Procédures sans réveil

80 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'a modere. Le resume non technique est presque entierement vide, le porteur renvoyant a des sections internes non publiees pour les objectifs, les procedures, les impacts et le devenir des animaux. Les seuls elements renseignes indiquent deux modeles murins de la maladie de Parkinson et une analyse de micro-ARN tissulaires, qui suppose le prelevement d'organes apres mise a mort. Le porteur affirme que la complexite et la cinetique de ces modeles ne peuvent etre reproduites in vitro.

Objectifs

Cf 3.3.2.2. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 4 versions révisées suite aux 4 examens du Comité d'Éthique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.

Bénéfices attendus

Cf 3.3.2.2. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 4 versions révisées suite aux 4 examens du Comité d'Éthique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.

Procédures

Cf 3.3.2.2. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 4 versions révisées suite aux 4 examens du Comité d'Éthique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.

Impact sur les animaux

Cf 3.3.2.2. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 4 versions révisées suite aux 4 examens du Comité d'Éthique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.

Devenir

Cf Procédures. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 4 versions révisées suite aux 4 examens du Comité d'Éthique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.

Remplacement

Nous utiliserons 2 modèles murins physiopathologiques mimant la MP qui orchestrent de nombreux processus cellulaires communs ou différents dont la complexité et la cinétique ne peuvent pas être reproduites in vitro. Ces modèles sont largement caractérisés dans la littérature.

Réduction

Cf RNT et § 3.3.6.1. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 4 versions révisées suite aux 4 examens du Comité d'Éthique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.

Raffinement

Cf RNT et § 3.3.6.1. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 4 versions révisées suite aux 4 examens du Comité d'Éthique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus utilisée dans les modèles physiopathologiques de la MP. De plus, le gène murin du précurseur de l’ODN présente une forte similitude avec son homologue humain et la séquence peptidique de l’ODN a été hautement conservée entre la souris et l’homme. Afin de mener à bien nos objectifs, nous effectuerons nos expériences sur des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines. En effet, à cet âge les souris ont terminé leur croissance longitudinale et leur prise de poids est minimale après cette période.

1848 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'a modere. Chaque animal subit une chirurgie de la tete qui provoque une hemorragie cerebrale par injection de collagenase, puis une IRM et deux semaines de tests moteurs, avant une thoracotomie terminale pour fixer et prelever le cerveau. Le porteur indique surveiller des signes de detresse post-chirurgicale comme l'inactivite ou la perte de poids, qui servent de points limites. Sur le remplacement, il se borne a affirmer que les procedures ne peuvent pas etre remplacees, et rattache le projet a des financements industriels.

Objectifs

L’effet de nos quatre stratégies thérapeutiques seront évalués en utilisant un modèle d’AVC hémorragique chez la souris par administration intraveineuse (i.v) ou en infusion sur 72h à l’aide de pompes osmotique placées en sous cutanée (Alzet-2001) pour chaque traitement. Nous chercherons également à comparer l’effet de ces stratégies thérapeutiques à 2 doses afin de déterminer laquelle permet d’obtenir une réduction du déficit sensorimoteur ainsi que du volume hémorragique. Ces doses seront fournies par l’industriel.

Bénéfices attendus

Ce projet fait l’objet de plusieurs financements industriels afin d'étudier de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant la réduction du déficit sensorimoteur ainsi que du volume hémorragique en cas d'AVC hémorragique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la collagénase, provoquant ainsi une hémorragie dans le striatum. A J+1, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale et suiveront une série de test comportementale s'étalant de J+1 à J+14 post ischémie. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Un prélèvement de sang par ponction cardiaque sera réalisé avant perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant prélèvement. Les procédures douloureuse (chirurgie, persfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse post-chirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés.

Devenir

A la suite de la procédure 1, les animaux seront gardés en vie afin de réaliser le suivi de la récupération fonctionelle. A la suite de la procédure 2, les animaux seront gardés en vie afin de réaliser l'évaluation des hémorragies par IRM. A la suite de la procédure 3, les animaux seront gardés en vie afin de procéder au prélèvement du coeur post fixation. Enfin, les animaux seront mis à mort pour la procédure 4 permettant ainsi de prélever le cerveau préalablement fixé pour analyses immunohistochimies.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques.

