Procédures sans réveil

16 lapins vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Après une inhalation du médicament sur animal éveillé, chaque lapin est anesthésié plus de deux heures, intubé par la trachée, et sa toux est déclenchée par un cathéter, l'exercice étant simulé par électrostimulation des muscles des cuisses. Le porteur maintient volontairement une anesthésie moyenne pour préserver le réflexe de toux, ce qui pourrait laisser subsister une douleur qu'il déclare couvrir par des antidouleurs. Il retient le lapin parce qu'il tousse, à la différence des rongeurs, pour tester un médicament de l'asthme sur la toux chronique.

Objectifs

L’objectif est d’analyser l’effet d’un médicament par voie inhalée, sur le réflexe de toux, au repos et à l’exercice – ce médicament est connu depuis longtemps dans le traitement de l’asthme et de la bronchopathie chronique obstructive mais n’a jamais été testé sur le réflexe de toux – la toux chronique est considérée seulement depuis quelques années comme une maladie en soit, jusque-là, la toux a toujours été considérée comme un symptôme d’une autre maladie.

Bénéfices attendus

Si notre hypothèse d’une diminution du réflexe de la toux au repos et sa disparation à l’exercice est vérifiée, alors ce médicament pourrait avoir un effet bénéfique dans le traitement de la toux chronique, voire la prévention de la toux à l’exercice.

Procédures

-inhalation du médicament ou de liquide physiologique pendant 3 min chez lapin vigil, -45 min, injection d’antidouleurs et anesthésie générale, maintenue pendant 2h30 – la profondeur de l'anesthésie est vérifiée et ajustée toutes les 5 min -chez lapin anesthésié : intubation par la trachée ; mesure en continu de la température corporelle, de l’activité cardiaque, des paramètres respiratoires, de l’activité des muscles abdominaux -chez lapin anesthésié : avec et sans exercice physique (l'exercice est simulé par stimulation de quelques secondes des muscles des cuisses par des électrodes) : induction de la toux par stimulation trachéale par un cathéter introduit dans la trachée

Impact sur les animaux

Toutes les expériences seront conduites sous anesthésie générale : la profondeur d'anesthésie est moyenne pour préserver le réflexe de toux - il pourrait donc exister un risque de douleur mais celui-ci sera couvert par l’administration préalable et systématique des médicaments anti-douleur et sera vérifiée toutes les 5 minutes

Devenir

il s'agit d'une procédure sans réveil, les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation

Remplacement

Le réflexe de toux ne peut s’étudier que sur un organisme entier, pourvu de réflexes – donc il n'existe aucune alternative à l'expérimentation animale si l'on souhaite analyser aussi précisément le réflexe de toux à l'exercice pendant le cycle respiratoire.

Réduction

16 lapins répartis en 2 groupes (médicament ou contrôle) seront nécessaires pour mener à bien ce projet et constituent l’effectif minimum requis pour une interprétation statistique pertinente. Ce nombre a été calculé en nous basant sur des données expérimentales issues des études précédentes, et en utilisant un logiciel de prévision statistique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans l'animalerie où toutes les règles de confort pour limiter au maximum l’anxiété et le stress sont appliquées : hébergement en groupe sociaux, au sol, présence d’enrichissements nombreux (balles de foin, jouets, plateformes pour se cacher ou grimper ; eau, nourriture à volonté L'anesthésie utilisée lors de l'expérimentation animale est conforme aux procédures validées par les services vétérinaires et le niveau de douleur est vérifié tout le long de l'expérimentation.

Choix des espèces

Le lapin de type Néo-zélandais a été choisi car c’est un animal qui présente un réflexe de toux, contrairement aux rongeurs. Des lapins de 3 mois seront utilisés car cet âge est optimal pour un bon fonctionnement des voies respiratoires avec des réflexes de toux présents.

32 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Après un jeûne de douze heures, chaque animal subit sous anesthésie une laparotomie et une chimiothérapie diffusée en aérosol pressurisé dans l'abdomen, puis huit prélèvements sanguins par cathéter avant la mise à mort, pour comparer des pompes et des buses de nébulisation. Le porteur décrit surtout un stress lié au transport et à la contention, jugeant les procédures peu douloureuses car pratiquées sous anesthésie générale. Il justifie le choix du porc par un péritoine et une cavité abdominale proches de ceux de l'humain, permettant d'employer directement le matériel chirurgical destiné aux patients.

