prélever les organes et faire des analyses moléculaires.
Remplacement
Les test ont été préalablement fait sur des lignées cellulaire et îlots isolés avant l'approche in vivo. Cette étape intermédiaire est essentielle après les tests sur lignées cellulaires et avant les tests sur ilots humains. Il est nécessaire de pouvoir étudier l'effet de la greffe d'îlots illuminé sur un organisme entier et pas uniquement sur des cellules isolées avant l'utilisation chez l'humain.
Réduction
Réduit au minimum le nombre d'animaux : nous prévoyons l'usage de 115 rats : 75 pour l'obtention de minimum 30 rats diabétique (l'injection de la molécule rendant les rats diabétique a une efficacité de 40% minimum), 10 rats contrôles et 30 rats pour obtenir des îlots à greffer. L'ensemble des ces effectifs ont été déterminé par des tests statistiques afin de pouvoir détecter un ré-équilibrage glycémique. A noter que si l'efficacité de la molécule rendant les rats diabétique est supérieur à 30%, les rats surnuméraire seront réaffectés sur d'autres projets. A noter que les rats injecté avec de la Streptozotocine et non devenu diabétique pourront être utilisé à des fins d'enseignement de techniques expérimentales au sein du laboratoire.
Raffinement
Raffinement : 1) Améliorer l’hébergement des animaux avec un milieu enrichi 2) Observation quotidienne (pesée, glycémies, comportement, aspect, détection de tout souffrance) 3) Dans les 48h suivant les injections de streptozotocine, risque d’hypoglycémie : mise à disposition d’eau avec du sucre durant 48h 4) Au long cours après l’injection de la molécule rendant les rats diabétiques, développement d’un diabète et hyperglycémie : si glycémie > 3g/L, injection d’une molécule pour diminuer le sucre dans le sang 5) Change d’animaux plus fréquent (toutes les 48h ou plus si nécessaire) 6) Chirurgie faite sous anesthésie + Analgésie préopératoire 7) Chirurgie effectuée sur un tapis thermostaté pour éviter le refroidissement des animaux au contact direct avec la surface de travail 8) Dans les suites opératoire, réveil sous lampe chaude, mise à disposition de nourriture semi-liquide, utilisation d’une litière en cellulose pour plus de propreté 9) Analgésie post-opératoire : avec injection d'un antalgique toutes les 8h durant 48h 10) Toutes les manipulations d’animaux sont faites par des personnes expérimentée et habilitée à l’expérimentation animale. Les points limites : un score est donné aux animaux selon 3 critères : Changement de poids corporel initial, Apparence physique, Comportement. Si le score est supérieur à 3, les animaux seront considérés en souffrance et seront euthanasiés par le responsable du projet après consultation de la cellule bien-être animal.
Choix des espèces
Modèle de rat classiquement utilisé pour l'isolement d'ilots pancréatiques par digestion enzymatique, et conditions fonctionnelles au laboratoire pour induction d'un diabète par la streptozotocine. Adultes d'environ 200-300g afin d'avoir un pancréas mature et pour avoir un meilleur effet de la streptozotocine.
Etude de l’expression de la SELENOT et effets du peptide PSELT dans la régulation périphérique et centrale de l’homéostasie énergétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
365 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 245 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras, elles subissent l'implantation de mini-pompes, des traitements par un peptide sur environ deux mois et jusqu'à dix prélèvements sanguins, pour étudier une protéine anti-oxydante et son application au traitement de l'obésité. Le porteur affirme que seul un modèle mammifère intégré, chez l'"animal entier", permet de comprendre ces effets. Les retombées thérapeutiques annoncées sont renvoyées à de possibles perspectives futures.
Objectifs
La SELENOT est une nouvelle thiorédoxine impliquée dans le contrôle du stress du reticulum endoplasmique (RE) des cellules neuroendocrines. Elle est notamment impliquée dans la production de la proopiomélanocortine ou POMC et de l’insuline, suggérant que cette protéine anti-oxydante pourrait jouer un rôle dans le maintien de l’homéostasie énergétique et qu’un défaut de son activité pourrait contribuer au développement de l’obésité et ses comorbidités. En effet, il est maintenant bien établi que le cerveau obèse est stressé et que le stress du RE dans l'hypothalamus joue un rôle central dans la résistance à la leptine et le développement de l'obésité. Récemment, l'hypothèse selon laquelle le stress du RE dans l’hypothalamus est causalement lié à la résistance à la leptine et à l'obésité a été étayée par de nombreuses preuves expérimentales. En effet, lors d'un régime riche en graisses (high fat diet, HFD) chronique, les neurones hypothalamiques développent un stress du RE qui induit une résistance à la leptine et à l'insuline, et conduit à un gain de poids. L'effet anorexigène de l'alpha-MSH, peptide dérivé de la POMC, joue un rôle déterminant dans le contrôle de l'équilibre énergétique et du poids corporel. Ces données ont permis d’établir que le développement des neurones POMC et la maturation de la POMC en alpha-MSH sont altérés par le stress du RE qui est associé à l'obésité, entraînant une diminution de la production et de la sécrétion d'alpha-MSH, le régulateur central de l'homéostasie énergétique. Ces observations suggèrent que les neurones POMC pourraient être avantageusement ciblés pour le traitement des dysfonctionnements des neurohormones causés par le stress du RE et associés à l'obésité. L'identification d'un agent unique capable de cibler ce processus physiopathologique dans des tissus contrôlant le métabolisme tels que l'hypothalamus et le pancréas est un objectif majeur. Dans ce contexte, il est donc important d’étudier les variations de l’expression de la SELENOT dans l’hypothalamus de souris suite à un régime HF et de déterminer les effets du peptide en dérivant, le PSELT et quelques analogues (3 autres peptides analogues modifiés chimiquement pour supprimer, contrôle, ou améliorer l’activité) au cours de l’obésité et du diabète de type 2 associé car ces recherches pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, pour la première fois, de répondre à la question de la régulation de l’expression hypothalamique de la SELENOT, nouvel acteur potentiel dans la régulation centrale et périphérique du métabolisme énergétique et de l’application thérapeutique du PSELT pour le traitement de l’obésité associée au diabète de type 2. Cette étude a l’avantage d’aborder, en parallèle, les effets du PSELT aussi bien en périphérie que dans le cerveau en condition physiologique et physiopathologique.
Procédures
Les 4 procédures correspondant au test de sécrétion d'insuline, préparation d'explants, prélévements de tissus et biodistribution du PSELT) dureront 2-4 h (sécrétion d'insuline et biodistribution du PSELT). Des prélévements de sang seront effectués à partir de la queue des animaux vigiles comme décrit dans les différentes procédures (10 maximum par animal sur une demi-journée, chacun des prélévements prendra moins d'une minute). L'implantation de mini-pompes Alzet sera effectuée sur souris anesthésiées et toutes les précautions d'usage seront suivies pour minimiser la douleur. Au total, l'intervention durera 10 min par souris. Les mini-pompes Alzet sont implantées pour des traitements d'un mois. Les traitements avec administration intrapéritonéale des peptides dureront environ 2 mois.
Impact sur les animaux
Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. Les analyses d'expression de la SELENOT ne présentent pas de difficulté supplémentaire pour l'animal et le traitement par le peptide PSELT n'a pas montré d'effets indésirables ou de nuisancs chez la souris dans d'autres études antérieures de l'équipe. Par conséquent, nous n'attendons pas de manifestations particulières chez les animaux qui seront utilisés dans ces études.
Devenir
Les souris utilisées pour les tests physiologiques seront maintenus en vie pour le suivi des analyses postérieures aux différents tests. A la fin de ces différents tests, ces animaux seront mis à mort. Les animaux prévus pour des prélévements d'organes ou de grande quantité de sang seront mis à mort.
