Procédures sans réveil
Epac1 : une nouvelle cible thérapeutique testée dans un modèle murin d’AVC ischémique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 48 sous anesthésie sans reprise de conscience et 78 dans des procédures de niveau modéré. Elles subissent une chirurgie du cou pour occlure une artère cérébrale et provoquer un accident vasculaire, suivie d'une imagerie IRM, puis sont gardées vivantes 24 heures avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur indique que l'AVC provoque perte de poids et déficits sensorimoteurs, et que moins de 10 % des souris opérées meurent d'œdème ou d'hémorragie. Il décrit le recours au rongeur comme conditionnant la validité de l'évaluation et le transfert en clinique.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral ischémique (AVCi) est une maladie fréquente et invalidante. Comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la formation des lésions cérébrales suite à un AVCi est devenu une priorité pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en neuroprotection. L’objectif global du projet est d’évaluer l’impact de la protéine Epac-1 sur les dommages cérébraux dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral (AVC) transitoire appelée aussi ischémie-reperfusion cérébrale. L’implication d’Epac1 a été démontrée dans le cœur, le rein et la rétine suite à une ischémie-reperfusion. A notre connaissance, le rôle d’Epac1 dans la pathogenèse de l’AVC n’a pas été étudié à ce jour. Cependant, des études préliminaires in vitro et ex vivo sur cette nouvelle cible thérapeutique suggèrent un effet délétère d’Epac-1 sur l’unité neurovasculaire en condition d’ischémie-reperfusion cérébrale. Afin de confirmer ces résultats et d’aller plus loin dans l’exploration des effets in vivo de Epac-1 dans l’AVCi, nous proposons d’évaluer les conséquences d’une modulation d’Epac-1 soit à l’aide d’un agoniste (qui favorise l’expression de la cible thérapeutique), soit à l’aide d’un inhibiteur (qui supprime l’expression de la cible thérapeutique), par imagerie par résonance magnétique (IRM) multiparamétrique. Notre hypothèse est que l’inhibition d’Epac-1 devrait diminuer la taille des lésions, et protéger la barrière hématoencéphalique.
Bénéfices attendus
Si l’effet neuroprotecteur de la modulation d’Epac-1 est prouvé, cela validera Epac-1 comme une nouvelle cible thérapeutique. Il sera possible de proposer un nouveau traitement de l’AVCi, avec l’espoir à terme de limiter les séquelles neurologiques pour les patients victimes d’un AVC.
Procédures
L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM) est effectuée via un abord chirurgical au niveau du cou, pour accéder à la carotide commune, dans laquelle est inséré le filament occlusif qui est remonté dans l’artère carotide interne jusqu’à atteindre la bifurcation avec l’ACM. Cette seconde chirurgie, ainsi que l’imagerie réalisée pendant l’occlusion, puis la reperfusion par rétraction du filament, nécessite une anesthésie générale de 2h30 au maximum.
Impact sur les animaux
Suite à l'accident vasculaire cérébral, les animaux perdent du poids et présentent des déficits neurofonctionnels sensorimoteurs (par exemple hémiparésie et diminution de la sensibilité des vibrisses). La douleur concerne principalement la cicatrice due à l’abord chirurgicale (le cou) car les dommages au niveau du parenchyme cérébral n’engendrent pas de douleur (raison pour laquelle les patients présentant un AVC tardent à se rendre aux urgences). Les animaux sont gardés en vie 24 heures puis ils sont mis à mort à l’issue de l’examen IRM terminal. La principale complication du modèle est le décès par œdème malin ou hémorragie sous-arachnoïdienne (
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement du cerveau pour les analyses complémentaires postmortem (étude des mitochondries).
Remplacement
Notre étude in vivo vient compléter des études déjà réalisées in vitro et ex vivo qui ont montré la pertinence de nos hypothèses. L’utilisation du modèle animal adéquat (permettant une ischémie et une reperfusion) conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique (modèle de thrombectomie). L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures. Le projet utilisera des rongeurs, plutôt que des animaux de plus grande taille (chats, primate) grâce à l’utilisation d’un appareil d’imagerie à haut champ (7 Tesla) dedié aux petits animaux.
Réduction
Le nombre minimal et suffisant d'animaux a été estimé par une étude statistique en prenant en compte la variabilité attendue du modèle et les critères d'exclusion (absence d'infarct cérébral, hémorragie sous-arachnoïdienne). L’utilisation de l’IRM longitudinale permet de réduire le nombre d’animaux car chaque animal est son propre contrôle (on peut rapporter la taille de lésion à 24h par la taille de l’atteinte initiale en perfusion ou en diffusion en perocclusion chez chaque individu). Enfin, lors des prélèvements finaux, d'autres tissus pourront être prélevés et conservés en concertation avec nos collaborateurs au moment de la mise en place du projet afin de limiter, optimiser et valoriser au mieux les prélèvements et le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.
Raffinement
L’imagerie réalisée pendant l'accident vasculaire cérébral permet de sélectionner des animaux avec une occlusion artérielle correcte, et une lésion cérébrale significative. La variabilité du modèle est ainsi limitée. L’IRM per-occlusion est également efficace pour détecter les animaux présentant un hémorragie sous-arachnoïdienne précoce (
Choix des espèces
Les souris utilisées pour cette étude seront des souris SWISS car il existe une littérature importante rapportant l’utilisation de cette souche pour la recherche translationnelle sur les AVCi. En particulier, cette souche de souris a peu d'artères collatérales dans le cerveau ce qui permet d'avoir une lésion ischémique plus reproductible d'un animal à un autre. D'autre part, leur pigmentation de peau blanche rend plus facile la pose du cathéter caudal pour les examens IRM nécessitant l’administration d’un agent de contraste (imagerie de perfusion et de perméabilité). Les animaux auront entre 6 et 8 semaines (adultes) : la maturité cérébrale est atteinte et le poids suffisant pour la mise en place d’un cathéter veineux caudal pour l’injection des agents de contraste.
Effet d’un inhibiteur double des enkephalinases sur la depression corticale envahissante chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Ils subissent une ouverture du crâne et l'application d'un sel sur les méninges pour déclencher des ondes cérébrales associées à la migraine, avec enregistrement de l'activité électrique. Le porteur indique qu'aucun réveil n'est possible du fait de l'ouverture du crâne et des risques irréversibles. Il teste un inhibiteur d'enzymes comme piste contre la migraine, les retombées thérapeutiques restant renvoyées à des travaux futurs.
Objectifs
L'objectif est d'evaluer la faculté d'un inhibiteur de certaines enzymes ( en favorisant l'action des opioïdes endogènes) à diminuer les ondes d'inhibition électrique corticale déclenchées par application meningée de chlorure de potassium. Ces ondes d'inhibition corticale sont caractéristiques des évenements survenant lors dudéclenchement des crises de migraine et constitue dans la littérature un modèle de migraine reconnu. Le produit étudié ici a montré dans une étude récente son efficacité dans un autre modele de migraine chez le rat vigile mesurant l'hypersensibilité cutanée à la douleur induite par injection systémique d'un donneur de monoxyde d'azote.
Bénéfices attendus
Par ce projet nous escomptons apporter de nouvelles données significatives sur le potentiel antimigraineux de cet inhibiteur d'enzymes pouvant ( avec les travaux antérieurs et futurs) à terme deboucher sur un traitement efficace de cette pathologie
Procédures
Une procedure chirurgicale sous anesthésie ( isoflurane) sans reveil est appliquée par animal.
Impact sur les animaux
Aucun effet indesirable n'est envisagé sachant que les animaux seront sous anesthésie générale avec un monitoring des parametres physiologiques (tout au long de la chirurgie préparatrice et de l'enregistrement électrophysiologique) et mis à mort avant reveil.
Devenir
impossibilité de récuperer les animaux du fait de la craniotomie effectuée et des risques irreversibles (infectieux traumatiques) en cas de reveil.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Il n'existe pas dans la littérature aucune methode alternative (in vitro ou in silico) pouvant répondre à l'efficacité d'un produit à potentiel thérapeutique antimigraineux. Un animal entier avec un système nerveux intégre , même sous anesthésie, est un préalable à une etude pertinente dans le domaine de la douleur. Une methode in vitro ne pourrait rendre compte de la douleur car elle supprimerait de nombreux parametres (regulations...) et rendrait le résultat réducteur voir inadapté. Les études in silico constituent dans le domaine de la migraine encore une étape encore trop primaire aujourd'hui.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Dans ce but, les animaux (rats adultes de la souche Sprague-Dawley) sont placés dans des cages enrichies (rouleaux permettant de se cacher) ce qui permet de réduire le stress des animaux tout le temps précédant la chiurugie et l'enregistrement électrophysiologique. Pendant six jours, ils serontacclimatés à l’animalerie. Les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. La chirurgie est effectuée sous anesthésie générale, les animaux sont placés sur une couverture chauffante pendant tout le temps de la chirurgie et leur cornée est protégée par une couche de vaseline. Statistiques : le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. D’après les données du laboratoire nous observons un maximum de 20 % de rats qui doivent être écartés de l'étude.
Raffinement
La douleur de la chirurgie est contrôlée car elle s'effectue sous anesthésie générale avec un contrôle permanent (capteurs et alarmes dédiés) des paramètres physiologiques (ventilation , taux de O2 , CO2 , température, fréquence cardiaque et pression artérielle) Pendant l'enregsitrement électrophysiologique, la cornée est protégée par de la vaseline. Pour améliorer le bien-être des animaux avant la chirurgie, les cages (logées dans des salles de stabulation pour lesquelles la température 22°C +/- 2 et l'hygrométrie 55% +/- 5 sont monitorées) sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher. Ils beneficient de l'enrichissement social reglementaire en respectant la taille des cages et la surface disponible par animal prevues par la directive européenne 2010 ( 3 animaux par cage de 800 cm2).
Choix des espèces
La souche Sprague Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires . C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur.
Enseignement pratique de la physiologie sur le rat
- Enseignement supérieur
540 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, dans des procédures classées sans réveil. Chaque animal subit une chirurgie de trois heures avec pose de cathéters sur trois voies, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des étudiants de licence et de master. Le porteur décrit des incidents possibles quand un étudiant sectionne une artère ou provoque une détresse respiratoire, suivis de la mise à mort. Il justifie ces séances par la formation pratique des étudiants, alors qu'une part de son offre repose déjà sur des méthodes substitutives.