Objectifs

La chimiothérapie à aérosol intra-péritonéale pressurisée (PIPAC) est une nouvelle technologie pour administrer une chimiothérapie intrapéritonéale et traiter les patients souffrant de carcinose péritonéale avancée. Le médicament de chimiothérapie liquide est délivré au moyen d'un injecteur haute pression grâce à une pompe brevetée et une buse adaptée. Cette approche thérapeutique de la carcinose péritonéale est supposée avoir le potentiel de surmonter les deux limitations majeures de la chimiothérapie intrapéritonéale liquide classique : une meilleure diffusion du produit dans la cavité péritonéale et la pénétration limitée du médicament dans le tissu tumoral. Cette technique est maintenant admise et est réalisée dans des cas bien sélectionnés de patients ayant une carcinose péritonéale avancée. Bien que prometteuse, elle soulève encore de nombreuses interrogations : les différentes variations de pénétrations en fonction de la pression, de la position de la pompe délivrant la chimiothérapie, et des différents systèmes de nébulisations qui arrivent sur le marché. Jusqu’à présent un seul système de buse était disponible dans le commerce, mais une nouvelle génération de technologie de buse est maintenant disponible. Alors que les buses de PIPAC conventionnelles pulvérisent l'aérosol dans la cavité abdominale dans le prolongement de l'axe de la buse, la nouvelle génération de buses dispose de trois têtes de pulvérisation supplémentaires. Elles pulvérisent horizontalement et radiairement dans la cavité abdominale, visant à optimiser la répartition spatiale de la chimiothérapie dans l’abdomen. L'amélioration de la distribution des médicaments devrait optimiser l'efficacité de ce nouveau traitement PIPAC par rapport à la technologie conventionnelle des buses mono-spray. Néanmoins aucune étude expérimentale animale n’a prouvé cette amélioration. Plusieurs paramètres de performance pour évaluer l'effet antitumoral de la PIPAC ont été définis par des groupes d’expert et permettent d’avoir maintenant des valeurs contrôle de comparaison. L'objectif de ce travail est de comparer cette nouvelle technologie de tête multi-spray avec les buses de tête mono-spray conventionnelles dans un modèle animal in vivo en termes de distribution spatiale, de profondeur de pénétration et de concentration de chimiothérapie dans les tissus.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’avoir des données très précises des niveaux de pénétration tissulaire et sanguin des différentes drogues dans le tissu péritonéale et le sang. Elle permettra de voir si les modalités d’administration sont identiques ou différentes entre les pompes. Ces résultats permettront de mettre en exergue l’absence ou non d’homogénéité de la répartition des drogues dans les tissus en fonction des différentes pompes. Ces résultats seront ainsi tout de suite applicables à l’humain en modifiant le type de pompe, les dosages des drogues, et en évaluant également le risque de surdosage par le passage systémique des drogues.

Procédures

Il s’agit d’une procédure à la fin de laquelle les animaux seront euthanasiés, sous anesthésie générale profonde. Ils ne seront soumis avant l’intervention qu’à une privation de nourriture pendant 12h avec accès libre à l’eau, et aux manipulations nécessaires avant anesthésie. Ensuite les interventions se dérouleront sous anesthésie générale et analgésie adaptée et la mise à mort sera effectuée à la fin de la procédure, sans réveil. Durant l'anesthésie, ils subiront une procédure PIPAC d'une durée de 30 à 40 minutes, 8 prélèvements de sang via un cathéter veinaux posé sous anesthésie; puis après une pause de 30 minutes, soit un passage au scanner de 20 minutes, soit une laparotomie médiane immédiatement après euthanasie pour prélèvements de tissus.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis avant l’intervention à une mise à jeun pendant 12h avec accès libre à l’eau. Ils pourront également subir un stress durant le transport entre l’UE et la plateforme, ainsi que pendant la manipulation au moment de l’anesthésie. Ils subiront une contention en cage puis une injection intramusculaire pour l'induction de l'anesthésie. Toutes les autres interventions se feront sous anesthésie : intubation orotrachéale, contention en décubitus dorsal sur la table d'opération, laparotomie pour la procédure de PIPAC.

Devenir

Une fois la procédure d’imagerie et de chirurgie pour prélèvement effectuée, les animaux seront euthanasiés. En effet aucun replacement ni adoption n’est possible après des injections d’agents de contraste, et la chirurgie peut avoir des effets délétères sur les animaux. De plus, le retour à l'élevage d'origine est impossible pour des raisons sanitaires.

Remplacement

Nous ne pouvons pas comparer les mesures de concentration tissulaire et sanguine des drogues dans un modèle ex vivo ; l’utilisation d’un modèle animal est indispensable pour reproduire la cavité péritonéale humide et respecter les caractéristiques de la ventilation mécanique et le milieu chaud et humide fermé. Le volume de la cavité péritonéale chez le petit animal ne permet pas de réaliser ce type d’intervention. Les instruments et les insufflateurs de chirurgie laparoscopique ne sont pas adaptés pour un si petit volume et les trocarts d’accès ne peuvent pas être utilisés chez le petit animal. Nous avons choisi le modèle porcin du fait de sa disponibilité et de ses nombreuses similitudes anatomiques avec l’homme, notamment son système digestif.

