Procédures sans réveil
Etude des mécanismes cellulaires conduisant à l’alloimmunisation plaquettaire transfusionnel et à l’état réfractaire associé
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Les souris désignées comme "donneuses" sont tuées lors d'un prélèvement de sang terminal, les "receveuses" reçoivent des transfusions de plaquettes hebdomadaires puis subissent une chirurgie abdominale sans réveil pour observer leur rate au microscope. L'étude cherche à comprendre le rejet des plaquettes transfusées chez les patients sous chimiothérapie. Le porteur affirme que ces observations dynamiques "ne peuvent se faire que sur modèle animal" et ne sont pas modélisables in vitro.
Objectifs
La prise en charge des patients sous chimiothérapie aplasiante nécessite un support transfusionnel plaquettaire important et itératif. Une des complications graves de ces transfusions multiples est l’état réfractaire aux transfusions plaquettaires (ERTP), c’est-à-dire le rejet des plaquettes transfusées par le receveur. La transfusion est alors inefficace et ne permet pas de prévenir les risques hémorragiques. Ce rejet est expliqué par la présence, chez le receveur, d’anticorps spécifiques qui entrainent l’élimination rapide des plaquettes transfusées. Le mode d’action de ces anticorps conduisant à l’élimination des plaquettes n’est pas bien compris. Nous proposons d’étudier les mécanismes d’élimination des plaquettes in vivo avec l’utilisation d’un modèle murin d’état réfractaire aux transfusions plaquettaires. Nous étudierons finement les mécanismes moléculaires mis en jeu grâce à l’utilisation de souris transgéniques expriment des protéines humaines qui pourraient être impliquées dans ces réponses. Nous souhaitons caractériser, grâce à l’utilisation d’un microscope permettant les observations intra-vitales, les interactions entre les plaquettes transfusées et la rate du receveur dans une situation d’état réfractaire aux transfusions plaquettaires.
Bénéfices attendus
Les patients qui nécessitent un support transfusionnel important et itératif, notamment ceux sous chimiothérapie, sont susceptibles de développer un état réfractaire aux transfusions plaquettaires. Des anticorps produits par le receveur peuvent mener à l’élimination des plaquettes nouvellement transfusées entrainant ainsi une inefficacité thérapeutique de la transfusion. Identifier les mécanismes sous jacents de cette réponse immunitaire pourrait permettre de faire évoluer la prise en charge des patients nécessitant un support transfusionnel important. En effet, déterminer la cinétique et l’organe dans lequel les plaquettes sont éliminées nous apporterait des éléments de réponses quant aux mécanismes impliquées et nous permettrait ainsi de réfléchir à des nouvelles stratégies thérapeutiques pour éviter les etats réfractaires aux transfusions. Ceci permettrait une meilleure prise en charge des patients limitant ainsi les coups d’hospitalisation, la consommation des produits sanguins labiles et la surmortalité induit par les états réfractaires.
Procédures
Aucun prélèvement ne sera fait sur animal vigile. Prélèvement artériel : prélèvement terminal (dure moins de 5 minutes) Prélèvement sanguin au niveau de la queue (prélèvements hebdomadaires pendant 5 semaines consécutives ; prélèvement dure moins d'une minute Transfusion en intra-veineux hebdomadaire pendant trois semaines consécutives, Procédure chirurgicale (pose d'une chambre d'observation abdominale) (procédure terminale sans réveil, durée de l'observation 30 minutes)
Impact sur les animaux
Possible douleur suite à la transfusion en i.v., durée estimée à 1h post-injection. Les sites d’injections seront particulièrement observés pendant le suivi quotidien des animaux. Possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement à la queue, durée de 30 secondes avant endormissement Possible difficulté de mobilité/engourdissement au réveil de l’anesthésie gazeuse, durée estimée à 3-5min
Devenir
Les souris "donneuses" sont par définition toutes mises à mort après le prélèvement sanguin car ce prélèvement artériel est terminal. Tous les animaux prévus dans la procédure d'alloimmunisation (souris receveuses) sont gardés en vie car utilisées dans les autres procédures. Après les expériences de microscopie intra vitale, tous les animaux sont mis à mort car c'est une procédure chirurgicale sans réveil (une fois la rate exposée et la chambre d'observation en place, on ne peut pas réveiller l'animal).
Remplacement
Le but de ce projet est de déterminer les mécanismes d’élimination des plaquettes transfusées. L’approche en temps réel sur l’élimination des plaquettes sanguines par la rate et/ou le foie et dans le sang ne peut se faire que sur modèle animaux afin d’observer des processus dynamiques entre le sang et ces organes. Ces approches de cytométrie en flux et de microscopie intravitale nécessitent un modèle in vivo et ne peut pas être modélisée par des techniques in vitro.
Réduction
Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences seront minimalisés, avec la contrainte d’obtenir des observations suffisamment représentatives. Des tests sur des tissus fixés ont eu lieu dans un premier temps pour mettre au point les conditions expérimentales optimales de visualisation des plaquettes (cinétique, quantité de plaquettes, optimisation des marquages,) ce qui nous a permis de réduire au minimum le nombre d’animaux requis pour les observations in vivo.
Raffinement
Un soin particulier sera apporté afin de diminuer le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet : - Hébergement dans des cages munies de particules de bois et enrichie avec un carré en coton compressé afin depermettre aux animaux de réaliser un nid conformément à leurs besoins comportementaux - Installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie et pendant toute la durée d’observation sous le microscope. - Anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés. - Injection d’analgésique avant chaque procédure. - Mise en place d’une fiche de suivi pour suivre l’état des animaux et veiller à leur bien être tout au long de l’expérimentation. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé.
Choix des espèces
Puisque nous souhaitons mimer la différence génétique entre un donneur et un receveur, nous devons travailler avec des animaux de fond génétique différent. La consanguinité des souris et la bonne connaissance de leur système immunitaire en font un modèle de choix. Nous avons donc choisi deux lignées de souris bien caractérisées : les souris "donneuses" seront de fond génétique C57Bl6 et le souris "receveuses" de fond génétique BALB/c. De plus, nous souhaitons éudier l'importance d'un récepteur exprimé par les plaquettes des souris "donneuses", nous utilisons donc des souris C57Bl6 modifiées génétiquement qui expriment ce récepteur ou d'autres souris qui expriment une protéine fluorescente pour pouvoir les visualiser quand elles sont transfusées dans la souris receveuse. Enfin, un microscope dédié aux observations intravitales sera utilisé sur le modèle murin. La taille de la souris est compatible et adaptée à l’équipement ce qui rend ce modèle totalement pertinent. Les animaux seront utilisés au stade adulte, pubère, agé de 8 à 25 semaines afin d’avoir un système immunitaire mature.
Rôle de l’Angiopoïétine-like 4 dans la fuite capillaire associée au syndrome de réponse inflammatoire systémique secondaire à un choc cardiogénique post-arrêt cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
458 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent un arrêt cardiaque provoqué suivi d'une réanimation par massage cardiaque et ventilation mécanique, le porteur estimant que 20 pour cent meurent dans les trois heures et 40 pour cent dans les six heures malgré la réanimation. L'étude cherche une cible pour limiter la fuite capillaire au cours des chocs, l'arrêt cardiaque induisant selon le porteur un coma qui rendrait la procédure sans inconfort. Il affirme que les études in vitro préalables "ne sont pas satisfaisantes" et que le modèle animal est nécessaire pour intégrer les composantes physiologiques.
Objectifs
Ce projet de recherche fondamentale vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire (fuite de plasma au travers des vaisseaux) au cours des états de choc cardiogénique chez l’homme. Les états de choc constituent un enjeu de santé publique. Les admissions pour états de choc représentent un tiers des admissions en réanimation (environ 20.000 patients par an), et la mortalité associée reste de l’ordre de 40% actuellement. Il existe au cours des états de choc une fuite capillaire importante). Cette fuite capillaire est due à une augmentation de la perméabilité des vaisseaux du fait de l’activation de l’inflammation (syndrome de réponse inflammatoire systémique : SRIS). Lorsqu’elle est généralisée, cette fuite capillaire aggrave l’insuffisance circulatoire du fait de la baisse du volume sanguin, et participe à l’apparition de lésions sur l’ensemble des organes (syndrome de défaillance multiviscérale). Le contrôle de la fuite capillaire s’est avéré très bénéfique dans plusieurs modèles de choc chez l’animal. Cependant, les déterminants de cette fuite capillaire au cours des états de choc restent très peu connus chez l’homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons isolé plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire chez des patients atteints de SRIS. Cette étude a permis en particulier d’identifier l’angiopoïétine-like 4 comme cible d’intérêt particulier. Notre objectif est de fournir la preuve de concept que la modulation de l’activité de l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 permet de diminuer la fuite capillaire et la mortalité au cours du SRIS.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de caractériser le rôle de l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 dans la fuite capillaire associée au choc cardiogénique post-arrêt cardiaque, et le potentiel intérêt de sa modulation. Le contrôle de la fuite capillaire au cours de ce syndrome est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, l’arrêt cardiaque restant associé à plus de 50% de mortalité actuellement, et la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients.
Procédures
Une antalgie prophylactique par injection sous-cutanée sera systématiquement réalisée avant le début de la procédure (typiquement 1 à 2 secondes). Un cathéter veineux sera ensuite mis en place (la procédure complète dure environ 30 minutes). Toutes les différentes injections sont administrées via le cathéter et ne nécessitent donc pas d’interventions supplémentaires sur l’animal. La réanimation cardio-circulatoire comporte un massage cardiaque (8 minutes) et une ventilation mécanique (i.e. une assistance respiratoire) d’au moins 1h jusqu’à atteindre une fréquence respiratoire supérieure à 100/min. L’imagerie cardiaque par échographie (non invasive) dure typiquement 15 minutes.
Impact sur les animaux
De par la variabilité physiologique des animaux ou de par leur génotype, certains animaux répondent moins bien à la réanimation et le cœur reste en arrêt malgré la réanimation cardio-respiratoire : nous estimons une perte d’effectifs de 20% à 3h et 40% à 6h. Cependant, l’arrêt cardiaque induit une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (c'est-à-dire un coma), et les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Ceci est confirmé par notre suivi des animaux au cours de la mise au point du modèle.
