Procédures sans réveil
Rôle de la protéine 1 dans les maladies chroniques du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 640 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 60 mises à mort sous anesthésie sans réveil. Rendues obèses par un régime gras sur trois à six mois, elles subissent des prises de sang répétées, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, puis une chirurgie de prélèvement des cellules du foie au cours de laquelle elles meurent. Le porteur indique que les injections intrapéritonéales peuvent provoquer des comportements de gêne ou de souffrance et des lésions au site d'injection. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro reproduisant les interactions entre organes et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer des maladies du foie. Ces complications hépatiques ont augmenté dramatiquement en France, et affectent essentiellement les individus obèses. Aucun traitement n’est disponible. Il est crucial de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués pour proposer des approches thérapeutiques. Le premier stade de ces complications hépatiques est la stéatose hépatique (« foie gras »), de bon pronostic. Avec les années, les complications hépatiques peuvent progresser vers des stades graves (comme la cirrhose). Les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l’évolution de ces maladies restent peu clairs. Parmi les mécanismes impliqués, l'activation d'une voie de stress à l'intérieur des cellules du foie jouerait un rôle crucial. Cette voie est transmise au niveau moléculaire par 3 protéines. Une sur-activation hépatique de ces voies a été mise en évidence dans le développement des complications hépatiques à la fois au sein de modèles murins et de chez l’homme grâce à des prélèvements (biopsies du foie). Nos résultats préliminaires publiés indiquent une activation de la voie de la protéine transmembranaire 1 dans la stéatose et sa transition vers les complications hépatiques, que nous souhaitons étudier dans ce projet. L’objectif est d’étudier spécifiquement son rôle dans les cellules du foie, lors du développement des complications hépatiques Ainsi, nous analyserons si l'absence de la protéine transmembranaire 1 dans les cellules du foie de souris protège du développement de la maladie. Nous prévoyons d'utiliser 700 souris sur une période de 5 ans. La règle des 3Rs est donc prise en compte ici de la façon suivante : pour satisfaire à la réduction, chaque procédure prévoit d'utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à des études statistiques pertinentes. Pour le raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés et les personnes réalisant les procédures sont autorisées et appliqueront les règles d'éthiques. L'environnement sera enrichi pour diminuer le stress. Le suivi sanitaire régulier permettra d'identifier, le plus rapidement possible, les souris souffrantes et de prendre les mesures nécessaires. Enfin, conformément au principe de remplacement, notre hypothèse a été précédemment éprouvée in vitro. Il faut l'étudier dans un contexte plus physiologique, or il n'existe pas de modèle in vitro qui pourrait remplacer ces aspects.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo, nos résultats préliminaires obtenus in vitro. Nous pourrons ainsi mieux appréhender les mécanismes moléculaires (inflammation, métabolisme, mort cellulaire dépendants de la protéine transmembranaire 1) et comprendre leur impact dans la progression des complications hépatiques. Il n'existe pas de traitements des maladies hépatiques chroniques. La compréhension de ces mécanismes permettrait d'identifier des nouvelles cibles thérapetiques (IRE1 elle-même mais aussi des voies moléculaires qu'elle pourrait réguler).
Procédures
Pendant les régimes de 3 à 6 mois, les animaux seront soumis à 3 prises de sangs, de quelques minutes. Pour les tests de tolérance au glucose et à l’insuline, 1 seule injection est réalisée (avec le glucose ou avec l’insuline) puis le niveau de sucre dans le sang (glycémie) est mesuré 7 fois (une goutte de sang, lecture instantanée) pendant 2 heures. Le jour de la mise à mort, 1 prise de sang sera réalisée. Après l’injection unique de l’antibiotique, une seule prise de sang est réalisée avant la mise à mort de la souris. Pour la procédure chirurgicale permettant de récupérer les cellules du foie, l’animal est injecté une seule fois avec un mélange anesthésique/analgésique. L’animal meurt pendant la procédure. Après l’injection unique du composé inflammatoire, une seule prise de sang est réalisée avant la mise à mort de la souris.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la prise de poids chez l’animal. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, ...).
Devenir
Tous les animaux sont morts à la fin de chaque procédure. Le foie et les autres organes indiqués (tissu adipeux..) seront prélévés pour analyse histologique et moléculaire.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests statistiques paramétriques). En utilisant ces tests, nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande de projet un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique (niveau de significativité 0.05) quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience. Si un résultat significatif est obtenu (niveau de significativité 0.05), une seconde expérience ne sera pas réalisée. Cet effectif prédictif est confirmé par G-Power.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, leur bien-être est scrupuleusement pris en compte dans toutes les procédures en termes de conditions d'élevage (température et de l'hygrométrie). L'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique avec présence de tige en coton et d'igloo dans les cages. De plus, les souris seront hébergées en groupe (6 souris par cage, et 5 souris par cage si plus une souris fait plus de 30g). Les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et mises à mort des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières (au moins une fois par semaine ou par jour en fonction des procédures) nous permettront d'identifier précocement tout changement physique (blessure), ou de comportement : animal prostré, animal manquant de soin (qui ne fait pas sa toilette) qui sont des signes de stress et de souffrance, d'appliquer les points limites que nous avons définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
La souris est une espèce utilisée dans les études du métabolisme, particulièrement les maladies du foie pour ce projet. Le modèle murin est donc un modèle de choix, bien établit, pour l'étude de ces pathologies hépatiques. De plus, le modèle murin transgénique permet d'étudier précisément notre protéine d'intérêt et de répondre à la question de sa relevance thérapeutique. C'est un modèle disponible et utilisable, de surcroit doté d'une natalité importante. Notre laboratoire a des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. La similitude de son patrimoine génétique, avec celui de l’Homme, permet dans la mesure du possible, d'extrapoler les résultats à l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses biologiques, ainsi que protéiques, génomiques et histologiques. Compte tenu de tous ces arguments, il semblerait que ce soit le modèle le plus approprié dans notre cas. Dans toutes les procédures les souris seront âgées de 8-10 semaines. Le modèle animal de l’obésité nutritionnelle utilisé dans notre laboratoire consiste à mettre les animaux sous régime riche en lipides (à l’âge de 8-10 semaines) pour une durée allant de 12 semaines (3 mois : temps requis pour induire la stéatose) à 24 semaines (6 mois: temps requis pour induire la NASH).
Évaluation du potentiel thérapeutique de la stimulation d’une modification protéique, la O-GlcNAcylation, dans le choc hémorragique chez le rat Wistar de 10 – 13 semaines
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
1 128 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, la moitié sous anesthésie sans réveil et la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'environ deux heures trente provoquant un choc hémorragique, un prélèvement de sang à la queue, puis une seconde chirurgie suivie de la mise à mort pour prélever sang et organes. Le porteur décrit un état de choc avec mobilité fortement réduite et absence de réaction aux stimuli, et indique que les rats trop douloureux sont sacrifiés en cours de protocole. Il conclut que ces réactions systémiques complexes rendent l'animal indispensable faute de méthode alternative.
Objectifs
Les buts du projet sont de 1) valider l’innocuité des molécules 2) valider une cinétique d’administration de molécules plus spécifiques et stables, 3) valider une dose d’administration de molécules plus spécifiques et stables, 4) valider une voie d’administration et enfin, de manière plus transversale, mieux comprendre les mécanismes dans lesquels est impliquée l’O-GlcNAcylation via l’identification de protéines cibles. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l’O-GlcNAcylation dans l’état de choc hémorragique et potentiellement de développer une nouvelle stratégie thérapeutique.
Bénéfices attendus
Avec les différents résultats précédemment obtenus par l’équipe et celle de John C. Chatham, les résultats attendus sont une amélioration de la réponse inflammatoire, une amélioration de la fonction cardiovasculaire et des différents marqueurs de stress et ceux à différents temps d’administration, à différentes doses et selon les différentes voies d’injection. Ces résultats seront objectivés par l’étude in vivo de la fonction et du stress cardiovasculaire (pression artérielle, fréquence cardiaque), rénaux et hépatiques mais également par des tests biochimiques (RT-qPCR, Western blot) validant l’effet des molécules testées. Un bénéfice à très long terme peut être le développement d’une nouvelle approche thérapeutique dans la prise en charge du choc hémorragique.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 interventions. La première intervention consiste à la chirurgie permettant de développer le choc hémorragique (juste la chirurgie pour le groupe contrôle). Cette chirurgie durera environ 2h30 (sur la base des études précédemment menées). La seconde intervention consiste en un prélèvement d’une goutte de sang au bout de la queue sur un animal vigile. Cette intervention ne durera que quelques secondes. La troisième et dernière intervention consiste à la chirurgie permettant d’avoir accès aux valeurs hémodynamiques de l’animal 24h après l’induction du choc. Cette chirurgie durera environ 10 minutes et sera suivi du sacrifice de l’animal pour prélèvement du sang et des organes de l’animal.
Impact sur les animaux
Le modèle de choc hémorragique est un modèle sévère. Au cours de ce protocole, l’état de santé des animaux va s’aggraver du fait du développement du choc hémorragique avec une mobilité fortement réduite, une absence de réaction aux stimuli sonores et toucher mais également une diminution de la prise alimentaire, sans toutefois de réel impact sur le poids, le protocole n’ayant une durée que de 24h. Enfin, une douleur peut être associée à la chirurgie réalisée sur l’animal. L’apparition de ces effets indésirables est environ 2 à 3h après l’induction du choc et jusqu’au sacrifice.
Devenir
En fin de procédure 1 (développement du choc hémorragique), les animaux présentant des signes de douleur trop importants seront sacrifiés. Seuls les animaux ne présentant pas des signes de douleur trop importants seront conservés pour la procédure 2. En fin de procédure 2, l’ensemble des animaux seront mis à mort pour prélever le sang et les organes pour effectuer des analyses.