Réduction

Nous avons limité le nombre d’animaux au plus juste pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Nous utiliserons 27 animaux, et prévoyons 5 animaux supplémentaires en cas de problème. Nous nous sommes basés sur les études précédentes que nous avons réalisées et en utilisant les différences observées dans cette étude, nous utiliserons des tests conçus pour les petits effectifs. En nous basant sur les données de mesure de particules induite par la fumée chirurgicale in vitro, nous avons ainsi calculé la taille minimale d’un groupe de 3 animaux afin de respecter un niveau de signification de 95% et une puissance de 80%.

Raffinement

Les animaux seront logés dans des cases spacieuses contiguës avec des parois ajourées permettant le contact visuel entre les animaux et ils ne seront gardés en box de préanesthésie que la veille de l’intervention. Ils seront maintenus en groupe le plus longtemps possible, et manipulés dans le calme. Des mesures seront prises dès la prise en charge de l’animal jusqu’à la réalisation de la procédure en imagerie in vivo : Pré-examen imagerie/Anesthésie: les animaux arriveront la veille, et seront mis à jeun 12h avant l’intervention, avec abreuvement à volonté - Anesthésie (induction par voie intramusculaire), puis intubation, ventilation et maintien de l'anesthésie par voie gazeuse. La fréquence cardiaque sera enregistrée tout le long des interventions. En cas d’accélération du rythme cardiaque, sans perte sanguine associée, nous renforcerons le traitement antalgique par administration intramusculaire d'analgésique. En cas de tachycardie supérieure à 170 battements par minute, persistante au-delà de 5 minutes malgré l’administration d’analgésiques, nous procèderons à l’euthanasie (point limite). Mais nos procédures ne devraient pas être particulièrement douloureuses, elles reproduisent des interventions courantes chez l’homme sous anesthésie générale.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle porcin pour l’étude pharmacocinétique est indispensable, car cela reste le seul modèle animal possible pour étudier les modalités de diffusion de la chimiothérapie dans le péritoine. Le porc est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de pharmacocinétique de la chimiothérapie intrapéritonéale. L’anatomie digestive et les dimensions de la cavité péritonéale, similaires à l’homme, permettent de tester au mieux les modalités de diffusion péritonéale de la chimiothérapie. Le volume d’insufflation est similaire à l’homme et les instruments chirurgicaux et les dispositifs d’aspiration de la fumée disponibles sur le marché humain peuvent être utilisés tels quels. Le porcelet de 40 kg est le modèle le plus usité car la texture du péritoine et le volume de la cavité péritonéale sont similaires à l’homme et nous permettent d’appréhender au mieux les contraintes de volume en fonction de différents types de chirurgie.

15 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Sous une anesthésie pouvant durer deux heures, elles reçoivent une injection intra-artérielle de microcristaux suivie de séances d'imagerie, pour mettre au point une technique d'embolisation en vue d'une future étude sur la spondylarthrite. Le porteur indique recourir à des animaux de réforme ou déjà utilisés afin de ne pas en faire naître, et présente ce travail comme une étape de réduction pour les projets suivants. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou sur invertébré ne reproduit une maladie ostéoarticulaire chronique proche de celle de l'humain.

Objectifs

Plusieurs publication font état de tentative de guérison d'inflammations chroniques par injection intra-artérielle d'une substance qui forment des microcristaux. Il s'agit ici d'une mise au point technique préliminaire pour reproduire ce type d'injection chez la souris et de détecter ses effets par imagerie.

Bénéfices attendus

Les spondylarthrites sont des rhumatismes inflammatoires fréquent (0,3% de la population française) touchant les articulations, les tendons mais aussi d’autres organes (inflammation des yeux, de la peau et du tube digestif). Les raisons du déclenchement de cette maladie sont à ce jour mal comprises. Il y a parfois l’association d’une susceptibilité génétique et d’un environnement déclencheur comme une infection (exemple Chlamydia), et parfois l'influence de la flore intestinale est suspectée. Le but est de pouvoir tester un nouveau traitement et pour cela faire quelques mises au point ( imagerie, injection) avant de faire dans une étude longitudinale fonctionnelle (avec effet éventuel sur l'activité et la mobilité des souris) d'un modèle de spondylarthrite.

Procédures

Une injection IP ou SC d'un antalgique, puis une anesthésie volatile qui pourra durer 2h, avec mise à mort sans réveil. Durant cette anesthésie générale, il y aura une injection intra artérielle, possiblement une injection IV et des imageries.

Impact sur les animaux

Les animaux ne devront sentir qu'une douleur transitoire due à l'injection de l'antalgique, et un stress léger lors de l'induction de l'anesthésie dans le box à induction par isoflurane.