Remplacement
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, les effets du PSELT dans la dérégulation de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. L’effectif des groupes d’animaux pourra être diminué à 10 lors des études concernant la régulation de la SELENOT tout en conservant des données statistiquement fiables. De plus, les procédures, n’impliquant pas d’effet néfaste à long terme, pourront être menées successivement sur les mêmes animaux intercalées avec des périodes de repos de 5 jours au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués. D'autre part, plusieurs analogues peptidiques seront examinés d'abord in vitro dans des cultures de neurones hypothalamiques (lignée mHypo-POMC) pour leur activité neuroprotectrice et activatrice de la production de POMC avant de sélectionner quelques analogues qui seront étudiés chez la souris obèse. Cette approche réduira sigificativement le nombre d'animaux qui seront utilisés.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum leur souffrance éventuelle. Ainsi, dans le cas de procédures ayant un impact sévère sur l’animal des mesures permettant de palier le handicap généré seront mises en place. Par exemple, l’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur sera traitée par des analgésiques (buprénorphine (0.1 mg/kg)). C’est notamment le cas lors de l’implantation de mini-pompes Alzet après laquelle les souris seront étroitement surveillées pour prévenir l’apparition de tout signe de mal-être. Enfin, certaines procédures nécessitant des prélèvements de structures (ex : explants hypothalamiques et analyse de l’expression hypothalamique de SELENOT et autres marqueurs du stress du RE) sont classées sans réveil.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, les effets du PSELT dans la dérégulation de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme. Des souris seront étudiées d'une part parce que les mécanismes de l'obésité et du diabète ont été largement étudiés chez cette espèce dont la physiologie présente certaines similitudes avec celle de l'homme et parce que des modèles transgéniques appropriés peuvent aisément être obtenus chez cette espèce. La souris présente plusieurs avantages en élévage: coût d'entretien réduit et forte performance en reproduction. Des souris adultes seront utilisées car nous souhaitons comprendre les mécanismes de l'obésité et du diabète chez le sujet adulte principalement.
Preuve de concept d’un modèle d’hématome cérébral chez le lapin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
30 lapins vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués sans reprendre conscience. Chacun reçoit une injection de collagénase dans le cerveau pour provoquer un hématome, sous une anesthésie pouvant durer près de sept heures, avant la mise à mort et le prélèvement du cerveau. Le porteur cherche à mettre au point un modèle d'hématome cérébral sur un "gros animal" et teste plusieurs doses, un même lapin pouvant recevoir deux injections s'il survit à la première. Il présente le recours aux lapins comme "indispensable" et le justifie par une anatomie vasculaire proche de celle de l'humain, adaptée aux appareils d'imagerie cliniques.
Objectifs
Les hématomes cérébraux font partie des AVC, et sont à l’origine d’une véritable problématique en thérapeutique humaine. Ces lésions sont de mauvais pronostic contrairement aux AVC ischémiques qui ont bénéficiés des progrès extraordinaires des techniques endovasculaires, notamment l’avènement de la thrombectomie mécanique. Dans le cas des AVC hémorragiques et des hématomes cérébraux, l’expansion ultérieure de l'hématome grève le pronostic clinique du patient, ce qui entraîne généralement une survie limitée, et des handicaps majeurs. Le projet consiste en la création d’un modèle d’hématome cérébral chez le lapin, à partir d’une injection percutanée de collagénase. Afin de déterminer la meilleure dose, différentes doses seront évaluées dans ce protocole. Étant donné qu’il n’existe actuellement aucun modèle sur le gros animal d’hématome cérébraux avec les caractéristiques des hématomes cérébraux de l’Homme, la possibilité d’utiliser un tel modèle pourrait permettre à l’avenir d’explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques et d’améliorer les existantes.
Bénéfices attendus
Fournir un modèle d’hématome cérébral chez le lapin via une injection percutanée de collagènase avec une dose validée permettant : • De servir de modèle pour les projets de recherche préclinique sur le traitement de ces hématomes • D’évaluer de nouvelles techniques diagnostiques (électrophysiologie)
Procédures
Chaque animal aura la procédure chirurgicale adaptée à son lot (injection par voie intracérébrale selon les doses et volumes préalablement définis) sous anesthésie générale (jusqu’ à 7 heures d’anesthésie environ).L’animal ne sera pas réveillé à son terme.
Impact sur les animaux
L’anxiété et le stress sont des effets indésirables possibles en amont de la procédure. L’étude portant sur des hématomes cérébraux, une atteinte fonctionnelle du cerveau et des douleurs pourraient survenir mais seront controlées par l’anesthésie générale. Les animaux étant sous anesthésie générale tout au long de la procédure, il n’est pas attendu de nuisances ou effets indésirables pendant la procédure.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les pièces anatomiques (cerveau) à des fins d’analyse en anatomopathologie.
Remplacement
Ce projet vise à concevoir un modèle d’hématome intracrânien chez le gros animal permettant la recherche pré clinique (diagnostique, thérapeutique). L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est indispensable.
Réduction
Une analyse intermédiaire après 5 lapins sera réalisée pour évaluer la cinétique et la reproductibilité. Si ces résultats sont homogènes et satisfaisants au sein des 5 lapins, l’étude sera arrêtée. Si cela est possible, un même lapin pourra avoir 2 interventions, une de chaque côté du cerveau si un décès ne s’est pas produit suite à la 1ère injection en fonction des résultats du scanner et de la tolérance clinique afin de diminuer le nombre de lapins.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d'acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie expérimentale, et leur première entrée en procédure. Leur environnement comportera un enrichissement (bûchettes à ronger...). Les animaux seront suivis quotidiennement et leur état de santé sera évalué tout au long de leur phase d’acclimation et préanesthésie. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pendant les procédures chirurgicales et seront suivis au cours de la procédure avant la mise à mort. L'atteinte d'un point limite conduirait à l'arrêt de l'expérimentation (mise à mort). Les points limites spécifiques au projet identifiés (liés à l'apparition d'un hématome intracranien) sont l'apparition de troubles respiratoires et/ou un engagement cérébral, visualisé au scanner.
Choix des espèces
Les modèles petits animaux (souris, rats) ne permettent pas d’utiliser les outils d'imagerie cliniquement disponibles en raison de leur petite taille et ne permettent pas le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques telles que le traitement par voie endovasculaire en raison de la limitation de la navigation distale des cathéters dans le réseau vasculaire. Le lapin possède une anatomie vasculaire intra crânienne se rapprochant de celle de l’Homme avec un polygone vasculaire à la différence du porc. Enfin, la taille des vaisseaux du lapin permet une navigation endovasculaire avec les micro-cathéters utilisés en neuroradiologie interventionnelle chez l’humain. Le poids des lapins New-Zealand adulte est supérieur à 3.5kg, soit autant qu'un nouveau-né, ce qui permet d'utiliser les appareils d'imagerie disponibles en clinique et d’évaluer des stratégies chirurgicales ou endovasculaires. Les animaux utilisés seront des adultes de plus de 3kg500 pour la taille des artères.
Ischémie-reperfusion hépatique : mécanismes et approches thérapeutiques.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va du modéré au sévère, 284 d'entre elles étant opérées sous anesthésie et tuées sans réveil. Une partie subit une ischémie du foie provoquée en ligaturant l'apport sanguin pendant soixante minutes après ouverture de l'abdomen, avant reperfusion puis mise à mort, d'autres une perfusion hépatique menée jusqu'au décès ou une péritonite provoquée. Le porteur ne mentionne comme atteinte qu'une douleur post-opératoire prise en charge, alors que 376 souris sont classées en gravité sévère. Il affirme qu'aucune méthode ne reproduit in vitro ce phénomène complexe et revendique le caractère "indispensable" du modèle murin pour les validations précliniques.
Objectifs
En Europe, la transplantation d’organe fait face à un manque de don. Les rares organes disponibles sont menacés par un phénomène appeler ischémie/reperfusion, auquel notamment le foie est très sensible. Le concept d’ischémie-reperfusion (IR) consiste en l’augmentation du dommage tissulaire induit par une carence temporaire en oxygène lorsque cet apport est restauré. Ce phénomène est rencontré très fréquemment dans les pathologies aiguës, et concerne notamment les défaillances circulatoires (états de choc), l’infarctus du myocarde, la transplantation d’organes et le clampage vasculaire au cours de la chirurgie hépatique. Dans toutes ces situations se développe une période plus ou moins prolongée d’ischémie. Bien que le traitement vise à restaurer dès que possible l’apport en oxygène, on sait aujourd’hui qu’une telle restauration engendre en elle-même une série de phénomènes dommageables, regroupés sous le terme générique de «lésion de reperfusion». Sur le plan physiopathologique, les lésions hépatiques d’IR sont caractérisées par un important infiltrat à polynucléaires neutrophiles (PNN) dans les zones de nécrose hépatocytaire. Ces neutrophiles migrent dans le foie sous l’effet de facteurs chimioattractants afin d’exercer sur le site de l’agression leurs fonctions de phagocytose et de défense antibactérienne. Dans le cas de l’IR, les neutrophiles vont avoir un effet délétère en étant responsables des lésions hépatiques. Notre équipe a récemment montré que NOD1, un récepteur des composés bactériens, était un régulateur intrinsèque indispensable aux fonctions de migration et de phagocytose du PNN. Afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques de l’IR hépatique nous allons explorer les mécanismes d’interaction hépatocytes/ neutrophiles dans les lésions d’IR.