Remplacement
Le choc hémorragique est une pathologie sans traitement et faisant intervenir des mécanismes complexes et intégrés, nécessitant impérativement l'utilisation de modèles animaux, en effet, les réactions systémiques complexes de l'organisme ne peuvent pas être reproduites in vitro sur des modèles cellulaires, rendant l'utilisation d'animaux indispensables pour mieux comprendre les mécanismes associés et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire notre modèle et évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude) qui ne nécessiteront pas l’utilisation de nouveaux animaux. Les rats utilisés sont des Wistar mâles âgés de 10 à 13 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les différentes procédures expérimentales de la première étape (mise au point) seront réalisées sur des effectifs réduits afin de déterminer les conditions d’utilisation optimales. Dans un second temps, lorsque les conditions d'utilisation optimales auront été déterminées, les procédures seront réalisées sur un plus grand nombre d’animaux avec seulement les conditions sélectionnées dans la première étape. Afin de raffiner le modèle, des mesures seront mises en place afin de maximiser le confort des animaux par exemple avec la mise en place de scores et de points limites comprenant des critères morphologiques (aspect, comportement) et physiologiques (température, fréquence respiratoire, lactates), l’administration d‘un antidouleur en début de procédure (lidocaïne 2%, gouttes sur les zones d’incision (maximum de 0,49mL pour un rat de 350g), en fin de procédure (buprénorphine à 0,05 mg/kg) et à 8 heures post-chirurgie (buprénorphine à 0,05 mg/kg) est prévue et la réinjection d’une dose supplémentaire peut être considérée en cas de signe de douleur. Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés par 2, dans des cages avec enrichissement, sur portoirs ventilés et avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Après chirurgie, afin d’éviter au maximum le stress, les animaux seront placés dans la même cage. Un respect strict des cycles jour/nuit sera observé.
Choix des espèces
Ce modèle est, historiquement et actuellement, le plus utilisé et le mieux décrit. Sa proximité avec la symptomatologie du choc hémorragique chez l’Homme et sa très bonne reproductibilité font un modèle efficace pour cribler et valider l’efficacité des traitements. De plus l’ensemble des travaux et des résultats précédemment obtenus par l’équipe de JC Chatham sur l’étude du choc hémorragique ont été réalisé sur ce modèle, preuve de son utilisation et donc de la connaissance de ce modèle. Les rats utilisés sont des Wistar mâles âgés de 10 à 13 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les effectifs sont choisis pour avoir une puissance statistique suffisante pour conclure sur nos résultats. Ils sont choisis sur la base des tests statistiques utilisés et de l'expérience de ce modèle, permettant de réduire le nombre d'animaux. 10-13 semaines – c’est un âge standard pour ce genre de manipulations.
Validation de la sécurité et efficacité d’un mode d’application rapide des ultrasons focalisés pour l’occlusion des veines superficielles.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
45 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 27 sous anesthésie sans réveil et 18 avec réveil et suivi. Elles subissent l'application d'ultrasons focalisés sur les veines des membres postérieurs sous anesthésie générale d'environ quatre heures, avec prélèvements sanguins et échographies, avant mise à mort pour prélever les veines et réaliser histologie et autopsie. L'objet est de régler les paramètres d'un dispositif de traitement des varices avant son usage chez l'humain, une embolie pulmonaire étant le point limite prévu pour la procédure sans réveil. Le porteur affirme qu'aucun modèle numérique ne représente ces phénomènes tissulaires et conclut que le recours à l'animal est nécessaire.
Objectifs
Le but de cette étude est de quantifier l’apport de solutions techniques visant à améliorer l’efficacité du traitement utilisant la technologie des ultrasons focalisés (HIFU), 1) d'un point de vue sécurité : diminuer le risque de brûlure de la peau et des tissus sous-jacents, et 2) d'efficacité : oblitération de la veine traitée, lors du traitement de veines superficielles.
Bénéfices attendus
La technologie des ultrasons focalisés est déjà utilisée de manière commerciale pour traiter notamment les cancers de la prostate, les fibromes utérins, les varices, les nodules thyroïdiens, et de nombreuses autres applications cliniques sont en développement. Ils constituent généralement une alternative ambulatoire et non-invasive aux méthodes chirurgicales. Cette modalité pâtit généralement toutefois d’un temps de traitement plus long, qui freine son adoption. Cette étude permettra donc de déterminer les paramètres de traitement (en termes de puissance, fréquence et temps d'émission des pulses ultrasonores) optimaux garantissant un traitement efficace sans effets secondaires avant utilisation du traitement sur l’homme en ambulatoire.
Procédures
Les animaux seront soumis à un traitement non invasif par ultrasons focalisés 53 modalités de traitements pour chaque animal) sur les veines superficielles des membres postérieurs (une veine par membre, soit deux veines par animal). Ce traitement se fait sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux Pour chaque animal, 2 prélèvements sanguins de 10 mL seront réalisés au cours de cette même anesthésie générale : un avant la première application des HIFU et un après la dernière application HIFU. Un 3ieme prélèvement sera effectué également sous anesthésie générale au terme de la période de suivi du traitement, juste avant la mise à mort. Ces prélèvements sanguins sont faits à la veine jugulaire. La mise en oeuvre des 3 différentes modalités de traitement aux ultrasons sur chaque brebis requière une anesthéie générale d'environ 4h (ce qui permet à la fois l'examen échographique de la veine avant et après traitement, le traitement aux ultrasons lui-même et les prélèvements sanguins).
Impact sur les animaux
Lors de la procédure 1 (procédure sans réveil), le seul effet indésirable grave possible est une embolie pulmonaire. Il s'agit d'un point limite conduisant à l'arrêt de la procédure et à la mise à mort de l'animal. Lors de la procédure 2 (procédure avec réveil et suivi distant), les nuisances ou effets indésirables prévus incluent la survenue d'hématome, oedème ou induration au point d'application des ultrasons.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure car l'évaluation de l'efficacité et de la sécurité des modalités de traitement testées nécessité la mise en oeuvre de techniques de prélèvements tissulaires et d'analyse (histologie, autopsie par exemple) qui ne sont pas compatibles avec le maintien des animaux en vie dans des conditions de bien être adéquates.
Remplacement
L’emploi d’animaux est nécessaire car l’influence de la dynamique du flux sanguin sur les transferts de chaleur ne peut être observée avec d’autres modèles expérimentaux et aucun modèle numérique ne permet de représenter certains phénomènes tissulaires, à la fois ceux recherchés dans le cadre de l’étude (oblitération, rétrécissement de la veine) ou les éventuels effets adverses comme les brûlures, embolies ou thromboses des veines profondes. En effet, les paramètres des tissus sont connus avec des incertitudes trop grandes, ce qui limite la précision des calculs numériques. Par conséquent, l’évaluation des mesures de sécurité vis-à-vis de ces risques ne peut reposer uniquement sur ces calculs numériques imprécis. De plus, l’évolution des dommages tissulaires repose sur des phénomènes complexes (réparation des dommages à la paroi veineuse, mort du nerf par hypoxie) qui ne peuvent être simulés de manière fiable, ni étudiés ex vivo. Toutefois, les veines jugulaires seront également prélevées pour réaliser des traitements HIFU ex vivo en présence de thermocouples pour quantifier précisément la température atteinte lors des traitements.
Réduction
Les jugulaires seront également être prélevées pour réaliser des traitements HIFU ex vivo en présence de thermocouples pour quantifier précisément la température atteinte lors des traitements. Le résultat de ces expériences est pertinent ex vivo et il n’est pas nécessaire de les mettre en œuvre in vivo. Le prélèvement de ces veines après mise à mort nous permet donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour compléter nos preuves précliniques. Il n’est pas nécessaire d’explorer le domaine de paramètres (profondeur, puissance) en entier car la connaissance de la géométrie du faisceau permet d’estimer numériquement la variation de profondeur équivalente à une variation de puissance donnée (réduire, raffiner). Pour étudier la sécurité sur la peau, nous utiliserons le maximum d’emplacements possibles sur les pattes d’une même brebis sous anesthésie générale. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, des traitements seront réalisés lors de l’anesthésie générale pré-sacrifice sur la face médiale des pattes afin d’acquérir des données complémentaires de sécurité en phase aigüe. Les veines traitées ainsi que des portions de muscles situées en regard de la veine seront prélevées et envoyées pour analyse histologique.
Raffinement
Les brebis seront hébergées dans des stabulations libres collectives tout au long de l'étude. Elles auront accès à du foin et de l'eau ad libitum. L'application des ultrasons focalisés, ainsi que la mise en oeuvre des méthodes d'évaluation (échographie, prélèvement sanguins par exemple) seront réalisées au cours d'une même anesthésie générale afin de limiter la manipulation et le stress des animaux. Pour des animaux avec suivi distant, l’absence de souffrance ou d’inconfort (diminution de l'appétit, de l’activité, boiterie, altération de la sensibilité et perte des réflexes sur les membres) sera contrôlée par une observation quotidienne des animaux jusqu’à la fin de l’étude. En cas de manifestations douloureuses ou d’inconfort, des soins adaptés seront mis en place. Si la douleur ou l’inconfort demeurent réfractaires à ses soins adaptés, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
D’après notre expérience préclinique, la brebis constitue le meilleur modèle pour ces études. Ses veines ont un calibre suffisant (diamètre supérieur à la taille d’une lésion engendrée par un pulse délivré par notre système) et la saphène latérale est à une profondeur accessible par notre dispositif. De même les nerfs fibulaire et tibial sont à la bonne profondeur sous la peau à l’endroit où le nerf sciatique se divise. Par comparaison, les veines de lapin sont trop petites et la composition de la peau du cochon n’est pas favorable à la bonne propagation des ultrasons à la fréquence ultrasonore d’étude. Nous utiliserons des animaux adultes pour disposer des plus grandes zones de tir possible et de la latitude nécessaire à l’étude des profondeurs de traitement (au moins 2 cm de profondeur sous la peau, pour les tirs les plus profonds).