Devenir

Ils seront donc mis à mort avant leur réveil. Il s'agit de mises au point de techniques, sur des animaux de réformes, ou réutilisés : nous ne pouvons garantir leur état de santé après l'intervention.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle non vertébré ou insensible ou in vitro, de maladies ostéoarticulaire chronique semblable à l'homme. De plus cette étude doit permettre de rationaliser des essais cliniques faits sur l'homme, ce qui nous contraint de facto de mimer au plus près la situation chez l’homme.

Réduction

Nous utiliserons des animaux de réforme afin de ne pas faire naitre d'animaux pour cette étude, si nos contraintes de temps nous le permettent ainsi que le turn-over des animaux de réforme des animaleries avoisinantes. Cela est très, très probable. Cette étude est dictée par une démarche de réduction : la mise au point nous permettra de n'utiliser dans les projets qui suivront que le juste nombre d'animaux pour chaque question scientifique. Aucun test statistique n'est prévu à ce stade,

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés et sous analgéise avant d'être expérimentés, et ils ne seront pas réveillés. Nous ferons une antalgie en plus l'anesthésie terminale afin de s'assurer que l'animal ne souffrira pas, même si la couverture en isoflurane subit un aléas imprévu lors de la mise au point de l'imagerie. Les personnes impliquées sont d'excellents techniciens tant pour les imageries que pour les injections sur souris. C'est le mode d'injection et la zone à imager qui font l'objet de la mise au point ici. En cas de réveil inopiné (objectivé par une reprise de réflexe au pincement de la patte), ou d'aléas qui entrainerait un réveil non rectifiable (comme une coupure de courant), l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est le modèle qui sera utilisé pour étudier l'effet anti-douleur de ce type d'injection dans les arthrites réactionelles. Ce type d'étude se fait sur animaux adultes, la mise au point demande des animaux de taille similaire.

30 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque animal subit une seule chirurgie du rachis d'environ quatre heures, non pour produire des connaissances mais pour former des chirurgiens à des dispositifs de perçage vertébral et évaluer de nouveaux produits. Le porteur fixe un cochon pour deux à six participants sans aucun test statistique, et admet qu'un grand primate serait plus proche de l'humain mais qu'il lui préfère un "animal de rente" pour des raisons financières, pratiques et "psychologiques et éthiques". Il affirme qu'aucun protocole in vitro ou ex vivo ne reproduit les tissus vivants et les flux sanguins et juge l'entraînement sur animal vivant "nécessaire".

Objectifs

La chirurgie du rachis représente une difficulté majeure, par la présence de nombreux organes vitaux et sensibles (moelle épinière, terminaisons nerveuses, aorte). Les dispositifs médicaux permettent de sécuriser le geste du chirurgien en le guidant lors du forage des vertèbres car ils l’alertent en temps réel de potentiels dommages osseux lors de chirurgies de la colonne vertébrale. Ils sont équipés d'une technologie reposant sur la mesure de conductivité électrique (propriété d'un matériel à conduire le courant électrique) locale des tissus en temps réel, sans rayons-X, avec un capteur placé à la pointe de l’outil de forage. Le chirurgien est informé par les sons émis par le dispositif médical (comme un radar de recul de voiture) grâce à l’analyse de conductivité par le capteur. Son efficacité est prouvée par > 90 000 chirurgies dans le monde. L’une des branches de ce projet est de former les chirurgiens de la colonne vertébrale à l’utilisation de ces dispositifs médicaux. La formation au métier de chirurgien (humain ou vétérinaire) requiert un enseignement technique nécessaire à l’accomplissement des interventions chirurgicales. L'avènement des nouvelles techniques de communication et les progrès des ressources audiovisuels ont permis de grands progrès éducatifs. Cependant, la chirurgie reste un domaine technique où aucun apprentissage théorique ne pourra remplacer l'apprentissage technique. La formation des chirurgiens, la mise au point des dispositifs médicaux et ses évolutions technologiques nécessitent un modèle réaliste et représentatif des conditions réelles d’utilisation chez l’humain afin d’effectuer des tests de vérification/validation des choix techniques sélectionnés. Depuis quelques années, des simulateurs chirurgicaux se sont développés mais pour des raisons inhérentes à leur disponibilité et incompatibilité technique, les simulateurs ne peuvent pas être utilisés pour réaliser des formations aux chirurgiens. En effet, les simulateurs ne reproduisent pas la vascularisation et la conductivité électrique des tissus. Le deuxième objectif du projet est donc d’utiliser l’expérimentation sur animal car seul moyen d’évaluer de manière précise et dans des conditions réalistes les dispositifs médicaux développés.

