Procédures sans réveil
Etude de l’alvéolisation chez le rat en cas de retard de croissance intra-utérin induit par un régime hypoprotidique per gestationnel.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système respiratoire
568 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont les niveaux de souffrance vont de l'absence de réveil au modéré. Des rates gestantes reçoivent un régime pauvre en protéines pendant toute la gestation pour provoquer un retard de croissance chez leurs petits, puis 288 ratons subissent une injection quotidienne pendant dix jours avant mise à mort pour analyse des poumons. Le porteur indique que ce régime n'entraîne ni malformation ni surmortalité et classe l'injection comme peu douloureuse. Il présente le bénéfice, un traitement des troubles pulmonaires des grands prématurés, comme un objectif à moyen terme, et décrit le régime hypoprotidique comme le seul modèle animal reproduisant ces lésions.
Objectifs
Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est une adaptation à un environnement intra-utérin défavorable et a comme conséquence des altérations permanentes du métabolisme, de la croissance et du développement notamment pulmonaire et cérébral. Les conséquences du RCIU sont nombreuses et durables dans le temps. Le RCIU chez l'Homme multiplie par 6 la probabilité d'avoir un développement pulmonaire et notamment alvéolaire insuffisant chez le nouveau-né prématuré. L’alvéole pulmonaire est le principal site des échanges gazeux. Si sa taille diminue, la possibilité d’échanges gazeux entre l’air et les milieux intérieurs du corps humain diminue. En pratique, un nouveau-né prématuré a besoin d’apports en oxygène de façon prolongée car ses alvéoles ne sont pas suffisamment développées. Pour fonctionner, l’alvéole pulmonaire forme une niche de cellules en interaction et en communication. Les principales cellules participant à la croissance alvéolaire sont les pneumocytes de type 2 et les lipofibroblastes. Ces cellules sont régulées par des gènes jouant un rôle sur le métabolisme lipidique notamment le gène du Peroxisome Proliferative Activated Receptor (PPAR). Cette voie est modifiée en cas de RCIU. Le seul modèle chez l'animal reproduisant un RCIU et des troubles de l'alvéolisation est le régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD) pendant la gestation. Ce projet a pour but i) d'étudier les conséquences du régime LPD sur le développement pulmonaire de rats en étudiant l’aspect du poumon ii) de mieux caractériser les différentes cellules et leur répartition et iii) de proposer des traitements innovants pour favoriser la croissance et la régénération alvéolaire grâce à des médicaments agissant sur ces voies clés du métabolisme lipidique en recréant in vitro un poumon.
Bénéfices attendus
Ce projet améliorera la compréhension des anomalies de l'alvéolisation liées au retard de croissance intra-utérin et permettra d'aboutir à moyen terme à un traitement des troubles de l'alvéolisation chez les nouveau-nés prématurés humains.
Procédures
Les rates femelles adultes gestantes seront soumises à un régime hypoprotidique (Low Protein Diet (LPD)) pendant toute la durée de la gestation (21jours) Une partie des ratons (n=32) aura une analyse de leur fonction respiratoire : âge au moment des explorations fonctionnelles : 21 à 60 jours (durée des explorations : 1 jour). Une partie des ratons (n=288) recevra du 1er jour de vie au 10ème, une injection intrapéritonéale médicamenteuse (1 injection par jour d’une durée
Impact sur les animaux
Le régime Low Protein Diet a déjà été administré chez les rates gestantes sans complication en dehors d’une diminution de la prise pondérale pendant la gestation leurs petits. Le nombre de ratons par portée était identique à celui obtenu en cas d'utilisation d'un régime contrôle. Les animaux naissent avec un retard de croissance. Ils ne présentent pas de malformation associée. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul in utero ou après la naissance. Les injections médicamenteuses par voie intra-péritonéale sont couramment utilisées et n'induisent pas d'effet indésirable particulier pour les molécules étudiées en dehors de la douleur légère induite par l'injection elle-même. Les médicaments injectés ne sont pas décrits antérieurement comme induisant une douleur supplémentaire à l’injection. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 10%), les ratons seront mis à mort.
Devenir
Les ratons recevant les injections (procédure 2) seront gardés en vie au maximum jusqu'à J120. Les ratons de la procédure 1 (EFR) seront mis à mort à la fin de celle -ci. Les ratons seront mis mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement d’organes pour des études post mortem.
Remplacement
La principale cause de RCIU chez l’Homme est la prééclampsie. Il s’agit d’une pathologie exclusivement humaine. Plusieurs modèles de RCIU ont donc été mis au point chez l’animal. Le modèle de RCIU reproduisant au mieux les lésions observées chez l’Homme et le moins invasif pour l’animal est le régime Low Protein Diet (LPD). Notre première étude l'a démontré chez le rat où nous avons montré la ressemblance entre les lésions pulmonaires et cérébrales observées chez le rat et les RCIU humains. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles. L'étude de l’effet d'une molécule sur un organe aussi complexe que le poumon ne nous permet pas d'utiliser pour le moment de méthodes de remplacement.
Réduction
Les ratons issus des rates exposées ou non à un régime hypoprotidique seront étudiés dans les différentes expériences. Les animaux issus d'une même portée seront tous étudiés pour les différentes techniques choisies. Les animaux seront mis à mort à J4, J7, J10, J21, J60 ou J120 de vie pour étude des modifications fonctionnelles et cellulaires. Le nombre de ratons et de groupes expérimentaux ont été limités au strict nécessaire. La quantité de 6 à 8 animaux / groupe est la quantité adéquate pour chacune de nos analyses statistiques lors de nos études morphométriques, immunohistochimiques et moléculaires précédentes (qPCR, Western blot etc...). Une fois les données relevées, les tests statistiques prévus sont le Mann - Whitney test pour la comparaison des 2 groupes entre eux : comparaison de la masse des ratons (en g), etc... Le test utilisé pour la comparaison de 4 groupes après tests ex vivo sera un Two-way ANOVA (pour tester l'effet du régime et l'effet du traitement, ainsi que la combinaison des deux).
Raffinement
Afin de respecter la règle des 3R (raffiner, réduire, remplacer) dans notre projet, les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière à l'aspect, la mesure du poids et de la quantité de nourriture ingérée (femelles gestantes) et à l'aspect et la mesure quotidienne du poids pour les ratons. Les rates seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les rates auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, du papier kraft ciselé pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne. Aucune sur-mortalité n’avait été enregistrée précédemment et aucune malformation n’a été détectée. En cas de mal être : blessure, poids trop faible (si le poids est de 20% en dessous de la moyenne de la portée), déshydratation, les ratons seront mis à mort. Pour les mères adultes une attention particulière sera portée sur la quantité de nourriture mangée et sur le suivi de leur poids. En cas de perte de poids, la rate gestante sera sortie de l'expérimentation et mise à mort.
Choix des espèces
Le rat est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Notre première étude a montré de résultats reproductibles chez le rat et nous souhaitons le confirmer en allant plus loin dans les analyses moléculaires
Etude de la tolérance pulmonaire au décours d’une ventilation liquide chez le porc
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
30 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie, une partie sans réveil et une autre réveillée pour évaluer la récupération pulmonaire. Après une instrumentation chirurgicale d'environ deux heures, les animaux subissent une ventilation liquidienne des poumons destinée à induire une hypothermie rapide, présentée comme une stratégie contre les séquelles de l'arrêt cardiaque. Le porteur indique qu'une chute de l'oxygénation pendant l'induction ou une détresse respiratoire après réveil conduisent à une mise à mort anticipée, et que les poumons et la trachée sont prélevés en fin de protocole. Il affirme que l'étude d'un dispositif médical "doit se faire in vivo" et retient le porc pour sa proximité avec l'humain.
Objectifs
La survenue brutale et imprévue d’un arrêt cardiaque est un enjeu majeur de santé publique, à l’origine d’environ 700 000 décès chaque année en Europe et aux Etas-Unis. Bien que des avancées aient été faites ces dernières années afin d’améliorer la réanimation des patients, la mortalité reste considérable et seulement 5% des patients survivent avec une bonne récupération neurologique. Afin d’améliorer ce pronostic, notre laboratoire a développé une stratégie innovante qui consiste à induire une hypothermie ultra-rapide après l’arrêt cardiaque par la ventilation liquide totale hypothermisante des poumons. Expérimentalement, cette méthode est capable d’induire de puissants bénéfices neurologiques et cardiaques, par rapport aux méthodes traditionnelles de refroidissement. Dans la continuité d’un projet déjà déposé et validé, l’objectif de ce projet est de montrer la sécurité et la fiabilité du ventilateur liquidien pour induire une telle hypothermie ultra-rapide à l’aide d’un dispositif médical développé pour les patients adultes. Ce projet est nécessaire pour démontrer la tolérance pulmonaire du dispositif avant un usage chez l’homme.
Bénéfices attendus
Lors de travaux antérieurs évaluant les performances de la ventilation liquide totale à induire une hypothermie ultra-rapide, nous avons validé les performances attendues pour un dispositif médical de ventilation liquide hypothermisante. A partir de ce cahier des charges, un dispositif a été conçu et construit selon le chemin réglementaire attendu pour un dispositif médical commercialisable. Ce prototype doit donc être validé chez l’animal avant demande d’autorisation pour une évaluation clinique chez l’homme après un arrêt cardiaque. Le bénéfice attendu du projet est donc l’intégration des données à un dossier de demande d’évaluation clinique auprès des agences réglementaires.
Procédures
Les animaux seront exposés à une anesthésie à des fins d’instrumentation chirurgicale (pendant environ 2 heures) puis à une ventilation liquidienne pendant environ une heure (sauf dans le groupe témoin de la procédure 2). Dans la seconde procédure, les animaux seront soumis à 6 heures d’anesthésie supplémentaire et à une ventilation mécanique gazeuse. Ils seront ensuite réveillés afin d’évaluer la récupération pulmonaire.