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sérum et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du SRIS (Syndrome de Réponse Inflammatoire Systémique). La fuite capillaire est en effet d’origine multi-factorielle et l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 régule de nombreuses voies physiologiques. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats. Le plan expérimental a été optimisé de façon à combiner les données obtenues pour chaque animal et réduire l’effectif nécessaire. Notamment, l'imagerie cardiaque par échographie sera effectuée sur les mêmes animaux que les mesures de fuite capillaire. De plus, les analyses sanguines et histologiques seront effectuées sur le sang et les organes non prélevés. En parallèle, notre équipe poursuit une veille bibliographique continue sur le sujet et sur le modèle de façon à ne par dupliquer d’éventuelles nouvelles données. De la même façon, l’ensemble des résultats du projet sera publié, pour les rendre accessibles aux autres équipes.
Raffinement
Nous tendrons vers les objectifs préconisés de raffinement. L’arrêt cardiaque induisant une encéphalopathie post-anoxique avec des troubles de conscience (coma), les données de la littérature n’indiquent pas d’inconfort lié à cette procédure. Un suivi attentif d’un potentiel inconfort sera néanmoins mis en place : pour diminuer au maximum l’inconfort potentiel des souris au cours des procédures, une antalgie prophylactique sera systématiquement réalisée avant le début de la manipulation. Ensuite, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie appropriée. L’état de conscience sera systématiquement dépisté après levée de la sédation toutes les heures pendant 7 heures. L’inconfort sera dépisté par une échelle validée et un traitement antalgique sera administré en cas de besoin. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car le protocole précis de SRIS secondaire à un arrêt cardiaque est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de notre cible d’intérêt dans ce modèle. Ces expériences permettront de définir si le gène d’intérêt peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du SRIS chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de SRIS étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement, ainsi que lors de nos expérimentations préliminaires sur ce modèle.
Utilisation de la transplantation mitochondriale dans l’ischémie-reperfusion périphérique.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
30 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles subissent une anesthésie générale de quatre heures, pour deux tiers d'entre elles couplée à une chirurgie, et une partie voit l'apport d'oxygène du membre postérieur coupé pendant deux heures pour provoquer une ischémie-reperfusion. L'étude teste la transplantation de mitochondries comme moyen de limiter les lésions, avec en perspective déclarée un traitement adjuvant chez les patients menacés d'amputation. Le porteur indique travailler sur un modèle cellulaire dont les premiers résultats ne sont "pas concluants", et conclut que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
L’ischémie, définie par l’arrêt de l’apport sanguin artériel dans un territoire donné, entraîne une inadéquation entre les apports et les besoins de la cellule pour son fonctionnement et sa survie (i.e. apports en oxygène et en nutriments). La reperfusion, correspondant à la restauration de l’apport sanguin artériel nécessaire aux besoins de la cellule, est indispensable mais va paradoxalement provoquer des lésions supplémentaires avec une aggravation de l’état initial (dont la lésion la plus connue est une augmentation de la mort cellulaire). Les mécanismes contribuant aux lésions d’ischémie-reperfusion sont multifactoriels et complexes, mais la dysfonction des mitochondries (centrale énergétique de l'organisme), le stress oxydant et l’inflammation jouent un rôle majeur. Toute la problématique actuelle est de développer des stratégies permettant de lutter contre les effets délétères de l’ischémie-reperfusion. Nous avons ainsi développé des stratégies diverses dont la transplantation mitochondriale, qui a été développée dans l’ischémie-reperfusion cardiaque mais n’est actuellement pas appliquée au niveau des membres inférieurs. Dans ce contexte, l’objectif du présent projet est de développer la transplantation mitochondriale comme stratégie de prévention des effets délétères de l’ischémie-reperfusion périphérique.
Bénéfices attendus
Malgré l’influence des mitochondries dans les dommages engendrés par l’ischémie-reperfusion, peu de travaux se sont intéressés aux effets potentiellement protecteurs d’une transplantation mitochondriale afin de limiter le stress et les dommages engendrés par l’ischémie-reperfusion. Les applications potentielles de la transplantation mitochondriale dans de nombreux domaines thérapeutiques sont importantes. D’un point de vu clinique, la transplantation mitochondriale est un traitement qui pourrait être instauré chez les patients en adjonction à la revascularisation, pour pallier au déconditionnement musculaire lié à l’ischémie critique du membre inférieur. Le pronostic fonctionnel des patients en ischémie critique est extrêmement sombre, car 50% des patients nécessitent une amputation majeure à 1 an de l’évolution initiale de la maladie. Le développement de stratégies permettant de réduire le déconditionnement musculaire permettrait d’améliorer le pronostic fonctionnel des patients, et potentiellement de proposer un traitement aux patients non revascularisables. Cette technique thérapeutique est « simple » puisqu’elle repose sur un isolement de mitochondries afin de les adresser localement au tissu endommagé.
Procédures
Dans notre étude, un groupe qui servira de témoin sera soumis à une anesthésie générale de 4 heures. Deux autres groupes seront soumis à une anesthésie générale couplée à une chirurgie d'une durée de 4 heures.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux sera soumise à une diminution transitoire des apports en oxygène dans le membre postérieur pendant 2 heures. Cette procédure représente l'objet de notre étude et ne peut par conéquent pas être supprimée.
Devenir
Mise à mort des animaux à l'issue de la procédure pour prélèvement des tissus nécessaire à nos études sur la mitochondrie.
Remplacement
Notre équipe travaille actuellement sur un modèle in vitro (modèle cellulaire) d'anoxie-reoxygénation qui permettrait d'étudier les mécanismes sans avoir recours à l'expérimentation animale. Néanmoins, les premiers résultats sur ce modèle ne sont pas concluants et, par conséquent, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro permettant d’évaluer l’impact de l’ischémie reperfusion sur la dysfonction mitochondriale et les potentiels effets bénéfiques d’une transplantation de mitochondries. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d’étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés sur des modèles ex vivo ou in silico. Afin de mieux comprendre les avantages de la transplantation mitochondriale, il semble pertinent de considérer les organes dans leur intégralité et dans des conditions expérimentales les plus proches possibles des conditions physiologiques afin de potentiellement transférer ce modèle en clinique. Par conséquent, l’utilisation du modèle animal est indispensable à la réalisation de ce protocole.
Réduction
Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables.
Raffinement
Les animaux sont acclimatés à leur hébergement 10 jours avant le début des expérimentations. Les animaux sont répartis en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Les animaux seront suivis quotidiennement pour détecter tout signe de malêtre et des points limites ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie et les animaux seront maintenus à température grâce à un tapis chauffant.
Choix des espèces
Notre équipe a développé les différents modèles d’ischémie-reperfusion sur la souris afin d’éviter de réaliser des expérimentations sur des gros animaux et pour avoir la possibilité de pouesuivre no travaux sur des modèles de souris génétiquement modifiées pour explorer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Les souris seront âgées de 9 à 15 semaines pour qu’elles aient un poids d’environ 30 grammes. Nous avons choisi de travailler sur des souris jeunes afin d’exclure tout impact du vieillissement sur les paramètres analysés dans notre étude. Il est de même pour le poids, nous avons choisi de travailler sur des souris de 30 afin d’exclure un potentiel impact de l’obésité (accumulation de masse graisseuse) qui pourrait également impacter nos résultats.
Evaluation de nouveaux agents d’embolisation chez le lapin
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
720 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère, la majorité tués à l'issue et une soixantaine réutilisés. Ils subissent jusqu'à quatre interventions, implantation d'une tumeur au foie, embolisation d'une artère avec ou sans réveil, et des séances d'imagerie répétées jusqu'à dix fois sous anesthésie. Le porteur indique un risque de perte de mobilité voire de paralysie d'une patte, une ischémie de zones non ciblées et le développement de métastases hépatiques et pulmonaires. Il précise que beaucoup d'animaux sont tués pour ne pas atteindre les points limites ou parce qu'ils souffriraient de séquelles lourdes après des embolisations multiples, le projet testant des agents d'embolisation internes ou de partenaires.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité et la facilité d’utilisation d’agents d'embolisations divers sur différents territoires et différentes pathologies. Ce sont des produits qui peuvent être issus de la recherche interne ou de partenariats académiques ou privés.
Bénéfices attendus
L'embolisation est une pratique courante en clinique permettant une alternative à la chirurgie qui est invasive, douloureuse et parfois non réalisable. Cette procédure permet une récupération beaucoup plus rapide pour les patients et une durée d’hospitalisation plus courte. Dans ce contexte, proposer aux praticiens des solutions diverses répondant à toutes les utilisations potentiellement éligibles à l'embolisation est un problème de santé publique.
Procédures
4 procédures chirurgicales et des prélèvements sont prévus dans ce projet. - L’implantation tumorale hépatique (40 minutes sous anesthésie générale). Les lapins ne subiront cette procédure qu’une seule fois - L’embolisation artérielle sans réveil (40 minutes sous anesthésie générale). Les lapins ne subiront cette procédure qu’une seule fois mais ils peuvent avoir subi une implantation tumorale au préalable - L’embolisation artérielle avec réveil (40 minutes sous anesthésie générale). Les lapins ne subiront cette procédure qu’une seule fois mais ils peuvent avoir subi une implantation tumorale au préalable - L’imagerie Rayon X, échographique ou IRM (10, 20 et 50 minutes respectivement sous anesthésie générale). Cette procédure peut être répétée jusqu’à 10 fois mais avec des délais leur permettant de récupérer entre 2 procédures d’imagerie. Ces lapins auront tous subi une procédure d’embolisation avec réveil au préalable plus, éventuellement, une implantation tumorale. - Les prélèvements sanguins seront réalisés à l’oreille (quelques secondes en vigile) sur tous les animaux ayant eu une procédure d’embolisation avec réveil, pour les dosages de biomarqueurs ou de produit.