Bénéfices attendus

L’utilisation de ces dispositifs pour la pratique de la chirurgie du rachis nécessite un apprentissage spécifique qui doit se faire en dehors de l'exercice clinique quotidien sur les patients et la mise en place d'un enseignement structuré en dehors du bloc opératoire est une nécessité. Une étude récente met en évidence que la formation chirurgicale sur animal des chirurgiens reste à l'heure actuelle la plus formatrice des techniques d'apprentissage. La chirurgie sur l’animal est en effet un exercice plus proche de la réalité. Son but est de permettre la réalisation d’interventions chirurgicales dans des conditions d’autonomie opératoire. De plus, ceci stimule la réflexion sur la gestuelle et les stratégies opératoires. Pour la partie expérimentale sur des nouveaux développements, les bénéfices attendus sont de permettre une évaluation réaliste et dans des conditions très proches d’une chirurgie sur l’humain des nouveaux dispositifs ou de nouveaux designs. Cette évaluation est primordiale pour la validité des activités de vérification technique, et est également attendue de la part de nombreuses autorités ou organismes d’homologation.

Procédures

Les animaux sont soumis à une seule procédure chirurgicale sous anesthésie générale, sans réveil. Elle dure environ 4h.

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables attendus seront réduits au minimum grâce à l'optimisation du protocole anesthésique et la prise en charge de la douleur en période per-opératoire (permettant, comme chez l’homme, de réaliser un acte chirurgical dans des conditions adaptées et non délétères pour l’animal) et du fait de la mise à mort des animaux en fin de chirurgie (protocole sans réveil). Des incidents chirurgicaux sont toutefois toujours envisageables et peuvent conduire à une mise à mort anticipée des animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la formation, les dissections réalisées autour du rachis ne permettant pas une qualité de vie adéquate pour les porcs à la fin de la formation.

Remplacement

L’entrainement final sur animal vivant est nécessaire car aucun protocole in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire correctement les conditions rencontrées en cours de chirurgie. En particulier, la nature des tissus vivants et les flux sanguins. L’anatomie du cochon, notamment au niveau de son squelette de sa colonne vertébrale sont plus proches de ceux rencontrés chez l’homme que ce qui est observé chez des modèles petits animaux type rongeurs ou lagomorphe.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux tout en en permettant un bon apprentissage pratique, un cochon pour 2 à 6 participants maximum sera envisagé. Aucun test statistique n'a été effectué pour déterminer ce nombre. Il repose sur l'expérience acquise sur ce type de formation.

Raffinement

Une formation théorique au bonne pratique chirurgicale et d’essais sur animaux vivants sera réalisée avant la formation ou l’expérimentation pratique. Les essais proposés ne requièrent pas de suivi post-opératoire ni que les animaux soient en état éveillé. Les animaux seraient donc endormis pendant les essais en chirurgie ouverte et mis à mort sans réveil. Les animaux ont une période d'acclimatation de minimum 7 jours afin de les habituer à la manipulation et la contention. Ils sont hébergés en groupes sociaux jusqu'à la date de l'intervention, sur copeaux (pour leur permettre d'exprimer leur comportement de fouissage). Des jouets en plastique (ballons) sont mis à disposition au sol ou accrochés au mur. Les animaux seront anesthésiés pendant l’étude expérimentale (analgésie multimodale pré et per opératoire avec un alpha-2 agoniste : xylazine et un opioïde : fentanyl en pré-médication puis à la demande) puis mis à mort avant réveil.

Choix des espèces

Le modèle porcs (Sus scrofa domesticus) est un modèle reconnu de modélisation chirurgicale compte tenu de sa taille et de sa conformation organique. L’anatomie du cochon, notamment au niveau de la colonne vertébrale, de la qualité osseuse et des flux sanguins sont plus proches de ceux rencontrés chez l’homme que ce qui est observé chez des modèles petits animaux type rongeurs ou lagomorphe. Le modèle grand primate est le modèle qui serait le plus proche d'une situation clinique pour des chirurgiens souhaitant pratiquer la chirurgie sur l’homme ou pour des scientifiques souhaitant expérimenter des applications visant l’humain, cependant pour des questions financières, pratiques et surtout psychologiques et éthiques concernant l'utilisation de ces animaux comme animaux d'expérimentation, un modèle animal de rente est préféré et le modèle porc est choisi. Cochon jeune, moins de 6 mois d'un poids d'environ 40 kg pour des raisons pratiques et économiques, tout en permettant un bon apprentissage chirurgical. Au cours du projet, s’il est nécessaire d’obtenir des spécimens avec une densité osseuse plus élevée, des cochons légèrement plus âgés, entre 6 et 12 mois seront peut-être également envisagés.

20 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Le thorax est ouvert et un arrêt cardiaque est simulé par occlusion d'une artère du cœur, une circulation extracorporelle prenant le relais par des canules posées dans une veine et une artère, pour comparer un traitement innovant à un traitement conventionnel de l'arrêt cardiaque. Le porteur affirme qu'aucune modélisation numérique n'existe pour cette étude et que la comparaison est "nécessaire". Il justifie le recours au gros animal par la similitude du cœur du cochon avec celui de l'humain et par la taille requise pour la circulation extracorporelle.