Objectifs
Les procédures expérimentales proposées sur le modèle rat permettent aux étudiants d'explorer in vivo les régulations de plusieurs grandes fonctions physiologiques dispensées lors d'enseignements théoriques, en complément des enseignements qui utilisent des méthodes substitutives et alternatives.
Bénéfices attendus
La formation des étudiants (de Licence 3 à Master 2) en Physiologie, science étudiant les mécanismes intégratifs de l’organisme, nécessite que ceux-ci acquièrent un minimum d’expérience dans le domaine de la manipulation des animaux vivants et la réalisation de manipulations courantes qu’ils seront amenés à reproduire ultérieurement dans leur carrière. C’est au cours de cette première expérience qu’ils vont pouvoir faire un choix murement réfléchi pour leur avenir. Cette mise en pratique leur permet d'acquérir des compétences comme la gestion de l’anesthésie-antalgie, le suivi du bien-être des animaux, les techniques de cathétérisations (mise en place d’une canule dans un canal ou un vaisseau sanguin) et de prélèvements de tissus in vivo avec l’aide du personnel formé, mais aussi de bien appréhender la réglementation et l’éthique indispensables pour leur future carrière.
Procédures
Quatre procédures expérimentales de gravité « sans réveil » indépendantes les unes des autres sont proposées dans l’enseignement. Dans chacune des procédures, les rats sont soumis à une intervention chirurgicale de 3 heures (cathétérisation de 3 voies d'accès sur un même animal) sous anesthésie générale avec antalgie préalable au moins trente minutes avant de réaliser l’anesthésie. Pendant l'anesthésie-antalgie, par l’intermédiaire des cathéters mis en place, les fluides sanguins peuvent être prélevés en plusieurs fois à temps régulier (cela peut aller jusqu’à 10 prélèvements de 40 µL sans jamais dépasser un volume total supérieur à 10% du poids corporel) ou la sécrétion pancréatique est prélevée en continu. A l'issue de la procédure, les animaux sont mis à mort réglementairement.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1- La contention de l’animal au moment de l’antalgie puis de l’anesthésie, durée 1 minute d’intensité faible. 2- Réaction de l’animal au moment de la dissipation de l’effet anesthésique, intensité faible à moyenne (quelques minutes) 3- Hémorragie massive si l'étudiant sectionne l'artère carotide durant l'opération. Intensité moyenne à forte le temps de la mise à mort par surdosage d’anesthésique injecté par voie veineuse (quelques secondes). 4- Détresse respiratoire sévère malgré la trachéotomie. Intensité moyenne à forte le temps de la mise à mort par surdosage d’anesthésique injecté par voie veineuse (quelques secondes)
Devenir
les animaux entrent dans des procédures sans réveil et par conséquent, ils ne seront jamais réveillées à l'issue de l'expérimentation.
Remplacement
Sur notre offre de formation complète en TP de Physiologie animale (licence à master), 17 séances de TP différentes sont proposées. 24% des séances utilisent des méthodes substitutives, 42% sont réalisées ex-vivo (mise à mort pour prélèvement d’organes) et 24% concernent des procédures expérimentales, ne pouvant pas être remplacées car elles permettent d’étudier des mécanismes intégratifs qui n’ont pas leur équivalent en méthodes alternatives aujourd’hui.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux (total prévu 540 rats pour 5 ans) porte sur deux points : 1 – les étudiants travaillent sur un même animal en binômes/trinômes. 2 - Le nombre d’animaux est calculé au minima pour chaque séance de Travaux Pratiques (TP). Une séance de TP = 8 binômes (=8 rats) mais nous prévoyons un rat supplémentaire soit 9 rats par séance au maximum. Par rapport à notre projet précédent, nous n’avons pas eu de diminution des effectifs étudiants en Biologie, et par conséquent du nombre de groupe en licence. Nous avons modifié notre offre de formation en supprimant les TP de physiologie dans une des filières, en donnant la possibilité de choix d’option entre la physiologie animale et végétale, en réduisant le nombre de procédures proposées et en déplaçant les procédures expérimentales au semestre paire dans une unité d’enseignement (UE) optionnelle. Les étudiants concernés par ces TP ont choisi de les réaliser avec un objectif professionnel clairement affiché vers la physiologie. Nous allons ainsi diminuer le nombre d’animaux que nous aurions dû envisager avec l’ancienne maquette.
Raffinement
Le raffinement est mis en place dans la pratique de l’antalgie et de l’anesthésie, nos procédures expérimentales étant sans réveil. Les étudiants ont préalablement été sensibilisés au suivi de l’anesthésie. Ils sont donc responsabilisés à la surveillance rapprochée toutes les 5 minutes et au bien-être de l’animal. Chaque rat est analgésié une heure avant la séance de TP par un personnel compétent. Puis il est anesthésié-analgésié dans une pièce prévue à cet effet, isolé des animaux « en attente » par un personnel formé. Au cours de la procédure, les étudiants appellent l’enseignant dès qu’un signe de réveil apparait et c’est toujours le personnel compétent qui fait les réinjections. La température corporelle du rat est maintenue grâce à l’utilisation de tapis chauffants.
Choix des espèces
Ce modèle se rapproche fortement de la physiologie humaine. Il est possible de réaliser une anesthésie adéquate et de pratiquer des cathétérisations, de réaliser des prélèvements de fluides (sang, bile…), ce qui est plus difficile à réaliser sur la souris en travaux pratiques, étant donné la petite taille de l’animal. Rats adultes, à partir de 225g soit un âge de 8 semaines.La souche de rat peut-être du wistar ou Sprague-Dawley L’utilisation d’animaux adultes rend plus facile la mise en place des canules par les étudiants et permet de réaliser des prélèvements sanguins suffisants pour obtenir des données exploitables d’un point de vue quantitatif.
Evaluation du mélange Glubran®2/visipaque 320 sur modèle porcin lors d’embolisations artérielles rénales
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles cardiaques
6 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Ils subissent une obstruction des artères des reins sous imagerie, puis leurs reins sont prélevés pour analyse. Le porteur teste le remplacement d'un agent de contraste par un autre, en présentant le coût croissant du produit actuel comme le problème "majeur" à résoudre. Il justifie le choix du cochon par la ressemblance de ses reins avec ceux de l'humain, et écarte le recours à un simulateur au nom des conditions réelles de flux sanguin.
Objectifs
L'embolisation est une intervention thérapeutique mini-invasive consistant à obstruer une artère ou une veine. Elle permet d'empêcher le dysfonctionnement d'un vaisseau sanguin ou la prolifération d'une pathologie. Les indications de l’embolisation sont nombreuses et variées selon les pathologies et les vaisseaux à emboliser ( stopper une hémorragie ; traiter des lésions de vaisseaux sanguins ; traiter des tumeurs, et notamment des reins ou du foie) . Un des agents couramment utilisé pour l’embolisation est la Colle Chirurgicale Glubran®2 en mélange avec une huile iodée (Lipiodol) pour la visualisation sous rayons X. L'objectif du projet est d'évaluer le remplacement du Lipiodol par un autre agent de contraste lors d’embolisation artérielles rénales sur modèle porcin, et d’étudier son comportement rhéologique endovasculaire, en termes de pénétration et d’occlusion. L'objectif in fine est d’offrir aux praticiens et aux malades le traitement le plus adapté.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce projet sera de proposer une alternative à l'utilisation du Lipiodol lors des embolisations chimiques au Glubran®2. En effet, le problème majeur du lipiodol est son cout croissant, qui freine aujourd'hui son utilisation. Des alternatives permettraient également d'apporter des solutions pour les patients pour lequel le lipiodol est contre-indiqué. Cela permetta d’offrir aux praticiens et aux malades le traitement le plus adapté .
Procédures
La veille du traitement, les animaux seront mis à jeun pour la nuit. Le jour du traitement, les animaux seront placés sous anesthésie générale et subiront une procédure chirurgicale mini-invasive d'une durée d'environ 30 minutes. (L'embolisation sera réalisée sous contrôle angiographique et l'accès aux artères rénales sera réalisé par navigation endovasculaire, après mise en place de guide et cathéter dans l'artère fémorale droite.) Les animaux ne seront pas réveillés à la fin de la procédure et les reins seront prélevés pour être analysés.
Impact sur les animaux
La procédure se fait sous anesthésie générale et aucune nuisance ou effet indésirable n’est attendu au cours de ce projet. Les nuisances ou effets indésirables pourraient être : douleurs et stress lors de l'induction de l'anesthésie par administration IM, saignements lors de l'introduction des guides et cathéters dans l'artère fémorale, qui pourront être stoppées par application d'un point de compression ou d'une suture si besoin.
Devenir
Les 6 porcs du projet seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs reins pour les analyser (micro CT et analyse histologique).
Remplacement
Pour cette étude, il est nécessaire de travailler en conditions réelles de flux artériel ce qui est actuellement impossible à reproduire sur simulateur ou in vitro.
Réduction
Le nombre minimum de répétitions pour s’assurer de la reproductibilité est de 3 par mixture, et il y a 4 mixtures à évaluer. 12 reins sont donc nécessaires. Afin de réduire le nombre d'animaux, les deux reins seront traités, et 6 porcs seront donc nécessaires.
Raffinement
Les porcs arriveront sur place au minimum 7 jours avant la procédure pour leur permettre de s’habituer aux lieux et ainsi diminuer leur stress. Ils seront logés par groupes sociaux afin de respecter leur comportement grégaire, dans un box sur litière de paille ou de copeaux de bois agrémenté de jouets. En cas de température inférieure à 10 degrés dans l’animalerie, un système de chauffage individuel sera activé. Lors de la semaine d'acclimatation, le personnel animalier observera deux fois par jour le comportement des animaux afin de repérer d’éventuels signes de mal-être ou de souffrance. Ces signes inhabituels seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai. La procédure se déroulera sous anesthésie générale (AG).
Choix des espèces
Le modèle choisi est le porc, car la taille, l'anatomie et la physiologie de ses organes ( reins) sont comparables à celles de l'homme. De plus, le calibre du réseau vasculaire ainsi que la cascade de la coagulation porcine sont comparables à l’homme. Les animaux auront entre 3 et 5 mois (environ 60 kg) pour avoir une taille d’organes (reins) comparable à ceux des humains.