Bénéfices attendus
En Europe, la transplantation d’organe fait face à un manque de don. Les rares organes disponibles sont menacés par un phénomène appelé ischémie/reperfusion, auquel notamment le foie est très sensible. Le concept d’ischémie-reperfusion (IR) consiste en l’augmentation du dommage tissulaire induit par une carence temporaire en oxygène lorsque cet apport est restauré. Ce phénomène est rencontré très fréquemment dans les pathologies aiguës, et concerne notamment les défaillances circulatoires (états de choc), l’infarctus du myocarde, la transplantation d’organes et le clampage vasculaire au cours de la chirurgie hépatique. Dans toutes ces situations se développe une période plus ou moins prolongée d’ischémie. Bien que le traitement vise à restaurer dès que possible l’apport en oxygène, on sait aujourd’hui qu’une telle restauration engendre en elle-même une série de phénomènes dommageables, regroupés sous le terme générique de «lésion de reperfusion». Pour faire face à ce problème majeur de santé publique, il est indispensable de mieux le comprendre. Cela nécessite de travailler à l’échelle d’un organisme et donc l’usage des modèles animaux. Afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques de l’IR hépatique nous allons explorer les mécanismes d’interaction hépatocytes/ neutrophiles dans les lésions d’IR. Cette étude nécessite des approches in vivo et ex vivo chez la souris. Elle nécessitera également des souris invalidées pour le gène NOD1. Des tests de puissance ont permis de calculer au plus juste le nombre d’animaux indispensable. Les cellules isolées de souris seront utilisées dans plusieurs expérimentations ex vivo afin d’optimiser leur utilisation. Si de nouveaux outils in vitro apparaissent, ils seront utilisés en remplacement des animaux.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d’interventions : 1-une perfusion hépatique : après anesthésie profonde, le foie est perfusé jusqu’à ce qu’il blanchisse (quelques minutes), puis les veines sus hépatiques, caves et l'aorte sont sectionnées pour permettre l’évacuation des effluents (Cela induit alors la mort de l’animal). A la fin de la perfusion, le foie est prélevé afin d'isoler les hépatocytes. Vingt-quatre et 48 heures avant la procédure, certains animaux pourront recevoir une injection de modulateurs de NOD1 ou d’un excipient. 2-une péritonite stérile est induite chez les animaux afin d’isoler les neutrophiles péritonéaux qui seront ensuite utilisés dans des expériences ex vivo. Les animaux sont mis à mort 18h après l’induction de la péritonite stérile. 3-une ischémie-reperfusion du foie. Après anesthésie, la peau de l'abdomen et le péritoine des animaux seront incisés sur 1 cm, le foie externalisé, les lobes médians et latéral gauche seront ligaturés afin d’arrêter l’apport sanguin. Au bout de 60 minutes, la ligature sera retirée puis le foie reperfusé sera replacé dans l'abdomen. 8h ou 18h après levée de la ligature, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse pour réaliser un prélèvement sanguin, puis directement mises à mort afin de prélever le foie pour analyses ultérieures. Vingt-quatre et 48 heures avant la procédure, certains animaux pourront recevoir une injection d’un activateur de la voie NOD1 ou d’un excipient.
Impact sur les animaux
La chirurgie est par essence à l’origine de douleurs post-opératoires qui seront prise en charge par un protocole de traitement anti-douleur adapté.
Devenir
Dans les 3 procédures décrites, tous les animaux seront mis à mort, et leurs organes seront prélevés en vue d'effectuer des analyses histoloiques, de biologie cellulaire et moléculaire.
Remplacement
L’ischémie-reperfusion est un phénomène complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires à l’échelle du tissu. Il n’existe pas de méthode capable de reproduire in vitro ce processus physiologique. Par ailleurs, les molécules qui seront injectées aux souris auront été préalablement testées in silico et in vitro. Seules les molécules les plus efficaces seront testées chez les animaux.
Réduction
Les effectifs sont calculés à partir de données de la littérature et de données personnelles.
Raffinement
Les procédures sont définies au mieux pour offrir le maximum de confiance dans les résultats générés dans le respect du bien-être des animaux en limitant la souffrance animale (Raffiner). Lors de la chirurgie, les animaux recevront une anesthésie/analgésie avant le début de la chirurgie. Un anesthésique sera appliqué localement. Les animaux recevront, après la chirurgie, une injection d’antalgique toutes les 12h. Les animaux seront par ailleurs observés durant 15 à 30 min après la chirurgie, puis au bout de 2h jusqu’au réveil complet. Dans tous les cas, les animaux ne sont pas maintenus en vie plus de 24h après chirurgie. En cas de signes de douleurs : poil hérissé, absence de mouvement, baisse significative de l'activité motrice et/ou une perte de poids supérieure ou égale à 15% de la masse corporelle, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le modèle d’ischémie hépatique chez les souris est très bien décrit dans la littérature et est indispensable aux validations pré cliniques de candidats médicaments. De plus, pour décortiquer les mécanismes à l’origine de ce phénomène nous aurons besoin de modèles génétiquement modifiés uniquement disponible chez la souris. Enfin, la souris est le plus petit mammifère dans l’échelle de l’évolution parmi les modèles animaux. Les animaux utilisés auront entre 7 et 14 semaines car c’est l’âge optimal pour un développement reproductible des phénomènes d’ischémie-reperfusion.
Mise au point de souris humanisées par du microbiote- EU2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la gravité déclarée s'étale du "sans réveil" au sévère, alors que le porteur qualifie l'ensemble des actes de "sévérité légère". Des reproductrices axéniques reçoivent un gavage de microbiote de patients obèses, puis les animaux passent une imagerie sous anesthésie sans réveil, un isolement de vingt-quatre heures sans enrichissement et des injections irritantes. Les reproducteurs devenus trop vieux et les descendants au mauvais microbiote sont tués par dislocation cervicale, les autres après imagerie ou tests comportementaux pour analyse du cerveau. Le modèle est présenté comme "unique" pour relier microbiote et déclin cognitif.
Objectifs
Créer des colonnies de souris "humanisées" avec du microbiote issus de patients obèses avec des fonctions cognitives faibles ou fortes afin de démontrer la causalité et d'identifier pour isoler les bactéries d'intérêt. Etudier le rôle du microbiote sur les performances cognitives et émotionnelles des souris et ainsi développer des nouvelles stratégies thérapeutiques visant à ralentir le déclin neurocognitif associé à l'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir un modèle unique et original de souris humanisées et stables, colonisées avec le microbiote de patients présentant un score faible ou élevé de fonction cognitive, qui peut être étudié sur plusieurs générations (F1, F2, F3) sans transplantation fécale sur les descendants. Ce modèle de souris axénique humanisé peut être utilisé pour identifier le rôle du microbiote dans la variation des fonctions physiologiques et physiopathologiques, et nous permettront l'étude de l'apparition des composantes cognitives similaires à l'être humain.
Procédures
Pour la procédure expérimentales 1, les souris reproductrices de deux lignées de souris axéniques, C57Bl/6J et Tg2576, recevront un gavage unique d'une solution de 200 ul. Pour la procédure 2, les souris seront, par une unique séance, mises dans l’imagerie non invasive qui est faite sous anesthésie pendant 2 heures. Pour la procédure 3, les souris doivent être isolées, sans aucun enrichissement pendant 24 heures. Dans la procédure 4, marquage des cellules progénitrices par injection intrapéritonéale peut être irritante.
Impact sur les animaux
Notre projet comporte des actes expérimentaux de sévérité légère. En effet la procédure1 consiste en 1/ un gavage unique avec du microbiote de patients obèses qui va coloniser le tube digestif des animaux, qui seront vigiles durant cet acte. Le geste est rapide, sans douleur, générant un stress léger du à la contention, 2/la collecte de fèces pour vérifier la colonisation de leur tubes digestifs, elle est sans douleur. La colonisation du tube digestif par un microbiote humain n’a pas à priori d’impact sur la santé des animaux dans la durée. Pour la procédure 2, des mesures de tissus adipeux seront fait par une technique d’imagerie non invasive (l’IRM) pour lesquels les animaux seront anesthésiés pour les immobiliser, ils ne seront pas réveillés avant leur mise à mort, évitant ainsi toute souffrance/stress. Pour la procédure 3, l'isolement durant 24h pour le phénotypage métabolique en temps réel. Le manque d'un enrichissement au quel les souris sont habituées (sopalin, donc elles ne peuvent pas faire un nid) et il n' y a pas de litière au fond des cages non plus, ce qui peut stresser la souris. Dans la procédure 4, marquage des cellules progénitrices par injection intrapéritonéale peut être irritante.