Raffinement

Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’hémorragie intra crânienne. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines soit un poids de 35g pour les SWISS et d’environ 25g pour les C57BL6J. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’hémorragie.

3 110 miniporcs vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à modéré, la plupart tués à l'issue, 160 réutilisés et 40 adoptés. Chaque animal reçoit un produit à tester par administration unique ou répétée, avec pose de cathéters ou d'implants et prélèvements sanguins, avant l'analyse de ses organes, pour des études de toxicologie exigées par la réglementation avant les essais cliniques. Le porteur indique que ces actes peuvent provoquer douleur post-opératoire, perte de poids, léthargie et inflammation locale. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative pour déterminer la toxicité d'une substance après exposition systémique et qu'il faut accéder à l'animal "dans son entièreté".

Objectifs

La réalisation d’études de toxicologie générale, toxicologie de la reproduction, toxicologie juvenile, tolérance locale, de pharmacologie de sécurité est une obligation réglementaire avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (dispositif médical, médicament vétérinaire, produit chimique). Ces études sont réalisées selon les guidelines ICH, EMA, OCDE, US FDA ou toute autre guideline applicable. Préalablement aux études réglementaires, la réalisation d’études de pharmacocinétique / pharmacodynamique, pharmacologie d’efficacité, dose maximale tolérée et étude de recherche de doses est un prérequis nécessaire afin de collecter des données d’exposition, de toxicité et de pharmacologie sur le produit et de choisir ou ajuster de manière raisonnée les doses et le design des études réglementaires.

Bénéfices attendus

Les études de toxicologie par administration unique ou répétée sont réglementairement requises par les lignes directrices Européennes et Internationales et représentent une etape essentielle avant de réaliser des essais cliniques sur un médicament humain (sur des volontaires sains en court terme et sur les patients dans le moyen et long terme), ou pour l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché (dispositifs médicaux, médicament vétérinaire, produit chimique ). Pour les médicaments humains et vétérinaires et dispositifs médicaux, ces études sont des pré-requis indispensables aux essais cliniques. Ils visent à définir le profil de toxicité ou de tolerabilité des produits à tester et donc rendre les essais cliniques plus sures pour les patients ou volontaires participant à l'essai. Ils permettent aussi de définir le niveau de dose (marge de sécurité) pour la première administration à l’homme ou l’animal. Ces études incluent des évaluations toxicocinétiques pour déterminer les taux d’exposition entrainant une toxicité. En ce qui concerne les produits chimiques ce projet permettra d’evaluer la sécurité des molecules chimiques dans l’intérêt de la santé ou du bien-être de l’homme ou de l’animal comme demandé par la loi et par les lignes directrices européennes. Ce projet permettra donc d’avancer dans le développement des solutions thérapeutiques, prophylactiques ou diagnostiques innovantes pour le traitement de certaines maladies chez l’homme, les animaux ou les plantes et de contribuer à l’evaluation de la sécurité des produits chimiques.

Procédures

Ces études consistent en administration unique ou répétée du produit à tester. La fréquence de ces administrations varie en fonction du produit (par exemple 1 fois par jour, 1 fois par semaine). La durée des administrations est généralement rapide quelques secondes à quelques minutes, pour les administrations orales, souscutanée ou intraveneuse en bolus. Elles peuvent parfois être plus longue pour les perfusions (de plusieurs minutes à continue). Les administrations sont suivies d’observations régulières des animaux (plusieurs fois par jours), pesées corporelles (généralement de 1 fois par jour à 1 fois par semaine), évaluation des effets sur les paramètres sanguins ou urinaires (généralement 1 à 4 fois par étude), sur le développement neurocomportemental, squelettique et des fonctions reproductives, évaluation des fonctions respiratoires et cardiovasculaires et analyse macroscopique ou histopathologique. Les techniques engendrant le moins d’inconfort ou sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les autres techniques ou procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec le cas échéant un protocole d’analgésie adapté. Le nombre et la durée des interventions sont adaptés en fonction de l'utilisation clinique, de la durée d'étude, de la cinétique d'exposition, des effets attendus et sont définis dans le plan d'étude.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes, lors des procédures d’administration, de prélèvement de sang ou de pose de cathéter - Douleur légère à modérée en post-opératoire (quelques jours) pour la pose des cathéters ou d’implants de capteurs collectant des données physiologiques (par exemple pression artérielle, ventriculaire, pleurale, ECG, EMG ou autres) - Effets toxicologiques ou pharmacologiques légers à modérés dus à l’administration des médicaments ou produits chimiques à tester (perte de poids, léthargie, excitation, baisse en consommation de nourriture, tremblements, irritation ou inflammation locale au site d’administration…). Des points limites précoces adaptés sont mis en place selon la typologie d’etude et la classe du produit à tester afin d’eviter une prolongation inutile des effets observés. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures sont rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement analgésique, diminution de la dose testée, suspension de la procédure ou euthanasie)