Mise au point d’une Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour le meilleur suivi d’un modèle préclinique de greffes de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris (1/2)
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
22 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la gravité va du sans réveil au sévère. Quatorze reçoivent une greffe de cellules tumorales directement dans l'hypophyse par chirurgie crânienne, puis un suivi par IRM sous anesthésie, pour mettre au point l'imagerie d'un nouveau modèle de tumeur. Le porteur indique que ces tumeurs peuvent provoquer une compression du crâne, des maux de tête et une atteinte de la vision, tout en affirmant que les souris ne devraient pas atteindre ces stades. L'étude se limite à valider la faisabilité de l'imagerie, les retombées thérapeutiques restant renvoyées à des projets ultérieurs.
Objectifs
Les tumeurs hypophysaires humaines ont une incidence élevée (1/1500). Bien que bénignes, elles provoquent des maux de tête, des troubles visuels et peuvent être invasives et agressives. Elles répondent mal aux traitements thérapeutiques classiques et il est indispensable de trouver de nouvelles molécules pouvant limiter leur développement. Il existe peu d’outils d’étude pour caractériser leur comportement, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester de nouveaux traitements. Leur étude est donc tributaire de modèles précliniques qui soient représentatifs des tumeurs hypophysaires humaines. Bien que le nombre de lignées tumorales soit limité et la mise en culture de cellules dérivées de tumeur soit délicate, la greffe de ces différents modèles sous la peau des souris constitue actuellement la seule possibilité de modèle préclinique pour mettre au point et valider de nouveaux traitements thérapeutiques. Les greffes sous-cutanées sont toutefois peu représentatives du contexte intracrânien dans lequel se développent et évoluent ces lésions tumorales chez l’Homme. Notre projet vise à approfondir le développement d’un modèle expérimental de greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour disposer de modèles précliniques qui permettront : i) d’étudier le comportement et la biologie de différentes lignées et cellules tumorales dans leur environnement naturel de développement et ii) de valider de nouveaux modèles précliniques pour évaluer l’effet de drogues thérapeutiques. La mise en place et la validation de ce nouveau modèle de greffes intra-hypophysaires a déjà été réalisé par le biais d’une micro-injection automatisée dans l’hypophyse de souris sur des animaux profondément endormis. Notre projet vise à réaliser une étude pilote qui confirmera la faisabilité de mettre en place un suivi par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) et de quantifier le volume tumoral de cellules greffées à un stade précoce de développement tumoral. Le projet se deroulera sur deux animaleries.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à tester la faisabilité de réaliser des imageries IRM de l’hypophyse et développer de nouveaux modèles précliniques pour l’étude d’outils thérapeutiques dédiés aux atteintes tumorales de la glande hypophysaire. Le modèle qui sera mis en place permettra d'obtenir des résultats plus fiables que ceux obtenus sur tumeurs qui ont poussées sous la peau. L'imagerie IRM permet de tirer beaucoup d'informations et permet de reconstruire la tumeur en 3D. Il devrait enfin améliorer le suivi des animaux expérimentaux en prévenant mieux le développement de lésions tumorales et limitant ainsi leur exposition à de possibles gênes ou souffrances inutiles.
Procédures
Lors de l’injection des cellules tumorales dans leur hypophyse, les animaux subiront une chirurgie de 30 minutes maximum sous anesthésie générale et sous analgésie. Cet acte n’aura lieu qu’une fois. Les animaux subiront une anesthésie gazeuse d’une heure maximum lors de la procédure d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). Une injection de produit de contraste dans la cavité abdominale sera réalisé durant l’imagerie pour permettre de mieux visualiser les tumeurs.
Impact sur les animaux
Un acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie pour injecter les cellules dans l’hypophyse. La chirurgie (incision de 0.5 cm) va entrainer de la démangeaison pendant la cicatrisation. La greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse entrainera le développement de lésions tumorales intracrânienne. Ces lésions pourront comme chez l’homme entrainer une compression intracrânienne, conduisant à des maux de tête et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision. Les souris ne devraient toutefois jamais atteindre ces stades tumoraux avancés qui sont fréquemment retrouvés chez l’homme et sont déclencheurs d’une chirurgie. La procédure d’imagerie sera intégralement réalisée sous anesthésie gazeuse tout comme l’injection d’un produit de contraste pour mieux visualiser les tumeurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales réalisées. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les tumeurs collectées post-mortem, Des analyses histologiques permettront d’exploiter au mieux nos résultats et compléter les analyses d’image réalisées par IRM.
Remplacement
Les modèles de greffes tumorales orthotopiques (injection de cellules tumorales dans les tissus où se développent naturellement les tumeurs greffées) représentent actuellement les modèles précliniques les plus convaincants, car ils permettent d’étudier le comportement des cellules tumorales (pousse tumorale, remodelage du microenvironnement, réponse à certains traitements, …) dans leur environnement cellulaire natif. En raison de la nature complexe de la recherche proposée, qui vise à évaluer la prise de greffe et l’impact de l’environnement hypophysaire sain sur la progression tumorale de cellules injectées, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro.
Réduction
Afin de nous conformer à la règle de réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre le taux de succès de nos greffes et l’obtention d’un nombre suffisant de tumeurs que nous pourrons étudier par imagerie. Dans le cadre des travaux proposés, 22 souris devraient nous permettre d’aboutir à la démonstration ou non de la faisabilité de développer des outils d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) permettant de raffiner nos analyses, identifier plus rapidement l’apparition de lésions et espérer suivre l’effet de nouveaux composés thérapeutiques. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale ni de test statistique, notre procédure se limitant à la mise au point d’une IRM sur un nouveau modèle préclinique. L’utilisation de 8 souris non-greffées et la greffe de 14 souris au maximum sur 1 an nous permettra de confirmer la faisabilité de réaliser des imageries IRM et quantifier la taille des tumeurs étudiées.
Raffinement
L’imagerie de type IRM que nous souhaitons mettre en place vise par définition à raffiner le suivi et le bien-être du modèle préclinique de greffe intra-hypophysaire que nous développons. En parallèle de l’utilisation de cet outil, nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, comportement erratique). L’identification de ces signes entrainerait alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Les analyses post-mortem que nous réaliserons sur le matériel biologique collecté nous permettrons de valider la faisabilité mais aussi la sensibilité de l’imagerie par IRM que nous souhaitons mettre en place pour un meilleur suivi éthique de nos modèles expérimentaux.
Choix des espèces
Le modèle de souris choisi possède un système immunitaire appauvri. Il s’agit d’un modèle indispensable pour greffer du tissu humain ou des lignées rongeurs de fonds génétiques mixtes afin qu'il n'y ait pas de rejet du greffon. Il est réceptif aux lignées choisies et aux tumeurs humaines hypophysaires. Il est donc idéal pour les greffes dans l’hypophyse et permettra également l’étude du microenvironnement et de l’interaction entre la tumeur et son environnement. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 16 semaines. Ce sont à ces âges que nous avons validé nos 70% d’efficacité d’injection avec les coordonnées définies.
Mesure des paramètres cardiovasculaires après administration de candidats médicaments chez le rongeur démédulé.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 520
Cochons d'Inde : 280
1080 rongeurs, 520 rats, 280 souris et 280 cobayes, vont être utilisés dans des procédures menées sans réveil, sous anesthésie profonde jusqu'à la mort. Chaque animal subit une démédulation, la destruction du tronc cérébral et de la moelle épinière qui entraîne la mort cérébrale, puis est maintenu en survie artificielle sous assistance respiratoire pour une chirurgie et des mesures cardiovasculaires durant deux à trois heures. Ces essais réglementaires évaluent les effets d'un candidat-médicament sur le cœur avant tout passage chez l'humain. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode in vitro ou in silico suffisante pour cette évaluation sur "corps entier".
Objectifs
Le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité et/ou les potentiels effets secondaires d'un futur médicament sur le système cardiovasculaire. En effet, avant la mise sur le marché d'un nouveau médicament, l'évaluation de ses effets hémodynamiques est indispensable. Ce projet est réalisé dans le cadre des études d'efficacité et/ou de pharmacologie de sécurité réglementaires.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le processus de mise sur le marché de nouveaux médicaments. L'évaluation de potentiels effets secondaires sur le système cardiovasculaire de l'animal est un passage important et obligatoire avant une administration chez l'Homme. Ainsi, ce projet permet de réaliser des études d'efficacité et/ou de pharmacologie de sécurité obligatoires et donc, de valider ou invalider des substances à effets secondaires nuls ou importants sur les fonctions cardiovasculaires. Ainsi, les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments efficaces et présentant le moins possible d'effets secondaires cardiovasculaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'Homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.
Procédures
La procédure de ce projet décrit différents types d'interventions. L'animal subira une démédulation (quelques secondes) (suppression du tronc cérébral et de la moelle épinière conduisant à la mort de l'animal) sous anesthésie gazeuse profonde (endormissement en 5 minutes), puis l'animal sera placé immédiatement sous assistance respiratoire de façon à maintenir l'animal en survie artificielle en conservant ses fonctions végétatives. Les animaux subiront une chirurgie (entre 30 et 60 minutes) , afin de pouvoir faire les mesures des paramètres cardiovasculaires (entre 2 et 3 heures). Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant cette procédure. La durée totale d'une expérience n'excédera pas 4 heures.
Impact sur les animaux
Au cours de cette expérience, l'animal vigile sera contraint pour induire l'anesthésie; ceci pouvant engendrer un stress mineur à l'animal. L'animal subira une démédulation sous anesthésie gazeuse profonde induisant la mort cérabrale de l'animal, puis il sera placé immédiatement sous assistance respiratoire de façon à maintenir ses fonctions végétatives et une chirurgie d'instrumentation sera réalisée.
Devenir
Les procédures décrites dans ce projet sont des procédures sur animal en mort cérébrale dont les fonctions végétatives sont artificiellement conservées, donc sans réveil possible. La survie artificiellle des animaux sera arrêtée en fin d'expérience.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat, le cobaye ou la souris car il n'existe pas de méthode de substitution in silico ou in vitro pour étudier les effets d'un candidat médicament sur la fonction cardiovasculaire des animaux. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre à l'intégralité des objectifs scientifiques du projet. Or, avant toutes administrations à l'Homme, l'étude sur corps entier constitue un passage obligatoire pour l'évaluation des effets secondaires sur la fonction cardiovasculaire, et de la pharmacocinétique, d'un candidat médicament. A ce jour, le rat, le cobaye et la souris sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Ce nombre (en général n=6 /groupe) est calculé pour pouvoir réaliser une analyse statistique robuste.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : La formation du personnel • La mise au point de procédures rigoureuses • Un protocole anesthésique adapté • Le suivi d’éventuel signes cliniques • La détermination des points limites • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire • Des conditions d’hébergement (avant expérience) adaptées et optimisées pour améliorer le bien-être animal • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux.