Devenir
Les reproducteurs devenus trop vieux (à l'âge de 6-8 mois), ainsi que les animaux de la descendance ne présentant pas le microbiote approprié seront mis à mort par dislocation cervicale. Il en va de même pour tout animal qui présenterait le moindre signe de souffrance. Les souris utilisées, pour la procédure 2, seront également euthanasiées à la fin de la séance d’IRM afin de prélever des tissus adipeux qui seront utilisés pour des analyses ex vivo (résonance magnétique nucléaire et lipidomique). Après tous les tests de comportement, les souris seront euthanasiées afin d'étudier l'anatomie du cerveau. Les associations entre les résultats anatomie des tissus et les fonctions cognitives ainsi que les états émotionnels seront évaluées pour comprendre comment l'anatomie du cerveau détermine leur fonction.
Remplacement
Notre étude vise à évaluer les effets de la transplantation de microbiote fécal humain sur les performances cognitives et émotionnelles de souris. Cela ne peut être fait que sur un modèle animal. Comme les animaux présentent un microbiote local, notre étude nécessite un modèle animal dans lequel ce microbiote résident est supprimé (c’est-à-dire, des souris axéniques). Celles-ci offrent la garantie de pouvoir étudier spécifiquement l’impact comportemental du microbiote transplanté. De tels modèles axéniques sont actuellement disponibles dans les espèces de souris. Nous proposons une approche unique et originale pour transplanter le microbiote fécal de patients obèses dans ce modèle de souris axéniques. Dans les études que nous réaliserons au laboratoire, nous serons amenés à tester ces souris axéniques transplantées et leur descendance pour lequel il a été montré une stabilisation du microbiote.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est réduit pour atteindre une valeur minimale sans nuire à la qualité statistique des données. En outre, les souris seront réutilisées pour plusieurs expériences. Par exemple, après l'isolement dans les cages métaboliques, les souris seront mis à mort et prélever les tissus adipeux et le foie pour le profilage du microbiote tissulaire, afin d'obtenir un maximum de données en utilisant un nombre minimum d'animaux.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans une structure et des conditions parfaitement adaptées (élevage en isolateur, litière changée régulièrement, eau et nourriture à volonté, température et hygrométrie régulée,...) avec une surveillance quotidienne, week-end et jours fériés inclus. Les animaux bénéficient également d’un enrichissement de leur milieux (type feuille de cellulose, permettant une diminution du stress potentiel et la réalisation de petits nids par les animaux). Enfin, la souffrance éventuelle des animaux sera minimisée autant que possible et nous interviendrons immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance.tout animal présentant un aspect inhabituel : prostration, pelage terne et hirsute, traces de blessures infligées par les autres animaux sera isolé. Il fera l'objet d'une attention accrue et benéficiera de soins appropriés (désinfection des plaies ou accès facilté à la nourriture si nécessaire).Si aucune amélioration de son état n'est constaté, il sera mis à mort le plus rapidement possible pour eviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Afin d'étudier l'effet du microbiote, un modèle axénique sera nécessaire pour éviter les effets de la flore locale de l'animal hôte. Les espèces de souris axéniques sont actuellement disponibles. En plus, les modèles de souris sont des modèles bien adaptés à la recherche en neurosciences comportementales, car ils présentent une variété de comportements pertinents pour les maladies humaines. - Pour les souris de production, afin de générer la ligne de la souris, les animaux seront utilisés à l'âge adulte (2-8 mois) car il faut qu'ils aient atteints la maturité sexuelle pour permettre la reproduction. - Pour les souris en experimentation des souris adultes (6-18 mois) seront utilisées pour caractériser les phénotypes des souris dans ce projet et étudier leur évolution au cours du vieillissement.
Identifier les déterminants physiologiques de maladie (obésité, diabète…) par l’analyse non-invasive des paramètres métaboliques chez le petit animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 48
252 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré du "sans réveil" au léger, une partie réutilisée pour d'autres études et le reste tué pour prélèvement d'organes. Les animaux passent par une plateforme de mesure métabolique non invasive, avec un isolement individuel d'environ deux semaines présenté comme la seule contrainte. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable et estime qu'un quart environ des animaux est tué dans son établissement. Le dispositif sert des collaborations extérieures, le devenir de chaque animal dépendant de l'équipe qui le récupère.
Objectifs
Le but est d'étudier au niveau préclinique le métabolisme énergétique des souris ou rats par un outil non-invasif et complètement automatisé. Pour cela, la plateforme d’Exploration Physiologique Fonctionnelle (EPF) est composée de 12 cages et permet la mesure en temps réel et pour chaque souris ou rats : - la prise alimentaire et hydrique - la mesure de la consommation d’oxygène - la production de dioxyde de carbone - la mesure du quotient respiratoire (indicatif de la nature du métabolisme glycolytique ou oxydatif) - la dépense énergétique globale de l’animal - l’activité spontanée et la mesure fine des déplacements dans les 3 dimensions spatiales (X, Y, Z). La plateforme EPF permet aussi l’analyse non-invasive de la composition corporelle des souris et rats par un scanner à résonance magnétique. Ce système ne requiert pas d’anesthésie et permet de déterminer la masse maigre, la masse grasse, les fluides corporels et la composition totale en eau sur des souris et rats.
Bénéfices attendus
Cette étude s'inscrit dans le cadre de collaborations qui auront été préalablement validées par des comités éthique locaux aux équipes voulant collaborer avec nous pour connaitre les comportements métaboliques et cela sans douleur et en limitant le stress des animaux.
Procédures
Aucune intervention n'est effectuée, il s'agit d'une procédure non invasive de mesure de calorimétrie indirecte.
Impact sur les animaux
Cette lecture métabolique est non-invasive et nécessite un isolement de 2 semaines au total avant d'être regroupé. Nous n'attendons aucun effet indésirable sur les animaux, ceux-ci ont de la nourriture et de l'eau à disposition comme dans une cage d'hébergement classique, la seule contrainte étant l'isolement de l'animal obligatoire pour les prises de mesure. Chaques études collaboratives (21 par an) sont réalisées sur 12 souris ou rats.
Devenir
En fonction des collaborations, les animaux seront récupérés dans le cadre des collaborations et mis directement à mort pour prélèvements d'organes. Nous pouvons estimer que 25% des animaux sont mis à mort dans notre EU.
Remplacement
Dans le cadre des projets de collaborations nous devrons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour nos études nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux (activité, prise alimentaire et hydrique) et de métabolique . De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus.
Raffinement
Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs / le stress dans la procédure. Cette procédure est non invasive et ne provoquent normalement aucun effet indésirable sur les animaux.
Choix des espèces
Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur. Les animaux doivent être âgées au minimum de 10 semaines lorsque toutes les structures cérébrales et le métabolisme soient stabilisés.
Impact de la cryothérapie sur l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique
- Recherche appliquée
- Cancers
8 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, deux étant opérés sous anesthésie sans réveil. Les six autres subissent une chirurgie cérébrale d'une heure puis des IRM hebdomadaires sous anesthésie de deux heures pendant six à huit mois, pour suivre l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique après cryothérapie. Le porteur signale des effets liés aux anesthésies répétées et à la chirurgie du cerveau, œdème cérébral, déficit moteur, vomissements et céphalées, avant mise à mort pour analyser les tissus. Il justifie le recours au porc par un cerveau proche de celui des primates et présente ce modèle comme préparant un "transfert rapide" vers un essai clinique.