Objectifs

Chaque année, l’arrêt cardiaque touche en Europe près de 700 000 patients et 17 millions de personnes dans le monde. En l’absence de prise en charge efficace précoce, la survie dépasse rarement les 3 %. Même lorsqu’une réanimation a pu être mise en place rapidement, la reprise d’une activité cardiaque ne survient pas chez tous les patients. Nous proposons d’étudier l’impact d’un traitement innovant associant plusieurs médicaments à l'hypothermie, comparé à la prise en charge standard actuelle. Pour mettre en évidence de potentiels effets, nous mesurerons les variations de la tension artérielle, le débit cardiaque et la circulation sanguine au niveau microscopique via des techniques d'imagerie spécialisées. Nous évaluerons également les conséquences aux niveau des organes par prélevement post mortem et analyse des tissus au microscope. Des analyses sanguines nous permettrons de mesurer des possibles effets sur l'inflammation et la coagulation.

Bénéfices attendus

Le bénéfice sera de tester l’efficacité relative de cette combinaison de thérapeutiques afin d'améliorer le traitement de l'arrêt cardiaque réfractaire à la réanimation sous assistance circulatoire.

Procédures

Les animaux auront tout d'abord une injection d'un calmant afin de réduire le stress dû à la manipulation puis une perfusion intraveineuse sera posée afin de permettre une anesthésie générale. Une fois totalement endormi et sous traitement anti-douleur, nous procèderons à la mise en place d'un dispositif de circulation extra corporelle qui permet d'assurer un débit cardiaque et l'oxygénation du sang. Ce circuit implique d'installer une canule dans une veine et une artère du cochon. Nous réaliserons aussi une ouverture du thorax afin de mettre en évidence le coeur, et nous simulerons un arret cardiaque par occlusion d'une des artères du coeur. La circulation sanguine sera assurée par la circulation extra corporelle durant 60 minutes. Nous procederons à des prélèvements sanguins au moment de l'arret cardiaque, et après 3 et 6 heures. Toutes ces interventions sont réalisées sous anesthésie générale avec un anti-douleur délivré en continu.

Impact sur les animaux

Nuisances attendues sur les animaux : stress durant le transport et l'hébergement, douleur lors de l'installation de l'animal (piqure). Effets secondaires possibles : perte de sang lors de la pose de la circulation extra-corporelle.

Devenir

Notre protocole ne durant que quelques heures, le cochon ne pourra pas être réveillé dans des conditions compatibles avec la vie. De plus, des prélèvements de tissus cardiaques sont nécessaires pour une étude microscopique, l’animal ne reprendra pas conscience et sera euthanasié.

Remplacement

Il n'existe pas, à notre connaissance, de modélisation numérique pour cette étude. La place de cette approche thérapeutique n'a jamais été évaluée. Une vraie étude comparative est nécessaire. Le modèle de choc cardiogénique chez le cochon développé par notre équipe reproduit un état cardiologique très proche de l’état observé en clinique. Ce modèle animal est donc tout indiqué pour cette étude comparative.

Réduction

Modèle déjà en place dans notre structure permettant de réduire le nombre d’animaux à étudier, personnel formé à l’étude et la manipulation du modèle porcin. Le nombre d'animaux a été déterminé comme le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'obtenir des données statistiquements exploitables. La mise en place des appareillage (canules...) sera réalisée par des chirurgiens cardiaques expérimentés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes (au minimum 2 animaux) afin de limiter l’angoisse et le stress des animaux. Le milieu est enrichi avec des jouets adaptés (balles...). Une période de quarantaine d’au moins huit jours avant l’entrée des animaux dans le protocole est respectée permettant leur stabilisation physiologique et comportementale en réduisant le stress. Les animaux sont mis à jeun le jour de l’expérimentation et les cochons seront prémédiqués par l’injection intra-musculaire d’un produit anesthésique aux propriétés calmantes avec un produit psychotrope propriétés antidouleur. Les cochons seront ensuite sous anesthésie profonde pendant tout le protocole d'étude et sous antidouleur continue. Le cochon sera scopé en permanence, permettant de surveiller en continu la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire et la pression artérielle. Toute modification de ces paramètres entrainera une adaptation immédiate des médicaments afin d’assurer le confort de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle animal de cochon est utilisé pour sa similitude avérée, en termes d’anatomie cardiaque et de circulation sanguine, avec les processus physiologiques rencontrés en clinique. Le choix d’un modèle sur gros animal s’impose pour effectuer une circulation extracorporelle, nécessaire à notre projet. De plus, ce modèle est déjà connu de nos équipes.