Impact sur les animaux
La chirurgie au niveau de l’artère fémorale peut potentiellement entrainer une perte de mobilité, voire une paralysie de la patte arrière chirurgiquée. Celle ci se produit dans de rares cas ou le catheter inséré dans l'artère fémorale bloque de façon prolongée la vascularisation collatérale de celle ci. C'est potentiellement le cas lors d'une imagerie prolongée avec injection dans le système d'imagerie. Une ouverture du plan cutané au niveau abdominal peut se produire dans les 24 heures suivants l'opération si l'animal ote accidentellement ces points de suture une fois réveillé dans sa cage. L'embolisation avec des matériaux solides (microsphères) peut atteindre des zones non ciblées et générer une petite ischémie de ces zones. L'anesthésie prolongée peut provoquer une deshydratation de l'animal. Le développement de la tumeur hépatique conduit à terme à l'apparition de métastases hépatiques et pulmonaires. Enfin, les anesthésies répétées diminuent les prises hydriques et alimentaires des lapins.
Devenir
La majorité des animaux du projet sera euthanasiée afin de ne pas atteindre les points limites pour les lapins porteurs de pathologies évolutives (tumeur) ou parce qu'une étude histologique sera nécessaire afin de déterminer les effets du traitement ou encore parce que les animaux auront eu des embolisations multiples, pour diminuer le nombre total d'animaux du projet, mais ne pouvant pas être réveillés car ils souffriraient de sequels lourds.. Certains animaux (une soixantaine) pourront être réutilisés car ils n'auront subi qu'une procédure modérée (embolisation partielle et transitoire d'un organe) et qu'un suivi sur un mois aura été fait (paramètres sanguins) pour s'assurer de l'absence d'effets secondaires.
Remplacement
La réussite d'une embolisation est dépendante de différents paramètres. Il y a tout d'abord les paramètres intrinsèques à l'agent embolisant (taille, stabilité, viscosité ...) qui seront déterminés in vitro pour faire un premier tri des molécules. En parallèle, des études sur des systèmes en flux donneront des premiers renseignements sur le pouvoir embolisant des différents produits et permettront de réduire le nombre d'agents d'embolisation à tester in vivo. Passée cette préselection, seule l’expérimentation in vivo, permettra d'évaluer l'efficacité attendue chez l'homme. En effet, il est nécessaire de prendre en compte toutes les interactions entre l'agent d'embolisation et le vaisseau comme le flux, la tortuosité des vaisseaux, les interactions avec la paroi vasculaire, les systèmes de coagulation .....
Réduction
Chaque étude évaluant un nouvel agent d’embolisation, sera composée par 2 groupes d’animaux (n= 6 animaux par groupe) : le premier groupe aura le but d’évaluer le nouvel agent d’embolisation qui sera comparé à une référence clinique (deuxième groupe). Un animal pourra être utilisé pour plusieurs indications, c'est-à-dire, l'embolisation de divers organes afin de réduire le nombre d'animaux inclus dans ce projet. Un seul groupe d’animaux contrôle sera utilisé comme référence pour tous les agents d’embolisation d’une même classe (liquide, solide …). De plus, les animaux ayant reçu des agents d'embolisation transitoire sur un seul organe (1 seul rein, un lobe de foie ....) seront réutilisés pour le même ou un autre projet. Enfin, certains animaux permettront de tester l'efficacité de plusieurs agents d'embolisation sur un territoire ou d'un seul agent sur plusieurs territoires. Le nombre de 6 animaux par groupe est nécessaire et suffisant pour réaliser des analyses statistiques et comparer ainsi le l'efficacité des traitements
Raffinement
Une prémédication avec un antidouleur de la famille des morphines est systématiquement mise en place 1 heure avant chirurgie ou embolisation avec réveil de l’animal. Pour pallier aux nuisances et effets indésirables liés à la chirurgie les mesures suivantes sont mises en place: une hydratation sous cutanée (50 mL) est réalisée avant la chirurgie ,une injection locale d'anti douleur sur le site d’incision et une injection IV d'anti coagulant sont réalisés pour compléter les mesures anti douleur et prévenir les complications post opératoires. Une couverture anti inflammatoire est également mise en place sur les 16 heures post réveil de l’animal. Les lapins subissant chirugie abdominale porteront une collette pendant 5 jours post opération pour éviter qu’ils ôtent leur suture et soient opérés de nouveau pour la refaire. De même la tablette présente en temps normal dans la cage est retirée pendant 5 jours pour ne pas gener les déplacements de l'animal porteur de collerette et éviter de frotter sur la suture. Du foin (appétant pour les lapins) et une eau gélifiée sont placés dans la cage leur permettre de récupérer plus rapidement post chirurgie. Les objets (balle, morceaux de bois) sont conservés dans la cage. Le comportement des animaux opérés et embolisés est observé par les zootechniciens chaque jour de la semaine. Les points limites ont été définis sur la perte de poids de l'animal, sa mobilité, son comportement, la taille de la tumeur pour les animaux porteurs de tumeurs hépatiques,
Choix des espèces
Le lapin a été choisi car du fait de sa taille, il répond à tous les critères permettant de réaliser l'ensemble des procédures. La mesure du flux sanguin est accessible par les méthodes non invasives (échographie, IRM) ou mini invasives (fluoroscopie) et la réalisation de l'embolisation sélective se fait comme en clinique par montée de cathéter via l'artère fémorale. C'est également le modèle le plus référencé dans la littérature. Il est donc déjà validé et cela nous permettra de comparer nos résultats à ceux des autres agents embolisants. Enfin, l'expérience acquise dans le laboratoire sur cette espèce et avec des procédures similaires permet de s'assurer la meilleure inclusion des animaux. Animaux matures de plus de 10 semaines, d'environ 3.0 kg. Les animaux doivent avoir atteint leur taille adulte pour avoir des calibres artériels suffisants pour réaliser la procédure de cathétérisation.
Modèle murin de remplacement trachéal par une matrice aortique
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une autre opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil pour prélever un greffon d'aorte. Les souris opérées subissent une chirurgie de remplacement de la trachée par une matrice aortique de 45 minutes, avec des injections de tamoxifène cinq jours de suite pour les lignées transgéniques, et sont euthanasiées entre 7 et 90 jours après. Le porteur indique des douleurs post-opératoires, un risque d'infection et une perte de poids temporaire possibles. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne modélise ce remplacement et retient la souris pour ses lignées génétiquement modifiées, l'ancien modèle étant la brebis.
Objectifs
La greffe trachéo-bronchique est un véritable défi chirurgical et biologique. Des échecs successifs ont été observés avec les prothèses synthétiques, les bioprothèses, les allogreffes trachéales, et les autogreffes d’organes et tissus divers. Le remplacement trachéo-bronchique par une allogreffe artérielle cryopréservée soutenue par une endoprothèse a été réalisé récemment chez l'Homme. Cette technique est la seule à avoir prouvé son efficacité et durabilité. Des études expérimentales chez la brebis et des applications chez l’homme ont toutes montré la formation d’un nouveau conduit respiratoire avec de l’épithélium respiratoire et du cartilage « de novo ». Le greffon aortique cryopréservé joue un rôle très important dans cette régénération car il contient des cellules viables et libère des facteurs de croissance et des cytokines diverses . Le corps humain de l’hôte est un bioréacteur qui induit, en présence de la matrice aortique, des facteurs favorisant la migration et l’activation des cellules inflammatoires et des cellules progénitrices dans le greffon. Afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu lors du remplacement trachéal par la matrice aortique, nous souhaitons développer un modèle murin de remplacement trachéal par l’aorte qui nous permettra d’étudier les étapes-clés du processus de régénération plus facilement que chez la brebis. Afin de déterminer l’origine cellulaire des nouveaux anneaux cartilagineux présents dans la matrice aortique, des souris double transgéniques seront utilisées pour faire du traçage de la lignée chondrocytaire. OBJECTIFS i. Mettre au point le modèle de remplacement trachéal par l’aorte ascendante chez la souris. ii. Identifier les programmes cellulaires et moléculaires intervenant dans la néochondrogenèse au sein de la matrice aortique.
Bénéfices attendus
Ce projet représente la suite des travaux de recherche concernant le remplacement trachéo-bronchique par une allogreffe artérielle, réalisée chez la brebis, permettant l'utilisation de la technique chez l'homme, avec la formation de nouvelles voies respiratoires. Ce nouveau projet représente une étape d’un travail de recherche essentiel qui vise à identifier les mécanismes cellulaires qui favorise la régénération et la réparation tissulaire mis en jeu lors du remplacement trachéal. La mise en évidence de ces mécanismes permettra de proposer des solutions thérapeutiques afin d’améliorer et accélérer l’apparition de nouvelles voies respiratoires après le remplacement par allogreffe artérielle.
Procédures
- prélèvement post mortem d'un greffon aortique (1 intervention, durée de l'intervention: 15 minutes, acte réalisé après euthanasie), - injection de tamoxifène pour les animaux transgéniques uniquement (1 injection/jour pendant 5 jours continus, durée de l'intervention: 20 secondes, acte réalisé après traitement analgésique) - procédure chirurgicale (1 intervention, durée de l'intervention: 45 minutes, acte réalisé après traitement analgésique et anesthésique; prise en charge analgésique au cours de la période post-opératoire, l'euthanasie des animaux opérés aura lieu de 7 à 90 jours après la procédure chirurgicale).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont le risque anesthésique, la douleur post-opératoire, une infection post-opératoire, une perte de poids temporaire au cours de la période post-chirurgicale, le stress associé à des administrations intrapéritonéales répétées de tamoxifène.