Impact sur les animaux
L’effet indésirable susceptible d’être provoqué par la ventilation liquidienne totale est une hypoxémie pendant son induction. En cas de saturation en oxygène inférieure à 80% pendant 10 minutes, les animaux seront euthanasiés. De plus, l’apparition d’une difficulté respiratoire chez les animaux réveillés après la ventilation liquidienne peut entraîner une détresse respiratoire aiguë, objectivée par une polypnée ou une discordance respiratoire, les animaux seront euthanasiés.
Devenir
Afin de prélever les poumons et la trachée pour analyses histopathologiques, les animaux seront euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
L’étude de médicaments ou dispositif médicaux doit se faire in vivo, en utilisant des animaux à des fins scientifiques.
Réduction
Nous utiliserons 30 porcs à raison de 3 groupes de 10 animaux. Cette étude prévoit d’inclure 10 animaux par groupe en répartissant 5 mâles et 5 femelles dans chaque groupe. Ce nombre de 5 par sexe est le nombre minimal considéré comme acceptable dans les essais de tolérance ou toxicologie
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec leurs congénères dans des boxes avec des copeaux de bois au sol et enrichissement avec des jouets en plastique. Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques puissants, tout au long de la procédure.
Choix des espèces
Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme au vu de sa masse corporelle, de son anatomie cardiaque et des valeurs usuelles des paramètres hémodynamiques. Porcs à maturité sexuelle de 50 à 100 kg.
Formation pratique à l’endoscopie interventionnelle digestive sur modèle porcin
- Enseignement supérieur
90 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Chaque animal peut subir jusqu'à onze interventions endoscopiques du tube digestif au cours d'une même anesthésie d'environ sept heures, non pour produire des connaissances mais pour former des médecins gastro-entérologues à la dissection sous-muqueuse et à la gastro-entéro-anastomose. Le porteur indique que les risques sont l'hémorragie et la perforation en cours d'intervention et que les animaux sont tués sans réveil parce que le maintien en vie après autant d'actes s'accompagnerait de douleur. Il affirme que les simulateurs ne suffisent pas et que la pratique sur animal vivant est "indispensable" et "essentielle".
Objectifs
L’endoscopie a initialement été utilisée pour le diagnostique , et s’est développée pour réaliser de nombreux actes thérapeutiques . Elle permet l’utilisation d’un abord naturel, par conséquent mini-invasif pour traiter des pathologies graves avec le moins de morbidité possible. Parmi les pathologies concernées, nous pouvons citer par exemple le cancer colorectal (responsable de 18 000 morts par an), et les cancers de l’estomac, de l’œsophage et du pancreas (dont la survie est inférieure à 10% à 5 ans). Celles-ci peuvent etre traitées par les techniques de dissection sous muqueuse (colon, estomac, œsophage) et gastroentéroanastomose (pancreas). L’évolution constante des techniques et leur diversité croissante, impose une formation adaptée afin de pouvoir réaliser ces gestes en sécurité chez le patient. L’objectif de ce projet est de réaliser des formations pratiques pour les médecins gastroentérologues dans ces deux techniques :la dissection sous muqueuse et la technique de gastroentéroanastomose. La société européenne d’endoscopie gastrointestinal recommande ou impose la formation à ces techniques sur simulateurs et sur modèles animaux avant d’être pratiquées chez l’homme afin d’éviter tout risque de complications chirurgicales.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de former les praticiens gastro-entérologues à des gestes techniques complexes de l’endoscopie digestive interventionnelle qui nécessitent un entrainement régulier. Les bénéfices seront importants pour la sécurité des patients qu’ils auront à traiter par la suite.
Procédures
Trois jours avant l'intervention, les animaux seront placés sous régime hydrique à volonté constitué d'un mélange d'eau, de miel et de polyethylene glycol dans le but de vider et nettoyer le tube disgestif. Le jour du traitement, les animaux seront placés sous anesthésie générale et sous antalgique. Deux types d'intervention seront réalisées: la dissection sous muqueuse (dans l'estomac, l'oesophage et le colon) et la gastroentéroanstomose sous échoendoscopie. Il y aura au maximum 11 interventions par animal (10 dissections sous muqueuse et 1 gastroentéroanastomose). A la fin des différentes interventions, l'animal sera maintenu sous anesthésie générale et mis à mort . Le temps d'anesthésie sera d'environ 7 heures pour chaque animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles sur l'animal au cours de la procédure sont - le stress et l'inconfort lié à la mise à jeun et le régime imposé pour le lavage du tube digestif -les risques d'hémoragie/perforation en cours d'intervention. La procédure est entièrement réalisée sous anesthésie générale et sous analgésie.
Devenir
Les 90 porcs du projet (sur 5 ans) seront mis à mort à la fin de la procédure car de nombreux actes sont réalisés sur le même animal (10 prélèvement lors des dissections sous muqueuse et 1 gastroentéroanastomose) et le réveil et le maintien en vie de l'animal seraient accompagnés de douleur et d'inconfort digestif pour l'animal.
Remplacement
Des formations pratiques sur simulateur existent pour s'entrainer à des gestes simples d'endoscopie et de manipulation des endoscopes. Cependant , elle ne permet pas de mimer les mouvements respiratoires et les complications opératoires. C’est pourquoi il est indispensable de pratiquer ces deux techniques (dissection sous muqueuse et gastroentéroanastomose sous échoendoscopie) sur modèle animal avant de passer sur l’homme. La formation sur animal vivant est essentielle pour acquérir la maitrise des nouvelles techniques dans des conditions proches de celles observées chez l’homme avec gestion des mouvements respiratoires, prise en charge des hémorragies et gestion des perforations. Il n'existe pas de modèle in vitro ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter ces éléments.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs actes seront réalisés sur le même animal. Un maximum de 10 dissections sous muqueuse et une seule gastroentéroanastomose (pour des raisons anatomique) seront réalisés sur chaque animal.
Raffinement
Les porcs arriveront sur place au minimum une semaine avant la procédure pour leur permettre de s’habituer aux lieux et ainsi diminuer leur stress. Ils seront logés pendant la phase d'acclimatation dans un box sur litière de paille ou de copeaux de bois agrémenté de jouets. Dans le cas des formations régionales ,ils seront logés par groupes sociaux afin de respecter leur comportement grégaire. La litière sera retirée lors de la période de mise à jeun et de régime, et un jeu supplémentaire sera ajouté dans le box. En cas de température inférieure à 10 degrés dans l’animalerie, un système de chauffage individuel sera activé. Le personnel animalier observera deux fois par jour les animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels (perte d'appétit, posture antalgique et comportement inhabituel ) seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance avant le début de la procédure seront auscultés et soignés par le vétérinaire traitant, et si jugé nécessaire retirés de l’essai. La procédure se déroulera entièrement sous anesthésie générale (AG) et sous analgésie. En cas d'atteinte d'un point limite, la procédure sera interrompue.
Choix des espèces
Le porc est l’animal choisi en raison de la proximité anatomique du tractus digestif avec celui de l’homme et d’une composition similaire des muqueuses et sous muqueuse permettant la réalisation de la technique. Pour ces raisons la technique de dissections sous muqueuse et la technique de gastroentéroanastomose sous échoendoscopie peuvent être réalisées de manière identique à la technique chez l’homme sans matériel spécifique à l’espèce. Les animaux auront un poids entre 35 kg et 50 kg maximum, afin que la taille de l'oesophage et de l'estomac soit le plus comparable à ceux de l'homme et que le matériel endoscopique humain soit adapté et de longueur correcte.
Evaluation du dispositif Clampless 2 sur modèle ovin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
8 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié opérées et tuées sans réveil, l'autre en gravité modérée. Chaque animal subit un pontage artériel d'environ deux heures sous anesthésie générale pour tester un stent vasculaire en T, avant l'explantation du dispositif après mise à mort. Le porteur indique des risques de douleur, d'hémorragie et de thrombose, pris en charge par analgésie et médication. Il justifie le recours à la brebis par un diamètre d'artère proche de celui de l'humain et affirme qu'un banc d'essai ex vivo sur aorte de porc ne suffit pas à valider le dispositif en conditions réelles de flux.
Objectifs
En France, environ 13 000 pontages artériels périphériques sont réalisés chaque année, chez des patients souvent fragiles et âgés, présentant des lésions artériels étendues, pour lesquels les résultats des techniques endovasculaires actuelles sont médiocres. Selon leur localisation (pontage fémoro-poplité, pontage aorto ou ilio-fémorale, pontage axillo-fémoral, …), ces pontages sont grevés d’une mortalité variant de 2,3% (pontages fémoro-poplités) à 4,1 % (pontages aorto-fémorales), et une morbidité de 16 à 36,8 %. Ils nécessitent une anesthésie générale et impose une hospitalisation de 8 à 12 jours, avec parfois un séjour en réanimation. L'objectif de ce projet est d'évaluer un nouveau dispositif permettant ce type de pontage. Le dispositif est une endoprothèse (stent) vasculaire en forme de T qui permet l’implantation latérale d’une prothèse sur une artère, sans suture. Son utilisation permettrait de simplifier les techniques de pontages vasculaires afin de réduire significativement la taille des incisions chirurgicales, et éviter un arrêt circulatoire de 20 à 30 minutes, et ainsi d’évoluer vers une technique percutanée, réalisée sous anesthésie locale. Le but de l’étude est d’évaluer l’implantation du dispositif sur modèle ovin, afin de mettre au point et valider la technique opératoire d’implantation de ce nouveau dispositif, et de mettre en évidence les premières preuves d’efficacité et de sécurité du dispositif avant les évaluations de sécurité règlementaires.