23 lapins vont être utilisés, anesthésiés puis tués avant tout réveil, dans des procédures menées sous anesthésie générale continue. Chacun est intubé et ventilé mécaniquement pendant 24 heures, infecté dans la trachée par le pneumocoque, puis reçoit un traitement testé avant l'autopsie par injection létale d'anesthésiques. Le porteur maintient les animaux sous curare et anesthésie pour éviter tout réveil et prélève poumons, foie et rate, pour évaluer un inhibiteur de la protéine HSPB5 sur l'infection pulmonaire. Il retient le lapin plutôt que de plus petits rongeurs parce qu'il permet une ventilation prolongée par les voies naturelles, les retombées pour les patients en réanimation restant au conditionnel.

Objectifs

Objectifs du projet : L’objectif principal de cette étude vise à évaluer l’effet d’une injection par les veines d’un inhibiteur de la protéine HSPB5 (Heat Shock Protein B5) sur la capacité du lapin à éliminer les bactéries au cours de l’infection du poumon par la bactérie pneumocoque, sous ventilation mécanique à l’aide d’un respirateur. Objectifs secondaires : Evaluer l’effet d’une injection par les veines d’un inhibiteur d’HSPB5 sur : - L’amélioration du fonctionnement immunitaire - L’amélioration du fonctionnement des organes (poumon, foie) - La modulation du processus de fibrose du poumon (phénomène de cicatrisation anormale du poumon)

Bénéfices attendus

L’infection du poumon par la bactérie pneumocoque demeure associée à une forte mortalité et des séquelles pulmonaires, malgré les traitements anti-infectieux. Ces expériences permettront d’évaluer un nouveau traitement inhibant la protéine HSPB5 pour savoir si il améliore la capacité de l’organisme à éliminer les bactéries et permet une résolution plus rapide de l’inflammation. Ainsi ce travail permettra de préciser le rôle de la protéine HSPB5 dans la capacité de l’organisme à se défendre au cours de l’infection pulmonaire par la bactérie pneumocoque.

Procédures

Les lapins seront soumis, par ordre chronologique durant l’expérimentation : - Intubation orotrachéale par les voies naturelles sous anesthésie générale par un cathéter préalablement posé dans une veine, pour mise en place d’une sonde d’intubation afin de pouvoir pratiquer la respiration artificielle par ventilation mécanique (20’). - Ventilation mécanique utilisant des paramètres ventilatoires similaires à ceux utilisés en pratique clinique dans les services de réanimation pour les patients qui souffrent d’infections pulmonaires graves (24 heures). - Inoculation dans la trachée de la bactérie pneumocoque, par la sonde d’intubation, chez l’animal endormi, sous anesthésie générale continue (2’) - Injection du traitement (inhibiteur d’HSPB5) ou du traitement contrôle (composé sans effet sur HHSPB5) par le cathéter (5’) à H4 - Prélèvements de sang effectués en utilisant le cathéter veineux (2’) - Autopsie à 24 heures du début de l’expérimentation après injection létale d’anesthésiques (30’)

Impact sur les animaux

Des études antérieures montrent qu’une ventilation mécanique prolongée (jusqu’à 48 heures) avec des paramètres de ventilation plus agressifs que ceux utilisés dans cette étude, n’entraine pas de risque vital pour le lapin. Dans une précédente étude, ce même modèle, avec une ventilation plus protectrice pour le poumon, n’induisait pas non plus d’infection grave et de dissémination des bactéries dans le sang. Néanmoins l’ensemble des animaux sous respirateur pour effectuer la ventilation mécanique, seront sous anesthésie générale pendant l’ensemble de l’expérimentation (absence de réveil). Le cathéter veineux préalablement posé sous anesthésie générale permet un contrôle précis de l’administration des différents traitements et la réalisation des prélèvements de sang sans causer de douleur à l’animal. Les animaux seront présents à l’animalerie la veille du début de l’expérimentation. Les animaux resteront sous anesthésie générale pendant toute la durée de la manipulation, afin d’éviter toute douleur et tout réveil intempestif. Les animaux bénéficie aussi d’un traitement permettant d’immobiliser les muscles, comme lors de la prise en charge des patients en réanimation, et permettant une ventilation sans difficulté et sans aucun ressenti pour l’animal, comme réalisé dans nos précédents travaux.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure sous anesthésie générale, suivi d’une injection létale d’anesthésiques. Différents prélèvements seront effectués afin de réaliser les différentes mesures immunitaires, métaboliques, et afin d’évaluer les dysfonctions des organes. → Lavage broncho-alvéolaire : mesure de paramètres immunitaires et des concentrations d’HSPB5 → Prélèvement de tissu pulmonaire : histologie pour apprécier les dommages tissulaires, bactériologie pour apprécier la clairance microbienne, extraction de protéines pour mesures immunitaires et des concentrations d’HSPB5. → Prélèvement de foie et rate : bactériologie, extraction de protéines pour mesure des concentrations immunitaires et d’HSPB5. Ainsi, ces différentes mesures permettront d’évaluer l’effet de l’anti-HSPB5 sur le devenir de l’infection du poumon par la bactérie pneumocoque, sous ventilation mécanique.