Devenir
A la fin des procédures , les 480 animaux sont euthanasiés afin de réaliser des prélèvements post-mortem.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour modéliser le remplacement trachéo-bronchique par une allogreffe artérielle. Cette affirmation se base sur : - des discussions avec des confrères; - des conférences en pneumologie ; - une recherche bibliographique approfondie effectuée sur la période 2010-2021 dans les bases de données en utilisant es mots-clés suivants: replacement, trachea, aorta, alternatives.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les mises au point de la technique chirurgicale seront réalisées sur des souris euthanasiées, issues de surplus de colonie. Le calcul de la taille d'échantillon a été déterminé par un calcul de puissance à partir de données de la littérature. Un modèle murin de remplacement trachéal a été publié récemment en utilisant soit des trachées de souris syngéniques, soit des structures synthétiques. Cet article, unique référence existante sur ce type de modèle expérimental murin, déclare observer un taux de survie post-opératoire de 80% à 60 jours pour les greffons syngéniques. A partir de ces résultats, nous avons réalisé un calcul de puissance pour déterminer la taille des effectifs. Le nombre total d'animaux pour le projet est de 480 souris. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Avant la réalisation d'une procédure expérimentale, les souris seront maintenues en cage de 370 cm2. Les animaux seront logés en groupes sociaux stables formés de 4 individus compatibles. Il n'y aura pas de limitations en apports alimentaires et hydriques. L'enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification et d'abri en cellulose. Afin de vérifier la profondeur de la dose d'anesthésie, les signes suivants seront vérifiés: le relachement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe palpébral, une respiration calme. Si l'un de ces signes est toujours présent 10 minutes après l'injection ou apparait avant la fin de l'intervention chirurgicale, une deuxiéme injection de produits anesthésiques sera réalisée. La douleur post-opératoire sera prise en charge par l'application locale d'analgésique au niveau de la zone opérée et par une injection sous-cutanée d'analgésique. Si besoin, celle-ci sera répétée les jours suivants la chirurgie. Les interventions chirurgicales auront lieu le matin, permettant ainsi une vérification de l'état général des animaux en post-chirurgie, en particulier en s'assurant que les animaux sont complètement sortis de l'anesthésie en fin de journée (retour de la mobilité, prise hydrique et alimentaire). Une observation journalière des animaux est réalisée (apparence physique externe, changement de comportement, réponse aux stimuli externes, courbe de poids). Les animaux seront pesés quotidiennement lors des 5 jours suivant l’acte chirurgical. Par la suite, le poids sera enregistré 3 fois par semaine. Une perte de plus de 20% du poids initial ou la perte totale de mobilité seront considérés comme des points-limites, justifiant la fin du protocole expérimental. La cicatrisation sera observée en même temps que le suivi de poids. Des signes d’inflammation seront scrutés (rougeur, gonflement). La perte des fils de suture indiquera une bonne cicatrisation.
Choix des espèces
Le modèle de remplacement trachéal chez la souris offre la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés (contrairement au modèle ovin précédemment utilisé) pour pouvoir cibler le rôle de certaines populations cellulaires et des molécules impliquées dans le processus ide néochondrogenèse et ainsi, identifier des mécanismes responsables de la régénération trachéale. Pour le modèle de remplacement trachéal, des souris adultes (8-12 semaines) seront utilisées. En pathologie humaine, la technique de remplacement trachéal s’adresse surtout aux adultes (sténoses acquises bénignes et pathologie maligne de l’arbre respiratoire).
Dispositif de formation initiale et continue en chirurgie sur le modèle porcin
- Enseignement supérieur
24 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal subit de multiples gestes chirurgicaux lourds, laparotomies et cœlioscopies des systèmes urinaire, digestif et gynécologique, néphrectomie, hystérectomie ou transplantation, pour entraîner étudiants, chirurgiens et médecins. Le porteur indique pousser les sessions jusqu'à la gestion de complications graves comme des plaies vasculaires à réparer, afin de "diminuer le nombre d'animaux utilisés". Il justifie le modèle porcin par sa proximité anatomique avec l'humain et revendique un dispositif de simulation en amont.
Objectifs
L'objectif de ce projet vise à former et perfectionner des étudiants de 3ème cycle, des chirurgiens et des médecins à diverses procédures et gestes chirurgicaux chez le modèle porcin.
Bénéfices attendus
Avec l’application de la loi européenne sur le temps de travail des étudiants en troisième cycle des études de médecine, leur exposition à la clinique et à la pratique a très nettement diminué (Arnaud et al Prog Urol). Par ailleurs, la réforme du troisième cycle des études de Médecine a diminué la durée de leur formation. L’ensemble des équipes pédagogiques a donc jugé prioritaire la mise en place de programmes de simulation pour s’adapter à cette évolution et permettre à ces futurs médecins/chirurgiens d’avoir quand même une formation adéquate. En parallèle de cela, le dogme érigé par l’Haute Autorité de Santé (HAS) « Jamais la première fois sur le patient » impose désormais une formation et une pratique en amont de l’application à l’Homme. Pour toutes ces raisons, la simulation chirurgicale sur gros animal est devenue indispensable. La formation mise en place permettra aux étudiants en chirurgie viscérale (urologie, chirurgie digestive, gynécologie, viscérale pédiatrique) en fin de cursus de perfectionner leur technique et leurs connaissances après avoir pu faire de la simulation en dry lab et avoir passé les étapes précédentes du curriculum. L’objectif est donc de permettre à ces futurs praticiens d’avoir réalisé les interventions correspondant à leurs disciplines sur un gros animal avant de le faire chez l’Homme. En ce qui concerne la formation continue, l’objectif est de pouvoir offrir un perfectionnement à des médecins chirurgiens installés sur de nouvelles techniques ou des techniques hyper spécialisées comme la transplantation ou la chirurgie endoscopqiue.
Procédures
Dans le cadre de la formation initiale, les animaux seront soumis aux gestes chirurgicaux suivant : (1) laparotomie sur le système urinaire avec apprentissage des gestes techniques de type dissection, néphrectomie ou anastomose ; (2) laparotomie sur le système digestif avec apprentissage des gestes techniques de type dissection, préhension des vaisseaux, cholécystectomie ; (3) laparotomie sur le système gynécologique avec apprentissage des gestes techniques de type dissection, ovariectomie, hystérectomie, anastomose digestive ; (4) cœlioscopie sur le système urinaire avec apprentissage des gestes techniques de type préhension des tissus sans traction, dissection, néphrectomie et réimplantation urétéro-vésicale ; (5)cœlioscopie sur le système digestif avec apprentissage des gestes techniques de type ligature, cholécystectomie, cathétérisme, gastrolyse ; (6) cœlioscopie sur le système gynécologique avec apprentissage des gestes techniques de type dissection, hystérectomie. La formation continue sera de 2 types : (1) formation à la transplantation de foie et/ou de rein. Dans ce cadre, les gestes d’un greffe de ces 2 organes seront réalisés chez l’animal : préparation à la greffe, prélèvement et conservation d’organes, transplantation ; (2) formation à la technique de dissection sous muqueuse endoscopique. Pour cela, l’animal est soumis à une endoscopie pour réaliser une exérèse de tissu situé au niveau de l’œsophage et l’estomac.
Impact sur les animaux
Les animaux étant anesthésiés et sous analgésie durant toute la durée de l'intervention, puis euthanasiés sans réveil possible, aucune douleur ou inconfort ne sera subi(e) par les animaux utilisés pour ces formations. Cependant, les points suivants peuvent être listés et conduiront à l'euthananie de l'animal avant la fin de la procédure : - hémorragie abondante ne pouvant pas être contrôlée par le chirurgien responsable, - rythme cardiaque excessif pendant plusieurs minutes (>200 battements/min), et ne pouvant pas être stabilisé par une modulation de l'anesthésie ou de l'analgésie, - perte des signaux de monitoring, - incident technique ou humain ne permettant pas de poursuivre la procédure chirurgicale.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issu de chaque journée de formation sans réveil au préalable. En effet, pour optimiser l’utilisation des animaux, les procédures sont pour certaines bilatérales et ne permettent pas la survie et donc le réveil, comme par exemple la néphrectomie bilatérale, la cystectomie, etc. Par ailleurs, pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, les sessions sont poussées jusqu’à la gestion de complications peropératoires avec des plaies vasculaires graves à réparer. Enfin, les interventions réalisées sont à risque de complications postopératoires qui ne pourraient être gérées et de douleur.
Remplacement
Cette formation en chirurgie expérimentale sera faite sur modèle porcin car cette espèce, très proche de l’Homme en termes d’anatomie et de physiologie digestive, est la plus adaptée pour l’apprentissage des gestes chirurgicaux devant être exécutés chez l’Homme. Il est important de savoir que tout est mis en place pour remplacer et diminuer l’utilisation d’animaux pour la simulation. Nous avons mis en place un parcours de formation progressif permettant de réserver le matériel animal pour les étudiants en fin de cursus dans un but de perfectionnement et non d’apprentissage de base. Tout au long de leur cursus, les étudiants de troisième cycle ont des formations avec de la simulation procédurale. Elles reposent au début sur du dry lab avec de la manipulation et de la technique laparoscopique sur des pelvitrainer, puis sur des simulateurs numériques pour reproduire dans les limites de la technologie actuelle des exercices et des interventions chirurgicales pas à pas. En parallèle, les étudiants/internes ont de sessions de dissection sur des sujets cadavériques ou des pièces anatomiques. Enfin, lors de leur dernière année de cursus, la formation propose un perfectionnement sur 2 types de modèles : les sujets cadavériques revitalisés et les modèles porcins. L’objectif de la formation est donc de se rapprocher progressivement pendant le cursus de déroulé d’interventions les plus proches possibles de la réalité, tout en épargnant au maximum l’utilisation de sujets anatomiques et d’animaux. En fin de cursus ou pour la formation continue, il n’y a pour l’instant pas d’autre modèle aussi fidèle à disposition que ces 2 modèles pour permettre un perfectionnement chirurgical adapté à la pratique sur l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour cette formation a été réduit au minimum satisfaisant pour garantir un confort d’intervention tout autant pour les personnes chargées de veiller à la préparation, anesthésie et analgésie des animaux, que pour les étudiants et médecins devant se former (de 2 à 4 personnes formées par animal opéré). Toute addition de séances ou d’animaux supplémentaires fera l’objet d’un avenant à la présente saisine.
Raffinement
L'anesthésie et l’analgésie durant les interventions ont été conçues pour supprimer la douleur induite par une chirurgie et la manipulation des viscères.
Choix des espèces
Le porc est l'espèce modèle la plus utilisée en chirurgie expérimentale à visée humaine. L'anatomie générale du porc ainsi que la taille et la conformation des différents organes internes sont très proches de celles de l'Homme. Le porc représente donc un modèle de prédilection pour l'apprentissage de gestes chirurgicaux qui sont réalisés sur des patients humains dans le cadre d'interventions classiques en chirurgie hépatobiliaire et digestive. Les animaux sélectionnés seront des porcs conventionnels juvéniles de 30 à 40 kg car ce poids permet de disposer d'animaux avec des organes internes dont la taille se rapproche le plus de celle observée chez l'Homme.