Choix des espèces
Le rat, la souris et le cobaye sont trois espèces animales particulièrement adaptées et couramment utilisées pour évaluer le profil hémodynamique d'un candidat médicament. Animaux adultes : Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Enseignement du prélèvement pulmonaire et de la perfusion ex vivo des poumons dans le modèle porcin.
- Enseignement supérieur
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
200 cochons vont être utilisés, opérés sous anesthésie profonde et tués sans reprise de conscience, dans des procédures menées sans réveil. Chaque animal subit une intervention chirurgicale de moins d'une heure puis une mise à mort par exsanguination, non pour produire des connaissances mais pour enseigner à des étudiants et à des chirurgiens le prélèvement des poumons, y compris "à cœur battant". Les poumons sont ensuite prélevés pour des exercices de perfusion. Le porteur affirme que les simulateurs et films pédagogiques ne peuvent remplacer l'animal vivant pour reproduire les contraintes de l'ouverture du thorax.
Objectifs
L’objectif du projet est d’enseigner aux étudiants en médecine de troisième cycle, les techniques chirurgicales qui permettent le prélèvement des poumons chez le porc en deux situations : a)Sous analgésie et anesthésie profonde, ainsi qu’en présence de la circulation sanguine (« à cœur battant »), modélisant le prélèvement réalisé chez le donneur en mort cérébrale et donc ayant encore le cœur battant. b)Après anesthésie et euthanasie modélisant le prélèvement pulmonaire chez le donneur après arrêt cardiaque (nouveau vivier de donneurs autorisé en France depuis 2014). Les poumons serviront par la suite à la mise en place de la perfusion pulmonaire ex vivo a but pédagogique : pour les étudiants en médecine de troisième cycle et pour les chirurgiens thoraciques du monde entier formés à la transplantation pulmonaire lors de séminaires de formations.
Bénéfices attendus
Le porc est le modèle le plus pertinent pour la transplantation pulmonaire humaine en raison des similitudes anatomiques, physiologiques et immunologiques avec l’humain. Le nombre de transplantations pulmonaires a augmenté ces dernières années dans le monde. La pénurie d’organes pour la transplantation pulmonaire est due à la pénurie de donneurs et aux faibles taux de possibilité d’utilisation des poumons donneurs. Le modèle porcin permet la mise au point des méthodes de récupération de poumons qui ne sont pas éligibles à la transplantation, telles que la perfusion pulmonaire ex-vivo. On reproduit ainsi dans le modèle porcin les conditions pathologiques responsables de l’exclusion de ces poumons chez l’humain qui pourraient être utilisés pour la transplantation pulmonaire. C’est le cas des organes récupérés chez certain donneurs lors du décès prononcé après une limitation des thérapeutique active. Ces poumons sont considérés comme étant à risque élevé de dysfonction post-transplantation pour cause d’absence de vascularisation durant une période prolongée à température ambiante. La perfusion pulmonaire ex-vivo utilisée en routine clinique a montré que la méthode était sure et reproductible pour une optimisation de la fonction pulmonaire de greffons dont toutes les caractéristiques ne sont pas optimales. Les bénéfices attendus du projet sont les suivants : - La formation et l‘enseignement des étudiants en médecine de troisième cycle aux techniques chirurgicales permettant la récupération d’organes chez les patients donneurs. - La formation des chirurgiens thoraciques des équipes de transplantation pulmonaire du monde entier à la mise en place de circuits perfusion pulmonaire ex-vivo. - Amélioration des méthodes ex vivo pour la récupération d’organes donneurs pour la transplantation - La caractérisation des cellules immunitaires colonisant les poumons à l’état basal.
Procédures
Les animaux subissent une unique intervention chirurgicale sous analgésie et anesthésie profonde d’une durée courte inférieure à 1 heure et ils sont euthanasiés par exsanguination. : Les animaux sont euthanasiés après anesthésie générale courte inférieure à 1 heure.
Impact sur les animaux
Douleur : adaptation de la prise en charge en fonction des modifications des paramètres physiologique. Trouble du rythme cardiaque au moment de l’induction anesthésique et de la sternotomie dans la procédure 1. Hémorragie lors la dissection du médiastin. Hyperthermie maligne au moment de l’induction anesthésique. L’intégralité des gestes expérimentaux seront faits sous anesthésie profonde sans réveil avant une euthanasie finale, réduisant les nuisances au stress des animaux lors de leur préparation.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélever les poumons.
Remplacement
Des alternatives pour l’apprentissage de la chirurgie existent : des films pédagogiques, des modèles inertes mimant des organes ou des organismes entiers ou encore des logiciels de simulation sur ordinateur. Ces alternatives sont utilisées en amont de ces séances d’apprentissage sur l’animal vivant mais ne peuvent pas les remplacer. Pour le cas particulier de la chirurgie thoracique, il y a besoin d’un organisme vivant mimant les contraintes mécaniques et physiologiques lors de l’ouverture de la paroi thoracique : la résistance des plans osseux, la fragilité des vaisseaux, les contraintes liées aux mouvements des poumons sous ventilation assistée
Réduction
Les poumons prélevés lors de ces séances d’apprentissage seront utilisés pour améliorer les méthodes de perfusion pulmonaire ex-vivo ou bien pour la caractérisation des cellules pulmonaires à l’état basal, en absence du stress oxydatif. Ces approches permettent de réduire le nombre d’animaux en combinant les séances d’enseignement avec l’utilisation des organes prélevés pour les deux thématiques mentionnées.
Raffinement
Les animaux arrivent dans la structure d’hébergement de transition du fournisseur après transport spécialisé. Ils restent dans cette structure durant au moins 7 jours, ce qui leurs permet de s’acclimater à leur nouvel environnement et avec une surveillance régulière du personnel. Ils sont nourris deux fois par jour et bénéficient d’un enrichissement du milieu par des chaines et des jouets. Ils seront transportés en cages de transport avec litière de copeaux afin de limiter leur stress lors du transfert au sein de la plateforme chirurgicale.
Choix des espèces
Le porc est le modèle le plus pertinent pour la transplantation pulmonaire humaine en raison de similitudes anatomiques, physiologiques et immunologiques avec l’humain. Animaux jeunes d’environ 100 jours d’âge dont les poumons ont une taille la plus proche possible de celle des poumons humains adultes.
REPMOD-Évolution et réversion des modes de reproduction: les bases génétiques de l’oviparité et de la viviparité chez le lézard vivipare (Zootoca vivipara)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
260 lézards vivipares vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du "sans réveil" au modéré, une partie tuée pour prélèvement, l'autre relâchée sur ses lieux de capture ou gardée captive à vie pour les hybrides. Les femelles subissent des échographies répétées sur animal éveillé puis sont mises à mort pour prélever leurs oviductes, tandis que d'autres individus subissent une biopsie de la queue sans anesthésie ni analgésie. Le porteur justifie l'absence d'anesthésie par la petite taille des animaux et leur capacité à régénérer la queue. Il affirme que l'étude de l'expression des gènes exige des tissus frais d'animaux vivants et écarte l'usage d'échantillons de muséum.
Objectifs
Le but du projet est de comprendre la génétique de la reproduction, et son évolution. Le modèle unique du “lézard vivipare” (Zootoca vivipara) comprend différents types de reproduction au sein de la même espèce. En effet, certains lézards pondent des œufs, d’autres donnent naissance à des juvéniles déjà formés, et certaines lignées de ces lézards qui donnaient naissance à des jeunes se sont remis à pondre des œufs au cours de l’évolution. Ces différentes situations vont nous permettre d’étudier l’expression des gènes dans les organes reproducteurs des femelles et décrire la structure de ces organes afin d’en comprendre leur fonctionnement, qui permettra d’expliquer l’apparition des différentes formes de reproduction chez les différentes lignées de Z. vivipara.
Bénéfices attendus
Ce travail va apporter des connaissances sur les différences génétiques présentes dans les différents types de reproduction du lézard vivipare qui sont encore inconnus. Plus généralement, ce travail sera une contribution majeure à la compréhension de l’évolution de la reproduction chez les vertébrés. Ce travail permettra aussi de mieux comprendre l’histoire de l’évolution de Z. vivipara. Les génomes obtenus grâce à cette étude seront mis à disposition de la communauté scientifique. Sur le long terme une meilleure compréhension de la reproduction du lézard vivipare permettra de mettre en place des programmes plus adaptés à sa sauvegarde. Les scientifiques de ce projet, ainsi que plusieurs des partenaires impliqués dans ce projet, sont investis dans des associations de vulgarisation scientifique et de protection des reptiles qui permettent à la fois de mieux faire connaitre ces animaux mais aussi de faire évoluer la législation vers une meilleure protection de leurs habitats. Ils participeront à des conférences grand public autour de la protection des reptiles en partenariat avec des ONG dans le domaine de l’écologie.
Procédures
Types d’interventions prévues : 1. Pour 120 femelles sauvages, et au maximum 40 femelles issues de croisements hybrides, des échographies seront effectuées sur animaux vigiles car l’intervention ne dure que quelques minutes, et sera effectuée 2 à 3 fois par semaine. Lorsque les organes reproducteurs seront à la bonne phase du cycle reproductif, les femelles seront euthanasiées selon une méthode réglementaire. 2. Des biopsies de queue seront réalisées sur 100 individus, pour analyser les bases génétiques de la reproduction de 40 mâles et de 20 femelles (les femelles sauvages utilisées pour les croisements hybrides), ainsi que 40 animaux hybrides issus de ces croisements. Cette intervention est très rapide et sera effectuée sans anesthésie ni analgésie due à la petite taille de l'animal et à leur capacité à régénérer leur queue. Une désinfection des instruments médicaux utilisés et de la queue sera effectuée pour chaque individu. En dehors de ces procédures les manipulations seront réduites au minimum pour limiter le stress des animaux.
Impact sur les animaux
Les populations de Zootoca vivipara en France et en Autriche sont suivies depuis de nombreuses années par les écologues et leur maintien en captivité est bien maitrisé. Tous les lézards qui ne seront pas mis à mort dans le cadre de l’action seront relâchés aux points GPS de leur capture (à l’exception des individus hybrides qui seront maintenus en captivité jusqu’à leur mort naturelle).