Remplacement

Le Remplacement du modèle animal est limité pour ce type d’expérimentation. L’utilisation de modèles d’étirements de cellules de poumon ne permet pas de reproduire l’infection, la réponse immunitaire et les conséquences sur le reste de l’organisme qui conduisent au décès. Le lapin est un modèle privilégié pour réaliser une ventilation mécanique prolongée par les voies naturelles. La ventilation mécanique de plus petits animaux nécessite en effet des procédures plus invasives telles que l’ouverture vers l’extérieur de la trachée, ne peut être conduite plus de 6 heures, et se complique fréquemment. Les complications de cicatrisation anormale du poumon (fibrose pulmonaire) dans les suites d’une pneumonie surviennent essentiellement en réanimation où la pneumopathie a nécessité une ventilation prolongée. Ce modèle de ventilation mécanique chez le lapin apparait pour ce projet particulièrement pertinent.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum, tout en respectant nos objectifs scientifiques. Le nombre d’animaux est déterminé sur la base de nos précédents travaux représentera le nombre minimal d’animaux permettant de produire des résultats qui peuvent être analysés avec des tests statistiques. Au total, le nombre maximal de lapins sera de 23 : - N = 10/groupe (20 lapins au total) +/- 15% de perte attendue (23 lapins)

Raffinement

Chaque procédure est réalisée sous anesthésie générale. Un cathéter veineux maintenu par un gilet permet de s’affranchir de ponctions veineuses itératives et assure une anesthésie constante. Les animaux sont hébergés à température réglée. L’intubation et l’inoculation se font sur un animal préalablement anesthésié par le cathéter veineux. Un délai de 5 min est observé avant toute intervention. L’animal est pré-oxygéné. Un laryngoscope pédiatrique permet d’exposer les cordes vocales à la vue et d’insérer sous contrôle de la vue un guide semi rigide à bout mousse atraumatique entre les cordes vocales et par la suite la sonde d’intubation. En cas de mouvements moteurs lors de la stimulation de la bouche au début de la procédure, l’animal est reposé et une nouvelle dose de mélange anesthésique est administrée. L’intubation ne doit souffrir d’aucune résistance de la part de l‘animal. L’anesthésie est entretenue à l’aide d’un pousse seringue électrique pendant toute l’expérimentation et jusqu’au décès. Un médicament appelé curare permet de maintenir l’animal immobile pendant toute la durée de l’expérimentation, évitant tout risque d’extubation (retrait de la sonde d’intubation de la trachée de l’animal). Les animaux sont positionnés sur un tapis chauffant, hydratés par perfusion continue de sérum physiologique et les yeux hydratés puis occlus. Le rythme cardiaque est enregistré en continu pour dépister les variations de fréquence cardiaque et ainsi une possible dysfonction du système d’anesthésie pour y remédier rapidement. Cette surveillance est particulièrement importante dans les heures qui suivent le début de l’anesthésie générale, après l’intubation, pour détecter des défauts de fonctionnement de l’administration des traitements par le cathéter. Un passage systématique toutes les 8 heures sera effectué pour recueillir les constantes de l’animal, juger de l’efficacité de l’anesthésie et changer la seringue d’anesthésique. La mise à mort sera effectuée au terme de la durée d’expérimentation (24 h) par une injection létale d’anesthésiques administrée par le cathéter veineux. En dehors de complications possibles au moment de l’induction de l’anesthésie, nous n’attendons pas de mortalité avec ce modèle d’après nos précédents travaux, et ceux d’autres équipes. En cas de décès, l’animal sera sous anesthésie générale, sans réveil possible. Idem lors de l’autopsie programmée à 24 ou 48 heures. Une évaluation rétrospective sera effectuée à la fin du projet.

Choix des espèces

La ventilation prolongée est maitrisée sur de grands animaux (porc, singes). Les modèles sur petits rongeurs (souris, rat), ont de nombreuses limites qui rendent l’interprétation des résultats difficile : - Ventilation invasive par trachéotomie, source de complications (stress de l’animal, hémorragie, décès possible). - Contrôle difficile des volumes du fait de la taille de l’animal (une variation de volume peut entrainer des différences importantes en termes de lésions pulmonaires). - Durée de ventilation limitée (maximum 6h), l’information sera alors incomplète, car ne renseignant que sur les premières heures du processus. Le modèle du lapin permet une ventilation prolongée par les voies naturelles, sans entrainer de répercussion vitale et sur les paramètres d’échange gazeux. Lorsqu’ils auront obtenu un poids entre 2,8 et 3,3kg, environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont nécessaires. La filière respiratoire haute doit être suffisamment large pour permettre une intubation atraumatique (intubation plus difficile lorsque l’animal fait moins de 2,5kg). Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.