Etude de l’activité cardiaque chez la grenouille
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
900 grenouilles vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil ou avant l'expérience. Anesthésiées et démédullées, elles servent à exposer ou prélever le tissu cardiaque pour que des étudiants de licence et de master enregistrent l'activité électrique du cœur de quarante minutes à trois heures. Le porteur décrit une finalité de formation pratique et non de production de connaissances. Il justifie le recours à la grenouille par sa simplicité expérimentale et une chirurgie "facilement applicable" par les étudiants.
Objectifs
Formation pratique des étudiants en troisième année de licence science de la vie. Les étudiants par la mise en place de procédures expérimentales sur la grenouille sont formés à la manipulation sur animaux en vue d'obtenir des résultats exploitables et d'élaborer des comptes rendus scientifiques. Il s'agit d'aborder expérimentalement la fonction cardiaque sur ce modèle.
Bénéfices attendus
Obtentions de résultats interprétables par les étudiants d'un point de vue fonctionnel. Application direct des notions théoriques vues en cours sur la physiologie et la régulation cardiaque. De plus cette technique permet aux étudiants de visualiser en conditions réelles les modifications de cette activité cardiaque induites par les différents médiateurs.
Procédures
Pour la formation des étudiants en licence 3 les animaux sont anesthésiés et désensibilisés. Un accès au tissu cardiaque permet alors aux étudiants d'enregistrer et de travailler sur l'activité électrique de l'organe durant 3 heures. Pour la formation des étudiants en Master 1 les animaux sont anesthésiés et désensibilisés. Un prélèvement de tissu cardiaque permet alors aux étudiants d'enregistrer et de travailler sur l'activité électrique de l'organe durant 40 minutes.
Impact sur les animaux
léger stress lorsqu'on manipule les animaux. Ensuite les animaux sont anesthésiés, puis désensibilisés pour être utilisés dans des conditions dites "ex vivo".
Devenir
Mise à mort: pour les travaux pratiques de master 1: les animaux sont mis à mort avant l'expérience puisque un prélèvement cardiaque est réalisé pour travailler sur le tissu. Pour les travaux pratiques de licence 3 les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure qui est une procédure sans réveil. La mise à mort est justifiée par le fait de leur désensibilisation et de la procédure expérimentale réalisée par les étudiants pour leur formation.
Remplacement
L'intérêt est d'avoir accès à une application directe de la régulation de la fonction cardiaque par les étudiants. De ce fait, l'utilisation des animaux est pleinement justifiée pour une formation de qualité en physiologie animale concernant les étudiants de ce parcours.
Réduction
Les conditions expérimentales sont définies de façon à réduire le nombre d'animaux utilisés. 1 seul animal par binôme d'étudiants limitant le nombre une première fois, et la mise en commun des résultats de l'ensemble des binômes pour un nombre de d'échantillons satisfaisant, limitant le nombre une seconde fois.
Raffinement
L'anesthésie ainsi que les procédures de désensibilisation sont utilisées pour permettre de mener par la suite les expériences ex vivo
Choix des espèces
La grenouille étant un animal poïkilotherme, les conditions expérimentales restent simplifiées. En effet, les expériences ex vivo peuvent être réalisées sans contrôle particulier de température et de gaz respiratoires. De plus, la chirurgie permettant l'accès au coeur, ne nécessite pas de gestes compliqués et peut alors être facilement applicable par les étudiants. Les animaux sont utilisés à l'âge adulte pour une fonction et régulation cardiaque optimales.
Contribution des stocks de glycogène astrocytaires au soutien métabolique de l’activité neuronale dans le cerveau sain (EU2/2 collaborateur)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil ou légers. Une partie subit sous anesthésie une craniotomie d'une à une heure et demie ou des injections d'insuline et de glucose pouvant provoquer une hypoglycémie, avant que le cerveau soit fixé par un faisceau de micro-ondes qui les tue. L'étude porte sur le rôle des réserves de glycogène dans le fonctionnement du cerveau. Le porteur affirme que le recours à l'animal vivant est "indispensable" car l'interaction entre le cerveau et les vaisseaux ne se modélise pas in vitro.
Objectifs
Les stocks énergétiques du cerveau consistent principalement en réserves de glycogène présentes dans les cellules gliales. Ces stocks représentent une proportion infime des quantités totales de glycogène présentes dans l’organisme, par exemple dans le foie ou les muscles. Ils sont présents dans toutes les régions du cerveau, notamment le cortex cérébral, l’hippocampe et même le nerf optique. Même limités, ces stocks sont situés au plus près des neurones et de l’activité synaptique et cette localisation privilégiée les met en position de participer à l’activité normale ou pathologique du cerveau. Ils sont recrutés en conditions d’hypoglycémie ou d’ischémie pour alimenter les cellules du cerveau, lorsque les ressources énergétiques sont limitées. Des résultats récents indiquent que les réserves de glycogène peuvent aussi être sollicitées pendant des phases d’activité neuronale, et contribuer ainsi au fonctionnement normal du cerveau, par exemple pendant le codage et la consolidation de la mémoire. Le glycogène est une macromolécule d’environ 10-40 nm de diamètre qui peut être hydrolysée pour entrer dans les réactions de glycolyse qui permettent de produire l’énergie des cellules. Les données récentes de la littérature suggèrent que lorsque les astrocytes hydrolysent leurs stocks de glycogène, ils libèrent préférentiellement du lactate, et que ce lactate est mis à disposition des neurones qui peuvent le transformer en pyruvate et alimenter le cycle de Krebs pour produire de l’énergie. Cependant, la dynamique et les mécanismes de ces échanges de lactate sont encore très mal connus, ainsi que leur rôle in vivo. Le but de ce projet est de décrire ces flux de lactate grâce à une technique de détection innovante afin de comprendre quand et comment est recruté le glycogène pendant le fonctionnement normal du cerveau.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ce projet, permettra de mieux comprendre le rôle des réserves de glycogène dans le fonctionnement normal du cerveau, et représentera une avancée dans la compréhension du métabolisme cérébral en conditions physiologiques ou pathologiques. Il pourra ouvrir la voie vers de nouvelle stratégies de protection du cerveau pendant des agressions cérébrales aiguës comme le traumatisme crânien et les hémorragies méningées.
Procédures
Les interventions consisteront à fixer le cerveau par un faisceau de micro-ondes. Dans certains cas, la fixation sera précédée d'une intervention chirurgicale ou d'injections sous-cutanées d'insuline et de glucose. L'intervention chrirugicale visera à induire une ou plusieurs dépolarisations corticales. Elle consistera en une craniotomie sous anesthésie générale et analgésie, et durera entre 1h et 1h30. Les injections consisteront en une administration sous-cutanée d'insuline suivie de trois injections de glucose espacées d'une heure, l'ensemble de la procédure durant 3h.
Impact sur les animaux
Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et analgésie sans réveil. Les nuisances sur les animaux sont donc très minimes. L’anesthésique utilisé permettra de couvrir la durée nécessaire aux expériences à réaliser. Les effets indésirables sur l’animal se limitent donc à des problèmes d’anesthésie pouvant provoquer un réveil de l’animal lors de son positionnement dans l’appareil stéréotaxique ou en cours d’enregistrement, ce qui reste rare. L'injection d'insuline peut provoquer des épisodes d'hypoglycémie entre deux injections de glucose.
Devenir
Les animaux seront mis à mort par le faisceau de micro-ondes dirigé sur le cerveau. Le cerveau sera ensuite prélevé ce qui exclut la survie de l'animal.
Remplacement
Les flux de glucose, de lactate et d’oxygène dans le cerveau reposent sur l’interaction entre le cerveau et le système vasculaire qui l’alimente en nutriments. Cette interaction ne pas encore être modélisée in vitro. Notamment, dans les tranches de cerveau, les capillaires sanguins sont découpés et le flux sanguin est absent. Pour cette raison, le recours à l’animal vivant est indispensable.
Réduction
Ce projet impliquera 72 rats adultes mâles et femelles. Le nombre d’animaux utilisés au cours du projet est maintenu à un niveau minimal permettant des analyses statistiques nécessaires à l’établissement de conclusions fiables.
Raffinement
Concernant la douleur pendant la chirurgie, un traitement analgésique est prévu avec une injection sous-cutanée de buprenorphine (0.02 mg/kg) et une administration locale de lurocaïne sur le scalp, pratiquées avant l’incision de la peau. La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale par l'isoflurane et en appliquant les points limites définis par (1) une défaillance du système d'anesthésie pouvant conduite au réveil de l'animal et (2) l'apparition d'une hemorragie incontrôlée au niveau du scalp. Concernant l'angoisse infligée à l'animal, elle est réduite par un hébergement par groupes de deux à six dès l’arrivée au laboratoire et par l’insertion d’un enrichissement dans les cages d’hébergement (roue d’exercice, matériau de nidification). Les animaux disposent de nourriture et de boisson à volonté.
Choix des espèces
Le rat est un modèle mammifère très utilisé dans la recherche sur le métabolisme cérébral ; ce qui permet de s’appuyer sur un corpus bibliographique conséquent. Par rapport à la souris, le rat possède une boite crânienne plus grande, qui permet d’implanter facilement plusieurs capteurs, ce qui est plus difficile chez la souris. Il est possible que ce projet se poursuive par des études chez l’animal vigil, et si c’était le cas, seul le rat pourrait supporter l’implantation de capteurs embarqués et d’amplificateurs miniaturisés. Rats seront des adultes de 10 semaines ou 300g de poids corporel. A cet âge, le développement de l'animal est terminé et les mécanismes biologiques restent stables dans le temps.