Objectifs
Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale maligne primitive la plus fréquente et est extrêmement agressif. Actuellement, le traitement de référence est une chirurgie pour enlever la zone tumorale si elle est accessible, accompagnée par une radiothérapie puis une chimiothérapie. Malgré un traitement bien conduit, tous les patients présentent une récidive tumorale locale ou régionale. Forts d’une première étude ayant démontré un gain important dans la survie des patients traités par cryothérapie, nous souhaitons affiner la compréhension des mécanismes en jeu et plus spécifiquement, l’impact de la cryothérapie sur la barrière hémato-encéphalique (BHE), véritable muraille protégeant le cerveau mais bloquant l’arrivée des molécules thérapeutiques. En effet, lors de notre étude clinique, la BHE des patients s’est révélée fragilisée. Or, l’ouverture de la BHE représente un facteur important d’amélioration du pronostic des patients en permettant l’arrivée des médicaments dans le cerveau et donc aux cellules tumorales. Dans ce contexte, notre objectif consiste tout d’abord à confirmer cette ouverture de la BHE par la cryothérapie cérébrale sur un modèle porcin, puis, dans un second temps, de déterminer le délai d’ouverture de la BHE qui offrirait une fenêtre thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de valider et déterminer la durée de l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique suite à une cryothérapie, offrant une fenêtre thérapeutique pour l’administration de chimiothérapies dans le traitement de tumeurs cérébrales. Le protocole défini pour ce projet se rapproche au maximum des conditions chez le patient, aussi bien pour la chirurgie que pour le suivi mini-invasif utilisant l’IRM, préparant un transfert rapide vers un essai clinique. Ainsi, une étude clinique prospective rentrant dans le cadre d’un programme hospitalier de recherche clinique (PHRC) pourrait ensuite être réalisée afin d’évaluer l’efficacité de la cryothérapie cérébrale sous IRM combinée à un traitement adjuvant chez des patients atteints d’une récidive de glioblastome.
Procédures
Les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale initiale d’une heure sous anesthésie générale, puis à des examens IRM hebdomadaires sous anesthésie de deux heures pour suivre sur 6 à 8 mois le statut de la barrière hémato-encéphalique.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant survenir sont liés aux anesthésies répétées (stress, nausées, désorientation, hypothermie, irritation trachéale) et à la chirurgie cérébrale (inflammation de la plaie, œdème cérébral, déficit moteur controlatéral, vomissements et céphalées).
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour l'analyse des tissus cérébraux qui complètera les données IRM sur l'état de la barrière hémato-encéphalique.
Remplacement
Ce projet fait suite à une étude clinique démontrant le fort intérêt thérapeutique d’utiliser ce traitement innovant chez des patients atteints de glioblastome en récidive. Le but étant la validation de l’ouverture de la BHE par la cryothérapie, nous devons travailler dans un tissu vivant sain afin de soustraire tout effet de la pathologie sur l’intégrité de la BHE. Par conséquence, nous ne pouvons éviter à ce jour l’utilisation d’un modèle animal. Préalablement aux études in vivo, la mise au point de la chirurgie est validée sur cadavre de porc afin d'adapter le protocole aux variations anatomiques et de réduire à moins de 2 cm l'ouverture nécessaire pour l'insertion de la sonde de cryoablation.
Réduction
Il s'agit d'une preuve de concept. Le nombre d’animaux ainsi que leur répartition entre les procédures ont été estimés au plus juste pour répondre à notre problématique. Le protocole d’une procédure dépendra du résultat de la précédente. L’usage de l’IRM, méthode non invasive et non irradiante utilisée en clinique pour observer l’intégrité de la BHE nous permettra de suivre un même animal au cours du temps et ainsi de limiter les effectifs requis.
Raffinement
Les porcs sont hébergés en groupe sociaux dans de larges box enrichis de jeux à mâcher et de balles, ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques. Les conditions d’ambiance sont contrôlées et la température est maintenue entre 18 et 24°C. Une période d’acclimatation permet aux animaux de s’habituer à leur environnement et au personnel soignant qui met en place un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses. Le jour de l’intervention, les porcs sont tranquillisés pour être transportés sans stress dans la salle d’opération, ils sont maintenus sous anesthésie générale avec gestion de la douleur pendant la chirurgie et l’acquisition d’images IRM. Suite à la chirurgie, les animaux sont étroitement surveillés jusqu’à leur réveil et tous les jours suivant l’intervention. Une grille d’évaluation de la douleur est établie avec la conduite à tenir en cas de complications. Une videosurveillance 24h/24 permet un suivi visuel des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie. Des points limites sont définis pour détecter les signes précoces d’une détérioration et arrêter la procédure en cas de souffrance.
Choix des espèces
Le cerveau circonvolutionné du porc ressemble davantage au cerveau des primates que le cerveau lissencéphale (cortex lisse, sans circonvolutions) des rongeurs, et la littérature rapporte le modèle porcin comme pertinent dans de nombreuses approches en neurosciences notamment dans l’étude de la BHE. L’accès à un modèle de grande taille est nécessaire pour reproduire la cryothérapie chez le patient. Le volume et l’anatomie du cerveau de jeunes porcs de 30 à 50 Kg répondent à cette limitation et permettent d’envisager la survie l’animal dans de bonnes conditions.
Evaluation de l’utilisation du sérum physiologique pour l’imagerie endocoronaire en tomographie par cohérence optique (OCT).
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
14 porcs vont être utilisés dans une intervention de deux heures menée sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit une ponction artérielle puis un cathétérisme des artères coronaires droite et gauche pour des coronarographies répétées, afin de comparer la qualité d'image obtenue au sérum physiologique et au produit de contraste. Le cœur est ensuite prélevé pour examiner l'endothélium des coronaires. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne peut servir et présente le recours au "gros animal" comme "nécessaire" pour transposer les résultats à l'humain.
Objectifs
Les images obtenues par l’OCT (Tomographie par Cohérence Optique) offrent une résolution supérieure à l’IVUS (IntraVascular UltraSound) lors de la mise en place des stents coronaires. L’utilisation de l’OCT nécessite l’administration d’un produit de contraste ce qui augmente les risques d’insuffisance rénale et contre indique donc son utilisation chez les patients présentant une insuffisance rénale chronique. Le sérum physiologique (NaCl 0.9%) a déjà été utilisé à la place du produit de contraste avec des résultats insatisfaisants en raison d’une mauvaise qualité d’image par rapport au protocole d’imagerie utilisant un produit de contraste, cependant ill n’existe à ce jour aucun protocole validé d’imagerie coronaire par OCT utilisant exclusivement du sérum physiologique. L’objectif de notre étude est de définir le meilleur débit d’injection du sérum physiologique permettant d’obtenir une qualité d’imagerie coronaire similaire à celle obtenues avec l’administration d’un produit de contraste.
Bénéfices attendus
L’utilisation du sérum physiologique à la place du produit de contraste pourrait réduire le risque d’insuffisance rénale post-OCT dans les procédures de coronographie. L’OCT avec sérum physiologique pourrait ainsi être utilisée chez les patients avec insuffisance rénale pré-existante. Il est nécessaire de trouver le débit optimal d’administration de sérum physiologique qui s’associe à une qualité du signal satisfaisante pour que l’imagerie coronaire soit interprétable.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention de 120 minutes, réalisée sous anesthésie générale, consistant en la réalisation d'une ponction artérielle suivi d'un cathétérisme des coronaires droite et gauche pour la réalisation de plusieurs coronarographies successives, à l'issue de laquelle les animaux ne seront pas réveillés. Il n'y a aucune intervention prévue sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La seule nuisance sera l'injection intra musculaire permettant d’obtenir une sédation vigile et une tranquiliation avant de réaliser l'anesthésie générale. L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. S'agissant de procédures expérimentales sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure. Pas d’effets spécifiques connus à l'utilisation de l'OCT dans l’expérience humaine en dehors de ceux inhérents au cathétérisme des coronaires (dissection, spasme coronarien, fibrillation non resorbable ou thrombose).
Devenir
La finalité de l'étude est de comparer la qualité d'imagerie des coronaires lorsque l'on utilise un produit de contraste iodé (PCI) ou avec l'utilisation de sérum physiologique. Afin de vérifier l'absence de lésion coronaire liée au débit d'injection de contraste iodé ou de sérum physiologique, les coeurs seront explantés pour prélever les coronaires et réaliser une étude histologique de l'endothélium.
Remplacement
Il n’existe pas, à notre connaissance, de modèle expérimental in silico ou in vitro pouvant servir à étudier et évaluer la qualité de la visualisation de la circulation coronaire en condition physiologique. L’impact des structures anatomiques (peau, muscle, os) et des caractéristiques hémodynamiques de la circulation coronaire, la rhéologie du sang et de son interaction avec le produit de contraste iodé ou le sérum physiologique sur la qualité d'imagerie des coronaires ne peuvent être étudiés que sur un modèle animal (pas d’alternative in silico ou in vitro). Il est donc nécessaire dans notre approche d’utiliser un réseau coronaire d'un système vivant. Par ailleurs seul un modèle sur le gros animal permet d’extrapoler facilement les résultats à l’homme, dont le système cardiovasculaire est proche sur le plan anatomique et physiologique. Il n’existe pas de sonde endocoronaire d’OCT adaptée pour les petits animaux.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, deux animaux seront utilisés à la phase préliminaire afin de déterminer le protocole d’acquisition des images coronarographiques qui sera ensuite appliqué (incidence des acquisitions, dose irradiée, quantité d’agent de contraste). Le nombre d’animaux pour l'étude sera fixé à 10 afin de pouvoir réaliser des tests de comparaison statistique entre les résultats obtenus pour les coronaires droite et gauche. Nous utiliserons des modèles d’analyse de la variance pour nos analyses statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux, chaque animal sera son propre témoin, en réalisant une première imagerie coronarographique OCT à l'aide d'un produit de contraste iodé puis trois séries d'imageries coronarographiques avec des débits différents de NaCl . Au total un maximum de 14 animaux (2 animaux pour la phase test + 1 groupe de 10 aniamux + 2 animaux en cas d'échec d'une procédure) seront utilisés pour cette étude. Si les résultats des deux animaux préliminaires sont comparables à ceux obtenus dans le groupe test, ceux-ci seront inclus dans l'étude. Dès que le nombre de 10 animaux interprétable sera atteint, les inclusions seront stoppées.