Bénéfices attendus
L’objectif du dispositif testé (Clampless2) est de simplifier les techniques de pontages vasculaires et les bénéfices attendus sont une réduction significative de la taille des incisions chirurgicales, une diminution des risques opératoires (éviter un arrêt circulatoire de 20 à 30 minutes), et ainsi évoluer vers une technique percutanée, réalisée sous anesthésie locale. Ce projet est un étape dans le processus développement de ce dispositif car il permet de mettre au point et de valider la technique opératoire d’implantation de ce nouveau dispositif, et de mettre en évidence les premières preuves d’efficacité et de sécurité du dispositif avant les évaluations de sécurité (toxicité) règlementaire.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et sous antalgique. La durée de l'anesthésie sera d'environ 2 heures. Après leur réveil, les animaux rtecevront des traitements quotidiens par voie orale pour par voie sous-cutanée ou intramusculaire (antibiotique, antalgique, anti-thrombotique). A la fin de l'étude, les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Lors de la phase de chirurgie, les nuisances ou effets indésirables seront la douleur, et les risques l’hémorragiques. La procédure sera réalisée sous anesthésie générale et sous antalgie, et sera conduite par des chirurgiens vasculaires spécialisés dans ce type d’interventions sur l’homme. Lors de la phase de suivi post opératoire (procédure 2), les nuisances ou effets indésirables seront la douleur, les infections, les risques hémoragiques et les risques de thrombose. Ceux-ci seront prévenus par la médication mise en place : analgésie, antibiotique et anti-thrombotique.
Devenir
A la fin des deux procédures, tous les animaux seront mis à mort, et les dispositifs placés seront explantés pour des analyses supplémentaires.
Remplacement
Des études préliminaires ont été réalisées sur un banc d’essai sur modèle ex vivo (à partir d’aorte abdominale de porc) afin d’évaluer la mise en place du dispositif sous flux d’eau (afin de modéliser le flux sanguin). La perméabilité et l’étanchéité du dispositif ont été vérifiées, et le geste opératoire a été optimisé par évaluation du temps d’implantation et des pertes de fluides pendant la procédure. Cette étude préliminaire importante ex vivo ne permet cependant pas le remplacement total du modèle animal vivant. Il reste nécessaire de valider le dispositif sur un modèle entier vivant afin de travailler dans des conditions réelles de flux artériel, et de respiration, et pouvoir suivre à court terme (4 semaines) la tolérance et l’impact de l’implantation du dispositif, non modélisable sur modèle in vitro ou ex-vivo.
Réduction
Des études préliminaires ont été réalisées sur un banc d’essai sur modèle ex vivo (aorte abdominale de porc) afin d’évaluer la mise en place du dispositif sous flux d’eau (afin de modéliser le flux sanguin). La perméabilité et l’étanchéité du dispositif ont été vérifiées, et le geste opératoire a été optimisé par évaluation du temps d’implantation et des pertes de fluides pendant la procédure. Ce travail préliminaire permet donc de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisé grâce à une sécurisation du dispositif et une maitrise des gestes pratiqués. Le pontage sera réalisé entre les artères iliaques droite et gauche. Cependant, afin de diminuer le nombre d’animaux, un deuxième site possible de pontage sera exposé (carotide) à la fin de la chirurgie pour les animaux de la première procédure uniquement, afin d’anticiper de futures applications du dispositif.
Raffinement
Les animaux arriveront sur place au minimum une semaine avant la procédure pour leur permettre de s’habituer aux lieux et au personnel et ainsi diminuer leur stress. Ils seront logés par groupes sociaux (2 animaux) afin de respecter leur comportement grégaire. Ils seront hébergés sur litière de paille. Le personnel animalier observera au minimum deux fois par jour les animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation, et les animaux seront soignés par le vétérinaire et si jugé nécessaire retirés de l’essai. La procédure chirurgicale se déroulera entièrement sous anesthésie générale et sous analgésie. La douleur post opératoire sera évaluée selon une grille de douleur et prise en charge par un traitement analgésique adapté.
Choix des espèces
Les deux modèles possibles et décrits dans la littérature pour l’évaluation de ce type de dispositif et de chirurgie sont le porc et la brebis. En prévision d’une étude règlementaire longue de 3 à 6 mois, il est nécessaire de travailler sur un modèle adulte et physiologiquement stable et de taille similaire à l’homme (diamètre des artères stable afin d’éviter les risques de désinsertion du stent en cours d'étude) . Le modèle choisi est la brebis.
Impact de l’interaction ChiA/CHI3L1 sur l’implantation intestinale des Escherichia coli adhérents et invasifs associés à la maladie de Crohn : étude chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sans réveil. Elles reçoivent pendant douze jours un traitement au DSS, un antibiotique et des gavages quotidiens, avec des isolements pour collecter des fèces, afin d'induire une colite et d'étudier l'implantation de bactéries associées à la maladie de Crohn. Le porteur décrit une diarrhée et une perte de poids inférieure à 10 %, les souris étant tuées pour les prélèvements. Il indique avoir mené des études in vitro préalables mais juge l'expérimentation "indispensable" pour reproduire la complexité de l'interaction hôte-bactérie.
Objectifs
Le microbiote intestinal est un écosystème complexe de micro-organismes dont l'équilibre peut être rompu lors de pathologies comme la maladie de Crohn (MC). Les patients atteints de MC ont un microbiote enrichi en entérobactéries dont les Escherichia coli adhérentes et invasives (AIEC). De plus, chez ces patients, l’altération de la barrière intestinale engendre une augmentation de sa perméabilité, facilitant ainsi le passage d’éléments microbiens vers la lamina propria. Cet afflux d’éléments exogènes provoque une réponse immunitaire locale exacerbée. Ainsi, ces patients souffrent d’un état inflammatoire chronique au niveau de l’intestin jumelé à une accumulation locale de molécules pro-inflammatoires stimulant le système immunitaire dont les macrophages intestinaux. Ainsi, les macrophages sont considérés comme des acteurs clés de l’inflammation intestinale dans la MC. Néanmoins, chez les patients atteints de la maladie de Crohn, les macrophages sont jugés défectueux car incapables d’éliminer les bactéries ce qui est pourtant leur fonction dans l’organisme. Une protéine de ces macrophages, nommée CHI3L1, est en partie responsable du dysfonctionnement des macrophages dans l’élimination des AIEC. Il est décrit que la CHI3L1 est fortement exprimée par les cellules épithéliales intestinales des patients atteints de MC et qu’elle joue un rôle clé dans l’interaction des cellules de la barrière avec les bactéries AIEC notamment en interagissant avec une protéine bactérienne : ChiA. Des études ont démontré que les AIEC avaient une meilleure capacité d’entrée au sein de macrophages lorsqu’elles exprimaient la protéine ChiA, par comparaison avec des bactéries délétées pour ChiA. Elles ont également révélé que les AIEC survivaient deux fois moins au sein de macrophages traités avec des anticorps anti-CHI3L1 que dans une condition standard. Ces résultats appuient notre hypothèse et cette interaction constituerait donc une nouvelle cible pour des thérapies visant à décoloniser la muqueuse des individus colonisés. Les objectifs expérimentaux de cette étude sont : 1. Valider in vivo le rôle de l’interaction ChiA-CHI3L1 dans l’infection des macrophages de la muqueuse intestinale par les AIEC ; 2. Si ce rôle est validé, tester trois stratégies de blocage de l’interaction ChiA-CHI3L1 afin de déterminer si cela permet de réduire la colonisation de la muqueuse par les AIEC.
Bénéfices attendus
Ce projet exploratoire permettra de mettre en évidence l’importance de l’interaction ChiA-CHI3L1 dans l’invasion des macrophages intestinaux par les bactéries AIEC et de tester l’efficacité de différentes stratégies visant à limiter cette interaction : anticorps anti-CHI3L1, CHI3L1 recombinante, régime alimentaire enrichi en chitine. Si l’une de ces stratégies permet de réduire l’implantation des bactéries AIEC chez les souris, cela constituera une solide preuve de concept en vue d’une étude clinique interventionnelle chez les patients atteints de MC et colonisés par les AIEC.PBS
Procédures
Tous les animaux seront soumis à un traitement au DSS (Dextran Sulfate Sodium) pendant 8 jours, à un traitement antibiotique à la streptomycine pendant 3 jours et à une pesée quotidienne pendant douze jours. Tous les animaux subiront un gavage intra-gastrique quotidien pendant 5 jours. Tous les animaux seront isolés dans une enceinte fermée pendant une courte durée (inférieure à 30 min) en vue de collecter des fèces fraîches. Certains animaux recevront un régime alimentaire enrichi en chitine. Certains animaux subiront un traitement administré par injection intra-péritonéale ou par gavage intragastrique pendant 8 jours.
Impact sur les animaux
Les manipulateurs sont formés aux gestes techniques (contention, gavage, injection en intrapériotonéal) de sorte que ces gestes ne causent qu’un stress léger. L’expérience du laboratoire sur le modèle d’infection sous DSS (Dextran Sulfate Sodium) montre que les souris souffriront d’une colite modérée se traduisant par une diarrhée et une perte de poids (inférieure à 10% du poids corporel).
Devenir
La mise à mort de ces animaux est nécessaire pour les prélèvements post-mortem envisagés.