Devenir

En accord avec le plan d’étude utilisé les animaux pourrons être 1) euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques, microscopiques et/ou squelettiques) tels que requis par la réglementation pour la détermination des organes cibles ; 2) gardés en vie et retourner en zone d’hébergement hors étude suite à l’avis du vétérinaire avec l’évaluation de la gravité réelle des procédures subies ; 3) replacés en accord avec la structure en charge du bien-être animal et les vétérinaires ; 4) hébergés en attente d’inclusion en étude, conditionnée par un examen vétérinaire favorable.

Remplacement

Pour ce qui est du remplacement, il n’existe pas actuellement d’alternatives à l’expérimentation animale qui permettent de déterminer la toxicité de substances suite à une exposition systémique. L'utilisation du mini-porc répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques. Dans ces études, un relevé des signes cliniques et des paramètres sanguins des animaux est requis, il est donc nécessaire d’avoir accès à l’animal dans son entièreté, il est impossible de le remplacer par des méthodes alternatives pour évaluer les effets du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux pour les études réglementaires est défini dans les guidelines internationaux applicables (Guidelines ICH, …) et adapté en fonction du nombre de doses testées, du nombre de produit testés et de la présence ou non d’une période de réversibilité. Pour les études préliminaires, le nombre d’animaux par lot est établi au plus juste afin d’obtenir des résultats exploitables et en tenant compte des objectifs de l’étude, du nombre de doses testées et du nombre de produits et est précisé dans le plan d’étude.

Raffinement

Pour améliorer leur bien-être, les miniporcs males et femelles seront hébergés en groupes sociaux sauf incompatibilité avec la procédure expérimentale ou incompatibilité comportementale. Les miniporcs seront hébergés sur litière (copeaux de bois) dans un box avec un panier et un jouet (chaine métallique,…). Un enrichissement alimentaire est distribué quotidiennement aux miniporcs et réparti dans la litière permettant aux animaux de fourrager. Les techniques engendrant le moins d’inconfort ou sur une durée la plus courte possible pour l’animal seront privilégiées. Les actes pouvant engendrer du stress ou de l’inconfort seront réduits au minimum nécessaire (nombre et durée) et seront réalisés sous anesthésie avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Les animaux sont observés au moins 1 fois par jour (incluant le week end) afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques ayant des répercussions sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire (mise en place d’un traitement médical, interruption des administrations, réduction de la dose testée par exemple). Les autres techniques ou procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec le cas échéant un protocole d’analgésie adapté.

Choix des espèces

Il s’agit d’une justification réglementaire. En effet, le mini-porc est une espèce non-rongeur acceptée par les agences réglementaires. Le choix de cette espèce répond aux exigences réglementaires pour la réalisation d'études précliniques. Il est fait en fonction de critères scientifiques précis, des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques disponibles et en fonction des analogies entre l’homme et l’animal. De la naissance à adulte mature. En fonction du type d’étude et de la population ou des animaux cibles du produit, nous choisirons l’âge le plus adéquat. Ce choix et la justification sont détaillés dans le plan d’étude.

848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à modéré, certaines menées sous anesthésie sans réveil. Elles sont infectées par des microsporidies (Encephalitozoon cuniculi et E. intestinalis) dans l'oreille ou par gavage, puis observées par imagerie intravitale sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever oreille, ganglion et muqueuse intestinale. Le porteur décrit une réponse inflammatoire locale qu'il qualifie de minime et indique que tout signe de souffrance, poil hérissé ou baisse de motricité, entraîne l'euthanasie immédiate. Il affirme que l'analyse in vitro reste largement insuffisante pour saisir la réponse immunitaire in vivo et renvoie au futur les retombées, des stratégies immunothérapeutiques.