Raffinement
Période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche. Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères. Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention). L'environnement est enrichi (activité de fouissement encouragée, medecine ball, jeux dans le couloir, pesée sousforme de jeux avec récompense, planche à gratter, distributeur d’aliment). Contrôle quotidien par un animalier. Lors de ce contrôle, des observations basées sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales attendues aux stimuli externes (peu enclins aux manipulations, tentative de fuite) seront réalisées. Ces contrôles permettront de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées (Annexes 2-3). Réalisation des ponctions vasculaires percutanées échoguidées (Vivid E9, General Eletric, Milwaukee, Wis, USA) artérielles et veineuses, pour mise en place des cathéters de surveillance hémodynamique continue : moins de souffrance, moins de saignement et risque infectieux réduit.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le porc. Le porc présente une physiologie circulatoire proche de celle de l’homme (Fréquence cardiaque proche de 100/min, débit cardiaque entre 3,5 et 4 L/min pour un poids de 50 kg). Par ailleurs son anatomie cardiovasculaire facilite la réalisation de la coronarographie et des canulations artérielle et veineuse nécessaires pour la procédure. Cette convergence permet une adaptation optimale de l’espèce aux expérimentations et limitera au minimum le nombre d’animaux tests (échec techniques). Le porc permet donc de réaliser une modélisation chirurgicale et expérimentale de haute fidélité pour une meilleure applicabilité des résultats à la pratique clinique. Les animaux de ce protocole sont des porcs de 50kg (environ 90 jours) afin d’avoir un gabarit proche de celui d’un homme. A ce stade, ils ont une anatomie coronarienne semblable à l’Homme et les accès vasculaires périphériques artériels et veineux sont favorables à la réalisation du cathéterisme coronaire nécessaire pour l’OCT.
Validation des effets bénéfiques d’ILV01, un composant du sécrétome musculaire, sur la greffe d’îlots pancréatiques.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 167 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie subissant des prélèvements sous anesthésie sans réveil. Un diabète est induit par injection, des cellules pancréatiques sont prélevées chirurgicalement puis réimplantées dans le foie, et chaque animal subit jusqu'à 148 mesures de glycémie, 84 injections d'insuline, 84 injections du traitement testé et 22 prises de sang. Le porteur décrit des douleurs post-opératoires, des nécroses de la queue et des hémorragies liées aux prélèvements répétés. Le projet teste une myokine pour réduire le nombre de pancréas nécessaires à une greffe d'îlots, étape présentée comme 'indispensable' avant la clinique.
Objectifs
Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune induisant une destruction des cellules β pancréatique (sécrétant l’insuline) et une hyperglycémie. L'une des thérapeutiques proposées pour les patients DT1 est l'injection dans le foie d'îlots pancréatiques. En effet, la greffe d'îlots est une approche prometteuse permettant une quasi-normalisation du contrôle glycémique, qui prévient des évènements hypoglycémiques sévères et qui améliore significativement la qualité de vie du patient DT1. Cependant, cette thérapie se heurte à de nombreux obstacles qui la rende encore difficilement proposable à un grand nombre de patients diabétiques. En effet, durant toute la procédure de greffe, c’est-à-dire du donneur de pancréas, à l’isolement des îlots pancréatiques et jusqu’à la période post transplantation, la quantité d’îlots fonctionnelle ne cesse de diminuer. Cette perte peut s’expliquer par l’induction de mécanismes de mort cellulaire, de la perte de fonction des îlots tout au long des étapes de la greffe, par les réactions inflammatoires, par les réactions de rejets et par la trop longue période de revascularisation des îlots post greffe. Il en résulte qu'en moyenne 4 pancréas sont nécessaires pour greffer un patient et améliorer sa régulation glycémique. Ainsi, il est important de développer de nouvelles stratégies pour améliorer cette approche thérapeutique et réduire ce trop grand nombre de pancréas à utiliser afin de la proposer à un plus grand nombre de patients DT1. Dans cet optique, nous nous sommes intéressés aux myokines, qui sont des molécules sécrétées par le muscle et régulées par l’exercice physique. Parmi celle-ci, nous avons identifié ILV01. Lors d'une étude précédente, nous avons montré que cette myokine représentait un candidat d’intérêt pour améliorer l’efficacité de la greffe d’îlots car, in vitro, elle améliore la survie et la fonction des îlots pancréatiques (Rat et humain) et in vivo (Rat), elle améliore la fonction du greffon, elle permet une prise rapide et durable dans le temps de la greffe. Ainsi pour la suite du projet, nous souhaitons, dans un premier temps, déterminer si ILV01 permet de diminuer la quantité d’îlots à greffer pour réverser le diabète. Dans un second temps, en fonction des données obtenues lors de l’étape précédente, nous souhaitons valider in vivo ILV01 dans le cadre d’une greffe d’îlots humain chez le Rat immunodéficient. Enfin, ce projet est indispensable avant de passer en essai clinique.
Bénéfices attendus
La transplantation d'îlots est un traitement prometteur pour le diabète de type 1 car elle assure la stabilisation du métabolisme du glucose, une diminution significative des épisodes hypoglycémiques sévères, la normalisation des niveaux d'hémoglobine glyquée et permet de retarder ou d’atténuer les complications du diabète. Par ailleurs, cette approche thérapeutique est déjà approuvée et remboursable via divers systèmes nationaux de santé dans plusieurs pays, dont le Canada, l'Australie, le Royaume-Uni, la Suisse, l'Italie et la France. Néanmoins, actuellement, en moyenne 4 pancréas sont nécessaires pour réverser le diabète dû à la grande perte de la masse fonctionnelle d'îlots au cours des différentes étapes du processus de la greffe. Au vue de la grande pénurie d'organe, cette approche est encore difficilement proposable à tous les patients diabétiques nécessitant un greffe (raison vitale). Nos premières études in vitro et in vivo ont démontré qu’ILV01 améliorait considérablement la survie et la fonction des îlots chez le rat. Ce nouveau projet a tout d'abord pour objectif de déterminer si le traitement avec ILV01 permet de réduire la quantité d'îlots à injecter pour normaliser la glycémie du rat diabétique. Au vu de nos premiers résultats, nous supposons qu'avec notre traitement nous pourrions transplanter plus de patient que ce qui est possible aujourd'hui et ce projet pourra répondre à cette hypothèse. Par ailleurs, cette étude permettra de valider in vivo l'efficacité de notre ILV01 sur les îlots humain grâce à un modèle de rat immunodéficient. Enfin, ce projet sera le tremplin vers une étude clinique.
Procédures
Le diabète sera induit par injection pharmacologique réalisée sur animal vigile (1 injection/animal, durée une minute). Les cellules pancréatiques seront prélevées par approche chirurgicale sous anesthésie/analgésie profonde sans réveil (durée 5 minutes) et seront ensuite réimplantés 24h plus tard dans le foie par approche chirurgicale sous anesthésie et analgésie profonde (durée 10 minutes par animal). Tout au long de l’étude, la glycémie sera mesurée sur animal vigile à l’aide d’un glucomètre (durée de quelques secondes) afin d’évaluer l’efficacité de la greffe (148 fois/animal). Une partie de l’évaluation de l’efficacité de la greffe nécessitera de réaliser une injection de glucose aux animaux (8 injections/animal sur 84 jours, durée 1 minute). De plus, les animaux recevront au maximum 84 injections d’insulines si la glycémie reste élevée après greffe (durée 1 minute). Par ailleurs, 296 animaux de l’étude recevront en plus de ce qui est décrit ci-avant 1 injection quotidienne de notre traitement soit 84 injections/animal (durée 1 minute). Enfin, afin d’évaluer l’efficacité de notre traitement sur la greffe, 22 prélèvements sanguins seront réalisées par animal sur l’ensemble de l’étude (sous anesthésie locale, 2 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids lié au développement du diabète. - Stress lié aux injections quotidiennes de notre traitement et d'insuline. - Douleurs post-opératoires à la suite des chirurgies (laparotomie puis injection intraportale d'îlots pancréatiques). - Risque d’infection post-greffe. - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude. - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. - Hémorragie post section de la queue. - Inflammation au point d’injection due aux injections répétées. - Répétition des interventions durant toute la durée de l’étude (Mesures de glycémie, injections, prises de sang). - Périodes de mise à jeun.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.