Remplacement
Dans l’objectif de limiter les expérimentations sur animaux, des études préliminaires sur plusieurs modèles in vitro ont été menées au laboratoire. Nos principales hypothèses ont notamment été démontrées sur une lignée immortalisée de macrophages et sur des cellules primaires. Cependant, il n’existe pas de méthode alternative permettant de rendre compte de la complexité de l’interaction entre les cellules immunitaires de l’hôte et les bactéries AIEC. La virulence des bactéries dans le contexte du tractus gastrointestinal et la réponse des macrophages sont influencées par les multiples interactions au sein de la muqueuse intestinale. Les expériences faisant l’objet de cette demande d’autorisation sont donc indispensables pour déterminer si les bactéries AIEC utilisent l’interaction chiA-CHI3L1 in vivo pour infecter les macrophages intestinaux et pour tester l’efficacité des stratégies envisagées pour limiter cette interaction.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé pour cette manipulation a été réduit au minimum, dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Le maximum d’organes sera prélevé sur le même animal lorsque c’est techniquement possible sans compromettre la réussite de l’expérience. Il est à noter que l’extraction des macrophages de la lamina propria pour la cytométrie en flux requiert l’utilisation d’un colon complet pour garantir l’extraction d’un nombre suffisant de macrophages. L’expérience du laboratoire montre une hétérogénéité interindividuelle dans l’implantation des bactéries et dans la réponse de l’hôte à cette implantation. C’est pourquoi nous prévoyons trois répétitions de l’expérience comprenant chacune 5 animaux pour quantifier l’implantation bactérienne et localiser les bactéries en imagerie, et 3 animaux pour caractériser le profil phénotypique des macrophages infectés en cytométrie. Ce nombre d’animaux (3 x 5 = 15 animaux par condition expérimentale pour dénombrement et imagerie ; 3 x 3 = 9 animaux par condition pour la cytométrie) nous semble nécessaire pour obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages ventilées dans le respect de la réglementation et auront libre accès à l'eau et la nourriture. Une période d’acclimatation de 7 jours sera réalisée avant le début de l’expérimentation. Les conditions d'hébergement sont les suivantes : température 20-22°C, hygrométrie 40-60%, cycle 12h/12h, éclairage 350-450 lux. Un enrichissement est proposé aux souris : tube/cachette en polycarbonate teinté rouge préalablement lavé et stérilisé. Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement par des personnels formés à partir d’une grille d’évaluation dans le but de mettre en évidence tout signe de souffrance. En fonction de ce score individuel de bien-être et de son évolution, la surveillance sera adaptée ou le traitement de l’animal par des antalgiques sera envisagé. Si un animal dépasse le score limite, il sera alors sorti de l’étude et euthanasié.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris C57BL6 est lié à trois paramètres essentiels : -Utilisation du fond génétique C57BL6 préférable pour l’étude des réponses anti-infectieuses contre des pathogènes intracellulaires -Disponibilité des outils moléculaires (anticorps, cytokines recombinantes…) et expertise technique du laboratoire pour cette espèce -Importance des données bibliographiques déjà publiées sur la réponse immunitaire mucosale sur ce modèle C57BL6 Les expériences d’infection seront débutées sur des souris âgées de 6 semaines dans la mesure où la maladie de Crohn chez les Hommes se déclare majoritairement chez des sujets jeunes (pic entre 15 et 25 ans). L’expérience prendra fin à l’euthanasie des animaux après 12 jours d’expérimentation.
Nanoparticules fonctionnalisées pour le ciblage de la thrombose en imagerie SPCCT chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie, dont une partie sans réveil. Vingt d'entre elles subissent une chirurgie de trente minutes pour provoquer un thrombus dans la veine cave puis quatre séances d'imagerie, tandis que cinquante reçoivent une injection de nanoparticules à l'hafnium avant d'être tuées à différents délais pour prélever les organes et mesurer la biodistribution. Le porteur présente cette étude de biodistribution comme "impérative" pour obtenir les autorisations d'un éventuel essai clinique. Il avance des bénéfices pour les patients, doses de contraste réduites et moindre toxicité rénale, renvoyés à un usage clinique futur.
Objectifs
L'objectif du projet est de développer un agent de contraste pour l'imagerie scanner, injectable par voie intraveineuse à base de nanoparticules qui ont la propriété de reconnaitre précisément le thrombus. Notre agent de contraste sont des nanoparticules utilisant un métal lourd appelé Hafnium. Nous souhaiterions apporter la preuve chez l'animal de la capacité de nos nanoparticules à reconnaitre précisément le thrombus dans un modèle de thrombose de la veine cave inférieure chez la souris.
Bénéfices attendus
Mettre au point un agent de contraste reconnaissant du thrombus et détectable par imagerie scanner dans la maladie athérothrombotique. Les bénéfices sont multiples: 1) bénéfices directs pour le patient: identifier les territoires à risque d'évènements graves athérothrombotiques en identifiant au scanner les lésions qui captent les nanoparticules; 2) bénéfices directs aux patients également en permettant de réduire les doses de produit de contraste injectés aux patients, limitant ainsi les risque de toxicité rénale et d'allergie; 3) bénéfices économiques et bénéfice global en santé publique: participer à l'amélioration des préventions de la maladie athrothrombotique dont la prévalence sera inéluctablement croissante avec le vieillissement de la population (prévision de presque 18 millions de décès dans le monde d'accidents athérothrombotiques en 2030).
Procédures
Un groupe d'animaux (20 souris: 10 pour chaque formulation à tester) vont subir, sous anesthésie et analgésie, une chirurgie pour induire un thrombus, afin de mimer ce qu'il se passe chez l'homme dans les maladies d'athérothrombose, cette première intervention dure 30 minutes. Les animaux seront ensuite injectés avec les deux types de formulations et enfin avoir une imagerie pour visualiser le ciblage des nanoparticules sur le thrombus, chaque souris souris sera alors imagée 4 fois (30min, 1h, 2h, 4h). Un groupe d'animaux (50 souris) aura juste une injection d'une seule formulation de nanoparticules sous anesthésie puis euthanasiés au temps d'intérêt (30 min, 1h, 2h, 4h, 24h). Les organes seront prélevés pour évaluer la biodistrtibution de ces nanoparticules dans chaque organe. C'est une étude impérative afin d'obtenir les autorisations pour un éventuel essai clinique chez l'homme.
Impact sur les animaux
On peut s’attendre à ce qu’il y ait des douleurs liées à la chirurgie ou un réveil de l’animal, d’où la mise en place d’un antalgique et un anesthésiant. Nous surveillerons attentivement les signes de souffrance sur des critères cliniques (fréquence respiratoire) et ajusteront l’isoflurane aux besoins de l’animal.
Devenir
A la fin des deux procédures, les souris seront mises à mort et les organes d'intérêts seront prélevés pour les analyses histologiques.
Remplacement
Des études préliminaires in vitro sur un modèle de flux, développé au laboratoire, ont servi à évaluer en amont la capacité des nanoparticules fonctionnalisés au fucoïdane à se lier à leur cible moléculaire ce qui participe à réduire le nombre d’animaux à utiliser. La biodistribution des nanoparticules est nécessaire pour les dossiers à déposer auprès de l’agence nationale du médicament, pour un éventuel essai clinique. Seules les nanoparticules fonctionnalisées seront évaluées dans cette étude de biodistribution. A l’heure actuelle, aucun modèle ex vivo ne peut simuler cet évènement.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à utiliser a été déterminé d’après un test statistique prenant en compte la variabilité biologique inter-individuelle. Un nombre de 10 animaux par groupe est nécessaire pour assurer des résultats statistiquement pertinents. Les nanoparticules ont été d'abord testées et sélectionnées in vitro avant d'être testées chez l'animal, ce qui participe aussi à la réduction du nombre d'animaux. L’imagerie spectrale permet le suivi longitudinal d’un même animal et diminue le nombre total d’animaux. Les études in vitro ont permet de discriminer les formulations à tester in vivo ce qui participe à réduire le nombre d’animaux. Ainsi que le fait de réaliser l’étude de biodistribution que sur les nanoparticules fonctionnalisées réduit le nombre d’animaux.
Raffinement
Des mesures sont prises pour minimiser le stress, comme l’hébergement en groupe et enrichissement jusqu’au début des procédures. Les deux procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse et emploi d'analgésique. Les procédures réalisées seront sans réveil pour la 1) ; une injection sous cutanée de Buprénorphine sera réalisée pour réduire la douleur ; la procédure 2) de gravité légère, là aussi, une injection de Buprénorphine sera réalisée en amont de l’injection des nanoparticules (30 minutes avant, lors de la pesée des souris). Des points limites limites spécifiques aux procédures sont mis en place. Pour la procédure 1) sans réveil, où les souris sont gardées 4 heures au maximum, le suivi des animaux post chirurgie permettra de déterminer un score de douleur à partir duquel l’animal reçoit une injection d’analgésique, un suivi plus fréquent, ou une euthanasie. Les critères d’appréciation de la douleur après chirurgie incluent des critères d’apparence, des critères de comportement naturel ou provoqués ; des signes cliniques. Les mêmes critères seront appliqués sur la procédure 2) de gravité légère où les souris sont gardées 24 heures au maximum.
Choix des espèces
Stade jeune adulte (7 à 8 semaines)
Étude expérimentale du phénomène d’ischémie-reperfusion mésentérique chez la souris et le rat : caractérisation et recherche de marqueurs diagnostics.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
Rats : 90
180 animaux non-humains, 90 souris et 90 rats, vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Sous anesthésie générale, on ouvre l'abdomen et on ligature l'artère qui irrigue l'intestin pendant une heure avant de rétablir la circulation, ce qui provoque une mort des tissus intestinaux, avec chez le rat six prélèvements sanguins au cou. Le projet étudie l'ischémie-reperfusion mésentérique et cherche des marqueurs sanguins transposables à l'humain. Le porteur justifie souris et rats par la nécessité de conditions homogènes non réalisables chez l'humain et présente la mise à mort comme évitant la souffrance irréversible de l'intestin.
Objectifs
L’ischémie mésentérique est une pathologie sévère associant une insuffisance vasculaire et une souffrance digestive intestinale. Cette maladie résulte d’un débit sanguin et d’un apport en oxygène insuffisant pour répondre aux demandes physiologiques du tube digestif (intestin). Dans sa forme aiguë, c’est une urgence abdominale rare (< 1/1000 admissions à l’hôpital), avec une mortalité très élevée, de l’ordre de 60 à 80%, alors qu’elle est une maladie potentiellement réversible. La réoxygénation du tube digestif (intestin), essentielle à la préservation intestinale, peuvent paradoxalement accentuer les lésions vasculaires et tissulaires. Certaines études expérimentales sur animaux ont montré que les lésions muqueuses observées après 3h d’ischémie et 1 h de reperfusion étaient plus sévères que celles observées après 4h d’ischémie sans reperfusion. Cette observation implique des lésions initiées par le retour du sang oxygéné vers les tissus ischémiques. L'objectif principal est d'observer les interactions entre les cellules sanguines au sein des vaisseaux intestinaux de petit calibre lors d’arrêt de l'apport sanguin artériel au tube digestif puis lors de sa restitution. Nous souhaitons aussi étudier l'effet d'un traitement fluidifiant le sang (antithrombotique ou anticoagulant) sur ces intéractions. L’objectif secondaire est la recherche de marqueurs sanguins diagnostiques précoces et d’efficacité thérapeutique lors d'un arrêt de l'apport sanguin artériel au tube digestif puis lors de sa restitution, transposables à l’homme.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de mieux comprendre pourquoi il est difficile de restaurer une circulation sanguine efficace dans les petits vaisseaux mésentériques après une occlusion à l'origine de l'artère mésentérique supérieure (vascularisant le tube digestif), ainsi que l'intérêt de cibler rapidement les mécanismes inflammatoires et de coagulation pour obtenir de meilleurs résultats.
