Procédures sans réveil
Contrôle optique de l’activité cardiaque à l’aide de l’implantation d’un stimulateur optique dans un modèle de rat.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
90 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Ils subissent une thoracotomie et l'implantation d'un dispositif optique sur le cœur, avec injection de peptides photosensibles, avant d'être tués par une dose létale d'anesthésique. Le projet cherche à démontrer la possibilité de contrôler par la lumière l'activité électrique cardiaque chez un animal vigile. Le porteur affirme que seule l'expérimentation animale peut établir l'intérêt clinique de cette approche, un criblage in vitro ayant précédé la sélection des peptides.
Objectifs
Les troubles du rythme cardiaque d’origine génétique, médicamenteuse ou bien secondaires à une pathologie cardiaque ischémique conduisent dans de nombreux cas à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Les approches thérapeutiques actuelles requirent l’implantation d’un défibrillateur automatique ou bien l’utilisation de molécules anti-arythmiques dont la fenêtre thérapeutique est étroite en raison des effets secondaires associés à ces molécules. L'objectif de ce projet est de démontrer la possibilité de contrôler optiquement l’activité électrique cardiaque dans un modèle de rat vigile préalablement implanté d’un dispositif optique permettant l’activation de peptides photo-sensibles injectés sous forme inactive. L’illumination à 365-405 nm de la zone sur laquelle est implanté le dispositif permet un clivage du groupement protecteur et l’activation du peptide uniquement dans les zones illuminées. Les peptides utilisés dans ce projet ont été sélectionnés in vitro et ex vivo pour leurs effets sur des cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors d’études précédentes. Ainsi, par cette approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque, il sera possible de cibler les zones arythmogènes du cœur dans des modèles murins arythmiques ou bien chez le gros animal afin de proposer une nouvelle approche dans la prise en charge des arythmies.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre : 1. de faire la preuve de concept du contrôle optique, chez un animal vigile, de l’activité de composés ciblant les canaux ioniques présents dans le cœur et impliqués dans la génération des arythmies cardiaques, et 2. de contrôler, chez un animal vigile, la survenue d’arythmies cardiaques en s’affranchissant des effets secondaires dans les zones du cœur non ciblées, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
La totalité des animaux sera soumise à une thoracotomie et un enregistrement de l'activité électrique cardiaque. Le temps total de l’intervention sera inférieur à 45 min. Après pose de l'implant, des prélèvements sanguins seront réalisés afin de s'assurer de la bonne santé de l'animal et des composés activiés par la lumière seront injectés par voie veineuse.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale mise en œuvre lors de ce projet nécessite la mise en place d’une mini-thoracotomie. La gestion peropératoire de la douleur doit empêcher la survenue d’effets indésirables. Une étude précédente a démontré chez le rat l’absence d’effets indésirables de l’injection d’un peptide protégés similaires à ceux utilisés dans cette étude.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux sont euthanasiés par injection de dose léthale d'anesthésique après sédation en raison de l'efficacité de l'approche et de la non utilisationdes tissus par la suite.
Remplacement
Cette étude requiert une exploration fonctionnelle afin de valider in vivo une approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si l’approche testée présente un intérêt clinique en limitant la survenue d’arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur les cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé in vitro sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.
Réduction
Un maximum de 90 rats seront utilisés dans cette étude. La première étude visant l’adaptation à nos conditions d’un modèle déjà décrit et validé vise à raffiner le modèle et les conditions expérimentales. La mise en place rapide du modèle par des utilisateurs expérimentés permettra de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une puissance suffisante pour les analyses statistiques lors de la seconde étude. Au fur et à mesure de l'inclusion des données, des analyses statistiques seront réalisées. Si une différence statistiquement significative entre les conditions « sans activation » et « avec activation » des composés apparait (une valeur de p
Raffinement
Avant la procédure, les rats seront hébergés par couple en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids pendant à minima 2 semaines. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie (sevoflurane) avec une prise en charge analgésique adaptée. Les peptides à tester, sous leur forme protégée, ayant été sélectionnés pour leur absence d’activité sur leurs cibles, nous n'anticipons pas de douleur ou d'effets indésirables suite à leur injection. Toutefois, si l'un des peptides devait entrainer des effets indésirables détectables comme des difficultés respiratoires ou des convulsions, l'examen serait interrompu et le rat euthanasié. Au cours de la chirurgie, un saignement abondant non maitrisable, une perforation pulmonaire non resolvable conduirait à une euthanasie de celui-ci. Ce projet se base sur l’utilisation de points limites gradés, précis et adaptés. Leur application se fera en lien avec la SBEA à l’aide d’un arbre décisionnel visant à l’arrêt des souffrances.
Choix des espèces
Le rat constitue un bon modèle pour l’étude des arythmies cardiaques et de part la taille du cœur, offre une approche plus aisée que la souris pour le contrôle optique et localisé de l’activation des composés injectés. L'étude sera réalisée sur des rats adultes de 10 semaines pour faciliter les abords chirurgicaux et en raison de la taille de l’implant.