Devenir
En ce qui concerne les femelles utilisées pour l’intervention 1, elles seront euthanasiées afin de prélever leurs oviductes. Il s’agit de la seule technique qui actuellement permette d’obtenir des informations de qualité sur l’expression des gènes dans un organe spécifique. En effet, les ARNs (qui permettent d’obtenir les données d’expression des gènes) se dégradent très rapidement et il est nécessaire d’utiliser des tissus frais pour les obtenir. En ce qui concerne les femelles et les mâles utilisés pour la reproduction, ils pourront être relâchés à leur point de capture. Il est important de noter que ces individus pourront être utilisés pour plusieurs croisements avant d'être relâchés. Les animaux issus de croisements de lignées différentes (hybrides) ne pourront pas être relâchés dans la nature et seront gardés en élevage jusqu’à leur mort naturelle.
Remplacement
Les gènes liés à la reproduction des lézards vivipares ne sont pas encore connus. Il est donc obligatoire de travailler sur des animaux vivants pour les découvrir. L’étude de l’expression des gènes (ARN), contrairement à celle de l’ADN, nécessite d’utiliser des tissus frais. Il n’est donc pas possible d’utiliser des échantillons déjà présents dans les muséums ou des laboratoires de recherche. Dans le futur, nous travaillons à la mise en place de solution pour ne plus avoir à utiliser d’animaux vivants pour étudier les gènes que nous aurons identifiés au préalable (utilisation de lignées de cellules d’organes reproducteurs de reptiles en laboratoire).
Réduction
Un échantillon maximal de 260 individus semble optimal pour obtenir des résultats précis et exploitables (en dessous de ce nombre on court le risque de ne pas réussir à identifier les différences génétiques et donc de ne pas pouvoir répondre à la question scientifique motivant ces expériences). Le nombre d’animaux soumis à la biospie de la queue (100 lézards au lieu des 260 de l’étude) a été réduit, car la queue pourra être prélevée en même temps que les organes reproducteurs des femelles (160 femelles sont concernées).
Raffinement
Pour limiter le stress et coller le mieux possible à l'écologie de l'espèce, l'élevage sera effectué en milieu semi-naturel en extérieur par groupe de maximum 12 individus par bac de pâture de 1100L. Ils comprennent à la fois de la terre pour que les animaux puissent s'enfouir, des cachettes et des plantes pour imiter le milieu naturel. Il permet de minimiser le contact entre l’Homme et les animaux et donc de réduire le stress des lézards. Une supplémentation en nourriture et un arrosage selon la saison est prévu. Suite à la capture, une acclimatation d’une semaine avant manipulation sera effectuée dans une animalerie (UV et température contrôlée en terrarium) pour permettre d’identifier et traiter les éventuels parasites présents sur les animaux sauvages et éviter des risques de contamination. En ce qui concerne les manipulations des animaux notamment lors des échographies, elles seront effectuées dans les conditions les moins stressantes possibles (température basse, luminosité basse), le plus rapidement possible afin de limiter le stress lors de la contention en main. Le personnel intervenant sur les lézards aura été préalablement formé par des personnes capacitaires pour cette espèce. Bien qu’une douleur sera toujours présente lors des biopsies de l’extrémité de la queue, celle-ci sera réduite par l’utilisation de matériel adapté (ciseaux bien aiguisés) et de personnel formé pour cette procédure. Ceci permettra que cette procédure soit rapide et effectuée dans des conditions d’asepsie (désinfection du matériel entre chacun individu et application de Chlorhexidine diluée sur la plaie après la biopsie) qui permettent une cicatrisation rapide. L’animal sera de plus placé sur du sopalin pendant les jours suivant la biopsie pour limiter les risques d’infection et permettre une meilleure visualisation de la plaie pour suivre la cicatrisation. Les points limites suivants ont été définis : les animaux présentant des signes d’infection (pus + nécrose de tissus), un abattement, une léthargie ou une anorexie supérieure à 7 jours seront exclus de l’étude et pourront être euthanasié selon avis vétérinaire. Les animaux trop maigres seront mis en quarantaine et nourri quotidiennement, ils ne seront réintégrés dans l’étude qu’après reprise de poids et stabilisation. Les animaux adultes dont la queue est inférieure à 2cm ne seront pas utilisés pour la biopsie de queue, ils seront soit intégrés au groupe qui sera euthanasié (femelles) soit relâchés (mâles).
Choix des espèces
Les différences génétiques entre les animaux qui pondent des œufs, et ceux qui donnent directement naissance à des nouveau-nés ne sont pas connues. Ces analyses ne peuvent donc pas être simulées, et nécessitent le recours à des animaux vivants. Pour répondre à cette question, il est nécessaire d’avoir des animaux très proches possédant ces modes de reproductions différents : c’est le cas du lézard vivipare (Zootoca vivipara) qui est ainsi un modèle de choix unique pour cette recherche. Les animaux utilisés seront des adultes matures sexuellement. Une partie des femelles issues du milieu sauvage seront utilisées pour étudier leurs organes reproducteurs. Les mâles et les femelles issus du milieu sauvage restant seront utilisés pour la reproduction (obtention de lignées hybrides). Les nouveau-nés issus de ces croisements (individus hybrides) seront, pour une partie, utilisés pour étudier leurs organes reproducteurs (femelles), et pour une autre partie, gardés en captivité jusqu’à leur mort naturelle (mâles et femelles surnuméraires).
Mise au point d’une Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour le meilleur suivi d’un modèle préclinique de greffes de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris (2/2)
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
22 souris vont être utilisées et toutes tuées, 8 opérées puis tuées sans réveil et 14 exposées à un niveau de souffrance sévère. Les 14 souris greffées reçoivent une injection de cellules tumorales dans l'hypophyse par chirurgie, puis un suivi par IRM sous anesthésie avec injection d'un produit de contraste. Le porteur présente une étude pilote de faisabilité, sans répétition ni test statistique, pour vérifier qu'une IRM peut mesurer le volume tumoral. Il reconnaît que la greffe sous la peau est "peu représentative" mais affirme ne pas pouvoir remplacer le modèle murin par des approches in vitro.
Objectifs
Les tumeurs hypophysaires humaines ont une incidence élevée (1/1500). Bien que bénignes, elles provoquent des maux de tête, des troubles visuels et peuvent être invasives et agressives. Elles répondent mal aux traitements thérapeutiques classiques et il est indispensable de trouver de nouvelles molécules pouvant limiter leur développement. Il existe peu d’outils d’étude pour caractériser leur comportement, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester de nouveaux traitements. Leur étude est donc tributaire de modèles précliniques qui soient représentatifs des tumeurs hypophysaires humaines. Bien que le nombre de lignées tumorales soit limité et la mise en culture de cellules dérivées de tumeur soit délicate, la greffe de ces différents modèles sous la peau des souris constitue actuellement la seule possibilité de modèle préclinique pour mettre au point et valider de nouveaux traitements thérapeutiques. Les greffes sous-cutanées sont toutefois peu représentatives du contexte intracrânien dans lequel se développent et évoluent ces lésions tumorales chez l’Homme. Notre projet vise à approfondir le développement d’un modèle expérimental de greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour disposer de modèles précliniques qui permettront : i) d’étudier le comportement et la biologie de différentes lignées et cellules tumorales dans leur environnement naturel de développement et ii) de valider de nouveaux modèles précliniques pour évaluer l’effet de drogues thérapeutiques. La mise en place et la validation de ce nouveau modèle de greffes intra-hypophysaires a déjà été réalisé par le biais d’une micro-injection automatisée dans l’hypophyse de souris sur des animaux profondément endormis. Notre projet vise à réaliser une étude pilote qui confirmera la faisabilité de mettre en place un suivi par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) et de quantifier le volume tumoral de cellules greffées à un stade précoce de développement tumoral.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à tester la faisabilité de réaliser des imageries IRM de l’hypophyse et développer de nouveaux modèles précliniques pour l’étude d’outils thérapeutiques dédiés aux atteintes tumorales de la glande hypophysaire. Le modèle qui sera mis en place permettra d'obtenir des résultats plus fiables que ceux obtenus sur tumeurs qui ont poussées sous la peau. L'imagerie IRM permet de tirer beaucoup d'informations et permet de reconstruire la tumeur en 3D. Il devrait enfin améliorer le suivi des animaux expérimentaux en prévenant mieux le développement de lésions tumorales et limitant ainsi leur exposition à de possibles gênes ou souffrances inutiles.
Procédures
Lors de l’injection des cellules tumorales dans leur hypophyse, les animaux subiront une chirurgie de 30 minutes maximum sous anesthésie générale et sous analgésie. Cet acte n’aura lieu qu’une fois. Les animaux subiront une anesthésie gazeuse d’une heure maximum lors de la procédure d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). Une injection de produit de contraste dans la cavité abdominale sera réalisé durant l’imagerie pour permettre de mieux visualiser les tumeurs.
Impact sur les animaux
Un acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie pour injecter les cellules dans l’hypophyse. La chirurgie (incision de 0.5 cm) va entrainer de la démangeaison pendant la cicatrisation. La greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse entrainera le développement de lésions tumorales intracrânienne. Ces lésions pourront comme chez l’homme entrainer une compression intracrânienne, conduisant à des maux de tête et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision. Les souris ne devraient toutefois jamais atteindre ces stades tumoraux avancés qui sont fréquemment retrouvés chez l’homme et sont déclencheurs d’une chirurgie. La procédure d’imagerie sera intégralement réalisée sous anesthésie gazeuse tout comme l’injection d’un produit de contraste pour mieux visualiser les tumeurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales réalisées. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les tumeurs collectées post-mortem, Des analyses histologiques permettront d’exploiter au mieux nos résultats et compléter les analyses d’image réalisées par IRM.
Remplacement
Les modèles de greffes tumorales orthotopiques (injection de cellules tumorales dans les tissus où se développent naturellement les tumeurs greffées) représentent actuellement les modèles précliniques les plus convaincants, car ils permettent d’étudier le comportement des cellules tumorales (pousse tumorale, remodelage du microenvironnement, réponse à certains traitements, …) dans leur environnement cellulaire natif. En raison de la nature complexe de la recherche proposée, qui vise à évaluer la prise de greffe et l’impact de l’environnement hypophysaire sain sur la progression tumorale de cellules injectées, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro.