Procédures
Les animaux (souris et rats) seront opérés sur une table chauffante à 37°, après une anesthésie générale et un traitement antalgique. Après ouverture abdominale, l'artère mésentérique supérieure (branche de l’aorte abdominale vascularisant le tube digestif) sera ligaturée avec un fil chirurgical pendant maximum 1h puis déclampée pendant 1h. Chez la souris, les interactions cellulaires au sein des vaisseaux intestinaux de petit calibre seront observées grâce à un marqueur sanguin fluorescent, sous appareil optique, pendant l'ischémie (30 min ou 1h) puis pendant la reperfusion (1h) du tube digestif. Chez le rat, 6 prélèvements sanguins par un vaisseau du cou, seront réalisés afin de suivre différents biomarqueurs sanguins et évaluer l'efficacité du traitement anticoagulant administré au niveau de d’un vaisseau du cou sur un tiers des animaux (rat et souris) avant la ligature.
Impact sur les animaux
Chaque ischémie-reperfusion mésentérique conduit à des complications différentes pour chaque animal : ischémie des tissus intestinaux qui conduit à une mort des tissus intestinaux à des temps différents pour chaque animal (parfois à 30 min, parfois à 1h).
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées après la reperfusion intestinale afin d'éviter toute douleur liée à la souffrance irréversible de l'intestin et ses complications en cas de réveil. Tous les rats seront euthanasiés après la reperfusion intestinale afin de prélever l’intestin grêle pour analyse histologique et d'éviter toute douleur liée à la souffrance irréversible de l'intestin et ses complications en cas de réveil.
Remplacement
L’ischémie-reperfusion mésentérique est une maladie grave, d'une mortalité extrême (70% chez l'Homme), avec des formes très hétérogènes, encore très mal connue, qui n’est pas reproductible in vitro. L’utilisation des modèles souris et rat est justifiée par la nécessité d’une étude dans des conditions parfaitement homogènes et standardisées, non réalisables chez l’Homme.
Réduction
Les analyses des divers marqueurs évalués seront regroupées pour chaque souris et chaque rat afin d'optimiser le nombre d’animaux et les volumes de plasma nécessaires. Des travaux préliminaires ont permis d’évaluer les différentes moyennes escomptées permettant le calcul du nombre de sujets nécessaires afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
L’anesthésie et l’analgésie seront monitorées visuellement (réflexes à la douleur) et adaptées, l’animal sera opéré sur une table opératoire chauffée à 37°C.
Choix des espèces
Notre laboratoire est habitué à travailler avec les souris et les rats, et cela à chaque étape de l’expérimentation : soins préalables, maniement et gestion du stress, matériel anesthésique, opératoire et de monitorage, analgésie et euthanasie. L'observation des interactions cellulaires au sein des vaisseaux de petit calibre est obtenue de façon optimale chez la souris femelle de petit poids (15/20 g, d'environ 7 semaines) pour sa faible teneur en graisse mésentérique. La souris mâle ou le rat ont une teneur mésentérique en graisse trop importante, rendant l’observation du flux sanguin mésentérique difficile. Pour l’étude des biomarqueurs, de nombreux tests biochimiques ne sont disponibles uniquement pour les rongeurs ou l’Homme. Le rat male de 9 semaines (environ 350 g) a un volume sanguin suffisant aux 6 prélévements permettant suivre les taux de marqueurs spécifiques. Le volume sanguin de la femelle est moindre.
Effets physiopathologiques de l’alimentation maternelle chez des souris transgéniques ayant une délétion du facteur de transcription Tbx3 dans les neurones à POMC, kisspeptine ou AgRP (1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
5775 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 160 étant opérées et tuées sans réveil. Elles sont contenues dans un tube pour l'analyse corporelle, soumises à des jeûnes répétés jusqu'à 24 heures suivis de prélèvements sanguins, à une immobilisation et à des tests comportementaux anxiogènes, dans la première partie d'une étude sur l'effet d'une alimentation maternelle hypercalorique. Le porteur renvoie les retombées contre l'obésité et le diabète au "long terme". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ni informatique ne remplace l'animal vivant pour ces effets.
Objectifs
Dans le cerveau, différents neurones interagissent entre eux pour contrôler des processus biologiques essentiels. Parmi eux, certains déterminent ce que l’on nomme la « balance énergétique », à savoir l’équilibre entre la prise, le stockage et la dépense de calorie, qui détermine le poids corporel. Des dysfonctionnements dans ces neurones peuvent conduire à des maladies telles que l’obésité et le diabète de type 2. D’autres sont quant à eux connus pour contrôler la puberté et la fonction reproductive. En outre, ces neurones-ci sont particulièrement sensibles aux variations de l’équilibre énergétique. Par exemple, un manque d’énergie peut rapidement diminuer la fertilité, jusqu’à la reconstitution des réserves énergétiques. Un point commun marquant entre les neurones qui contrôlent la balance énergétique et ceux qui contrôlent la fonction reproductive est qu’ils produisent une molécule commune. Cette molécule est cruciale dans la détermination de l’identité et le fonctionnement de ces neurones. De précédentes études ont par ailleurs montré que le régime alimentaire de souris femelles gestantes pouvait affecter le développement neuronal de leurs embryons, notamment via des altérations dans la production de cette molécule. Notre objectif dans ce projet est donc d’étudier le lien entre l’alimentation maternelle et l’action de cette molécule dans nos différents neurones d’intérêt. Nous étudierons les différentes fonctions biologiques contrôlées par ces neurones, à savoir la puberté, le métabolisme (contrôle du poids corporel et du taux de sucre dans le sang) et l’anxiété. Pour ce faire, nous utiliserons différentes souris transgéniques, chez lesquelles les neurones que nous étudions ne peuvent plus produire cette molécule commune. Les mères de ces souris seront nourries soit avec un régime standard pour rongeurs, soit avec un régime hypercalorique et riche en graisses, pour tester l’effet de l’alimentation maternelle sur le développement des petits. Une batterie d’évaluations cliniques et de tests comportementaux et métaboliques nous permettront de répondre aux objectifs scientifiques cités ci-dessus.
Bénéfices attendus
Notre projet apportera des informations nouvelles sur la manière dont l’exposition maternelle à une alimentation hypercalorique interagit avec une molécule produite par nos neurones d’intérêt pour affecter la reproduction et le métabolisme de la descendance. À plus long terme, ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les maladies qui découlent d’une alimentation maternelle hypercalorique (obésité, diabète de type 2, etc.).
Procédures
Voici la liste des gestes techniques réalisés sur les animaux : - Analyse de la composition corporelle (1848 souris) : cette analyse nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 2 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées de 9 semaines. - Tests de contrôle de la glycémie (1848 souris) : ces test d’une durée maximale de 2 heures nécessitent de réaliser, après un jeûne de 3 à 16 heures, une injection d’une solution ou un gavage oral, puis de réaliser jusqu’à 7 prélèvements sanguins à différents temps post-injection (espacés de 15 minutes minimum), pour mesurer la quantité de glucose ou d’insuline dans le sang. Ces tests sont réalisés sans anesthésie. Quatre tests seront réalisés sur les mêmes souris, séparés d’un délai d’une semaine. - Evaluation de la maturité sexuelle (1848 souris) : chez les femelles, un petit volume de sérum physiologique sera instillé dans le vagin. Cet examen est quotidien, pendant 2 semaines, et sera réalisé 2 fois (puberté et âge adulte). Chez les mâles pré-pubères, une légère pression est appliquée autour du pénis pour décalotter le gland. Cette manipulation sera réalisée quotidiennement, jusqu’au jour où le décalottage est observé. Chaque examen/manipulation dure environ 10 secondes par souris. - Implant sous-cutané (792 souris) : dans l’une de nos expériences, nous effectuerons un traitement hormonal sur plusieurs jours. Pour ce faire, une unique chirurgie sera réalisée afin d’implanter un tube en silicone sous la peau des souris, qui délivrera le traitement en continu. Cette opération, d’une durée d’environ 30 min, est réalisée sous anesthésie générale, et la douleur est prise en charge grâce à une combinaison de différents médicaments (anesthésique locale, morphinique et anti-inflammatoire). - Tests d’anxiété (1056 souris) : 5 tests seront réalisés pour mesurer le niveau d’anxiété des souris, à raison de 2 tests par semaine, espacés d’au moins 2 jours, sur des souris vigiles. Dans la plupart des tests, la souris est libre d’explorer des environnements plus ou moins inconfortables pendant une durée limitée (entre 5 et 30 minutes). Le test le plus anxiogène nécessite deux jeûnes de 24 heures (séparés d’une semaine) ; le second jeûne étant également couplé à une immobilisation des souris pendant les 15 dernières minutes. Chaque test ne sera réalisé qu’une fois.