Altération de la myéline, activité cérébrale et cognition – étude pilote
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont six dans des procédures classées d'un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent de la cuprizone dans leur nourriture pour détruire la myéline de leur cerveau, subissent des craniotomies avec ou sans réveil pour enregistrer l'activité cérébrale, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour extraire le cerveau. Cette étude pilote cherche à relier renouvellement de la myéline et cognition, dans l'espoir lointain de mieux comprendre la sclérose en plaques et le vieillissement. Le porteur reconnaît l'absence de base statistique pour fixer le nombre d'animaux et conclut qu'aucune méthode ne remplace l'expérimentation animale.
Objectifs
Comprendre le fonctionnement du cerveau et traiter ses troubles nécessitent d’étudier cet organe complexe à plusieurs niveaux d’analyse, ce qui n'est pas encore possible sur des modèles in vitro. En l’absence d’alternatives adéquates, répondre à ces questions nécessite hélas encore à ce jour le recours à l’expérimentation animale. En apportant de nouvelles connaissances sur les réseaux neuronaux impliqués dans la cognition, ce projet permettra à plus long-terme de mieux comprendre la sclérose en plaques ou bien les troubles associés au vieillissement.
Bénéfices attendus
En apportant de nouvelles connaissances sur les réseaux neuronaux impliqués dans la cognition, ce projet permettra à plus long-terme de mieux comprendre la sclérose en plaques ou bien les troubles associés au vieillissement. Ce projet s’inscrit donc dans un cadre de santé publique.
Procédures
Les animaux seront soumis : - Traitement Cuprisone qui induit une démyélinisation transitoire ; ce traitement est donné dans la nourriture - Procédures chirurgicales (craniotomies) sans réveil sous anesthésie générales et analgésie afin d’enregistrer l’activité cérébrales avec des sondes adaptées - Procédures chirurgicales (craniotomies) sous anesthésie générale et analgésie avec réveil et traitement adapté de la douleur éventuelle, afin d’enregistrer l’activité cérébrales avec des sondes adaptées chez l’animal vigile - Perfusion intracardiaque sous anesthésie générale et analgésie profondes dans le but d’extraire les cerveaux
Impact sur les animaux
Le modèle à la Cuprisone et les techniques d'enregistrement utilisés dans ce projet sont maitrisés depuis longtemps par les experimentateurs
Devenir
Procédure #1 : 10 souris traitées à la Cuprisone + 6 contrôles maintenues en vie. Procédure #2 : réutilise toutes les 16 souris issues de la procédure #1 10 souris traitées à la Cuprisone, dont 4 seront gardée en vie pour entrer dans la procédure #3 et 6 sont euthanasiées afin de réaliser des analyses neuroanatomiques sur les cerveaux ; 6 souris contrôles, dont 2 seront gardée en vie pour entrer dans la procédure #3 et 4 sont euthanasiées afin de réaliser des analyses neuroanatomiques sur les cerveaux. Procédure #3 : réutilise 4 souris traitées à la Cuprisone et 2 souris contrôles préalablement enregistrées dans la procédure #2. Elles entreront en fin de procédure dans la #4. Procédure #4 : réutilise les 6 souris issues de la procédure #3 où elles sont euthanasiées afin de réaliser des analyses neuroanatomiques sur les cerveaux.
Remplacement
Le cerveau est un des organes les plus complexes, et l’objectif de ce projet est de décrypter le lien possible entre le renouvellement physiologique et pathologique de la myéline. Le caractère méconnu du fonctionnement cérébral implique que ce projet ne peut pas se passer de l'utilisation d'animaux afin d'en déterminer les mécanismes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour réaliser ce travail.
Réduction
Il s’agit d’une étude pilote et il n’y a pas de bases statistiques pour définir le nombre d’animaux. Compte tenu du caractère individuel des lésions, l’unité expérimentale correspond à l’animal. Seulement deux groupes d’animaux (contrôles et traités) seront utilisés, et le nombre d’animaux par groupe a été optimisé à 6 et 10 respectivement pour réduire au minimum le nombre de souris tout en obtenant des résultats significatifs. Sur la base de notre expérience en neurophysiologie, nous estimons que 6 à 10 animaux par groupe représentent un nombre nécessaire et suffisant.
Raffinement
Ce projet propose des méthodes pertinentes pour limiter la douleur, la souffrance, le stress et l’inconfort. Nous avons mis en place des points limites adaptés et précoces pour chaque procédure (comme les interventions chirurgicales) et une réponse rapide (suivi post-opératoire, analgésie (Buprécare 0,05mg/kg/24h sCut et Metacam 1mg/kg/24h sCut), suivi quotidien des animaux). Tous les actes invasifs seront pratiqués sous anesthésie générale utilisant une association de kétamine-xylazine (100 mg/kg et 10mg/kg) - Buprécare 0,05mg/kg et ropivacaïne (2mg/kg). Le bien-être animal est aussi privilégié au niveau des conditions d'hébergement (animaux à plusieurs dans de grandes cages, eau et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en cartons et divers objets) pour minimiser le stress et être au plus près du comportement naturel de l'espèce animale.
Choix des espèces
La myéline compacte telle qu’on la trouve chez l’homme n’existe pas chez les Invertébrés ; c’est une « astuce » de l’évolution permettant d’accélérer la vitesse de conduction du signal en adéquation avec l’augmentation de la taille des organismes. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle animal vertébré. Parmi ceux-ci, les rongeurs sont particulièrement intéressants de par leur capacité à remyéliniser assez efficacement après lésion. Le modèle utilisant la Cuprisone chez la souris est le modèle de référence. De plus, les dynamiques cérébrales générales analysées dans ce projet sont conservées entre les rongeurs et l’Homme. Les résultats de notre étude permettront de mieux extrapoler les mécanismes cérébraux chez l’Homme. Les expérimentations seront initiées sur des souris adultes soit relativement jeunes (2-3 mois) soit plus âgés (6-8 mois), dont certaines seront conservés pendant 6 mois avant sacrifice (à ce moment les souris seront alors âgées de 8 à14 mois).
PhotoBioModulation (PBM) : Évaluation préclinique de Sécurité, de Performance et d’Efficacité d’un nouveau dispositif médical en vue de traiter le Syndrome de Détresse Respiratoire Aigu (SDRA) par PBM sur un modèle porcin.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
60 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures que le résumé classe sans réveil alors qu'une partie décrit un suivi de huit jours. En phase aiguë, ils subissent une chirurgie de six heures avec dix prélèvements sanguins puis sont mis à mort, en phase chronique ils reçoivent un dispositif implanté par voie percutanée et des séances de photobiomodulation trois fois par jour pendant sept jours avant d'être tués au huitième. Le projet évalue ce dispositif censé traiter le syndrome de détresse respiratoire aiguë, dans la perspective d'un essai chez des patients atteints de COVID-19. Le porteur indique que le modèle porcin est "obligatoire" avant le passage chez l'humain.
Objectifs
L’objectif de notre dispositif médical est de traiter le SDRA par la PhotoBioModulation (PBM) dont le principe est d’augmenter l’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène et d’induire un effet anti-inflammatoire et immuno-modulateur. La thérapie par PBM n’étant pas applicable de façon externe sur l’ensemble du volume pulmonaire, nous envisageons d’utiliser notre dispositif médical par voie intravasculaire en irradiant la masse sanguine. Par ce biais, les hypothèses sont de réduire l’hypoxie pulmonaire en modulant les facteurs pro-inflammatoires circulants, de diminuer le risque pro-thrombogène et d’accélérer le processus de régénération de la barrière alvéo-capillaire. L’objectif du projet est une étude préclinique chez le porc permettant d’évaluer : - la sécurité, la performance et l’efficacité du DM implanté dans le système veineux en phase aiguë (suivi pendant 6 heures) - la sécurité et la performance du DM implanté dans le système veineux en phase chronique court terme (suivi pendant 8 jours). Notre dispositif médical a fait l’objet d’une étude antérieure de faisabilité (APAFIS#27362-2020092816379591) réalisée sur la plateforme Chauveau de l’ENVA (Maisons-alfort) sur un modèle aigu (sans réveil) d’hypoxie chez le porc.
Bénéfices attendus
Ce projet a été construit à la suite des recommandations des autorités règlementaires (ANSM). Sur la base des résultats obtenus et dans les circonstances de non-risques potentiels (sécurité, performance et efficacité du dispositif médical), un essai pilote d’étude clinique sera proposé afin d’évaluer la sécurité du dispositif médical chez des patients atteints de SARS-Cov-2 lié au COVID-19.
Procédures
Phase 1 : Cette phase est sans réveil et sera réalisée sous anesthésie générale durant toute la procédure. Les animaux seront prémédiqués, intubés et anesthésiés (mélange halogéné + O2 + air) durant toute l’intervention. L’oxymétrie sera contrôlée par un capteur approprié qui vérifiera la saturation en oxygène. En début d’intervention, les porcs seront sous un mélange O2 (à 0,5 l/min) et air à (0,5 l/min) afin d’obtenir une FiO2 autour de 52%. Cette anesthésie permettra à l’animal d’être en anesthésie profonde et sans souffrance. - La procédure chirurgicale sera réalisée sur tous les animaux, 1 seule fois, pendant 6h de procédure environ, suivi du sacrifice (animal toujours placé sous AG) - Prélèvements sanguins sur tous les animaux, 10 fois, durant les 6h de procédure. - Prélèvements des tissus et organes au sacrifice. Phase 2 : - sous anesthésie générale selon la procédure décrite en phase 1 : procédure mini-invasive d’implantation du dispositif médical par voie percutanée sur tous les animaux, suivi d’un contrôle radiologique, 1 seule fois, pendant 1h de procédure environ - sous sédation légère (kétamine + xylasine + propofol par voie IV) : - prélèvements sanguins sur tous les animaux, 1 fois (5 minutes), à J0, J2, J4, J6 et J8 - traitements par PBM sur tous les animaux (5 à 10 minutes), 3 fois/jour pendant 7 jours - sous anesthésie générale : contrôle radiographique et sacrifice de tous les animaux à J8 pour prélèvements des tissus et organes pour analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Lors de la procédure N°1 en phase aiguë, tous les animaux seront placés sous anesthésie générale durant toute la procédure. Les effets indésirables attendus pourraient être une trop forte instabilité hémodynamique et respiratoire des animaux lors de la phase d’induction du modèle de détresse respiratoire qui nous obligerait à euthanasier l’animal durant la procédure. Lors de la procédure N°2 en phase chronique, les effets indésirables attendus pourraient être une infection au niveau du point d’introduction de notre dispositif médical au niveau du cou ainsi qu’une possible thrombose partielle de la veine jugulaire. Ces possibles effets indésirables seront minimisés au maximum en travaillant sous conditions stériles et en réalisant une antibiothérapie et une anticoagulation systématique de tous les animaux durant les 8 jours de suivi longitudinal.