Réduction
Afin de nous conformer à la règle de réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre le taux de succès de nos greffes et l’obtention d’un nombre suffisant de tumeurs que nous pourrons étudier par imagerie. Dans le cadre des travaux proposés, 22 souris devraient nous permettre d’aboutir à la démonstration ou non de la faisabilité de développer des outils d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) permettant de raffiner nos analyses, identifier plus rapidement l’apparition de lésions et espérer suivre l’effet de nouveaux composés thérapeutiques. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale ni de test statistique, notre procédure se limitant à la mise au point d’une IRM sur un nouveau modèle préclinique. L’utilisation de 8 souris non-greffées et la greffe de 14 souris au maximum sur 1 an nous permettra de confirmer la faisabilité de réaliser des imageries IRM et quantifier la taille des tumeurs étudiées.
Raffinement
L’imagerie de type IRM que nous souhaitons mettre en place vise par définition à raffiner le suivi et le bien-être du modèle préclinique de greffe intra-hypophysaire que nous développons. En parallèle de l’utilisation de cet outil, nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, comportement erratique). L’identification de ces signes entrainerait alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Les analyses post-mortem que nous réaliserons sur le matériel biologique collecté nous permettrons de valider la faisabilité mais aussi la sensibilité de l’imagerie par IRM que nous souhaitons mettre en place pour un meilleur suivi éthique de nos modèles expérimentaux. Les examens d'imagerie et d'injection stéréotaxique se feront sous anesthésie gazeuse Isoflurane ; pour les injections stéréotaxiques l'analgésie sera assurée par l'utilisation de Buprenorphine et d'un anti-inflammatoire Metacam.
Choix des espèces
Le modèle de souris choisi possède un système immunitaire appauvri. Il s’agit d’un modèle indispensable pour greffer du tissu humain ou des lignées rongeurs de fonds génétiques mixtes afin qu'il n'y ait pas de rejet du greffon. Il est réceptif aux lignées choisies et aux tumeurs humaines hypophysaires. Il est donc idéal pour les greffes dans l’hypophyse et permettra également l’étude du microenvironnement et de l’interaction entre la tumeur et son environnement. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 16 semaines. Ce sont à ces âges que nous avons validé nos 70% d’efficacité d’injection avec les coordonnées définies.
Rôle des cellules immunitaires des méninges dans le développement et la physiopathologie du Système Nerveux Central chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
11 232 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, une partie sous anesthésie sans réveil. Adultes et nouveau-nés reçoivent des injections sous-cutanées, intra-péritonéales ou intracérébrales de vecteurs viraux, certains souriceaux subissant une imagerie sous anesthésie dont ils ne se réveillent pas, pour étudier le rôle des cellules immunitaires des méninges dans le développement du cerveau. Le porteur mentionne des études comportementales vers trente jours sans en préciser la nature. Il affirme qu'on "ne peut pas se passer" du modèle animal, tout en évoquant des cultures de neurosphères qui pourraient réduire le nombre de souris.
Objectifs
La surface du système nerveux central (SNC) est protégée par des membranes : les méninges. La découverte récente de la diversité des populations immunes y résidant et leur capacité à interagir avec le cerveau (influence sur le comportement, migraine, méningites, sclérose en plaque, …) ouvre de nouvelles perspectives en termes de recherche fondamentale et thérapeutique. Les cellules immunitaires les plus représentées dans les méninges sont les macrophages. D’autre part les méninges pénètrent profondément dans le cerveau entre les sous structures majeures du cerveau dont l’hippocampe, le siège de la neurogénèse. Dans ce contexte, mon projet a plusieurs objectifs : -1 : étude de l’implication des Macrophages Méningés (MM) et autres cellules immunitaires méningées au cours de la neurogénèse cérébrale physiologique- 2 : étude de leur implication dans la coordination de la croissance cerveau/crâne (rôle d’interface très important) -3 : étude de leur implication dans les troubles cognitifs postnataux dus à une inflammation au cours du développement cérébral (correspondante au troisième trimestre de gestation chez l’homme). Notre première stratégie sera de supprimer les macrophages méningés (MM) : soit par injection sous cutanée locale dde drogue dans des souris de type sauvage (déplétion chimique) ; soit par une approche génétique utilisant différents modèles de souris transgéniques. La seconde stratégie sera d’inactiver localement les gènes trophiques exprimés spécifiquement par les macrophages. Ces deux stratégies seront réalisées d’une part chez des souris adultes stimulées par activité physique, et d’autre part à des stades développementaux clés dans la maturation du système nerveux central. Nous évaluerons les conséquences de l’absence ou du dysfonctionnement des macrophages sur la neurogenèse cérébrale et le comportement.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce travail est de comprendre comment les cellules immunitaires des méninges interagissent avec le développement du cerveau. Du fait de la complexité des interactions cellulaires ainsi que du rôle de la vascularisation dans ce procédé (pour l’apport des cellules immunes), il n’est pas possible de se passer d’un modèle animal, et les études in vitro et in silico, bien qu’intéressantes, ne suffiront pas à comprendre la réponse immune du système nerveux central (SNC) dans son ensemble. L’organisation physique des tissus entre eux est cruciale et ne peut pas être modélisée in vitro. Les retombées de ces recherches au niveau fondamental mais aussi appliqué (découverte de thérapies ciblant les maladies inflammatoires et neurodégénératives) pour l’Homme constituent une justification éthique importante pour faire valoir notre projet impliquant des expériences sur animaux in vivo. Concrètement, nous espérons que ce projet nous apportera les bénéfices suivants : - A court/moyen terme, une meilleure compréhension du rôle physiologique des macrophages méningés (MM) dans 1) le neurodéveloppement, 2) la formation biomécanique du crâne et des méninges, 3) le comportement. - A moyen/long terme : permettre l’identification de candidats exprimés/sécrétés par les macrophages méningés (MM) impliqués dans la neurogénèse afin de pouvoir développer des stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des MM dans les troubles neurodéveloppementaux ou dans des maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections sous cutanées, intrapéritonéales, de molécules non toxiques à des volumes et des doses en accord avec l'âge et le poids des souris. Une minorité d’animaux seront soumis à des injection intracérébrales. Chez les adultes de 6 à 8 semaines : i) Injection sous cutanée sous la peau du crâne (acte de 30s sur animal vigile) d’un composé non toxique permettant de dépléter uniquement les macrophages des méninges tous les 2 jours pendant 15 jours soit 7 injections chez les animaux de type sauvage, ou 2 injections à 24 h d’intervalle juste avant la fin de l’expérience chez les animaux transgéniques. ii ) Injection unique intra- péritonéale (acte de 30s sur animal vigile) d’un composé non toxique permettant de tracer la formation des nouveaux neurones. iii) Injection intracérébrale de vecteurs viraux (virus inactivé transporteur de molécules) chez certains animaux de type sauvage : injection unique avec analgésie préventive sous anesthésie générale (durée 1h). iiii) prélèvement sanguin unique au coin de l’œil : sous anesthésie générale gazeuse en un geste de 30s juste avant la mise à mort de l’animal. Chez les souriceaux 0 à 10 jours : i) Injection sous la peau de la nuque (acte de 30s sur animal vigile) 3 injections maximum (une injection tous les 2 jours) chez les animaux de type sauvage et 2 injections chez les animaux transgéniques) dans le cas d’un composé non toxique permettant de dépléter uniquement les macrophages des méninges. 2 injections à 8 jours d’intervalle dans le cas de l’injection d’un marqueur de calcification. ii) Injections intra- péritonéales (acte de 30s sur animal vigile) : une injection unique dans le cas d’un composé non toxique permettant de tracer la formation des nouveaux neurones, 2 injections à 24h d’intervalle dans le cas d’un composé activant le système transgénique (uniquement pour certains modèles), une injection unique de toxine bactérienne ou alternativement 2 injections par jour à 6 h d’intervalle pendant 5 jours soit 10 injections totales d’une cytokine pour les animaux rentrant dans l’étude sur l’inflammation périnatale. iiii) Injection intracérébrale de vecteurs viraux (virus inactivé transporteur de molécules) chez certains animaux de type sauvage : injection unique avec analgésie préventive sous anesthésie générale (durée 20mn). V) Imagerie intra-vitale dans une procédure : pendant 1h sous anesthésie générale sur des souriceaux de 15 jours qui ne seront pas réveillés.
Impact sur les animaux
Les différents effets indésirables pouvant intervenir sont : une douleur au site d’injection en particulier pour les injections sous cutanées sous la peau du crâne ou sous la peau de la nuque, une mauvaise réaction à la molécule injectée ou un impact sur la croissance, du stress en particulier au moment des études comportementales à 30 jours, du stress pour la mère et pour les souriceaux, de la douleur au réveil lors des injections intracérébrales. Un contrôle quotidien de l’état de santé des souris, avec une grille de score pour chaque procédure permettra la détection d’anomalies. Si nous détectons une douleur, souffrance ou détresse, que nous n’arrivons pas à réduire par analgésie, l’animal sera euthanasié immédiatement. Dans le cas particulier des souriceaux, nous vérifierons également le comportement maternel, l’allaitement et la croissance des souriceaux. A la fin de chaque procédure les souris seront euthanasiées selon les méthodes réglementaires pour prélever méninges et cerveau.
Devenir
Chaque procédure nécessite l'euthanasie de tous les animaux selon les méthodes réglementaires pour prélever méninges et cerveau afin de les analyser.
Remplacement
L’objectif de ce travail est de comprendre comment les cellules immunitaires des méninges interagissent avec le développement du cerveau. Du fait de la complexité des interactions cellulaires ainsi que du rôle de la vascularisation dans ce procédé (pour l’apport de cellules immunes), il n’est pas possible de se passer d’un animal modèle, et les études in vitro et in silico, bien qu’intéressantes, ne suffiront pas à comprendre la réponse immune du SNC dans son ensemble. L’organisation physique des tissus entre eux est cruciale et ne peut pas être modélisée in vitro. Les retombées de ces recherches au niveau fondamental mais aussi appliqué (découverte de thérapies ciblant les maladies inflammatoires et neurodégénératives) pour l’Homme constituent une justification éthique importante pour faire valoir notre projet impliquant des expériences sur animaux in vivo. Puisque nous ne pouvons pas nous affranchir du modèle animal, nous réduirons au maximum le nombre d’animaux utilisés en suivant la règle des 3R. Certains axes du projet seront développés en utilisant en parallèle une approche de culture de neurosphères afin d’évaluer l’effet sur la neurogenèse de certains facteurs protéiques sécrétés par les macrophages présélectionnés par notre étude in vivo. Ceci nous permettra, nous l’espérons, de réduire encore le nombre de souris et les remplacer par un modèle in vitro.