Impact sur les animaux
Un protocole d’adoption est prévu pour certains animaux de ce projet. L’échange des portées va stresser les mères et les petits et il se peut qu’il y ait un rejet d’adoption. Cela n’aura lieu qu’une seule fois dans la vie des animaux. Certains tests de comportement sont susceptibles de générer de l’anxiété, via notamment l’exposition à un nouvel environnement inconfortable pour les souris (lumière, espace à découvert…). Nous effectuerons toujours le test le moins anxiogène en premier et avec un maximum de 2 tests par semaine. Ces tests durent entre 5 et 30 minutes. Le test le plus anxiogène, réalisé en dernier, implique deux mises à jeun des souris pendant 24 heures. Ces deux jeûnes seront espacés d’une semaine. La seconde mise à jeun s’accompagne également d’un stress d’immobilisation de 15 minutes. Chaque test ne sera réalisé qu’une seule fois par souris. Les souris impliquées dans les études métaboliques subiront également un léger stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Ces animaux seront également soumis à 4 tests de régulation de la glycémie, qui débutent par un jeûne de 3 à 16 heures, pouvant engendrer une perte de poids le jour suivant. Les prélèvements sanguins effectués dans le cadre de ces tests sont réalisés suite à une légère entaille (unique) à l’extrémité de la queue. Cette région n’est que peu innervée, donc moins sensible, mais une douleur peut être ressentie au moment de l’entaille. Il y aura un délai d’une semaine entre chaque test. Des douleurs post-opératoires sont attendues lors la pose chirurgicale d’un implant (tube en silicone) sous-cutané pour délivrer en continu des traitements hormonaux, du fait de l’incision qui sera réalisée (environ 1,5 cm). Ces douleurs devraient s’estomper dans les jours suivant la chirurgie, grâce au traitement analgésique mis en place.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études in vitro réalisées post-mortem.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier ensemble de caractéristiques biologiques (poids, composition corporelle et régulation de la glycémie, puberté), et également les comportements anxieux. Dans ce contexte, les neurones qui nous intéressent interagissent avec d’autres structures du cerveau mais également avec divers organes (foie, pancréas, organes sexuels…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre les neurones et le reste du corps. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire ou anxieux nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests, de manière à obtenir un maximum d’informations à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes souris, au lieu d’avoir recours à des lots différents. De même, l’ensemble des tests pour la caractérisation des comportements anxieux seront réalisées sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux seront hébergés collectivement (2 souris par cage). 2) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite de réaliser sur certains animaux une chirurgie pour installer un implant sous-cutané. Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. De plus, cette chirurgie constitue en elle-même un raffinement, car la pose de l’implant permet de délivrer les traitements pharmacologiques en continu pendant 6 semaines. Cela nous évite donc d’avoir à réaliser des injections répétées sur les animaux. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de modification de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.
Choix des espèces
La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et la régulation de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésité ont été développés chez la souris. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien cette étude ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Des souris pré-pubères seront utilisées pour l’étude post-mortem de leurs cerveaux, 21 jours après la naissance. Les souris qui auront l’implant sous-cutané pour les traitements hormonaux seront opérées à l’âge de 3 semaines (après sevrage, à l’entrée dans l’adolescence). L’étude de la puberté s’effectuera sur des souris âgées entre 3 et 5 semaines, à l’adolescence, puis plus tard à l’âge adulte (vers 12 semaines). L’étude du comportement anxieux et du métabolisme se fera sur des souris adultes (âgées d’environ 8 et 12 semaines, respectivement).
Effets physiopathologiques de l’alimentation maternelle chez des souris transgéniques ayant une délétion du facteur de transcription Tbx3 dans les neurones à POMC, kisspeptine ou AgRP (2/2 )
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
5775 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 160 étant opérées et tuées sans réveil. Elles sont bloquées dans un tube pour l'analyse corporelle, soumises à des jeûnes de 3 à 24 heures suivis de prélèvements sanguins répétés, à une immobilisation de 15 minutes et à des tests d'anxiété, pour étudier l'effet d'une alimentation maternelle hypercalorique sur la descendance. Le porteur renvoie au "long terme" d'éventuelles retombées contre l'obésité et le diabète. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ni informatique ne pourrait remplacer l'animal vivant pour ces comportements.
Objectifs
Dans le cerveau, différents neurones interagissent entre eux pour contrôler des processus biologiques essentiels. Parmi eux, certains déterminent ce que l’on nomme la « balance énergétique », à savoir l’équilibre entre la prise, le stockage et la dépense de calorie, qui détermine le poids corporel. Des dysfonctionnements dans ces neurones peuvent conduire à des maladies telles que l’obésité et le diabète de type 2. D’autres sont quant à eux connus pour contrôler la puberté et la fonction reproductive. En outre, ces neurones-ci sont particulièrement sensibles aux variations de l’équilibre énergétique. Par exemple, un manque d’énergie peut rapidement diminuer la fertilité, jusqu’à la reconstitution des réserves énergétiques. Un point commun marquant entre les neurones qui contrôlent la balance énergétique et ceux qui contrôlent la fonction reproductive est qu’ils produisent une molécule commune. Cette molécule est cruciale dans la détermination de l’identité et le fonctionnement de ces neurones. De précédentes études ont par ailleurs montré que le régime alimentaire de souris femelles gestantes pouvait affecter le développement neuronal de leurs embryons, notamment via des altérations dans la production de cette molécule. Notre objectif dans ce projet est donc d’étudier le lien entre l’alimentation maternelle et l’action de cette molécule dans nos différents neurones d’intérêt. Nous étudierons les différentes fonctions biologiques contrôlées par ces neurones, à savoir la puberté, le métabolisme (contrôle du poids corporel et du taux de sucre dans le sang) et l’anxiété. Pour ce faire, nous utiliserons différentes souris transgéniques, chez lesquelles les neurones que nous étudions ne peuvent plus produire cette molécule commune. Les mères de ces souris seront nourries soit avec un régime standard pour rongeurs, soit avec un régime hypercalorique et riche en graisses, pour tester l’effet de l’alimentation maternelle sur le développement des petits. Une batterie d’évaluations cliniques et de tests comportementaux et métaboliques nous permettront de répondre aux objectifs scientifiques cités ci-dessus.
Bénéfices attendus
Notre projet apportera des informations nouvelles sur la manière dont l’exposition maternelle à une alimentation hypercalorique interagit avec une molécule produite par nos neurones d’intérêt pour affecter la reproduction et le métabolisme de la descendance. À plus long terme, ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les maladies qui découlent d’une alimentation maternelle hypercalorique (obésité, diabète de type 2, etc.).
Procédures
Voici la liste des gestes techniques réalisés sur les animaux : - Analyse de la composition corporelle (1848 souris) : cette analyse nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 2 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées de 9 semaines. - Tests de contrôle de la glycémie (1848 souris) : ces test d’une durée maximale de 2 heures nécessitent de réaliser, après un jeûne de 3 à 16 heures, une injection d’une solution ou un gavage oral, puis de réaliser jusqu’à 7 prélèvements sanguins à différents temps post-injection (espacés de 15 minutes minimum), pour mesurer la quantité de glucose ou d’insuline dans le sang. Ces tests sont réalisés sans anesthésie. Quatre tests seront réalisés sur les mêmes souris, séparés d’un délai d’une semaine. - Evaluation de la maturité sexuelle (1848 souris) : chez les femelles, un petit volume de sérum physiologique sera instillé dans le vagin. Cet examen est quotidien, pendant 2 semaines, et sera réalisé 2 fois (puberté et âge adulte). Chez les mâles pré-pubères, une légère pression est appliquée autour du pénis pour décalotter le gland. Cette manipulation sera réalisée quotidiennement, jusqu’au jour où le décalottage est observé. Chaque examen/manipulation dure environ 10 secondes par souris. - Implant sous-cutané (792 souris) : dans l’une de nos expériences, nous effectuerons un traitement hormonal sur plusieurs jours. Pour ce faire, une unique chirurgie sera réalisée afin d’implanter un tube en silicone sous la peau des souris, qui délivrera le traitement en continu. Cette opération, d’une durée d’environ 30 min, est réalisée sous anesthésie générale, et la douleur est prise en charge grâce à une combinaison de différents médicaments (anesthésique locale, morphinique et anti-inflammatoire). - Tests d’anxiété (1056 souris) : 5 tests seront réalisés pour mesurer le niveau d’anxiété des souris, à raison de 2 tests par semaine, espacés d’au moins 2 jours, sur des souris vigiles. Dans la plupart des tests, la souris est libre d’explorer des environnements plus ou moins inconfortables pendant une durée limitée (entre 5 et 30 minutes). Le test le plus anxiogène nécessite deux jeûnes de 24 heures (séparés d’une semaine) ; le second jeûne étant également couplé à une immobilisation des souris pendant les 15 dernières minutes. Chaque test ne sera réalisé qu’une fois.
Impact sur les animaux
Un protocole d’adoption est prévu pour certains animaux de ce projet. L’échange des portées va stresser les mères et les petits et il se peut qu’il y ait un rejet d’adoption. Cela n’aura lieu qu’une seule fois dans la vie des animaux. Certains tests de comportement sont susceptibles de générer de l’anxiété, via notamment l’exposition à un nouvel environnement inconfortable pour les souris (lumière, espace à découvert…). Nous effectuerons toujours le test le moins anxiogène en premier et avec un maximum de 2 tests par semaine. Ces tests durent entre 5 et 30 minutes. Le test le plus anxiogène, réalisé en dernier, implique deux mises à jeun des souris pendant 24 heures. Ces deux jeûnes seront espacés d’une semaine. La seconde mise à jeun s’accompagne également d’un stress d’immobilisation de 15 minutes. Chaque test ne sera réalisé qu’une seule fois par souris. Les souris impliquées dans les études métaboliques subiront également un léger stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Ces animaux seront également soumis à 4 tests de régulation de la glycémie, qui débutent par un jeûne de 3 à 16 heures, pouvant engendrer une perte de poids le jour suivant. Les prélèvements sanguins effectués dans le cadre de ces tests sont réalisés suite à une légère entaille (unique) à l’extrémité de la queue. Cette région n’est que peu innervée, donc moins sensible, mais une douleur peut être ressentie au moment de l’entaille. Il y aura un délai d’une semaine entre chaque test. Des douleurs post-opératoires sont attendues lors la pose chirurgicale d’un implant (tube en silicone) sous-cutané pour délivrer en continu des traitements hormonaux, du fait de l’incision qui sera réalisée (environ 1,5 cm). Ces douleurs devraient s’estomper dans les jours suivant la chirurgie, grâce au traitement analgésique mis en place.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études in vitro réalisées post-mortem.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier ensemble de caractéristiques biologiques (poids, composition corporelle et régulation de la glycémie, puberté), et également les comportements anxieux. Dans ce contexte, les neurones qui nous intéressent interagissent avec d’autres structures du cerveau mais également avec divers organes (foie, pancréas, organes sexuels…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre les neurones et le reste du corps. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire ou anxieux nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests, de manière à obtenir un maximum d’informations à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes souris, au lieu d’avoir recours à des lots différents. De même, l’ensemble des tests pour la caractérisation des comportements anxieux seront réalisées sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximal dont nous estimons avoir besoin. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera bien évidemment.