Devenir
A l’issue des procédures 1 et 2, tous les animaux (placés sous anesthésie générale) seront sacrifiés par injection veineuse de Doléthal® afin de prélever les tissus (veine jugulaire) et organes (cœur, poumons) qui seront observés macroscopiquement lors de l’explantation. Ces échantillons seront ultérieurement étudiés par analyse histologique afin de nous permettre d’observer d’éventuelles lésions tissulaires et d’évaluer ainsi la sécurité de notre dispositif médical implanté in vivo.
Remplacement
Les effets de la PBM ont été testés au préalable sur des cellules cardiaques en cultures et sur des embryons de poulet. Notre dispositif médical a fait l’objet d’une étude antérieure de faisabilité sur un modèle aigu (sans réveil) d’hypoxie chez le porc et nécessite aujourd’hui une évaluation de sécurité et de performance. Le modèle préclinique (utilisation animaux) est obligatoire avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre total d'animaux a été réduit à 10 individus au maximum par groupe pour ces essais ; cet effectif permettra de détecter des anomalies ou des évènements indésirables majeurs avant une demande d'approbation d'un essai d'implantation chez l'Homme. Après expérimentation, du matériel biologique (organes, tissus) pourra être prélevé. Ces prélèvements pourront éventuellement servir pour les besoins d’autres études non liées à ce protocole, sans utiliser d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Pour réduire le mal être de l’animal à tous les stades de nos interventions: - Nous utilisons les techniques mini-invasives pour la pose des cathéters veineux (méthode de Seldinger) - L’entrée des porcs dans la structure expérimentale est programmée de façon à fournir aux animaux un environnement optimum (mise en loge d’expérimentation au minimum 7 jours avant l’intervention…). Les porcs sont hébergés dans les conditions adaptées à leur espèce, logés sur copeaux, en groupe sociaux puis en loge individuelle lorsque les animaux nécessitent un suivi individuel, avec jeux à leur disposition. Un suivi quotidien leur est apporté. Un vétérinaire assure le suivi sanitaire. - Les traitements quotidiens par PBM (durée moyenne du traitement : 10 minutes) seront réalisés sous sédation légère de l’animal. - Pour la mise à mort, l’animal est toujours préalablement anesthésié avant induction d’une surcharge anesthésique.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour notre étude est le porc adulte de taille réduite (lignée FBM, âgés de 12-20 mois, 55-70kg) qui présente une taille adulte pertinente pour tester notre dispositif à taille réelle et une anatomie vasculaire suffisamment proche de l’homme pour en faire un modèle satisfaisant d’essai préclinique. Ces porcs de taille réduite permettent de travailler sur des porcs adultes représentatifs de l’âge où surviennent les pathologies d’intérêt chez l’homme. Souvent les autres groupes travaillent sur des porcs charcutiers pris à un âge très jeune pour avoir un poids manipulable mais leur réactivité tissulaire et en particulier vasculaire relève plus de la pédiatrie et n’est absolument pas prédictive de ce qui se passe chez l’homme adulte. …. Nous utiliserons des porcs adultes de taille réduite, d’âge supérieur à 1 an, de sexe mâle (castré) ou femelle, ayant un poids compris entre 55 et 70 kg. L’éleveur est le fournisseur exclusif de cette souche de porcs (lignée FBM). Nous avons des données expérimentales importantes sur ce type d’expérimentation, nous permettant de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de nouveaux protocoles sans réveil de l’animal ou en chronique. Les résultats obtenus sur les animaux de cet âge sont convaincants et suffisants dans nos études. Ce modèle animal nous permet : - De travailler sur des animaux représentatifs de l’âge où surviennent les pathologies chez l’homme. - D’utiliser notre dispositif médical en taille réelle. De transposer les connaissances acquises vers une utilisation clinique humaine.
Photo-bio-modulation (PBM): Évaluation préclinique de sécurité, de performance et d’efficacité d’un nouveau dispositif médical permettant de traiter l’ischémie/reperfusion cardiaque en phase aiguë par PBM sur un modèle porcin.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
15 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. On leur ouvre le thorax par sternotomie, on ligature une artère coronaire pour provoquer un infarctus, on implante un dispositif lumineux dans le ventricule gauche, avec suivi par IRM et huit prélèvements sanguins sur cinq heures. Le projet teste ce dispositif de photobiomodulation censé limiter les lésions de reperfusion, les retombées pour les patients étant renvoyées à un éventuel essai clinique ultérieur. Le porteur décrit le porc comme le "modèle le plus pertinent à l'heure actuelle" pour la circulation coronaire humaine.
Objectifs
L'infarctus du myocarde se définit comme la nécrose d'une partie du muscle cardiaque, lorsque cette zone n'est plus irriguée par les artères coronaires qui lui apportent l'oxygène véhiculé par le sang. La prise en charge de l’infarctus du myocarde consiste à rétablir le flux sanguin en débouchant l’artère le plus rapidement possible après le début des symptômes. Bien que cette reperfusion soit obligatoire pour la survie du patient, elle engendre par elle-même des répercussions que l’on associe aux problèmes d’ischémie/reperfusion qui peuvent induire des phénomènes de mort tissulaire jusqu’à plusieurs jours après la reperfusion. La thérapie par Photobiomodulation (PBM) se définit comme une irradiation lumineuse athermique et non ionisante aux longueurs d’ondes visible et proche infrarouge, notamment, pour stimuler la consommation d’oxygène en phase d’hypoxie ou stimuler la réponse cellulaire et tissulaire afin d’améliorer la cicatrisation des tissus et en réduire l’inflammation. Ainsi nous souhaitons démontrer l’efficacité de la thérapie par PBM in situ sur le tissu myocardique ischémique à réduire significativement la perte de la fonction myocardique après reperfusion. L’objectif de cette étude préclinique est d’évaluer la sécurité, la performance et l’efficacité d’un dispositif médical innovant permettant le traitement en phase aiguë de l’ischémie/reperfusion cardiaque par la PBM sur un modèle de porc de taille réduite sur lequel nous induirons une ischémie cardiaque suivie d’une reperfusion de la coronaire. De façon générale, le porc possède une physiologie coronaire et cardiaque très semblable à l’homme. Cette vascularisation est très intéressante pour les travaux sur les maladies coronariennes et fait du porc le modèle le plus pertinent à l’heure actuelle pour ce domaine particulier. La mise au point du modèle expérimental porcin d’ischémie-reperfusion en phase aiguë a été réalisée dans le cadre d’une étude ultérieure qui nous a permis de caractériser par IRM les dommages cardiaques consécutifs à une lésion d’ischémie-reperfusion. Pour ce projet, un total de 15 porcs seront utilisés. Les animaux seront profondément endormis sous anesthésie générale, avec une prise en charge de la douleur due à la chirurgie. A l’issue du protocole, l’animal, toujours placé sous anesthésie générale, sera euthanasié et du matériel biologique (sang, organes, tissus) seront prélevés pour analyse.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’obtenir des preuves de concept d’efficacité de notre traitement par PBM dans un modèle d’ischémie-reperfusion cardiaque en phase aiguë. Nous voulons développer un produit qui permet d’irradier le cœur in situ pour permettre à la technologie de traitement par PBM de pallier significativement les effets de la reperfusion lors de la prise en charge de l’infarctus aigu du myocarde. Sur la base des résultats obtenus, nous pourrons soumettre une étude préclinique d’efficacité en phase chronique et dans les circonstances de non-risques potentiels (sécurité, performance et efficacité du dispositif médical), un essai pilote d’étude clinique sera proposé afin d’évaluer notre traitement par PBM chez des patients présentant une ischémie cardiaque. Cette nouvelle approche thérapeutique réduira significativement les lésions et la perte de la fonction cardiaque suite aux phénomènes délétères de la reperfusion suivant ischémie.
Procédures
La procédure est sans réveil et sera réalisée sous anesthésie générale durant toute la procédure. Les animaux seront prémédiqués, intubés et anesthésiés (mélange halogéné + O2 + air) durant toute l’intervention. L’oxymétrie sera contrôlée par un capteur approprié qui vérifiera la saturation en oxygène. En début d’intervention, les porcs seront sous un mélange O2 (à 0,5 l/min) et air à (0,5 l/min) afin d’obtenir une FiO2 autour de 52%. Cette anesthésie permettra à l’animal d’être en anesthésie profonde et sans souffrance. - La procédure chirurgicale (sternotomie, ligature de l’IVA, mise en place du dispositif médical dans le ventricule gauche) sera réalisée sur tous les animaux, 1 seule fois, avec un suivi pendant 5h de la procédure, puis sacrifice (animal toujours placé sous AG) - Le suivi par imagerie IRM sera réalisé sur tous les animaux sous AG durant les 5 h de procédure - Prélèvements sanguins (via le cathéter veineux central) sur tous les animaux, 8 fois, durant les 5h de procédure. - Prélèvements des tissus et organes au sacrifice.