Remplacement
Nous souhaitons valider notre traitement sur la fonction d'une greffe d'îlots pancréatique chez un sujet diabétique. Or, la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’étudier la fonction d'un greffon d'îlots, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à la cellule à insuline isolé mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent. Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Le nombre d’animaux nécessaire pour la réalisation des groupes que nous avons indiqué correspond au nombre nécessaire d’animaux à utiliser afin d’obtenir des résultats statistiques. De plus, ce nombre est basé sur les différences interindividuelles des animaux et des préparations d’îlots humains que nous isolerons mais aussi sur notre longue expérience obtenue au cours des nombreuses études métaboliques réalisées sur des rats rendus diabétiques dans le cadre de transplantation d’îlots pancréatiques. Cette étude nécessitera 1167 rats.
Raffinement
Le raffinement intervient au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Concernant les animaux immunodéficients, ceux-ci seront hébergés en cage ventilée. Par ailleurs, la litière, les cages, les éléments d’enrichissement seront stérilisés avant utilisation. De même, il sera utilisé de la nourriture irradiée et de l’eau filtrée. Toute intervention sur ces animaux sera réalisée sous hotte stérile (changes et expérimentations), avec du matériel stérile et une surveillance augmentée par rapport à des animaux standards sera effectuée (au moins 2 fois par jour). Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés voir la mise à mort en cas d’atteinte de points limites. En accord avec cette grille, des points limites prédictifs ont été déterminé afin de soustraire les animaux aux procédures expérimentales en cours d’étude. Les actes chirurgicaux et les prélèvements terminaux seront réalisés sous anesthésie analgésie profonde. De plus, la chirurgie et les tests d’évaluation d’efficacité de notre traitement, ne seront effectués que 2h après avoir placé les animaux dans la salle où aura lieu l’expérimentation, afin de diminuer le stress. Enfin, tout acte sur l’animal sera réalisé par du personnel expérimenté afin de réduire au maximum la durée des interventions et le stress des animaux.
Choix des espèces
Le Rat est la principale espèce utilisée dans de nombreuses études sur le diabète et la transplantation d’îlots pancréatiques. En effet, les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme. De plus, les rats ont été préférés aux souris à cause de leur taille permettant une aisance de manipulations et facilite les interventions chirurgicales. Les rats pour cette étude seront âgés de 8 semaines, coïncidant avec un poids d'environ 200g. Poids idéal pour le prélèvement des pancréas, la réalisation des chirurgies et de nos tests d’évaluation d’efficacité de notre traitement.
Impact de modes de ventilation mécanique innovants sur la fonction pulmonaire régionale imagée en scanner spectral au cours du syndrome de détresse respiratoire expérimental chez le lapin
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
14 lapins vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque procédure dure 2 h 30 et comprend une préparation chirurgicale puis l'induction d'un syndrome de détresse respiratoire aiguë, avec une hypoxémie profonde comparable à celle des patients de réanimation. Le porteur affirme que le ressenti de cette hypoxémie est 'nul' sous sédation et que le réveil ne serait pas justifiable. L'étude teste un mode de ventilation mécanique suivi par imagerie scanner, présenté comme une étape 'indispensable' avant un essai clinique.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’investiguer si la ventilation oscillatoire multifréquence (MFOV) permet d’assurer une ventilation et la perfusion pulmonaires adéquates et d’en déterminer les paramètres de réglage optimaux, dans un modèle expérimental de syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) que nous avons mis au point chez le lapin et le porc représentant un poumon d’adulte. Les connaissances issues de ces expérimentations ont une importance pour le patient car elles permettront de proposer un mode de ventilation mécanique pour prévenir les lésions pulmonaires induites en anesthésie générale ou en réanimation.
Bénéfices attendus
Les données de cette étude permettront d’établir une preuve de concept et d’optimiser les paramètres de réglage de MFOV permettant d’obtenir le meilleur rapport entre surdistension et recrutement pulmonaire d’une part et d’autre part la ventilation et la perfusion. Cette preuve de concept et validation est une étape indispensable avant un essai clinique chez le patient atteint de SDRA. La recherche de nouveaux modes ventilatoires protecteurs tels que le MFOV est nécessaire étant donné que la mortalité chez les patients atteint d’un SDRA et nécessitant une ventilation mécanique reste élevée et que la lésion pulmonaire induite par la ventilation mécanique (Ventilator-Induced Lung Injury ; VILI) est reconnu comme étant une des causes de cette mortalité.
Procédures
Une procédure est prévue sur lapin. Cette procédures se fait sur des animaux sous anesthésie générale, sans réveil. La procédure complète à une durée de 2h30 qui comprendr l'anesthésie, la préparation chirurgicale, des mesures à l'état basal et l'induction de syndrôme de détresse respiratoire aigue.
Impact sur les animaux
Ce protocole comporte une procédure sans réveil. Les animaux seront placés sous anesthésie générale profonde, comprenant entre autres une analgésie puissante, comparable à celle utilisé chez l’homme pour les chirurgies lourdes, maintenue durant toute la durée du protocole. Les effets néfastes du SDRA expérimental sont une hypoxémie profonde, comparable à celle observée chez les patients de réanimation avec SDRA. Le ressenti de l’hypoxémie est nul sous ces régimes de sédations. A la fin du protocole, ils seront euthanasiés par surdosage des drogues anesthésiques.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Le réveil en condition de SDRA n'est pas justifiable expérimentalement compte tenu des objectifs de l'étude et de la souffrance potentiellement engendrée lors du réveil.
Remplacement
Un modèle animal doit être utilisé car il n’est pas possible de valider la technique chez l’homme, le nombre de scanner requis étant responsable d’une irradiation qui serait inacceptable pour les patients. De plus, il est très difficilement envisageable de déplacer un patient de réanimation dans un scanner spectral sans le mettre en danger, en particulier si celui-est dans un état sévère. Il n’existe pas à ce jour d’alternative non humaine, non animale pour simuler un SDRA.
Réduction
A l’aide de données précédemment obtenues, nous avons réalisé un calcul de puissance afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires à la recherche, en prévoyant d’utiliser une analyse de variance à mesures répétées, ou un test de Kruskal-Wallis, selon la normalité de la distribution des données. La réalisation de mesures répétées chez un même animal permet de diviser par 2 le nombre d’animaux requis.
Raffinement
L’utilisation d’animaux vivants permet l’étude dynamique et cinétique de la ventilation mécanique et la respiration en tant que phénomène physiologique. Elle permet de reproduire expérimentalement de façon assez crédible le SDRA observé chez l’homme. L’utilisation d’animaux permet des mesures scannographiques répétées, inenvisageable chez l’homme du fait de l’exposition aux rayons X, et une quantification en imagerie TEP difficilement réalisable chez un patient de réanimation.
Choix des espèces
L’utilisation d’animaux vivants permet l’étude dynamique et cinétique de la ventilation mécanique et la respiration en tant que phénomène physiologique. Elle permet de reproduire expérimentalement de façon assez crédible le SDRA observé chez l’homme. L’utilisation d’animaux permet des mesures scannographiques répétées, inenvisageable chez l’homme du fait de l’exposition aux rayons X, et une quantification en imagerie TEP difficilement réalisable chez un patient de réanimation.
Perfusion in situ de foie de rat adulte à la collagénase
- Enseignement supérieur
30 rats vont être utilisés dans des travaux pratiques menés sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil par dislocation cervicale. Chacun subit une intervention de moins de deux heures, incision de l'abdomen et pose d'une canule dans la veine porte, non pour produire des connaissances mais pour que des étudiants s'entraînent à prélever un foie et en cultiver les cellules. Le porteur décrit un risque d'hémorragie et de détresse respiratoire pendant les gestes, et prévoit quatre rats par an plus deux de secours en cas d'échec de la canulation. Sur le remplacement, il affirme que la réalisation de cultures primaires impose de tuer un rat pour prélever son foie, sans mentionner d'alternative par don de tissus.