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux seront hébergés collectivement (2 souris par cage). 2) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier et de bâtonnets en bois pour ronger. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite de réaliser sur certains animaux une chirurgie pour installer un implant sous-cutané. Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole analgésique approprié. Durant la chirurgie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le traitement anti-douleur se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. De plus, cette chirurgie constitue en elle-même un raffinement, car la pose de l’implant permet de délivrer les traitements pharmacologiques en continu pendant 6 semaines. Cela nous évite donc d’avoir à réaliser des injections répétées sur les animaux. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, en fonction de différents critères cliniques et comportementaux. Une grille de scores permet de prendre des décisions adaptées en cas de modification de l’état de l’animal. Il peut s’agir soit de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude (après avis vétérinaire), soit de sa mise à mort si rien ne peut être fait pour le soulager.
Choix des espèces
La régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et la régulation de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésité ont été développés chez la souris. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien cette étude ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Des souris pré-pubères seront utilisées pour l’étude post-mortem de leurs cerveaux, 21 jours après la naissance. Les souris qui auront l’implant sous-cutané pour les traitements hormonaux seront opérées à l’âge de 3 semaines (après sevrage, à l’entrée dans l’adolescence). L’étude de la puberté s’effectuera sur des souris âgées entre 3 et 5 semaines, à l’adolescence, puis plus tard à l’âge adulte (vers 12 semaines). L’étude du comportement anxieux et du métabolisme se fera sur des souris adultes (âgées d’environ 8 et 12 semaines, respectivement).
Exploration de l’axe mégacaryocyte/plaquette dans le syndrome de Stormorken
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
108 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sans réveil. Le porteur décrit pourtant des coupures répétées du bout de la queue sous anesthésie gazeuse et des prélèvements sanguins étalés sur plus de dix jours, pour mesurer le temps de saignement lié à une mutation de STIM1. Il indique que cette mutation provoque un déficit entraînant la mort à partir de 32 semaines, les procédures étant menées avant 20 semaines. Il présente le recours à la souris comme "irremplaçable", faute d'inhibiteurs pharmacologiques.
Objectifs
Les plaquettes sont des acteurs essentiels du maintien de l’intégrité vasculaire. Elles sont les premiers éléments cellulaires à intervenir dans l’arrêt du saignement lors d’une blessure vasculaire en participant à la formation d’un thrombus, ceci constituant l’hémostase physiologique dite primaire. Des problèmes de saignements plus ou moins graves peuvent être dus à des défauts de production et de fonctions plaquettaire. La mutation gain de fonction de la protéine STIM1 R304W/+est associée à une anomalie de l'homeostasie calcique intra-cellulaire dont les conséquences sont une modification de la production et de la fonctionalité des plaquettes. Notre étude vise à décrypter les mécanismes moléculaires et cellulaires permettant de comprendre le phénotype hémorragique dû à cette mutation de STIM1.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'un point de vue fondamental de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires du role de STIM1 dans la production et la fonction plaquettaire. D'un point de vue clinique, ce projet permettra de comprendre l'évolution de la maladie hémorragique chez l'homme.
Procédures
Une coupure (de 3 secondes) de 3 mm du bout de la queue de la souris anesthésiée par injection IP (intra-péritonéale) est réalisée. Le temps d'arrêt de saignement (évalué à 50μl maximum de sang avant l’arrêt du saignement) sera évalué jusqu’à 20 minutes maximum. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé au niveau de la veine cave inférieure après anesthésie par injection IP . La prise de sang dure 1-2 minutes et un volume de sang de 800 à 1000 μl est prélevé. La souris est anesthésiée par anesthésie gazeuse et injectée en IP avec un anti-douleur pour un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) suite à une coupure de 1 mm (de 3 secondes). Nous réalisons ensuite une injection IP du composé d’intérêt inoffensif et non irritant. Six prélèvements sanguins à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute), suite à une coupure de 1 mm (durée de 3 secondes) est réalisé après anesthésie gazeuse et injection d’un anti-douleur sur une durée de 280h. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. Une injection d’un composé inoffensif et non-irritant est réalisée en intra-veineux pendant 10 secondes sur souris anesthésiée par anesthésie gazeuse. 1 heure après l’injection, puis toutes les 24 heures pendant 4 jours, un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) par coupure de 1 mm (durée de 3 secondes), est réalisé sur l’animal sous anesthésie gazeuse et injecté en intra-péritonéal avec un anti-douleur. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut.
Impact sur les animaux
Le modèle murin génétiquement modifié STIM1 R304W/+ qui mime la pathologie humaine présente un déficit musculaire et hématologique qui entraine la mort à partir de 32 semaines de vie. Cependant toutes les procédures expérimentales seront réalisées avant 20 semaines. Pour les procédures expérimentales sur animaux vivants, les composés injectés ne sont pas irritables ou/et délétères (anesthésiques, anti-douleurs et anticorps). Les produits injectés ont déjà été utilisés par différents laboratoires, dont le nôtre, et n'ont montré aucun effet indésirable. Ces injections n'induisent qu'une légère douleur au moment de la piqûre et un stress qui ne durent que 5 à 10 secondes.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car toutes les procédures nécessitent des prélèvements de sang et/ou d'organes.
Remplacement
Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexicité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré d’hémostase et thrombose non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum : en suivant des protocoles expérimentaux déjà établis dans le laboratoire, en tenant compte d’expériences déjà réalisées dans l’équipe qui nous ont montré que nous pouvons obtenir des résultats statistiquement corrects en faisant des groupes de 12 souris pour chaque procédure réalisée. Nous nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables en évitant la répétition d’études antérieures déjà réalisées et/ou publiées et en fonction des résultats obtenus au cours des différentes procédures expérimentales. Nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 4 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes, qui si elles existent, seront statistiquement affinées avec des groupes de 12 souris par procédure. L'approche statistique permettra d'analyser les différences obtenues entre groupes.
Raffinement
Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson avec du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois dans la cage. Une observation quotidienne des souris est réalisée par les zootechniciens ou les responsables du projet en terme de comportement général (prostration, activité anormale, isolement) et d'apparence (poils hérissés, plaies/blessures, amaigrissement anormal). Toutes les personnes impliquées dans ce projet (zootechniciens et les responsables de projet) sont formées et qualifiées au respect des conditions du bien-etre animal et diplômées en expérimentation animale. Toutes les procédures expérimentales se font sur souris anesthésiées et analgésiées sauf pour les injections intrapéritonéales qui sont des gestes rapides de moins de 10 secondes sur animaux vigiles. Un contrôle permanent de l'état d'anesthésie des souris sera réalisé par les expérimentateurs tout au long de la procédure. Tout au long des procédures, les animaux seront surveillés par les zootechniciens et les expérimentateurs. En cas de blessure, l'animal sera isolé et la blessure sera nettoyée 2 fois par jour pour favoriser une cicatrisation propre. Une mise à mort rapide de la naissance à la mort ou lors d'une procédure expérimentale sera effectuée si l'animal atteint le score de 6 par addition des scores suivants : Plaies / Blessures soignables (10 mm ou non soignables : 3, Apparence : manque de toilettage : 1, Apparence : pelage terne et poils hérissés : 2, Perte de poids 20% : 3, Comportement : réaction légèrement exagérée ou moins mobile ou comportement répétitif léger : 1, Comportement : réaction modérément exagérée ou mobilité limitée ou comportement répétitif modéré : 2, Comportement : réaction violente ou immobilité>24h ou comportement répétitif excessif : 3.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris car les mécanismes d’hémostase et thrombose sont transposables à l'homme mais aussi car nous disposons de modèles murins génétiquement modifiés invalidés pour nos protéines d'intérêt car il n'existe pas à ce jour d'inhibiteurs pharmacologiques. Stade adulte de 8 à 20 semaines car de part et d'autre de cette fourchette d'âge les réponses fonctionelles en hémostase et thrombose peuvent être modifiées.
Diplôme d’École – Chirurgie générale des animaux de laboratoire
- Formation professionnelle
Rats : 180
360 rats et souris vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans le cadre d'une formation à la chirurgie. Chaque stagiaire s'exerce sur un rat, ablation d'un rein lors d'une chirurgie abdominale d'environ deux heures, et sur une souris, pose de cathéters lors d'une microchirurgie vasculaire. Ces gestes ne produisent aucune connaissance, ils entraînent des praticiens à des techniques opératoires. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive pour l'apprentissage de ces chirurgies.
Objectifs
Cette formation à la chirurgie générale des animaux de laboratoire, ouverte à des professionnels utilisant des animaux de laboratoire, permet de fournir aux participants les outils nécessaires à la chirurgie sur animaux de laboratoire, de la conception du protocole anesthésique à la réalisation des étapes chirurgicales. Après une approche théorique et une première initiation sur des modèles chirurgicaux, les stagiaires s'exerceront sur un rat et une souris de 8 à 10 semaines, à raison d'un animal par stagiaire. Les participants pratiqueront sous la supervision directe de deux encadrants compétents qui auront présentés les gestes chirurgicaux sur vidéos et en salle de travaux pratiques. Ces travaux pratiques permettront aux participants d'acquérir les notions et gestes nécessaires à : - la réalisation d'une chirurgie abdominale (ablation d'un rein) depuis sa mise en place anesthésique jusqu'aux soins post-opératoires (1 rat par participant) - la réalisation d'une microchirurgie vasculaire sous microscope opératoire et pose de catéthers vasculaires artériels et veineux (1 souris par participant). Le nombre total d'animaux utilisés sera de 12 rats et 12 souris par session (2 à 3 sessions par an).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont (i) de fournir les connaissances théoriques anatomique, anesthésique et chirurgicale nécessaires à la chirurgie générale des animaux de laboratoire ; (ii) de proposer et réaliser un protocole anesthésique adapté à chaque chirurgie, à savoir reconnaitre les points limites et réagir en conséquence ; (iii) de pouvoir pratiquer en autonomie l'ensemble des gestes chirurgicaux nécessaires à une chirurgie abdominale et à une microchirurgie vasculaire chez le rat et la souris.