Impact sur les animaux
Cette procédure en phase aiguë est sans réveil. Tous les animaux seront placés sous anesthésie générale durant toute la procédure, avec une prise en charge de la douleur. Les effets indésirables attendus pourraient survenir lors de la phase d’ischémie cardiaque et lors de la phase de reperfusion : une trop forte instabilité hémodynamique pourrait entraîner des arythmies et des fibrillations ventriculaires. Des manœuvres de réanimation (massages cardiaques et défibrillation par électrochocs) ainsi qu’une médication appropriée (anti-arythmiques, adrénaline) sont prévues afin de minimiser les risques. Cependant, nous ne pouvons pas exclure un décès de l’animal qui sera prononcé après 50 minutes de réanimation non efficace.
Devenir
A l’issue de la procédure, tous les animaux (toujours placés sous anesthésie générale) seront sacrifiés par injection veineuse de Doléthal® afin de prélever les tissus (veine jugulaire) et organes (cœur, poumons) qui seront observés macroscopiquement lors de l’explantation. Ces échantillons seront ultérieurement étudiés par analyse histologique afin de nous permettre d’observer d’éventuelles lésions tissulaires, de quantifier la zone à risque et d’évaluer ainsi la sécurité de notre dispositif médical implanté in vivo.
Remplacement
Les effets de la PBM ont été testés au préalable sur des cellules cardiaques en cultures et sur des embryons de poulet. Notre dispositif médical nécessite aujourd’hui une évaluation dans un modèle préclinique de taille humaine (porc) avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour cette étude, le nombre total d'animaux a été réduit au maximum à 15 individus traités par PBM ; cet effectif permettra de réaliser une comparaison statistique avec les résultats du groupe témoin obtenus lors d’une étude précédente. Après expérimentation, du matériel biologique (organes, tissus) pourra être prélevé. Ces prélèvements pourront éventuellement servir pour les besoins d’autres études non liées à ce protocole, sans utiliser d’animaux supplémentaires.
Raffinement
Pour réduire le mal être de l’animal lors de nos interventions : - les animaux seront placés sous anesthésie générale pendant toute la procédure, avec une prise en charge de la douleur - L’entrée des porcs dans la structure expérimentale est programmée de façon à fournir aux animaux un environnement optimum (mise en loge d’expérimentation collective au minimum 7 jours avant l’intervention…). Les porcs sont hébergés dans les conditions adaptées à leur espèce, logés sur copeaux, en groupe sociaux avec jeux à leur disposition. Un suivi quotidien leur est apporté. Un vétérinaire assure le suivi sanitaire. - Lors du transfert du site d’hébergement au site d’expérimentation, les animaux seront tranquillisés par une injection en IM de Stresnil®. - Pour la mise à mort, l’animal est toujours placé sous anesthésie générale avant induction d’une surcharge de Doléthal®.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour notre étude est le porc adulte de taille réduite (lignée FBM, âgés de 12-20 mois, 55-70kg) qui présente une taille adulte pertinente pour tester notre dispositif à taille réelle et une anatomie vasculaire suffisamment proche de l’homme pour en faire un modèle satisfaisant d’essai préclinique. Ces porcs de taille réduite permettent de travailler sur des porcs adultes représentatifs de l’âge où surviennent les pathologies d’intérêt chez l’homme. Souvent les autres groupes travaillent sur des porcs charcutiers pris à un âge très jeune pour avoir un poids manipulable mais leur réactivité tissulaire et en particulier vasculaire relève plus de la pédiatrie et n’est absolument pas prédictive de ce qui se passe chez l’homme adulte. …. Nous utiliserons des porcs adultes de taille réduite, d’âge supérieur à 1 an, de sexe mâle (castré) ou femelle, ayant un poids compris entre 55 et 70 kg. L’éleveur est le fournisseur exclusif de cette souche de porcs (lignée FBM). Nous avons des données expérimentales importantes sur ce type d’expérimentation, nous permettant de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de nouveaux protocoles sans réveil de l’animal. Les résultats obtenus sur les animaux de cet âge sont convaincants et suffisants dans nos études. Ce modèle animal nous permet : - De travailler sur des animaux représentatifs de l’âge où surviennent les pathologies chez l’homme. - D’utiliser notre dispositif médical en taille réelle. - De transposer les connaissances acquises vers une utilisation clinique humaine.
Plateforme chirurgie rongeur : Validation méthodologique et formation des utilisateurs
- Enseignement supérieur
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Rats : 70
1 140 rongeurs, des souris et des rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Ils subissent des chirurgies de la moelle, stéréotaxiques, une électroporation, une microdialyse, une vasectomie, des interventions sur nouveau-nés, ainsi que des gavages, injections et prélèvements sanguins. Ces gestes ne visent pas à produire des connaissances mais à standardiser les appareillages d'une plateforme de chirurgie et à former ses utilisateurs. Le porteur affirme que le recours aux souris et aux rats est une "étape obligatoire" impossible à remplacer et présente le "bien-être animal" comme un bénéfice de la formation.
Objectifs
La plateforme chirurgie rongeur de l’institut dispose de différents appareillages qui doivent être testés et validés afin de standardiser les procédures (les données recueillies serviront de base aux analyses des utilisateurs de la plateforme). Par ailleurs, la plateforme a également pour vocation de former les utilisateurs aux différents appareillages qui seront utilisés par ces derniers. Pour les formations réglementaires mises en place sur site et pour les certificats interne de formation des utilisateurs, nous utilisons des animaux du commerce ainsi que des animaux contrôles ou ne possédant pas le génotype d'intérêt mais sans phénotype dommageable de tous les projets autorisés au sein de l'animalerie, d’âge, de souche et de sexe contrôlés.
Bénéfices attendus
La plateforme a pour vocation de former les utilisateurs aux différents appareillages qui seront utilisés par ces derniers : les bénéfices de ce projet sont les bons usages des techniques par les utilisateurs et le bien-être animal lors de la mise en place de ces procédures.
Procédures
procédure 1 : chirurgie de la moelle (1 fois, sous anesthésie générale, 30min-1h, 184 souris et 10 rats), procédure 2 : chirurgie stéréotaxique(1 fois, sous anesthésie générale, 30min-1h, 184 souris et 10 rats ), procédure 3 : electroporation (1 fois, sous anesthésie générale, 30min-1h, 50 souris), procédure 4 : gavage, injection sous cutanée, intrapéritonéale sur animal vigil, (5 fois, sur animal vigile, 30min-1h, 184 souris et 10 rats), procédure 5 : prélèvement de sang (5 fois, sous anesthésie générale ou vigile suivant lesite de prélèvement, 30min-1h, 184 souris et 10 rats), procédure 6 : microdyalise (1 fois, sous anesthésie générale, 30-min-1h, 56 souris), procédure 7 : vasectomie (1 fois, sous anesthésie générale, 30-min-1h, 50 souris), procédure 8 : chirugie sur nouveau-nés(1 fois, sous anesthésie générale, 10-min, 50 souris), procédure 9 :euthanasie (1 fois, sous anesthésie profonde, 10-min, 496 souris et 50 rats)
Impact sur les animaux
aucun, nous utiliserons tous les méthodes adéquates pour l'hébergement, ainsi l'analgésie pre et post-opératoire
Devenir
procédure 1 (chirurgie de la moelle) = euthanasie , procédure 2 (chirurgie stéréotaxique) = euthanasie, procédure 3 (electroporation) = euthanasie, procédure 4 (gavage, injection sous cutanée, intrapéritonéale sur animal vigil) = réutilisation en procédure 9, procédure 5 (prélèvement de sang) = réutilisation en procédure 9 , procédure 6 (microdyalise) = euthanasie, procédure 7 (vasectomie) = euthanasie, procédure 8 (chirugie sur nouveau-nés) = euthanasie, procédure 9 = euthanasie
Remplacement
S’agissant d’une plateforme d'exploration fonctionnelle chez le rongeur, le recours à des souris et des rats est une étape obligatoire du processus. Il nous est impossible de substituer ces travaux avec d’autres méthodes n’utilisant pas ces animaux.
Réduction
le nombre d'animaux utilisé est réduit au maximum mais doit permettre une formation adéquate des utilisateurs
Raffinement
les procédures prennent en compte des temps de récupérations et des nombres d'essais visant à réduire le stress et la fatigue des animaux. Lors des procédures chirurgicales, un protocol adapté d'anesthésie et d'analgésie pre et post-opératoire est mis en place pendant 48h après la chirurgie. De plus les animaux sont hébergés en groupe jusqu'à 6 animaux par cage dans un milieu enrichi avec un nid et une maisonnette suite à une intervention chirurgicale. Le monittoring de la température, de l'hygrométrie ainsi que le suivi est réalisé quotidiennement
Choix des espèces
Notre projet nécessite l’utilisation de souris et de rats, au sein de la plateforme rongeur, pour l'amélioration des techniques de chirurgie mise en place mais également la formation des utilisateurs aux bonnes pratiques d'expérimentation. Les animaux seront utilisés après sevrage et jusqu’à 10 mois qui est la fenêtre de chirurgie classiquement utilisées par les utilisateurs de l'institut pour les procédures 1, 2, 4, 5, 6, 7 et 9 et embryonnaire pour la procédure 3 et P0-P2 pour la procédure 8. Les animaux commerciaux ne sont ni identifiés, ni génotypés par contre les animaux issus de la réutilisation sont tatoués (doigt) et génotypés entre 9-12 jours.
Effet d’une administration intranasale d’OP sur l’expression cérébrale du gène cFos chez la souris sauvage et la souris F77I
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
96 souris vont être utilisées, tuées sans réveil, dans des procédures menées sous anesthésie. Le résumé publié laisse vides les rubriques objectifs, procédures, bénéfices et impacts, remplacées par un texte type indiquant que leur absence empêchait l'enregistrement du dossier, si bien que ce qui est infligé n'y est pas décrit. Les seuls éléments renseignés indiquent une administration intranasale d'un peptide pour en étudier l'effet coupe-faim, dans un programme sur l'obésité et le diabète. Le porteur y qualifie d'"indispensable" le recours à un "organisme vivant intégré et autonome" comme la souris.