Stratégies ciblant le microbiote intestinal dans le contexte de la maladie de Crohn
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
1 096 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent des bactéries et des composés par gavage intragastrique, jusqu'à 35 administrations, un prélèvement sanguin, et pour une partie une colite déclenchée par un produit chimique ajouté à l'eau de boisson, pour tester trois stratégies visant des bactéries associées à la maladie de Crohn. Les retombées annoncées pour les patients, des options thérapeutiques personnalisées, sont renvoyées aux essais cliniques et au long terme. Sur le remplacement, le porteur affirme que la validation à l'échelle de l'"organisme entier" reste "nécessaire" malgré les tests in vitro déjà menés.
Objectifs
Le microbiote intestinal joue un rôle clé dans le développement et l’entretien des pathologies inflammatoires chroniques de l’intestin. En effet, dans de nombreuses pathologies, certaines populations de bactéries ‘bénéfiques’ pour l’hôte sont diminuées au détriment de bactéries ‘agressives’ aux propriétés pro-inflammatoires. Dans la maladie de Crohn, il a été observé une surexpression d’une protéine au niveau de la muqueuse de l’intestin grêle des patients. Cette protéine agit tel un récepteur pour certaines bactéries adhérentes et invasives. Une fois attachées à la muqueuse iléale, ces bactéries peuvent traverser la muqueuse et déclencher et/ou entretenir une inflammation intestinale. Chez l’animal, ces bactéries adhérentes et invasives sont capables d’aggraver une inflammation intestinale déjà existante et elles sont également capables de coloniser l’intestin et d’induire une inflammation intestinale dans en modèle de souris exprimant la protéine humaine réceptrice de ces bactéries. Ces modèles murins sont précieux pour pouvoir tester l’efficacité de stratégies thérapeutiques visant spécifiquement ces bactéries. Dans le cadre de ce projet de 5 ans, 3 grandes stratégies seront testées pour éliminer ces bactéries adhérentes et invasives aux propriétés inflammatoires : une stratégie combinant des bactéries probiotiques et des extraits de plante, une stratégie innovante à base de microcapsules portant des substances anti-bactériennes et enfin une stratégie visant certaines enzymes bactériennes de microbiote intestinal. Ce projet permettra de déterminer l’efficacité à l’echelle de l’organisme entier de chacune de ces stratégies visant les bactéries adhérentes et invasives, afin de retenir des candidats d’intérêt pour des essais cliniques chez les patients atteints de maladie de Crohn. Il est attendu que l’élimination ou la prévention de l’installation de ces bactéries au niveau intestinal permettent de diminuer ou de prévenir les symptômes inflammatoires chez les patients.
Bénéfices attendus
La recherche de nouvelles thérapies ciblant les causes de l’inflammation comme le microbiote intestinal et plus particulièrement les bactéries adhérentes et invasives aux propriétés inflammatoires est une priorité dans la maladie de Crohn. Les investigations chez l’animal permettront de compléter les analyses in vitro en modèle cellulaire et de mieux comprendre les mécanismes d’actions sous-jacents de chaque stratégie. C’est une étape cruciale qui permettra à terme, de proposer ces stratégies lors d’essais cliniques chez les patients. Le fait de proposer différents modèles animaux complémentaires pour analyser l’efficacité de ces 3 stratégies est très important pour maximiser les chances d’obtenir de bons résultats en clinique. En effet, nombre de stratégies probiotiques par exemple peinent à montrer des effets bénéfiques lorsqu’elles sont testées chez l’Homme. Ces options thérapeutiques personnalisées seraient proposées aux patients hébergeant des souches de bactéries adhérentes et invasives, dans le but de maintenir les phases de rémission et/ou d’améliorer l’efficacité des traitements actuels, contribuant ainsi à leur « bien-être ».
Procédures
-Dans le cadre de ce projet, les animaux recevront par voie orale des composés/probiotiques ou bactéries. L’administration intra-gastrique des solutions sera quotidienne sur animal vigile. Cet acte, réalisé par un personnel formé, n’est pas douloureux pour l’animal et les volumes n’excèderont pas 0,2mL, ce qui est un très faible volume. Quand 2 composés seront administrés le même jour, un temps de 1 heure minimum sera respecté (souvent 2 heures). Une administration gastrique est un geste rapide qui demande une dizaine de seconde par animal. Selon les procédures, il y aura entre 7 et 35 administrations intra-gastriques réalisés sur l'animal (2 gavages/jour au maximum). -Les animaux auront un unique prélèvement sanguin d’un volume de 100µL. Ce prélèvement sera réalisé sur animal endormi sous anesthésie gazeuse. L'endormissement sous isoflurance demande entre 1 et 2 minutes. Le prélèvement sanguin est un geste rapide qui dure quelques secondes. -Enfin, une procédure nécessite d’injecter aux animaux un mélange anesthésiant/antalgique. Les animaux sont mis à mort avant leur réveil, 2h plus tard.
Impact sur les animaux
Une légère inflammation intestinale est attendue chez les animaux (classe légère). Il sera possible de soulager les animaux qui montreraient des signes de douleur en leur administrant des composés analgésiques. Si l’état des animaux ne s’améliore pas suite à ce traitement, les animaux seront sortis de l’étude et mis à mort. Une procédure induira une réponse inflammatoire intestinale modérée chez l’animal (colite) suite à l’administration d’un composé chimique dans l’eau de boisson (afin de mimer des patients en crise inflammatoire). Les animaux seront suivis plusieurs fois par jour pendant cette étude et un analgésique sera administré contre la douleur. Les animaux resteront dans l’étude tant qu’ils n’atteindront pas les points limites afin de pouvoir conclure sur l’efficacité des traitements. Ceux qui atteindront les points limites seront sortis de l’étude et mis à mort.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisé lors de ces procédures sera mis à mort à la fin des expérimentations. Il est nécessaire de prélever un ensemble d’échantillons biologiques chez l’animal à l’issu de l’expérience pour compléter les données issues des observations cliniques (signes de colite), ou encore les données inflammatoires suite à des dosages dans les fèces des animaux. En effet, il faut évaluer les niveaux d’inflammation au niveau des tissus intestinaux, faire des analyses histologiques qui permettront de mettre en évidence les dommages des tissus et de mesurer l’épaisseur de la couche de mucus ou et enfin, analyser le microbiote associé à la muqueuse intestinale (séquençage ADN bactériens), donnée essentiel au projet pour comprendre l’effet complet des stratégies visant le microbiote.
Remplacement
Avant ces essais chez l’animal, les 3 grandes stratégies seront analysées in vitro, sur des modèles de cellules en culture (cellules épithéliales intestinales humaines et cellules immunitaires) afin de sélectionner les composés/probiotiques/extraits les plus efficaces pour lutter contre les bactéries adhérentes et invasives retrouvées chez les patients atteints de maladie de crohn. Cependant, il est nécessaire de valider l’efficacité des stratégies à l’échelle d’un organisme entier pour plusieurs raisons : -les traitements seront analysés après avoir « subit » un passage digestif (pH acide de l’estomac, sels biliaires…), -la présence du système immunitaire et du microbiote intestinal peuvent interférer dans l’efficacité de la stratégie, -les composés peuvent être absorbés par l’intestin, et ne plus être présent dans la lumière intestinale, pour agir sur les bactéries adhérentes et invasives -l’efficacité, voire l’innocuité des traitements peuvent varier selon le statut inflammatoire (septicémie, toxicité…)
Réduction
-Le nombre d'animaux a été réduit dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Le nombre de 10 animaux/lot devrait permettre de réaliser des tests statistiques adaptés d’après l’ensemble des données animales antérieures. -Il est à noter que les révisions d’articles scientifiques se durcissant, il est maintenant nécessaire de réaliser les expérimentations sur mâles et sur femelles, raison qui nous contrait à augmenter le nombre d’animaux. -Le fait de réaliser des expériences à lots multiples permet de limiter le nombre d’animaux en comparant le lot témoin/contrôle avec l’ensemble des lots « traités » en une seule fois. -Les études antérieures ont montré que le nombre de bactéries adhérentes et invasives dans les fèces des animaux était le reflet du nombre de bactéries associées à la muqueuse. La quantification des bactéries dans les fèces en fonction du temps permet de réduire le nombre d’études. Cette mesure permet de réaliser un suivi de colonisation en fonction du temps de façon non-invasive et sans douleur pour l’animal. Dans le cas contraire, il aurait fallu euthanasier les animaux à différents temps post-infection pour comptabiliser les bactéries associées à la muqueuse intestinale.
Raffinement
-Les animaux seront hébergés selon les standards prévus par la règlementation, en groupes sociaux, dans un environnement adapté et enrichi. -Une période d’acclimatation sera réalisée avant le début des procédures (une semaine). -Un enrichissement est proposé aux souris: lamelles de cartons compressées et maisonnettes ou tremplins avec abris. -Les animaux seront surveillés quotidiennement pour évaluer tout changement de comportement et/ou de motricité et perte de poids. -Lorsque des symptômes de colite seront attendus, les surveillances seront renforcées (2-3 fois par jour) afin de pouvoir administrer immédiatement un analgésique dans un premier temps et de suivre l’évolution de l’état de l’animal. En cas d’évolution négative de l’état général (déterminée d’après une grille de score), si les points limites sont atteints, les animaux seront sortis de l’étude immédiatement et mis à mort selon la réglementation en cours. A noter que les animaux sont préalablement anesthésiés à l’isoflurane avant la mise à mort.
Choix des espèces
-Le modèle choisi est la souris. L’unité de recherche possède deux modèles de souris transgéniques exprimant un récepteur humain aux bactéries adhérentes et invasives mimant l’interaction bactéries/épithélium intestinal observée chez les patients atteints de maladie de Crohn. Concernant le modèle de colite induite par un produit chimique placé dans l’eau de boisson, l’espèce animal couramment employé pour la réalisation de ce test est la souris. Il en est de même pour le modèle d’interaction bactéries/ épithélium intestinal (« anse iléale »). -L’ensemble des souris utilisées lors de ce projet seront utilisées au stade de jeune adulte, (6-8 semaines) reflétant le pic d’incidence de la maladie de Crohn (15-30 ans). Cela correspond également à l’âge auquel les expérimentations antérieures menées au laboratoire et publiées ont été réalisées.