Procédures
Les rats sont soumis à une procédure chirurgicale d'une durée d'environ 2h sans réveil visant à exercer les participants à la mise en place d'un protocole anesthésique et une chirurgie abdominale. Les souris sont soumises à une procédure de microchirurgie vasculaire d'une durée d'environ 2h sans réveil visant à exercer les participants à la mise en place d'un protocole anesthésique et à la pose de cathéters.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont inhérentes aux procédures chirurgicales : douleurs lors des phases nociceptives telles que les incisions cutanée et musculaire qui entraineraient une augmentation de la fréquence respiratoire, voire un réveil per-opératoire. L'ensemble de ces nuisances sont prises en charge par le protocole anesthésique et analgésique (morphine 2,5mg/kg SC, isoflurane en maintien à 2-2,5% ). La mise à mort des animaux en fin de procédure est systématique pour les animaux utilisés.
Devenir
L'ensemble des procédures de ce projet ont été définies comme sans réveil car elles sont réalisées dans le cadre d'une formation à l'apprentissage de nouvelles techniques chirurgicales, qui peuvent être longues et lourdes pour les animaux.
Remplacement
L'apprentissage de techniques chirurgicales sur rongeurs nécessite l'utilisation de rongeurs de laboratoire car, à l'heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives pour l'apprentissage de techniques chirurgicales abdominale et vasculaire.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque procédure chirurgicale est limité à un animal par participant pour réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en permettant aux participants d'apprendre dans les meilleures conditions sur le rat et la souris.
Raffinement
Observation quotidienne des rongeurs et hébergement des souris par groupe de 5 maximum et des rats par groupe de 4 dans des cages agrémentées de tunnels ou d’igloos pour que les animaux aient une meilleure stimulation sociale. La prémédication des rats et souris avec de la morphine à 2,5mg/kg SC permet de diminuer le stress au temps pré-opératoire et de réduire au maximum la douleur de l'animal au moment du temps opératoire. Une demi-dose de morphine peut être administrée lors de la procédure chirurgicale si des signes nociceptifs sont observés (augmentation de la fréquence respiratoire, augmentation de la fréquence cardiaque, ...).
Choix des espèces
Le rat et la souris sont les espèces les plus indiquées dans ce type de procédure chirurgicale du fait de la taille des organes et de leur topographie. Par ailleurs, ce sont les espèces les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants et les moins susceptibles de ressentir de la douleur dans les conditions de la procédure expérimentale. Les rats et souris sont âgés respectivement de 5 et 9 semaines pour permettre un développement suffisant pour faciliter l'approche chirurgicale des participants.
Contrôle qualité des médicaments radiopharmaceutiques marqués au Tc99m sur rongeurs en conformité des méthodes de la Pharmacopée EU.
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Rats : 1275
1 680 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil pour 1 275 d'entre eux et impliquant un niveau de souffrance léger pour 405. Anesthésiés, ils reçoivent l'injection d'un médicament radiopharmaceutique puis sont tués pour le prélèvement de leurs organes, afin de contrôler la biodistribution de chaque lot avant sa commercialisation. Le porteur indique que ce contrôle qualité est exigé par les pharmacopées européenne et américaine. Il signale qu'une évolution réglementaire a déjà permis d'arrêter la biodistribution sur 30 lots par an, sans étendre ce remplacement aux autres.
Objectifs
Ce projet a pour objet de permettre au laboratoire pharmaceutique de continuer à pouvoir contrôler des médicaments radiopharmaceutiques dans le respect des AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) octroyées par les autorités de santé de tous les pays concernés (notamment la FDA « Food and Drug Administration ») et des méthodes de la Pharmacopée Européenne. Pour cela le laboratoire pharmaceutique a besoin de pouvoir réaliser des tests de distribution physiologique appelés « tests de biodistribution » in vivo sur des rongeurs, afin de valider l’efficacité de chaque lot de médicament radiopharmaceutique concerné avant son administration humaine.
Bénéfices attendus
La mise sur le marché des médicaments marqués, à usage thérapeutique et diagnostique pour l'homme, exige des essais d'efficacité : la distribution physiologique du produit sur rongeurs. Le recours à des rongeurs dans le cadre de contrôle qualité de médicaments radiomarqués est préférable à d'autres espèces car ces animaux permettent de fournir des résultats pertinents en utilisant la voie d'administration identique à celle de l'homme lors de diagnostic par scintigraphie.
Procédures
Dans le cadre du contrôle qualité du médicament radioactif à réaliser avant mise sur le marché, le test d'efficacité du produit sur 3 rats de faible poids se fait sous anesthésie générale par un mélange d'anesthésie/analgésique chimique avant injection du produit. Le volume à injecter est fonction du poids du rat. L'acte d'injection de ce mélange de faible volume dure quelques secondes. Une fois l'animal anesthésié, au remps indiqué dans la procédure, le technicien injecte le produit radioactif de faible volume à la seringue en quelques secondes. La voie d'injection avec un médicament marqué à usage diagnostic ou thérapeutique est la voie utilisée chez l'homme. Après un temps déterminé dans la procdure, le technicien s'assure que les animanux soient toujours anesthésiés avant de mourir, avant d'effectuer les gestes chirurgicaux nécessaires au test. L'euthanasie des animaux s'accompagne d'un prélèvement de sang au niveau de l'aorte abdominale. Elle est suivie des prélèvements d'organes cités dans la procédure de contrôle en vigueur. Concernant le test d'efficacité du produit radioactif chez les 3 souris, celles-ci sont soit anesthésiées par un mélange d'anesthésie/analgésique chimique avant injection du produit, soit elles sont injectées vigiles selon la procédure de contrôle en vigueur. Une fois l'animal anesthésié, au temps indiqué dans la procédure, le technicien injecte le produit radioactif de faible volume à la seringue en quelques secondes. Dans le cas des souris anesthésiées avant injection du produit radioactif, la pratique d'euthénasie appliquée est la dislocation cervicale avant d'effectuer les gestes chirurgicaux nécessaires au test. Elle est suivie des prélèvements d'organes cités dans la procédure de contrôle en vigueur. Dans le cas de souris vigiles, l'injection du produit radioactif d'un faible volume à la seringue se fait en quelques secondes. Après un temps déterminé dans la procédure, elles sont anesthésiées par un mélange d'anesthésie/analgésique chimique en tenant compte du poids de l'animal. Le technicien s'assure que l'animal est correctement anesthésié (immobilité, myorelaxation, pas de retrait lors du pincement de la patte) avant d'effectuer les gestes chirurgicaux nécessaires au test. L'euthanasie s'effectue par section de la carotide. Elle est suivie des prélèvements d'organes cités dans la procédure de contrôle en vigueur.
Impact sur les animaux
Nous pourrions attendre des effets indésirables si les molécules étaient défectueuses. C’est le but de notre test : identifier la qualité, ou les défauts de nos molécules radiomarquées. Si elles ne sont pas marquées correctement, elles sont rarement toxiques. Si une contamination quelconque était intervenue pendant la fabrication, les animaux pourraient subir des effets indésirables, comme un choc anaphylactique, mais ils sont anesthésiés et des mesures seraient rapidement prises pour prendre en charge cette situation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de manipulation du fait de la manipulation de biodistribution consistant aux prélèvements d’organes.
Remplacement
Les autorisations de mise sur le marché et la Pharmacopée Européenne exigent des contrôles de qualité in vivo sur les médicaments radiopharmaceutiques avant leur administration à l'homme. Les médicaments sont fabriqués selon leur AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) et sont soumis à des tests impératifs de contrôle qualité et libératoires avant commercialisation, dont la biodistribution fait partie. Ce test est appliqué selon les méthodes décrites dans la pharmacopée européenne et américaine et/ou du dossier d'Autorisation de Mise sur le Marché. Les méthodes physico-chimiques commencent à être prises en compte selon les produits par les autorités comme il est indiqué dans le paragraphe Réduction. 1) Les obligations réglementaires (pharmacopée européenne/américaine) évoluent et permettent l'arrêt des tests de biodistribution pour certaines spécialités pharmaceutiques. Nous profitons de cette opportunité pour cesser tout test de biodistribution sur la spécialité concernée. 2) Des démarches sont entreprises pour demander une variation du dossier d'AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) ; celle-ci consiste à supprimer le test de biodistribution en s'appuyant sur la corrélation existante entre les résultats obtenus via le test de biodistribution et les tests physico-chimiques réalisés en parallèle. 3) Décision stratégique d'arrêt de certains produits pour lesquels la biodistribution était requise. 4) Lors de la formation pratique d'un nouveau technicien, l'utilisation du "rat trainer" s'est substituée à l'utlisation d'animaux pour apprendre les injections.
Réduction
Une étude de marché a induit l’arrêt de 2 produits. Une variation réglementaire du dossier d’AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) de 2 autres produits a été acceptée par l'Agence du médicament, en s'appuyant sur les tests physico-chimiques. Cela implique l'arrêt de la biosdistribution sur 30 lots/an sur les 120 lots testés à ce jour.
Raffinement
Une amélioration continue de nos locaux permet d’accroitre la prise en compte des besoins des animaux au cours de procédures. Dès que les animaux sont anesthésiés, tout est mis en œuvre pour les maintenir au chaud et éviter toute perturbation. Tous les transports entre les lieux de vie des animaux et les laboratoires sont encadrés de précautions. Un tapis chauffant, par exemple, est placé au fond de la cage pendant l’attente, puis pendant le réveil. Un personnel expérimenté et formé manipule les animaux avec précautions. Nos procédures sont de courte durée et ne sont pas douloureuses.
Choix des espèces
La mise sur le marché de produits de contraste radioactifs exige des essais d'efficacité : la biodistribution sur rongeurs (rats ou souris) comme l'imposent les autorités européennes et américaines à l'industrie pharmaceutique qui produit ces marqeurs. Les tests réalisés par groupe de 3 rongeurs adultes permettent de valider l'innocuité et l'efficacité des marqueurs utilisés chez l'homme en utilisant la même voie d'administration, afin de fournir des résultats pertinents.