Objectifs
Cf 3.3.2.2. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 6 versions révisées suite aux 6 examens du Comité d'Ethique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.
Bénéfices attendus
Cf 3.3.2.2. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 6 versions révisées suite aux 6 examens du Comité d'Ethique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.
Procédures
Cf 3.3.2.2. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 6 versions révisées suite aux 6 examens du Comité d'Ethique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.
Impact sur les animaux
Cf 3.3.2.2. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 6 versions révisées suite aux 6 examens du Comité d'Ethique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.
Devenir
Cf procédures. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 6 versions révisées suite aux 6 examens du Comité d'Ethique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.
Remplacement
Les troubles du comportement alimentaire, l’obésité et le diabète en particulier, sont des préoccupations majeures de santé publique avec des incidences et prévalence en constante augmentation depuis plusieurs années. Actuellement de nombreux modèles de souris (HFD ; ob/ob ; MC4R-/-…) ont été développés afin de mieux appréhender l’origine des dérèglements centraux de l’homéostasie énergétique et proposer de nouvelles alternatives thérapeutiques. Afin de compléter nos données pharmacologiques obtenues sur cultures primaires et physiologiques sur l’effet anorexigène de l’ODN (OP) chez des souris sauvages et génétiquement modifiées, le recours à une organisme vivant intégré et autonome tel que la souris est indispensable.
Réduction
Cf 3.3.6.1. et RNT. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 6 versions révisées suite aux 6 examens du Comité d'Ethique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.
Raffinement
Cf 3.3.6.1. et RNT. La présente demande a été créée sous la version 1.1.1 d'APAFIS ainsi que les 6 versions révisées suite aux 6 examens du Comité d'Ethique local. L'absence de texte dans cette section empêche la sauvegarde définitive.
Choix des espèces
L’intérêt de travailler chez la souris réside dans le fait que tous nos travaux déjà effectués, tant in vitro qu’in vivo, l’ont été chez la souris. Dans un souci de cohérence scientifique nous souhaitons poursuivre nos études physiologiques chez cette même espèce. De plus, la souris est relativement sensible à une modification de son régime alimentaire et permet ainsi de suivre facilement l’impact d’un traitement sur son métabolisme énergétique. Afin de mener à bien nos objectifs, nous effectuerons nos expériences sur des souris âgées adultes de 6 à 10 semaines. En effet, à cet âge les souris ont terminé leur croissance longitudinale et la prise de poids est minimale après cette période.
Développement d’un nouveau modèle murin de la Dystrophie Myotonique de Type 1 : caractérisation physiologique et moléculaire du phénotype musculaire.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans une succession de procédures allant de la sévérité légère à modérée. Elles portent une mutation induite pour reproduire une dystrophie myotonique et subissent injections, prélèvements sanguins rétro-orbitaires et tests musculaires (grip test, rotarod), avant une analyse fonctionnelle invasive du muscle sous anesthésie suivie d'une mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur indique attendre une myotonie, une atrophie et une faiblesse musculaires, avec de légers troubles respiratoires. Il présente ce nouveau modèle murin comme un "enjeu majeur" et une étape "incontournable" pour comprendre la maladie et évaluer des thérapies.
Objectifs
La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est une des maladies neuromusculaires les plus fréquentes chez l’adulte. Cette maladie est caractérisée par de multiples symptômes parmi lesquels des atteintes musculaires (faiblesse musculaire, myotonie), cardiaques et neurologiques particulièrement invalidantes. La mutation à l’origine de cette pathologie consiste en l’expansion de répétitions CTG dans la région 3’ non traduite du gène DMPK. Les ARNm DMPK mutants contenant ces répétitions pathologiques s’accumulent dans le noyau sous forme d’agrégats (foci) et séquestrent notamment les protéines de liaison aux ARNs de la famille MBNL. La perte fonctionnelle de MBNL altère la maturation de plusieurs ARNs et certaines anomalies ont été associées à des symptômes. Cependant, d’autres mécanismes semblent être impliquées dans cette maladie complexe. Il n’existe actuellement pas de traitement pour la DM1. L’étude des mécanismes moléculaires à l’origine de cette maladie multisystémique nécessite des modèles animaux reproduisant les principaux symptômes observés chez le patient DM1. Ces modèles sont également indispensables pour valider le développement de nouvelles thérapies. Il existe quelques modèles murins de la DM1 qui ont permis de grandes avancées mais qui présentent cependant de nombreuses limites et ne reproduisent qu’une partie des symptômes de la DM1. Le développement de nouveaux modèles murins présentant le plus de similitudes avec la pathologie humaine est donc un enjeu majeur. Les objectifs du projet sont: 1) la création d'un nouveau modèle murin (souris) de la Dystrophie Myotonique de type 1, spécifique du muscle et reproduisant plus fidèlement les principales anomalies physiologiques, histologiques et moléculaires observées chez l'homme que les modèles animaux décrits précédement 2) la validation de ce modèle et l'optimisation des conditions d'induction de la mutation 3) l'analyse physiologique, histologique et moléculaire du phénotype musculaire induit par la mutation à long et court terme chez les souris 4) l'analyse de la réversibilité du phénotype après arrêt de l'expression de l'ARN mutant afin de mimer l’effet des thérapies et d’examiner la capacité de récupération musculaire dans les approches thérapeutiques ciblant cette maladie.
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce nouveau modèle murin une reproduction plus fidèle des défauts physiologiques, histologiques et moléculaires observés dans les muscles de patients DM1 que dans les autres modèles animaux décrits précédement. L'obtention et l'etude de ce nouveau modèle murin plus performant ouvrira la voie à une meilleure caractérisation des mécanismes moléculaires à l'origine de la pathologie et des conséquences physiologiques. Enfin l'utilisation de ce modèle devrait permettre de tester et de valider chez la souris le développement de nouvelles thérapies de traitement de la DM1 développées au laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur cette maladie.
Procédures
Les 720 souris ce projet seront impliquées dans des procédures de sévérité légère, modéré et sans réveil. La première procédure P1, de séverité modérée, qui s'étale sur une période de temps de 1 à 8 mois et concerne 672 souris est le maintient d'une lignée d'animaux transgéniques suceptibles de développer des symptômes musculaires. La deuxième procédure P2, de séverité légère, concerne 48 souris et consiste a injecter l'inducteur doxycycline en injection intra-péritoneale et s'étale sur une durée de 4 jours. La troisième procédure P3 de séverité légère et réalisé 2 à 3 fois au cours l'experience concerne 576 souris et consiste en un prélevement sanguin au niveau du sinus retro-orbitale. Les procédures P4 (grip test) et P5 (rotarod) de séverité légères concerne 576 souris et consistent en des tests non invasifs de la fonction musculaire qui seront réalisés 2 à 3 fois au cours de l'experience (selon la phase). La procédure 6, sans réveil, concerne 576 souris et consiste en un test invasif de la fonction musculaire réalisé sous anesthésie dont l'issue est la mort de l'animal par dislocation cervicale afin de réaliser des prélevements musculaires.
Impact sur les animaux
Les symptômes ou effets attendus pendant ou à l'issue de la procédure P1 (classée modérée) sur les souris induites uniquement (cad ayant recu de l'inducteur: doxycycline) sont exclusivement musculaires compte tenu de la specificité d'expression de l'ARN mutant et sont: une myotonie, une atrophie, une faiblesse ou une fatiguabilité musculaire plus importante pouvant se traduire par des troubles de la mobilité et des difficultés respiratoires légers. Les effets indésirables attendus pendant les autres procédures P2, P3, P4, P5 sont classés légers et sont un stress léger lors des manipulations et test d'évaluation fonctionnelle non invasifs du muscle ou de l'ordre de la gène ressentie lors d'une piqure (injections de doxycycline ou d'anesthésique). La procédure d'analyse fonctionnelle et invasive du muscle P6 s'effectue entièrement sous anesthésie et est classée sans réveil. En l'absence de l'inducteur (doycycline) administré soit en injection péritonéale (sévérité légère) en phase 1 soit par après addition au régime alimentaire (en phase 2 et 3) les souris ne présenterons aucun symptômes.
Devenir
En phase 1 étape 1, les 48 souris ne feront l'objet que d'une procédure (P2) et seront euthanisées le lendemain de la procédure pour réaliser des prélèvements de tissus musculaires nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires. En phase 1 étape 2, les 96 souris ne feront l'objet que d'une procédure (P1) et seront euthanisées a l'issue de la procédure pour réaliser des prélèvements de tissus musculaires nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires. En phase 2 et 3, après avoir été impliquées dans une succession de procédures P1, P3, P4, P5 et P6, les 576 souris seront euthanasiées après la procédure P6 (analyse fonctionnnelle du muscle) pour réaliser des prélèvements de tissus musculaires nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires
Remplacement
Les modèles in vitro de cellules musculaires restent imparfaits puisqu’ils ne reproduisent pas le contexte tissulaire adulte de la fibre musculaire qui est une cellule hautement spécialisée et différenciée. La compréhension des mécanismes à l’origine de la DM1 et le développement d’approches thérapeutique nécessitent d’avoir recours à des modèles animaux de cette pathologie qui expriment la mutation DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et physiologique. A ce jour, les modèles murins de la DM1 existants ne reproduisent que partiellement les anomalies moléculaires et physiologiques observées chez les patients. Le développement d’un nouveau modèle murin de la DM1 présentant davantage de similitudes avec la pathologie chez l'homme est un enjeu majeur et une étape incontournable dans la compréhension de la pathologie humaine et l'évaluation des approches thérapeutiques développées dans notre laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur la DM1. L’obtention de ce nouveau modèle murin de la DM1 présentant davantage de similitudes avec la pathologie chez l’homme est un enjeu majeur et une étape incontournable dans la compréhension de la pathologie humaine DM1 et l’évaluation des approches thérapeutiques développées dans notre laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur la DM1.