Etude de la diffusion tissulaire de nouveaux antibiotiques de la famille des béta-lactamines-Inhibiteurs de béta-lactamases dans le rein et le muscle de porc par microdialyse
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
14 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués sans réveil. Chaque animal subit une anesthésie d'environ douze heures et une chirurgie de deux heures pour poser des sondes de microdialyse dans les reins, un muscle et une veine, suivie de huit prélèvements de sang, avant d'être mis à mort pour prélever les reins. Le porteur étudie la diffusion de deux antibiotiques dans les tissus et affirme que les modèles in vitro disponibles sont "très imparfaits", d'où la "nécessité" de recourir à l'animal. Il choisit le cochon pour sa proximité anatomique avec l'humain.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier la distribution tissulaire rénale de deux béta-lactamines-inhibiteurs de bétalactamases chez le porc par microdialyse en mesurant les concentrations libres rénales et musculaires obtenues par microdialyse, le tissu musculaire ayant été choisi comme tissu contrôle ne présentant pas de barrière physiologique. Ces concentrations tissulaires seront ensuite comparées aux concentrations totales et libres plasmatiques. L'exposition de l'antibiotique dans ces différents fluides et tissus sera caractérisée par le calcul de la surface sous la courbe. Ce projet vise donc à caractériser le comportement pharmacocinétique (PK) de ces molécules au site infectieux potentiel. La diffusion tissulaire des antibiotiques chez l’humain étant difficile à appréhender, la déterminer chez l’animal est un point important pour une meilleure compréhension du comportement des antibiotiques. Cette étude PK chez le porc est une étude incluse dans un projet plus conséquent, visant à étudier la diffusion tissulaire de ces antibiotiques dans plusieurs espèces animales (rat et porc) afin de simuler par modélisation pharmacocinétique physiologique (PB/PK) les concentrations tissulaires et notamment rénales obtenues chez l’humain lorsque ces antibiotiques sont administrés à des schémas posologiques usuels. Ce projet permettra d’apporter des informations nouvelles sur la PK tissulaire de ces antibiotiques au site d’infection et donc à terme d’optimiser leur utilisation dans le traitement des maladies rénales infectieuses sévères.
Bénéfices attendus
Les concentrations des antibiotiques au site infectieux chez l’humain n’étant pas accessibles, ce projet va permettre d’étudier le comportement pharmacocinétique au site d’infection rénal de deux antibiotiques de dernier recours utilisés dans le traitement des infections urinaires compliquées et résistantes. Cette étude PK chez le porc, associée à une étude identique de la diffusion tissulaire de ces deux antibiotiques chez le rat, actuellement en cours de réalisation au laboratoire, va permettre par des approches de modélisation PB/PK de simuler les concentrations humaines au site infectieux lorsque ces antibiotiques sont administrés à des schémas posologiques usuels. Ce projet permettra une meilleure compréhension de la PK au site d’infection de ces antibiotiques et donc à terme une optimisation de la prise en charge des patients.
Procédures
-Anesthésie générale et chirurgie de mise en place de sondes de microdialyse au niveau chaque rein, d'une veine abdominale et d'un muscle et pose d'un cathéter central à la veine jugulaire : tous les animaux du projet, 1 chirurgie par animal, sur animaux anesthésiés et sous traitement analgésique, durée de la chirurgie : environ 2h, durée de l'anesthésie : environ 12h. -Prélèvements de sang : Huit prélèvements sanguins de 1 mL seront réalisés à 0.5h, 1h, 1.5h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h post administration des ATB (2 min)
Impact sur les animaux
Lors des anesthésies de longue durée, les animaux peuvent avoir une hypotermie. Ils seront installés sur une table avec tapis chauffant. Une couverture chauffante pourra être mise sur eux, et la salle de chirurgie est également bien chauffée. Leur température est suivie tout au long de la procédure afin de réagir au plus vite. Une hyperthermie maligne en lien avec l'anesthésie générale à l'isoflurane peut exceptionnellement être observée. Parmi les complications précoces, citons un risque d'hématome, d'hémorragie lors de la pose du cathéter central veineux dans la jugulaire. Des réactions d’hypersensibilité peuvent être observées lors de l’administration de certains antibiotiques, ces réactions sont souvent ponctuelles et conduisent le plus souvent à l’apparition d’éruption cutanée.
Devenir
Les animaux à la fin de la procédure seront tous euthanasiés. Les reins seront prélevés à l’issue de la mise mort.
Remplacement
La diffusion tissulaire des antibiotiques chez l’humain est difficile à étudier, la déterminer chez l’animal est un point important pour une meilleure compréhension du comportement PK de ces antibiotiques. A l’heure actuelle, les modèles in vitro à notre disposition sont très imparfaits et ne permettent pas de mimer les concentrations tissulaires observées chez un être vivant, à la suite d’une administration de substance médicamenteuse, d’où la nécessité d’avoir recours aux animaux. De plus, ces données seront les premières décrivant la distribution de ces nouveaux antibiotiques dans le tissu rénal permettant une meilleure compréhension de leur PK au site d’infection, ce qui à terme permettra d’envisager d’optimiser leur utilisation dans le traitement des maladies rénales infectieuses sevères et résistantes.
Réduction
La microdialyse est considérée comme la technique de référence en pharmacocinétique pour l’étude de la distribution tissulaire des médicaments. C’est une technique très puissante puisqu’elle permet de réaliser des prélèvements en continu dans différents fluides ou tissus chez un même animal permettant d’obtenir des données PK riches et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés et donc la variabilité interindividuelle. De plus, la méthode correspondant à une perfusion continue d’une sonde à un débit très faible (1 µL/min en moyenne) par un liquide physiologique permet de réaliser un nombre important de prélèvements sans aucune déperdition de fluides chez les animaux. Des études de microdialyse menées sur une autre espèce, notamment le rat, montre une très faible variabilité des résultats de part le nombre de dialysats générés dans une étude. La fiabilité de cette technique nous permet d’utiliser un nombre limité d’animaux concernant ce projet. : 6 porcs par antibiotique seront suffisants Des manipulations préliminaires vont être nécessaires pour l'étude de microdialyse afin d’ajuster entre autres les débits de perfusion de sonde pour les rendements et les intervalles de collecte. Pour cela, 2 porcs supplémentaires seront nécessaires, et seront à ajouter au total des 12 porcs utilisés, ce qui nous fait un total de 14 porcs pour ce projet. sur le plan des statistiques, afin de pouvoir estimer l'aire sous la courbe (AUC) moyenne pour chaque antibiotique avec une précision de 15%, il nous faudrait 6 porcs par antibiotique.
Raffinement
Les porcs subiront une procédure sans réveil. Ils arriveront directement de leur site d’élevage au site d'expérimentation (les 2 bâtiments sont distants de moins de 5 km). Pour la procédure, les animaux seront sous anesthésie générale avec ventilation mécanique assistée et monitoring des paramètres physiologiques (température, saturation en oxygène, fréquence cardiaque…). Un traitement analgésique sera administré avant même le début de la chirurgie. Les animaux seront manipulés dans le calme et anesthésiés à leur arrivée.
Choix des espèces
Ce projet s’inscrit dans un projet plus vaste dont l’objectif est de simuler les concentrations rénales humaines obtenues chez des patients après administration de doses usuelles par des approches d’extrapolation inter-espèces utilisant la modélisation PK physiologique (PB/PK : le porc étant l’espèce présentant le plus de similitudes anatomiques avec l’humain, son utilisation apparait justifiée. Les porcs sont de race Large White. Les animaux seront âgés de 2 mois environ. A ce stade, les animaux pèsent 20 à 25 kg, ce qui facilite la manipulation et la chirurgie. La taille du rein est proche à ce stade de celui de l’humain.
Description d’un protocole de perfusion-fixation trans-cardiaque chez les poissons téléostéens pour l’étude de cellules souches du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
432 poissons de plusieurs espèces vont être utilisés, mis à mort sous anesthésie profonde par la perfusion d'un fixateur chimique dans le cœur. La procédure est finale et ne vise pas à produire des connaissances biologiques nouvelles mais à mettre au point et publier un protocole de fixation adapté aux petits poissons. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale ne permet d'étudier un tissu par immuno-histologie ou microscopie électronique, et que la qualité de fixation obtenue réduira à terme le nombre d'individus utilisés. Les espèces concernées sont des poissons zèbres, médakas, astyanax et cichlidés, étudiés à trois stades de développement.
Objectifs
La qualité de la fixation est cruciale pour le succès des protocoles histologiques. L’efficacité de la fixation par immersion dans le fixateur est limitée par la taille de l’échantillon considéré ; de par la lente diffusion de la molécule fixative au centre du tissu. De plus, la fixation-perfusion cardiaque permet une perfusion immédiate du fixateur à travers la circulation sanguine. Actuellement, dans les études chez les tétrapodes, la fixation-perfusion cardiaque est la technique standard dans les études histologiques. Enfin, l’avantage de la perfusion cardiaque est impérative lorsque l’homogénéité de fixation est cruciale comme pour les études d’épitopes labiles en immunohistologie ou dans les expériences de microscopie électronique. Alors qu’il existe de nombreuses publications décrivant la perfusion cardiaque pour les tétrapodes, aucune n’est adaptée aux poissons. Ce protocole permet de réaliser la dissection et la perfusion-fixation cardiaque chez les poissons téléostéens, les poissons zèbres, les médakas et les cichlidés.
Bénéfices attendus
Tout d’abord ce projet concerne l’étude des régions des cellules souches du toit optique chez les téléostéens. D’autre part, la présente demande d’autorisation de projet permettra de publier un protocole de perfusion-fixation adapté au petits poissons téléostéens qui manque actuellement à la communauté scientifique. De plus, la très bonne fixation que permet la perfusion permettra de réduire grandement le nombre d’individus utilisé pour les expériences d’immuno-histologie et de microscopie électronique. En effet comme tous les tissus sont parfaitement fixés en plus du cerveau, ceux-ci peuvent être tous étudiés dans d’excellentes conditions éventuellement par différentes équipes et pour différents projets.
Procédures
Les poissons ne seront soumis qu’à l’unique procédure décrite dans cette demande d’autorisation de projet. Cette procédure est finale et comporte la mise à mort sous anesthésie profonde par la perfusion-fixation intra-cardiaque de fixateur liquide (formaldehyde et/ou glutaraldéhyde). La procédure doit être réalisée en 3 à 5 minutes comptées après que le poisson est sorti du mélange anesthésique.