Réduction
Nous tenterons de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en effectuant des expériences pertinentes et complètes. Nous utiliserons des tests statistiques adéquats pour planifier nos expériences en fonction de la littérature et des données internes de l’équipe. Nous utiliserons plusieurs tissus du même animal (méninges, cerveau, crâne et sang). Les données quantitatives générées seront analysées statistiquement par le test de t de Student. Pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, le nombre d’individus nécessaire est de 20 animaux par groupe dans chaque procédure et 40 animaux par groupe pour les études comportementales. Nous utiliserons donc 11232 souris pour l’ensemble de ce projet sur cinq ans. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les études comportementales seront réalisées avant l'euthanasie de l'animal et le prélèvement des structures cérébrales. Les souriceaux utilisés pour l’étude de la neurogénèse (déplétion génique ou chimique des macrophages et mastocytes des méninges) se verront prélever les méninges et le crâne dans le cadre de l’étude sur la formation du crâne. Les souris proviendront d’établissements éleveurs, fournisseurs localisés et de collaborateurs.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, concues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques et exemptes d’organismes pathogènes spécifiques. Les conditions de l’animalerie sont contrôlées (température, hygrométrie, photopériode). Les cages de 530cm2 seront utilisées pour limiter le stress des animaux (100cm2 de surface par animal au minimum, dômes protecteurs et matériel pour la confection de nids). Des précautions supplémentaires seront prises sur les souriceaux : après manipulation l’utilisateur se frottera les mains avec la sciure en provenance de la cage de la mère, ce qui limitera les dépôts d’odeur et favorisera la réintégration au sein du nid. Les souriceaux seront réchauffés grâce à une lampe à infra-rouge, avant d’être replacés. Les injections seront réalisées par des personnes formées à la manipulation des nouveaux nés avec du matériel adapté aux nouveaux nés. L’état de santé des animaux sera évalué quotidiennement selon 5 grands critères : 1-apparence globale (apparence physique et grimace), 2- Respiration et oxygénation (fréquence respiratoire et/ou coloration des extrémités), 3- évolution pondérale individuelle 4 – comportement (provoqué ou non) et continuité de l'accouplement, 5- autres observations (saignement ou tout autre signe clinique jugé par le technicien expérimenté). Une grille de score spécifique à l'âge avec évaluation de la douleur sera complétée. Les points limites nécessitant l’observation accrue, soulagement de l’animal (buprénorphine sous cutanée 0,1mg/kg qui sera répétée toutes les 12 heures) ou l'arrêt de la procédure avec euthanasie seront détaillés dans chaque procédure. Ce sont : poils hirsutes, dos arrondi, fréquence respiratoire augmentée et rythme instable, pâleur ou cyanose, perte de poids individuelle >20%, comportement anormal, hypo-mobilité, isolement, défaut d’alimentation ou d’hydratation, diarrhées, saignements, et en particulier pour les souriceaux, abandon par la mère, décoloration.
Choix des espèces
De nombreux modèles physiopathologiques étant partagés entre l’homme et la souris, nous utiliserons des souches de souris consanguines ainsi que des lignées génétiquement modifiées. De plus, le vaste développement de modèles transgéniques (pour cibler et visualiser des populations cellulaires précises) et l’utilisation d’une grande variété de drogues déjà testées chez la souris permet de tester plus rapidement et plus efficacement nos hypothèses. Enfin, nos modèles d'étude sont fréquemment utilisés chez la souris et leur physiopathologie est donc bien décrite. Pour toutes ces raisons, le modèle murin représente le modèle le plus prometteur pour effectuer notre étude. Nous utiliserons des souris de 6 à 8 semaines (J42 à J56) mâles et femelles afin d’évaluer l’impact des macrophages méningés sur la neurogénèse adulte avec ou sans activité physique. Nous utiliserons également des souriceaux à des âges clés du développement neuronal. Ainsi pour les études de neurogenèse et de croissance cerveau-méninges- crâne, les gestes techniques seront réalisés entre J0 et J9 avec analyse à J3 ou J7 ou J10 en fonction des questions posées. Pour les études cognitives, les gestes techniques seront réalisés de J1 à J5 (correspondant au 3ème trimestre de gestation chez l'homme) avec analyse à J8 ou J30.
Travaux pratiques sur rongeurs au cours de formation chirurgie destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales chirurgicales
- Formation professionnelle
Rats : 920
880 souris et 920 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque stagiaire dispose de trois heures pour pratiquer sur eux des interventions comme l'ovariotomie, la vasectomie, la splénectomie, la néphrectomie ou la microchirurgie vasculaire, non pour produire des connaissances mais pour former du personnel à la chirurgie expérimentale. Le porteur indique recourir en partie à des animaux "de réforme" ou issus d'un génotypage non désiré, déjà destinés à l'euthanasie. Il présente le projet comme une réponse à des "besoins de formation" à l'expérimentation animale.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de former les stagiaires sur les thématiques suivantes : -Organisation d'une salle ou bloc de chirurgie expérimentale, conception des procédures chirurgicales, choix et entretien du matériel. - Asepsie opératoire, préparation des animaux et du personnel. -Prémédication, anesthésie (y compris l’intubation), monitoring, analgésie pré, per et post-opératoire -Techniques de base en chirurgie : hémostase, sutures, soins - Points limites adaptés aux procédures chirurgicales -Techniques chirurgicales spécifiques (Chirurgie stéréotaxique chez la souris et le rat, microchirurgie vasculaire chez le rat. Ovariotomie, vasectomie et splénectomie chez la souris, néphrectomie, biopsie hépatique et anastomose digestif chez le rat).
Bénéfices attendus
Cette formation répond à des besoins de formation sur l’expérimentation animale. Le stage vise à acquérir les concepts pour mettre en œuvre des techniques chirurgicales chez les rongeurs. La formation enseigne aussi la rigueur des gestes chirurgicaux et la mise en pratique des descriptions de l’anatomie chirurgicale permettant d’obtenir des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles. Cette formation permettra au stagiaire, une fois dans son laboratoire de mieux appréhender les techniques d’anesthésie, de chirurgie et de gestion de la douleur per et post-opératoire et de contribuer ainsi au raffinement lors de procédures chirurgicales. Une attestation de compétences nécessaires pour pratiquer la chirurgie expérimentale sur animaux vivants est délivrée conformément au décret 2013-118 du 1er février 2013
Procédures
Afin d’offrir un enseignement complet de la chirurgie chez les rongeurs, nous envisageons de proposer 4 types de procédures chirurgicales ainsi qu’une procédure dédiée à l’intubation. Les stagiaires disposeront de 3heures pour réaliser chaque intervention chirurgicale et d’une heure pour la procédure de l’intubation. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de ne ressentir aucune douleur.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures chirurgicales dans cette formation sont des procédures sans réveil. Les effets indésirables peropératoires sont indiqués dans les points d’arrêt et ils conduiront à l'arrêt de la procédure et à la mise à mort de l'animal.
Devenir
Les animaux ne seront pas conservés en vie pour éviter des souffrances inutiles, ils sont mis à mort directement après la fin des procédures par injection d’Euthasole (140mg/kg en IV pour les rats et 140mg/kg en IP pour les souris).
Remplacement
Des tissus artificiels (plaque en silicone) seront utilisés pour l’apprentissage des sutures. Des simulateurs de microchirurgie (systèmes de chas des aiguilles) seront utilisés pour la validation des techniques de maniement des Instruments et des fils de suture de petit diamètre. Des cuisses de poulet du commerce seront utilisées pour l'apprentissage de la dissection des vaisseaux et des nerfs d’une manière atraumatique ainsi que la réalisation des anastomoses et sutures nerveuses.
Réduction
Les méthodes statistiques requises habituellement ne peuvent s’exercer dans ce cas, car le but de ce projet est pédagogique. Néanmoins le projet a été pensé de manière à mettre en place plusieurs dispositions pour réduire l'effectif des animaux nécessaire : L’utilisation de la retransmission vidéo pour l’apprentissage des gestes techniques de la microchirurgie (seulement un seul rat sera utilisé). Pour réduire le nombre des animaux commandés nous utiliserons aussi des souris et des rats de réformes ou de génotypage non désiré destinés à l’euthanasie (des animaux provenant de notre établissement et qui n’ont jamais servi dans d’autres procédures expérimentales).
Raffinement
Avant les procédures, Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton pour les rats, des maisonnettes en plastique ou de dômes pour les souris, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes spécifiques et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. L'alimentation et l'eau seront distribuées à volonté. Le choix des instruments est adapté aux techniques de chirurgie « classique » micro-invasive afin d’éviter les lésions et délabrements superflus des tissus, sources de douleurs. Tous les animaux recevront une analgésie à base de buprénorphine, 30 minutes avant les manipulations. Toutes souffrances seront évitées par l'anesthésie de l'animal avec des agents médicamenteux adaptés. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.
Choix des espèces
Cette formation de chirurgie est destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales chirurgicales sur les petits rongeurs (souris et rats). Dans le but de faciliter la contention et la manipulation pour les participants, nous utiliserons des souris adultes de 25 à 35 g. Pour les rats nous utiliserons des rats adultes de 350g en moyenne, puisque les animaux plus jeunes rendent la réalisation des différents montages plus difficile (exemple : la microchirurgie).
Biotrauma rénal chez le porc : impact de la ventilation mécanique sur l’inflammation, la perfusion et l’oxygénation régionale rénale à l’aide de l’imagerie couplée IRM-TEP.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
30 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Après trachéotomie et pose de cathéters, ils subissent 24 heures de ventilation mécanique à réglages volontairement inadaptés, un groupe recevant en plus une instillation d'acide chlorhydrique dans la trachée pour provoquer une détresse respiratoire sévère, avant imagerie IRM-TEP et mise à mort. Le porteur indique que les lésions pulmonaires induites sont irréversibles et incompatibles avec une respiration autonome, ce qui rend selon lui le réveil impossible. Il justifie le recours au porc par une morphométrie proche de l'homme et écarte les organoïdes et cultures cellulaires, jugés incapables de reproduire les interactions entre organes.