Objectifs

L’immunobiologie des microsporidioses est un domaine encore peu exploré. Parmi les composants cellulaires de la réponse immunitaire anti-microsporidie, les cellules dendritiques et les macrophages représentent des cellules clés qui vont faciliter la transition entre la réponse immunitaire innée et adaptative chez l’hôte infecté. Or, le parasite est capable de moduler cette réponse. Parmi les mécanismes d’échappement immunitaire décrits in vitro, citons l’exemple d’Encephalitozoon avec E. cuniculi qui se réplique à l’intérieur des macrophages par inhibition de l’acidification du phagosome et absence de fusion phagolysosomale. E. intestinalis interfère quant à lui avec différents aspects de la physiologie des cellules dendritiques : leur différenciation, leur maturation, la production de cytokines, induisant ainsi un « priming » aberrant des lymphocytes T. Ainsi, les microsporidies « piratent » le système immunitaire de l’hôte, mais peu de données existent encore sur la mise en place de ces stratégies d’échappement in vivo. Notre projet vise à explorer in vivo, chez la souris, la mise en place de la réponse immunitaire anti-microsporidie, en étudiant en temps réel les interactions entre les microsporidies et les composantes cellulaires de la réponse immunitaire innée (macrophages, polynucléaires neutrophiles, cellules dendritiques). Le modèle du pavillon de l’oreille de la souris comme support pour l’analyse de la dynamique de la réponse immunitaire par imagerie intra-vitale est un des plus utilisés. Un travail récent a étudié les interactions entre les cellules de l’immunité innée et le staphylocoque doré. L’objectif est ici d’adapter ce modèle à l’étude de l’immunobiologie des microsporidioses. Nous proposons également d'étudier la réponse immunitaire anti-microsporidie au niveau de la muqueuse intestinale, dans le modèle de l'anse iléale de la souris. En infectant avec l’espèce E. Cuniculi, puis E. intestinalis plus fréquemment retrouvée chez l’homme, le modèle murin intestinal mis au point mimera au mieux la physiopathologie de l’infection humaine par ce parasite intestinal.

Bénéfices attendus

De façon globale, ce projet nous apportera des connaissances nouvelles pour une meilleure compréhension de la réponse immunitaire dirigée contre les espèces microsporidiennes E. cuniculi et E. intestinalis, un domaine encore peu exploré à ce jour. L’objectif in fine sera de développer des stratégies immunothérapeutiques permettant de mieux contrôler ces infections dans le futur.

Procédures

-Expériences d'imagerie intravitale sur le tissu de l'oreille : le tissu cutané de l'oreille est imagé en microscopie confocale (imagerie intravitale) après inoculation des parasites (spores infectieuses) chez l'animal anesthésié (de quelques heures à 6 jours après l'infection)(durée: 2h, 5 interventions au total). Les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérience. -Expériences avec biopsies de tissu : les tissus (oreille, ganglion) sont prélevés chez des animaux euthanasiés à différents temps après l'infection. -Expériences d'imagerie intravitale de la muqueuse intestinale : la muqueuse intestinale est imagée chez des animaux infectés par gavage (inoculation de spores infectieuses par voie orale) et anesthésiés (durée : 2h, 1 intervention). Les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérience d'imagerie (temps 2-4h ou 24h).

Impact sur les animaux

* Expériences dans le modèle du pavillon de l’oreille : toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. Les animaux sont pesés chaque jour après l’injection des spores dans l’oreille, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Les expériences sont de courte durée (6 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection est minime. Toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière : poil hérissé, baisse de la motricité, mènera cependant à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec euthanasie des animaux. * Expériences dans le modèle de la muqueuse intestinale : toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière après l'inoculation des spores d’E. cuniculi ou d' E. intestinalis par gavage : poil hérissé, baisse de la motricité, conduira à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec euthanasie des animaux. Toutes les expériences d'imagerie intravitale de la muqueuse intestinale seront réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. L'animal est euthanasié à la fin de chaque expérience.