Objectifs
Le Bachelor Universitaire de Technologie Génie Biologique parcours Biologie médicale et Biotechnologie prépare en 6 semestres des techniciens supérieurs ou des assistants ingénieurs polyvalents dans le domaine de la santé humaine et du bien-être, de la santé animale, ainsi que dans celui des biotechnologies. Qu'il exerce dans un laboratoire ou dans une entreprise, le titulaire de ce diplôme possède les compétences techniques requises pour réaliser des examens ou des analyses biologiques, physico-chimiques ou biochimiques, effectuer des tests de contrôle des produits et intervenir en expérimentation animale in vivo et in vitro. Dans le cadre de la formation, une des « compétences ciblées » porte sur les études à l'échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé. Parmi les apprentissages critiques, des techniques alternatives et complémentaires à l'expérimentation animale sont mises en œuvre. Les effets de molécules toxiques sont mesurés. Dans le cadre de travaux pratiques du Bachelor Universitaire de Technologie Génie Biologique parcours Biologie Médicale et Biotechnologie, l'objectif est d'établir des cultures primaires d'hépatocytes obtenues en perfusant le foie du rat adulte à la collagénase (enzyme de dissociation tissulaire) in vivo. Ces cultures primaires sont largement utilisées pour les études toxicologiques et métaboliques et sont normalisées. Ce projet va permettre aux futurs actifs de mettre en place des cultures primaires d'hépatocytes afin de tester la cytotoxicité de molécules à différentes concentrations in vitro. Les hépatocytes sont isolés directement du foie de rat et sont ainsi utilisés comme modèles de l'état physiologique in vivo. Des lignées cellulaires immortelles de foie existe mais sont moins représentatives de cellule hépatique normale in vivo.
Bénéfices attendus
La formation professionnelle dispensée aux étudiants leur permet d'appréhender la réglementation relative à l'expérimentation animale et les techniques de dissociation tissulaire et de pouvoir établir ainsi une culture primaire de cellules in vitro.
Procédures
Dans la procédure, les rats sont soumis à une intervention de moins de 2 heures sous anesthésie générale avec antalgie préalable au moins 30 minutes avant de réaliser l'anesthésique. Une incision de la peau de la patte arrière droite puis une injection d'héparine dans la veine fémorale sont effectuées (1 minute). Une incision de la peau et des plans musculaires de l'abdomen est réalisée (quelques minutes). La veine porte est canulée (quelques minutes). A l'issue de la procédure, les animaux sont mis à mort réglementairement (dislocation des cervicales).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1- Le stress généré lors de la contention de l'animal au moment des injections de l'antalgie puis de l'anesthésie, durée une minute, de gravité légère. 2-Une hémorragie massive si la veine porte est sectionnée durant les gestes réalisés, durée de moins d’une minute et de gravité modérée. 3-Le stress lié à la détresse respiratoire malgré la trachéotomie, durée une minute et de gravité modérée.
Devenir
Après la perfusion le rat ne peut pas survivre. Par conséquent, à l'issue de la procédure, l'animal est mis à mort par dislocation des cervicales.
Remplacement
L'objectif de la séance de travaux pratiques est de réaliser des cultures primaire à partir de foie ; cela nécessite de mettre à mort un rat pour prélever son foie. L'utilisation d'animaux ne peut être substituée pour générer ces cultures.
Réduction
L'équipe enseignante est consciente de la nécessité de limiter le nombre d'animaux utilisés et s'efforce d'adapter le protocole dans cet optique. Nous avons mis en place les mesures suivantes permettant la réduction du nombre d'animaux : - Quatre rats sont utilisés par an (1rat par groupe de travaux pratiques de 14 étudiants) et deux rats supplémentaires par an sont prévus au cas où la canulation de la veine porte échoue. Dans environ 50 % des groupes de travaux pratiques, le rat supplémentaire est utilisé. Ce projet n'a pas pour objet d'études statistiques.
Raffinement
La raffinement est mis en place dans la pratique de l'antalgie et de l'anesthésie, nos procédures expérimentales étant sans réveil. 30 minutes avant la séance de travaux pratiques, chaque rat est analgésié puis anesthésié par le personnel habilté dans la pièce réservée aux anesthésies. Au cours de la procédure, les étudiants suivent la grille d'évaluation du suivi d'anesthésie et appellent l'enseignant dès qu'un signe de réveil apparait. L'enseignant évaluera la situation et mettra en place les gestes adéquats (réinjections ou mise à mort).
Choix des espèces
Le projet se propose d'utiliser le rat, modèle d'utilisation standardisée, dans les domaines de la recherche et du diagnostic. Les rats sont couramment utilisés pour des études en physiologie et pharmacologie. Le protocole (débit de perfusion et concentration enzymatique) a été élaboré pour des rats adultes d'environ 250g.
Rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire chez la souris femelle.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
144 souris femelles vont être utilisées dans une chirurgie terminale menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacune subit un acte unique de vingt minutes suivi du prélèvement du cerveau, pour analyser la morphologie des neurones de l'hypothalamus à différents âges entre le dixième et le soixantième jour de vie. Le porteur décrit un inconfort limité à la contention et à l'injection, et renvoie les retombées à de meilleurs traitements des troubles de la puberté et de troubles psychiatriques. Sur le remplacement, il affirme que l'étude d'un réseau neuronal complexe dans l'"organisme entier" exige l'animal vivant.
Objectifs
La puberté est une période critique de développement aboutissant à la maturité sexuelle. C’est un moment de plasticité cérébrale intense, associé à de considérables changements hormonaux, neuraux et comportementaux. Cela est d’autant plus important que la perturbation de l’initiation de la puberté est associée à un risque plus élevé de développer de nombreuses maladies neurologiques. La puberté est déclenchée par la réactivation de l'axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique. L'augmentation pubertaire de la sécrétion des stéroïdes sexuels et la localisation cérébrale des récepteurs des œstrogènes suggère un rôle clé de l’œstradiol dans les changements qui ont lieu à la puberté. L'objectif de ce projet est d'étudier les changements de plasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire. Des souris femelles seront utilisées afin d’étudier la morphologie neuronale au cours du développement hypothalamique et d’identifier les périodes les plus sensibles aux changements hormonaux.
Bénéfices attendus
Les données obtenues contribueront à déterminer les périodes clés de plasticité du cerveau et le rôle des œstrogènes pubertaires dans ces processus. Ceci est particulièrement pertinent dans le contexte du développement de meilleurs traitements pour les troubles de la puberté mais également pour les troubles psychiatriques et comportementaux qui se manifestent souvent pendant cette période.
Procédures
Les animaux (n=144) subiront un acte unique de chirurgie terminale effectuée sous anesthésie et analgésique d’une durée de 20 minutes. A l’issue de cet acte terminal les prélèvements sont réalisés pour analyse.
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales. Les produits administrés pour l’anesthésie, l’analgésie et l’euthanasie n’ont pas d’effet douloureux connus, les animaux auront le seul inconfort de la contention et de l’injection (piqure de l’aiguille).
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses neuroanatomiques et morphologiques.
Remplacement
L'étude du rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire femelle nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses neuroanatomiques et neuroendocrines. Il n'est donc pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives..
Réduction
Les effectifs utilisés (144 animaux au total) ont été calculés au plus juste afin de garantir la puissance statistique, compte tenu de la variabilité interindividuelle. L’expertise scientifique de l’équipe dans l’étude neuroanatomique des fonctions de reproduction permet de connaitre le nombre d’animaux nécessaire par groupe afin d’obtenir des résultats fiables. Afin de réduire le nombre d'animaux, plusieurs régions du cerveau seront analysées en même temps pour le même animal. Les autres organes (hypophyse, ovaire, dents, squelette...) seront proposés aux collaborateurs de l'équipe comme cela est fait habituellement au sein de l’équipe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L'hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d'espace et d'environnement. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. L'anesthésie profonde de l'animal est vérifiée par le pincement de la patte arrière et l'absence du réflexe de clignement de paupière suite à une stimulation de l'œil. Une analgésie sera effectuée 20 minutes avant la chirurgie terminale.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et neuroanatomiques grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...) et de données dans la littérature permettant, d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Ce projet utilisera des femelles à différents jours postnataux (JPN) : JPN10, JPN15, JPN20, JPN25, JPN30, JPN35, JPN40, JPN45 et JPN60. Cela apportera de nouvelles connaissances quant aux changements cérébraux qui ont lieu en particulier dans l’hypothalamus au cours du développement postnatal et pubertaire.