Objectifs
La ventilation artificielle est utilisée quotidiennement au bloc opératoire ou en réanimation pour soigner les patients atteints de troubles respiratoires sévères. La ventilation artificielle est aussi responsable d’effets adverses liés à la surdistension exagérée du poumon. Ces effets adverses liés à la ventilation pourraient aussi toucher les deux reins et mener à leur dysfonction. A titre d’exemple, les patients atteints de formes sévères de COVID-19 et traités par ventilation artificielle présentent fréquemment une dysfonction rénale sévère. La tomographie par émission de positons (TEP) est une technique d’imagerie médicale nucléaire qui permet de mesurer l’inflammation rénale et la perfusion rénale (la quantité de sang qui irrigue le rein). L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’estimer indirectement l’oxygénation rénale. Nous avons donc la possibilité d’étudier comment l’inflammation, la perfusion ou l’oxygénation du rein est impacté par la ventilation artificielle, et ceci sans avoir recours à la chirurgie. L’hypothèse de notre travail est qu’une ventilation mécanique aux réglages inadaptés est responsable d’une inflammation rénale. Notre objectif est de montrer que des réglages inadaptés du respirateur vont être responsable d’une augmentation importante de l’inflammation rénale.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme Notre étude pourrait décrire comment la ventilation artificielle vient impacter le fonctionnement rénal normal. Elle est l’étape primordiale pour le développement de nouveaux réglages du respirateur visant à protéger les reins des effets délétères de la ventilation artificielle. Bénéfices à long terme Il existe une réelle applicabilité clinique et de recherche des outils utilisés dans le projet, l’IRM étant disponible dans la grande majorité des centres hospitaliers. En effet, dans le cas où notre étude serait positive, nous voudrions mener une étude chez l’homme dans laquelle nous étudierons les effets sur les reins de différents réglages du respirateur. De plus, la crise sanitaire COVID-19 a mis en avant le besoin urgent de faire progresser et d’accélérer les connaissances sur la ventilation artificielle et les troubles respiratoires graves. Ceci est d’autant plus vrai que l’infection sévère au COVID-19 se complique fréquemment d’un dysfonctionnement des deux reins. Nous devons donc mettre tout en œuvre pour que les facteurs réversibles, incluant les effets délétères induits par le respirateur, soient absolument maîtrisés afin de limiter au maximum ces complications graves.
Procédures
Préparation de l’animal En début d’expérience, une injection dans le muscle des médicaments sédatifs et anti-douleur est réalisée, à l’aide d’une méthode qui permet de ne pas avoir à maintenir l’animal. Au décours de cette injection, l’animal s’endort en moins de 10 minutes. Anesthésie générale Une fois cette injection réalisée et efficace, l’animal est équipé d’une perfusion au niveau de l’oreille. Celle-ci permet de débuter l’anesthésie générale. L’efficacité de celle-ci est immédiate. L’anesthésie générale est maintenue en continue jusqu’à la fin du protocole et la mise à mort de l’animal. Conditionnement de réanimation Une fois sous anesthésie générale, nous réalisons une trachéotomie chirurgicale (ce qui consiste à faire un trou dans la trachée) pour connecter l’animal au respirateur artificiel. Ensuite, nous mettons en place des perfusions dans les artères et veines du cou pour injecter les médicaments et faire les prises de sang, ainsi qu’une sonde dans la vessie pour recueillir les urines. Cette étape dure 60 minutes. Stratégies expérimentales Notre étude évalue l’impact sur les reins de 4 stratégies de ventilation sur poumons sains ou malades détaillé ci-dessous. Ventilation artificielle La ventilation artificielle avec réglages inadaptés (groupe haut volume insufflée, groupe haute pression) est réalisée sous couvert de l’anesthésie générale et n’entraine aucune souffrance à l’animal. Ces stratégies sont appliquées pendant 24 heures. Un des groupes d’animaux reçoit une ventilation conventionnelle, c’est-à-dire avec des réglages similaires à ceux utilisés chez l’homme (groupe contrôle). SDRA expérimental Un groupe d’animal reçoit une instillation dans la trachée d’acide chlorhydrique afin de générer une maladie respiratoire sévère. Ce modèle mime l’inhalation dans les poumons de liquide gastrique acide, qui est une cause fréquente d’admission en réanimation. Ce modèle induit une chute du niveau sanguin d’oxygène. Les animaux de ce groupe ont les mêmes réglages du respirateur que les animaux contrôle. L’induction du modèle est aussi réalisée sous anesthésie générale. Imagerie IRM-TEP Au bout de 24h d’application des stratégies expérimentales, une série d’imagerie médicale IRM-TEP est réalisé chez l’animal, toujours sous anesthésie générale. Cette étape dure environ 2h.
Impact sur les animaux
La première étape du protocole consiste à placer l’animal dans un état de sommeil profond (inconscience de l’animal et maintien de sa respiration sans assistance) à l’aide d’une prémédication. La prémédication est réalisée par l’injection intra-musculaire d’un mélange médicamenteux sans contention de l’animal. La nuisance provient de la piqûre, ainsi que la douleur générée par l’injection du mélange. C’est la seule procédure réalisée alors que l’animal est éveillé. La prémédication permet ensuite la mise en place d’un cathéter dans une veine périphérique du pavillon de l’oreille après administration de la prémédication sédative. Elle peut être responsable d’un saignement facilement contrôlable par une compression veineuse de 10 min. A partir de cette étape, l’animal est maintenu sous anesthésie générale profonde, et ceci jusqu’à sa mise à mort. Les stratégies expérimentales sont testées sous anesthésie générale continue et peuvent se compliquer d’effets indésirables connus en lien avec la ventilation mécanique. Ces complications peuvent mener au décès de l’animal avant la fin du protocole. A aucun moment, l’animal n’est réveillé après l’induction de l’anesthésie générale, et ceci jusqu’à sa mise à mort à la fin du protocole.
Devenir
La mise à mort des animaux en fin de protocole est rendue obligatoire par la nécessité d’évaluer l’atteinte rénale et pulmonaire au microscope. En effet, l’objectif de notre étude est de démontrer les mécanismes responsables de la dysfonction rénale lors de stratégies de ventilation artificielle avec réglages inadaptés, mais aussi d’évaluer comment ceux-ci peuvent être identifiés de façon non-invasive ou in vivo. La preuve de performance de ces techniques d’imagerie ne peut être fait que par leur confrontation à l’atteinte constatées sur l’organe directement visualisé au microscope. De plus, les différentes interventions réalisées durant la procédure ne permettraient pas de réveiller l’animal en fin de procédure car les lésions pulmonaires induites par la ventilation aux réglages inadéquats ou le modèle de SDRA expérimental sont responsables de dégâts pulmonaires irréversibles et très probablement incompatible avec une respiration sans assistance artificielle.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants permet de reproduire expérimentalement de façon crédible les atteintes respiratoires sévères observées chez l’homme. Le porc est un modèle dont la morphométrie permet l’utilisation de la même technique de ventilation (respirateur artificiel) et les mêmes techniques d’imagerie (IRM-TEP) que chez l’homme. Les alternatives non animales comme l’utilisation d’organoïdes, d’organ-on- a-chip, ou cultures cellulaires ne sont pas retenues car elles ne permettent l’évaluation des interactions inter-organes que nous cherchons à démontrer dans ce protocole.
Réduction
Dans un précédent travail, nous avions montré un doublement significatif de l’inflammation pulmonaire après 4 heures de ventilation aux réglages délétères chez 6 animaux. D’autres auteurs ont observé un doublement de l’expression d’une protéine-cible de l’inflammation dans les reins de porcs soumis à un modèle de dysfonction rénale Sur la base de l’hypothèse que 24h de ventilation à haut volume insufflée induira un doublement de l’inflammation rénale, il faudra 6 animaux par groupe, soit 24 animaux au total. Ce nombre est augmenté de 20% afin de prendre en compte la mortalité attendue, soit un nombre total d’animaux nécessaire de 30.
Raffinement
Les porcs sont prémédiqués par une injection intra musculaire de sédatifs et d’antalgiques, elle se fait sans contention physique en utilisant un prolongateur préconnecté au trocart. Son efficacité est confirmée par la persistance d’une ventilation spontanée, et un animal qui se laisse manipuler sans contrainte physique. Cette prémédication permet la pose de la voie veineuse périphérique. L’anesthésie générale est débutée et maintenue par voie intraveineuse durant toute la durée de la procédure et jusqu’à la mise à mort de l’animal. Elle associe un médicament sédatif (propofol) et un antalgique (fentanyl) puissants. L’efficacité de celle-ci est immédiate et son efficacité est évalué avant paralysie chimique. L’anesthésie général est réévaluée en cas d’efficacité insuffisante, en augmentant sa dose. L’ensemble du conditionnement et des procédures expérimentales est réalisé sous anesthésie générale. La trachéotomie est préférée à une intubation orotrachéale car elle permet d’avoir une occlusion complète de la filière trachéale requise pour éviter les fuites autour du ballonnet. L’initiation de la paralysie chimique (curarisation) est réalisée à la fin du conditionnement, après un période de stabilisation de 30 minutes durant laquelle la qualité de l’anesthésie générale a été confirmée. La curarisation est rendue obligatoire car elle représente le standard de soin chez les patients atteints de SDRA. Une variation de plus de 20% de la tension artérielle, de la fréquence cardiaque et de la température permet la détection d’un défaut de sédation-analgésie sous curares. Une réinjection de sédation-analgésie et une augmentation de la dose continue sont alors administrés le cas échéant.
Choix des espèces
Le porc est un modèle dont la morphométrie permet l’utilisation de la même technique de ventilation (respirateur artificiel) et les mêmes techniques d’imagerie (IRM-TEP) que chez l’homme. Porc mâle ou femelle (proportion 50/50) : le modèle expérimental de ventilation mécanique et de SDRA vise à reproduire l’épidémiologie habituelle observée chez l’humain en réanimation (soit une proportion de femmes de 40%). Stade de développement : 12-14 semaines (30±2 kg). Le stade de développement des animaux correspond à une maturation pulmonaire proche de celle du proc adulte. La taille et le poids des animaux sont compatibles avec une manutention aisée lors des expériences, et est adapté au champ de vue de la caméra IRM-TEP utilisée.