Devenir

Les animaux inoculés avec les spores d’E. cuniculi ou d’E. intestinalis sont gardés en vie (quelques heures ou quelques jours) en vue de l'imagerie de la muqueuse intestinale ou du tissu de l’oreille. A la fin de chaque session d’imagerie et ainsi à la fin du projet, tous les animaux sont euthanasiés en vue des prélèvements de tissus infectés (oreille, ganglion auriculaire, muqueuse intestinale).

Remplacement

Notre approche expérimentale inclut une première analyse in vitro avec des lignées cellulaires et des cultures primaires de cellules immunitaires, mais elle reste largement insuffisante pour connaitre les interactions fines mises en jeu entre parasites et cellules immunitaires. En effet, elle n’englobe que très partiellement la complexité de la réponse immunitaire in vivo, à l'échelle tissulaire.

Réduction

Expériences de microscopie confocale dans le modèle du pavillon de l’oreille (expériences I) ou de la muqueuse intestinale : le nombre d’animaux par lot (n=1) a été défini selon la puissance statistique et la variabilité des paramètres étudiés. Dans le modèle de l’oreille, le même animal est suivi au cours de 6 points de cinétique différents (faible nombre d’animaux utilisés). Dans le modèle intestinal, l’expérience est de courte durée (observation soit au temps 2-4H, soit au temps 24h) et l’animal est euthanasié à la fin de chaque expérience. L’expérience est répétée 20 fois (modèle de l’oreille) ou 30 fois (modèle intestinal) car une grande variabilité de la réponse immunitaire peut être observée d’un individu à l’autre, et selon le modèle utilisé. Ce nombre est justifié par la variabilité des réponses in vivo dues à la variation de l'inoculum parasitaire et à une réponse immunitaire individuelle hétérogène. Une analyse statistique par Anova ou test de Student sera réalisée, une différence au niveau du recrutement cellulaire ou de la charge parasitaire sera généralement considérée comme statistiquement significative lorsque la P value sera inférieure à 0,05.

Raffinement

Les animaux sont stabulés dans une salle climatisée (22 ± 2°C) avec un cycle 12/12 h (jour/nuit, 7h00 à 19h00) et un taux d’humidité maintenu à 55%. Les animaux ont libre accès à la boisson et à la nourriture. Le régime alimentaire est composé de croquettes (A04-Safe, Epinay/Orge, France). Dans les deux modèles d’étude (modèle oreille, modèle intestinal), toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. *Modèle du pavillon de l’oreille : Après imagerie du tissu de l’oreille et pendant la phase de réveil, l'animal est placé sur un tapis chauffant thermorégulé pour éviter l'hypothermie, et gardé en observation pendant 2 heures puis remis dans sa cage initiale si tout va bien (pas de poil hérissé, respiration régulière, recouvrement d'une motricité normale, alimentation normale). Les animaux sont pesés chaque jour après l’injection des spores dans l’oreille, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Les expériences sont de courte durée (6 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection est minime. Toute souffrance apparente de l'animal repérable en surveillance journalière : poil hérissé, baisse de la motricité, mènera cependant à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec euthanasie des animaux. Les biopsies de tissus seront toujours réalisées sur des animaux euthanasiés, après dislocation cervicale. Après vérification de la mort de l’animal par arrêt total, rapide et durable des mouvements cardio-respiratoires et par l’absence de réflexes (pincement de la patte), les tissus (oreille ou ganglion lymphatique) sont prélevés très rapidement. * Modèle de la muqueuse intestinale : le recours à l'anesthésie profonde permet d'éviter tout stress ou douleur chez l’animal. Les expériences sont de courte durée (quelques heures). L'animal est sacrifié après observation de la réponse inflammatoire au niveau du sommet des villosités intestinales (anses iléales).

Choix des espèces

La souris est actuellement le modèle de vertébré couramment utilisé pour étudier in vivo la réponse immunitaire anti-microsporidie. Des souris C57BL6 mâles ou femelles de 8 à 12 semaines seront utilisées. Le poids (âge) choisi correspond à celui d’un jeune animal adulte qui a un système immunitaire mature. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 à 12 semaines, ce qui correspond à l'âge d'une souris possédant un système immunitaire mature.