Impact sur les animaux
Les nuisances concernant un lot de poissons avant la mise à mort par perfusion-fixation peuvent être dues à : 1- Leur déplacement de l’animalerie vers le laboratoire de perfusion ; 2- Les poissons étant perfusés un par un, la pêche au filet du poisson dans son aquarium pour le mettre dans l’aquarium d’anesthésie peu stresser le poisson concerné et brièvement ses congénères, cet opération est réalisée environ en une minute ; 3- Le pincement la queue du poisson pour tester du niveau de profondeur de l’anesthésie, puis lorsque on teste une seconde fois l’anesthésie en positionnant les aiguilles de contention. Passé ce dernier stade et après la dissection du cœur, le poisson est mis à mort par la procédure de perfusion-fixation.
Devenir
L’ensemble des poissons de ce projet seront soumis à une anesthésie profonde suivie par la perfusion-fixation intra-cardiaque de fixateur liquide (formaldehyde et/ou glutaraldéhyde. Cette procédure est finale.
Remplacement
Il n’y a aucune alternative non animale pour étudier un tissu biologique par immuno-histologie ou par microscopie électronique. Notre étude nécessite un échantillonnage d'espèces proches phylogénétiquement et dans le cadre de notre projet d’étude comparée, ces espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées.
Réduction
Pour ce projet, le nombre de poisson prévu a été calculé dans le but le réduire au minimum. Ce type d’étude histologique et de microscopie électronique ne nécessite pas en elle-même un nombre statistique d’individus étudiés. De plus, l’établissement du protocole de perfusion-fixation aboutira à une réduction du nombre d’individus utilisé de fait de la qualité de la fixation obtenue dans la communauté des chercheurs travaillant sur les petits téléostéens.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être des poissons sera assuré par les zootechniciens compétents de l’institut. Pour les poissons élevés à l’institut (zébrafish, médakas, astyanax), les individus resteront dans l’animalerie jusqu’à ce que l’ensemble des équipements nécessaires soient en place. Comme indiqué ci-dessus, les individus prévus pour une journée de perfusion, seront amenés dans une zone de stabulation proche mais suffisamment éloigné de la zone de perfusion pour que les bruits ne génèrent pas de stress. Puis les poissons seront prélevés un par un puis déplacé près de la zone de perfusion et anesthésiés loin de la zone de stabulation. Pour les cichlidés qui ne sont pas encore élevés au laboratoire mais qui sont achetés en animalerie, les jours de perfusion seront adaptés à leurs livraisons, c’est-à-dire qu’ils seront perfusés le jour de leur arrivée au laboratoire afin que leur stress du voyage ne se poursuive pas inutilement.
Choix des espèces
D’une part, les espèces zébrafish, médakas et astyanax sont reconnus par un grand nombre de publications comme des poissons modèles pour les analyses neuro-anatomiques étudiant les structures cérébrales de téléostéens à petits cerveaux. D’autre part, des espèces moins connues de cichlidés présentent des comportements complexes (émotions, motivation, apprentissage) et présentent de plus grand cerveaux (Amatitlania nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra). Notre projet vise à réaliser une étude comparative phylogénétique entre toutes ces espèces du point de vue neuro-anatomique, immuno-histologique et comportemental. L’avantage du choix de ces espèces est que certaines sont relativement proche phylogénétiquement mais qu’elles présentent a la fois des différences importantes entre leurs structures cérébrales. Pour ces études nous aurons donc besoin de procéder à ces comparaisons à la fois comportementales, anatomiques et immuno-histologiques. Pour toutes ces espèces nous avons donc besoin de valider le protocole de perfusion-fixation trans-cardiaque. Pour les espèces de zébrafish, médakas et d’astyanax nous étudions trois stades de développement (3 semaines, 1 mois et 3 mois) car nous cherchons à connaître le rôle des niches de cellules souches dans le développement du toit optique une structure du cerveau des téléostéens. Les cichlidés nous intéressent pour leurs capacités comportementales de haut niveau et seul le stade adulte nous intéresse pour cette étude.
Neurostimulation des voies dopaminergiques in vivo par des ultrasons de basse énergie chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, dans une chirurgie du crâne de trois à quatre heures. Elles reçoivent une stimulation cérébrale par ultrasons de basse énergie pendant qu'une microélectrode mesure la libération de dopamine, pour vérifier si ces ultrasons excitent bien les neurones in vivo. Le porteur affirme que la technique a déjà été testée in vitro et sur des explants, et que l'étape chez l'animal est "nécessaire" avant tout passage chez l'homme. Les retombées annoncées pour la maladie de Parkinson restent renvoyées au conditionnel et au long terme.
Objectifs
La neurostimulation par ultrasons de basse énergie (low-energy ultrasound ou LEUS) est une méthode prometteuse pour stimuler des régions cérébrales de façon non-invasive et avec grande sélectivité spatiale limitée à quelques mm3 de tissu nerveux. La neurostimulation par les LEUS a déjà été testée chez l’animal, et a été capable d’évoquer des mouvements des membres, des vibrisses chez le rongeur, voire des yeux. Cependant, les effets cellulaires des LEUS et les mécanismes biologiques de cette stimulation demeurent largement inconnus. Un verrou important consiste à comprendre comment les LEUS affectent la neurotransmission, le mécanisme fondamental par lesquels les neurones libèrent des neurotransmetteurs et transmettent des signaux chimiques à leurs voisins. In vitro, les LEUS sont capables d’induire des libérations de calcium intracellulaire et d’évoquer une libération de dopamine par des neurones en culture. Cependant, la pertinence de ces effets in vivo au sein d’un cerveau intact reste inconnue. Ce projet se focalisera sur les neurones dopaminergiques de la souris. La libération de dopamine peut être monitorée en routine par la technique de voltamétrie cyclique rapide à l’aide de microélectrodes en fibre de carbone. L’objectif de ce projet est de tester in vivo l’hypothèse selon laquelle la stimulation par LEUS des voies dopaminergiques induit une libération de dopamine dans le cerveau, démontrant ainsi que les LEUS ont bien la capacité d’exciter les neurones in vivo et de stimuler la libération de neurotransmetteur.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ce projet permettra d'évaluer le potentiel des LEUS pour stimuler le cerveau de façon non invasive et localisée. Il s’agira de la première évaluation de ce type in vivo et cette approche apportera des informations cruciales sur les mécanismes biologiques mis en jeu par la stimulation par LEUS dans le cerveau. Il existe déjà des pathologies neurologiques humaines dont les traitements utilisent la neurostimulation. Par exemple, les patients atteints de maladie de Parkinson et ne répondant plus aux traitements pharmacologiques peuvent recevoir une électrode de stimulation pour compenser la perte de dopamine dans leur cerveau. D’autre pathologies humaines pourraient bénéficier d’une approche thérapeutique par neurostimulation mais les développements de ces thérapies sont limités par les risques liés à l’implantation d’électrodes invasives dans le cerveau. La technique de neurostimulation par LEUS pourrait offrir une alternative prometteuse pour remplacer les méthodes de neurostimulation invasive dans la maladie de Parkinson et peut-être ouvrir la voie vers de nouvelles thérapies à base de neurostimulation chez l'homme.
Procédures
Procédures chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie sans réveil d'une durée de 3-4 h.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures expérimentales seront effectuées sur l’animal anesthésié sans réveil. Les protocoles de stimulation cérébrale par LEUS ne causent aucune douleur, ni perte de poids, ni stress puisque les stimulations, préalablement testées sur des cultures cellulaires et in vivo, seront calibrées et de courte durée. L’anesthésique utilisé permettra de couvrir la durée nécessaire aux expériences à réaliser. Les effets indésirables sur l’animal se limitent donc à des problèmes d’anesthésie pouvant provoquer un réveil de l’animal lors de son positionnement dans l’appareil stéréotaxique ou en cours d’enregistrement, ce qui reste rare.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux en fin de chirurgie car le réveil de l'animal après une chirurgie du crâne entrainerait des souffrances inutiles.
Remplacement
La technique de neurostimulation par LEUS a déjà été testée in vitro sur des neurones en cultures ainsi que sur des explants de cerveau. L'étape in vivo chez l'animal est maintenant nécessaire avant de passer chez l'homme afin de vérifier l'efficacité de la stimulation et son innocuité.
Réduction
Les effectifs des groupes ont été réduits au maximum afin de permettre une mise au point sérieuse des procédures : 10 souris pour la mise au point de la détection de dopamine, 10 souris pour la mise au point des paramètres d'angulation des électrodes, 20 souris pour l'optimisation des paramètres de la stimulation LEUS. Nous pourrons procéder à des comparaisons statistiques de différents paramètres de stimulation par LEUS à l'aide d'un test de Student ou d'une ANOVA à partir d'un effectif de 6 animaux par groupe. Par exemple, la comparaison entre les paramètres LEUS optimaux et la stimulation électrique de référence pourra être menée à bien avec ces effectifs.
Raffinement
Concernant la douleur, un traitement analgésique est prévu avant la chirurgie avec une injection sous-cutanée de buprenorphine (0.02 mg/kg) et une administration locale de lurocaïne sur le scalp, pratiquées avant l’incision de la peau. La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale par l'isoflurane et en appliquant les points limites définis par (1) une défaillance du système d'anesthésie pouvant conduite au réveil de l'animal et (2) l'apparition d'une hemorragie incontrôlée au niveau du scalp. Concernant l'angoisse infligée à l'animal, elle est réduite par un hébergement par groupes de deux à six dès l’arrivée au laboratoire et par l’insertion d’un enrichissement dans les cages d’hébergement (roue d’exercice, matériau de nidification).
Choix des espèces
La souris est une espèce qui a été largement caractérisée pour la libération de dopamine dans le noyau Accumbens évoquée par une stimulation électrique de faisceau médian du télencéphale. Les procédures permettant de réaliser cette mesure ont été décrite dans la littérature et serviront de base à notre approche expérimentale. Souris adultes pour bénéficier d'une taille maximale.