Réduction
Afin d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux, tous les animaux issus des croisements (sans distinction de sexe) seront utilisés. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, histologie et biologie moléculaire et ce, sur plusieurs tissus. Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation d’animaux supplémentaire prévue dans la seconde étape, et ainsi de suite. Les analyses physiologiques et comportementales finales seront réalisées avec des lots suffisants pour permettre d'obtenir des résultats statistiques fiables. Nos études précédentes, nous ont permis de déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés et assurer la distribution normale de nos données.
Raffinement
En conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. L’entretien des souris ainsi que les différents protocoles expérimentaux seront assurés par du personnel qualifié et le bien-être des animaux sera amélioré par la mise en place d’un enrichissement de milieu avec des nid de lanière kraft. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température (20-24 degrés) et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (éclairage 6h30-18h30). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur ainsi qu’une de perte de poids de 20% seront considérés comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduiront à l’euthanasie des animaux concernés. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement. Il est à noter que les souris transgéniques n’ont aucun phénotype avant l’addition de doxycycline au régime alimentaire. La majorité de nos études consiste à étudier à l’aide de tests non invasifs et invasifs la fonction musculaire de ces souris. Les tests invasifs seront réalisés sous anesthésie et seront sans réveil. Des études histologiques et moléculaires seront réalisées à partir d’échantillons de tissus prélevés sur les mêmes animaux après euthanasie de l’animal selon les procédures standard, réalisées dans le respect de l'éthique animal.
Choix des espèces
A ce jour, des modèles murins, drosophile et poisson-zèbres ont été décrit pour la DM1. Cependant tous ces modèles expriment soit des petites expansions CTG pures soit des expansions de triplets CTG interrompues différentes de la mutation humaine et ne reproduisent pas toutes les altérations physiologiques et moléculaires observées chez l'homme. Le seul modèle exprimant de grandes répétitions CTG est le modèle de souris DMSXL. Cependant l’expression musculaire du transgène chez la souris DMSXL adulte est faible et ne reproduit pas l’ensemble des anomalies présentent dans le muscle de patient DM1. Compte tenu de la complexité de manipulation de grandes répétions CTG pour la création de modèles, nous avons choisi de modifier le modèle murin DMSXL afin de produire au stade adulte, une quantité d’ARN mutants suffisante pour mimer le phénotype musculaire présent chez les patient DM1. Le développement d’un nouveau modèle murin est donc essentiel pour une meilleure compréhension de la physiopathologie et l’évaluation d’approches thérapeutiques pour la DM1. Au début des procédures les souris utilisées seront des souris sevrées et adultes âgées de 8 semaines. L'age des souris au début de l'expérience est justifié par la durée de l'expérience (>1 an) et par la nécessité que le développement musculaire soit achevé. En fonction des phases et de l’étude de l’impact du temps sur le phénotype les souris auront entre 2 et 15 mois lorsqu’elles seront euthanasiées pour les prélèvements.
Y a t-il un rythme circadien chez les juvéniles de Sepia officinalis ?
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
180 seiches juvéniles (Sepia officinalis) vont être utilisées, tuées sans avoir subi d'intervention préalable. Les œufs sont prélevés dans la nature, puis les juvéniles sont mis à mort par refroidissement progressif sur glace pour prélever leurs organes, cerveau, lobe optique et yeux, et étudier l'expression de gènes de l'horloge biologique sur vingt-quatre heures. Le porteur indique qu'aucun prélèvement partiel n'est possible sans "dommages irréparables", d'où la mise à mort, et qu'il n'existe "pas d'alternative in vitro". La recherche est fondamentale, avec des bénéfices annoncés pour la compréhension de l'évolution des rythmes et l'élevage de la seiche.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de déterminer si le juvénile de seiche Sepia officinalis montre après éclosion un rythme interne dit circadien correspondant à une « horloge biologique ». Ce projet consiste ainsi à caractériser le niveau d’expression des gènes impliqués dans le contrôle du cycle au cours d’un cycle jour/nuit, soit sur 24H. Le rythme circadien contrôle de nombreux mécanismes physiologiques liés au comportement, au sommeil, au niveau d’hormones entre autres. Presque tous les organismes vivants sont concernés. Il est en correspondance avec les alternances jour/nuit, soit selon un rythme 12h/12h. De nombreux organismes montrent un rythme journalier avant la naissance. Il est régulé par des gènes dont l’expression oscille au cours de la journée. Une régulation entre ces gènes a été mise en évidence chez les mammifères et la mouche. Chez certains mollusques marins de la zone de balancement des marées, il a été montré que l’expression de ces gènes suivait un rythme lié à la marée (rythme tidal), et non un rythme 12/12. Les seiches sont des espèces côtières et sont soumises particulièrement en Manche et Atlantique aux marées. Des expériences de rythmicité (comportemental) ont montré qu’elles avaient un rythme journalier avec une activité locomotrice et alimentaire plus importante la nuit. Nous avons montré que les gènes cibles sont exprimés dans l’embryon à un stade tardif, avant éclosion, et dans différents tissus dont les yeux. Par ailleurs, une première étude récente faite par l’équipe sur les embryons n’a pas permis de déterminer la présence d’un rythme avant éclosion dans les organes cibles. Il s’agit ici d’évaluer si une cyclicité peut être mise en évidence chez le juvénile et mise en relation avec leur physiologie et l’environnement (cycle tidal ou cycle jour/nuit) en déterminant la dynamique d’expression des gènes d’intérêt sur 24h.
Bénéfices attendus
Les résultats aideront 1) à approcher la diversité des rôles des gènes “circadiens” dans le rythme, gènes dont l’importance a récemment été reconnue par le prix Nobel de médecine (2017) 2) à la caractérisation d’un éventuel rythme interne, important pour l’optimisation des conditions d’élevage de la seiche mais aussi 3) à une meilleure compréhension de l’histoire évolutive des rythmes et de leur contrôle pour tous les animaux.
Procédures
Les animaux ne subissent aucune intervention avant leur euthanasie. Lorsqu’ils sont retirés de l’aquarium, ils sont immédiatement transférés dans un récipient et euthanasiés
Impact sur les animaux
Les animaux ne subissent pas de nuisances avant la mort, aucun effet indésirable n’est attendu car les animaux sont maintenus dans des conditions proches du milieu naturel.
Devenir
Pour étudier l’expression des gènes dans les tissus, il est nécessaire que les organes soient extraits et fixés, ce qui implique l’euthanasie des animaux. Il n’est pas possible de prélever une partie de l’animal sans causer des dommages irréparables (pas de survie après prélevement des yeux, du cerveau entre autres).
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à déterminer, par une approche physiologique globale, l’existence d’un rythme interne dans les organes (cerveau, lobe optique, yeux) d’un organisme entier. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle.
Réduction
Le nombre d’œufs prélevés dans la nature est minimisé à 180 oeufs en tenant compte des 10% d'oeufs qui ne sont pas fécondés naturellement. Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’éviter de la répéter ultérieurement si les résultats n’étaient pas satisfaisants. Le nombre tient compte de la variabilité biologique entre individus, de la puissance statistique pour des résultats robustes et des problèmes de qualité biologique qui peuvent advenir. Afin de respecter les limites acceptables de la validité scientifique, 10 individus juvéniles seront donc fixés pour chaque point horaire choisi, soit au total 160 juvéniles.
Raffinement
Afin d’éviter le stress des embryons, la grappe d’œufs est saisie entre les doigts puis retirée de son support en étirant les ligaments d’accroche jusqu’à la détacher délicatement. Les œufs récoltés sont transportés en eau de mer et placés dans des paniers flottants dans un aquarium de 200L, ce type de stabulation permet de maintenir des conditions optimales d’oxygénation pour les embryons dans l’oeuf. L’aquarium (200L.) est alimenté en circuit ouvert d’eau de mer filtrée (100µm.) non thermorégulée, c’est-à-dire à la température naturelle environnementale. Les œufs sont donc dans des conditions proches du milieu naturel du point de vue physicochimique : conditions « naturelles » de température (entre 16 et 18°C), de salinité (entre 35 et 36 g/L.), et de pH (8 à 8.2), et en conditions lumineuses du jour (éclairement normal). Les constantes physico-chimiques (température, salinité, pH, oxygène) sont contrôlées quotidiennement sur toute la durée du développement. Une observation quotidienne permet de s’assurer de l’état sanitaire des pontes mises en paniers. Lorsque les embryons ont éclos (naturellement), les juvéniles ressemblent alors à un adulte et adoptent immédiatement le mode de vie des adultes. Un enrichissement environnement sous la forme de cachette diverses (tube de et pièces de PVC, « cabanes…) est alors proposé aux animaux. Ils sont nourris à satiété avec des crevettes de taille adaptée. Les animaux qui présenteraient des anomalies comportementales (flottaison, immobilisme, blessure), seront écartés et immédiatement euthanasiés par surdose d’éthanol. Au bout d’une semaine, toutes les 1h30 sur 24h, 10 juvéniles sont pris à l’épuisette et placés dans un bécher d’un litre contenant de l’eau de mer du système d’élevage puis transportés jusqu’à une salle adjacente où l’euthanasie sera réalisée. Afin de limiter le stress et la souffrance supposée des juvéniles, ils sont transférés délicatement et rapidement dans l’eau de mer. Le récipient est mis sur glace ce qui permet un refroidissement progressif, et une anesthésie des animaux par le froid. Ils sont observés jusqu’à constatation d’une léthargie (relâchement pupillaire, le relâchement des bras et du manteau) puis une fois la mort confirmée (arrêt respiratoire, relâchement des chromatophores), les juvéniles sont placés dans le fixateur (froid également).
Choix des espèces
La seiche européenne est le seul mollusque possédant un cerveau et des yeux performants, qui ponde des œufs sur nos côtes. Contrairement à d’autres espèces de céphalopodes comme les pieuvres, son développement est court (
Etude des conséquences pressionnelles et homéostatiques des liquides labyrinthiques de l’animal soumis à un désordre pressionnel extrinsèque
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
50 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Chacune subit une chirurgie de deux à trois heures ouvrant l'oreille moyenne et cathétérisant les espaces sous-arachnoïdiens, avec une élévation de la pression intracrânienne. Le porteur indique que cette hyperpression sur le cerveau n'est "pas compatible avec le réveil de l'animal", d'où la mise à mort. L'objectif est de comprendre les mécanismes de la maladie de Ménière, le porteur justifiant le choix de la gerbille par la facilité d'accès à son oreille interne et une anatomie proche de celle de l'humain.
Objectifs
L'intitulé du projet est l'evaluation du profil evolutif pressionnel et homéostatique des compartiments de l'oreille interne d'un animal soumis à un deséquilibre pressionnel extrinséque, le but étant de comprendre les mécanismes sous-jacents responsables des symptomes d'une crise de maladie de Meniere qui sont essentiellement représentés par une surdité, des acouphènes et un vertige. les mécanismes étiopathogéniques restent à ce jours inconnus, il y'a plusieurs théories qui expliquent les mécanismes physiopathologiques responsables de l'eclosion des symptomes de cette maladie. La plus communement admise à l'heure actuelle est l'hydrops endolymphatique qui signifie l'augmentation du volume du compartiement périlymphatique de l'oreille interne, cela fut constaté la première fois par Hallpike et Cairns (Hallpike and Cairns, 1938) sur des dissections de patients porteurs de la maladie. Par la suite Kimura a provoqué un état similaire d’hydrops sur l’animal en empêchant la résorption de la périlymphe en bloquant l’aqueduc vestibulaire (Kimura, 1967) Les constatations électrophysiologiques de ce type de modèle étaient très variables, avec des atteintes minimes contrastant avec l’importance de l’hydrops (Salt, n.d.). De plus les mesures pressionnelles lors de ces manipulations montraient également des résultats discordants entre les auteurs qui mettaient en évidence un différentiel pressionnel entre les deux compartiments (Böhmer et al., n.d.)(Andrews et al., 1991)(Böhmer and Andrews, 1989)(Böhmer and Dillier, 1990)(Ito et al., 1987), et les auteurs qui retrouvaient une pression similaire(Klis and Smoorenburg, 1994; Tonndorf, 1983; Warmerdam et al., 2003). La question de la physiopathologie de cette maladie reste toujours d’actualité à savoir, est-ce l’hydrops (dilatation de la membrane limitante de Reissner) ? Ou l’excès pressionnel au dépend du compartiment endolymphatique (avec action prépondérante sur la membrane basilaire) qui est responsable des symptômes ?
Bénéfices attendus
comprehension des mecanismes sous-jacents responsables des symptomes de la maladie de Méniere, ce qui permettra ulterieurement d'adapter la thérapeutique
Procédures
Procedure chirurgicale (abord de l'oreille moyenne - catheterisation des espaces sub-arachnoidiens) et d'elevation de pression intracanienne : une procédure par animal (durée entre 2 et 3 heures)
Impact sur les animaux
Aucun, car animal anesthésié profondement puis sacrifié à la fin de l'intervention
Devenir
le sacrifice animal est necessaire du fait de l'effet de l'hyperpression intracranienne sur le parenchyme cerebral pendant la procedure qui n'est pas compatbile avec le reveil de l'animal
Remplacement
L’expérimentation sur la gerbille de Mongolie -qui est fréquemment utilisée au sein du laboratoire de biophysique neurosensorielle- a dans la majeure partie des cas été réalisée sans écueil particulier du fait de la facilité d’accès aux structures de l’oreille interne. L’animal doit être vivant, cela permet d’étudier les phénomènes osmotiques, biomécaniques et régulateurs actifs des pressions de l’oreille interne, phénomènes qui ne peuvent être observés chez l’animal mort. Enfin, il demeure impossible d’étudier ces phénomènes chez l’être humain, ce qui imposerait de cathétériser l’oreille interne avec risque accru de surdité sévère et vertiges invalident, le cathétérisme des espaces sous arachnoïdiens est également un acte invasif qui ne se justifie pas en conditions normales.
Réduction
Les etudes précedantes réalisées (voire le chapitre dédié) nous permettent de reduire l'effectif d'animaux necessaires au minimum
Raffinement
le bien-être animal sera amélioré grâce l’hébergement des animaux en groupe dans des cages enrichies. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré, per-opératoire
Choix des espèces
Le système cochleo-vestibulaire de la gerbille de Mongolie est sensiblement identique à son homologue humain. Lors des précédentes études, le cochon d’inde avait été utilisé, mais le fait qu’il présente des épisodes fréquents d’otite séreuse rend difficile l’expérimentation sur son oreille moyenne et interne. L’expérimentation sur la gerbille de Mongolie -qui est fréquemment réalisée au sein du laboratoire de biophysique neurosensorielle- a dans la majeure partie des cas été réalisé sans écueil particulier du fait de la facilité d’accès aux structures de l’oreille interne. L'appareil vestibulaire de la Gerbille est mature à partir de la première semaine post-natale tandis que l'appareil auditif l'est à 21 jours, lorsqu'elles ont atteints leur taille adulte. C'est donc à cet âge que nous commencerons les tests pressionnels
Développement d’un système d’angiographie super-résolue pour le diagnostic précoce de l’accident vasculaire cérébral.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
8 brebis vont être utilisées, anesthésiées pour des séances d'imagerie de trois à quatre heures sur trois jours, puis tuées à l'issue de la dernière acquisition. Elles reçoivent une injection d'agent de contraste pour mettre au point une échographie 3D super-résolue, comparée à l'IRM et à l'artériographie, avant un angioscanner cérébral post-mortem de très longue durée. Le porteur justifie le choix de la brebis par l'épaisseur de son crâne, proche de celle de l'humain, et affirme qu'il "n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou par simulation". Il s'agit d'une phase de mise au point technique sur animaux sains, préalable à un usage envisagé chez l'humain.
Objectifs
Nous souhaitons développer et utiliser l’échographie super-résolue pour diagnostiquer les AVC ischémiques et hémorragiques chez l’humain après une phase de développement chez l’animal. La technique de Microscopie par Localisation Ultrasonore (ULM en anglais) a été inventée en 2010 et démontrée dans le cerveau de rat. Cette technique consiste à tracer à l’échelle du micromètre le parcours d’un agent de contraste ultrasonore approuvé en clinique qui consiste en une solution de microbulles injectables (Sonovue®, Bracco) et restreintes au domaine vasculaire. L’ULM a ainsi pu cartographier la structure vasculaire à l’échelle des pré-capillaires chez l’animal et a aussi été utilisée depuis chez l’humain.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons développer et utiliser l’échographie super-résolue pour diagnostiquer les AVC ischémiques et hémorragiques chez l’humain après une phase de développement chez l’animal. La technique de Microscopie par Localisation Ultrasonore (ULM en anglais) a été inventée en 2010 et démontrée dans le cerveau de rat. Cette technique consiste à tracer à l’échelle du micromètre le parcours d’un agent de contraste ultrasonore approuvé en clinique qui consiste en une solution de microbulles injectables (Sonovue®, Bracco) et restreintes au domaine vasculaire. L’ULM a ainsi pu cartographier la structure vasculaire à l’échelle des pré-capillaires chez l’animal et a aussi été utilisée depuis chez l’humain.
Procédures
Les animaux suivroint deux procédures : Mise au point de l’angiographie 3D ULM et Imagerie par IRM et artériographie. Des sédations et anestésies générales seront nécesaires sur 3 jours, la mise à mort est prévue à la fin de la dernière séance d'acquisition de données. Les séances d'imagerie dureront entre 3 et 4heures maximum.
Impact sur les animaux
Cette toute première étape sera donc réalisée sur des animaux sains sous anesthésie générale. Une injection de l’agent de contraste Sonovue® sera réalisée par voie veineuse pour permettre l’acquisition. De plus, la méthode 3D ULM sera comparée aux gold standards que sont l’IRM et l’artériographie. Il est prévu de faire une campagne d’acquisition par animal avec les différents systèmes sur 3 jours. L’animal sera réveillé entre chaque journée d’acquisition. Une fois les séquences d’imagerie réalisées, l’animal sera mis à mort pour effectuer un angioscanner cérébral de très longue durée afin d’atteindre une résolution de quelques microns.
Devenir
Les animaux qui suivront la première procédure seront inclus dans la deuxième procédure. A la fin de l'acquisition de données de la deuxième procédure les animaux seront mis à mort sans réveil.
Remplacement
Notre projet de recherche porte sur les mécanismes pathologiques affectant le réseau vasculaire du cerveau. Bien que ces questions soient posées pour aider à une meilleure compréhension des pathologies humaines et l’amélioration de leur diagnostic, une première étape nécessite la neuro-imagerie chez le mouton dont l’épaisseur du crâne est similaire à celle de l’humain. Pour que le diagnostic ULM 3D des AVC chez l’humain puisse aboutir. En conséquence, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou par simulation des mesures que nous souhaitons réaliser.
Réduction
Nous estimons qu’il nous faudra au maximum n=8 brebis pour les mises au point technologiques. Nous considérons cependant la possibilité d'arreter les expériences des que lea robustesse dea imageries est suffisante.
Raffinement
Ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie adéquate afin d’abolir toute douleur et souffrance animale. Les conditions d’hébergement seront en adéquation avec le bien-être animal.
Choix des espèces
Afin de servir de modèle pour l’angiographie ULM 3D chez l’homme, le réseau vasculaire de l’animal ainsi que la conformation et l’épaisseur de son crâne doivent s’approcher de l’anatomie humaine. Le crâne doit comporter des aberrations acoustiques afin de démontrer les techniques de compensation, ce qui favorise le mouton par rapport à la souris ou au rat, dont l’épaisseur du crâne se rapproche de celle du crâne humain. Dans toute cette étude, des moutons adultes seront utilisés afin de bénéficier de cerveau pleinement développé et un crâne d’épaisseur similaire à celle de l’Homme.