Impact des polluants atmosphériques sur le phénotype évolutif du syndrome de détresse respiratoire aiguë
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
9 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à sévère. Elles reçoivent des instillations intranasales et trachéales de polluants atmosphériques et de LPS, provoquant une inflammation pulmonaire aiguë qui peut entraîner perte de poids, léthargie et fermeture des yeux, les souris atteignant 20 % de perte de poids étant mises à mort. Le projet vise à montrer l'impact des polluants sur la défaillance respiratoire aiguë. Le porteur indique qu'une partie des expériences se fait in vitro ou in silico, mais conclut au recours à la souris pour reproduire la maladie.
Objectifs
Les défaillances respiratoires aiguës inflammatoire sont une cause fréquente d'admission en réanimation. Il s'agit d'affections graves, responsables de nombreuses complications et d'un risque de décès élevé. L'exposition aux polluants atmosphériques fait partie des facteurs aggravants pouver expliquer l'évolution défavorable retrouvée chez certains patients atteints de défaillances respiratoires. Néanmoins, cette relation de cause à effet reste peu étudiée et mal comprise à ce jour. Le but de ce projet est donc d'explorer le rôle de l’exposition aux polluants atmosphériques sur l’évolution de la défaillance respiratoire aiguë inflammatoire.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est démontrer l’impact défavorable des polluants atmosphériques sur l'évolution des patients atteints de défaillance respiratoire aiguë inflammatoire. Si l’hypothèse de notre projet était confirmée, il s’agirait d’un argument supplémentaire en faveur de la réduction des polluants atmosphériques dans l’environnement. Ces données permettraient d'étayer l'argumentaire scientifique supportant les politiques de santé publique visant à réduire l'exposition aux polluants atmosphériques. Ce projet vise en outre à comprendre les mécanismes par lesquels les polluants atmosphériques sont susceptibles d'impacter l'évolution des patients de réanimation souffrant de défaillance respiratoire aiguë inflammatoire. Ceci devrait permettre d'identifier des cibles thérapeutiques visant à réduire le risque de décès chez ces patients.
Procédures
1. Instillation intranasale de PBS / PUF / NP-B[a]P / DEP : • 1 procédure / animal • Durée : 1 minute. 2. Instillation trachéale de PBS / LPS : • 1 procédure / animal • Durée : 1 minute. 3. Mesures de compliance pulmonaire par Flexivent : • 1 procédure / animal concerné • Durée : 3 minutes
Impact sur les animaux
L’inflammation aiguë pulmonaire peut entraîner, selon son intensité, une détérioration plus ou moins rapide de l'état clinique général de la souris qui se manifeste par une perte de poids, une réduction de la mobilité, une catarrhe oculaire, une fermeture des yeux et un poil hirsute.
Devenir
Les procédures expérimentales nécessitent la collecte d’échantillons biologiques (lavages broncho-alvéolaire, poumons), ou la réalisation de mesures invasives de la fonction respiratoire rendant nécessaire la mise à mort des animaux.
Remplacement
Une partie des expérimentations visant à comprendre l’effet des polluants atmosphériques sur l’évolution de la défaillance respiratoire aiguë inflammatoire sont réalisées sur cellules cultivées en laboratoire (in vitro) ou par méthode bioinformatique (in silico), permettant de remplacer certaines expérimentations animales
Réduction
Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum nécessaire afin de mettre statistiquement en évidence les effets des polluants atmosphériques.
Raffinement
Afin de réduire stress et souffrance, un enrichissement de l’environnement est pratiqué dans notre animalerie (maison rouge dans toutes les cages, possibilité de rajouter des lanières de papier). De plus, une surveillance régulière (journalière ou bi-hebdomadaire en fonction des protocoles) des animaux est effectuée, et la mise à mort par injection létale de pentobarbital réalisée en cas de souffrance identifiée par des caractéristiques telles que : prostration, poils hirsute, perte de poids (égale ou supérieure à 20% du poids initial). Toute administration par voie intranasale ou intratrachéale sera précédée par l’administration d’un anesthésique/analgésique.
Choix des espèces
Les modèles animaux souris reproduisent les différents paramètres observés au cours de la défaillance respiratoire aiguë inflammatoire. En outre des souches de souris génétiquement modifiées existent, permettant d’identifier les molécules ou cellules impliquées dans le développement de cette pathologie.
Etude par imagerie d’un marqueur de neuroinflammation dans un modèle de trisomie 21 chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Souris transgéniques modèles de trisomie 21 et témoins, elles reçoivent un cathéter dans la veine caudale sous anesthésie puis une heure d'imagerie TEP avec traceur radioactif, avant d'être tuées 48 heures plus tard pour prélever le cerveau. Le porteur cherche à valider cette méthode d'imagerie de la neuroinflammation dans ce modèle. Il affirme qu'il est indispensable de tester les composés dans un organisme vivant entier et qu'aucune méthode alternative ne peut s'y substituer.
Objectifs
L'objectif est de développer une nouvelle stratégie thérapeutique pour la trisomie 21 basée sur des nouveaux composés capables d'agir sur l'inflammation du cerveau. Dans une 1ère étape, les propriétés anti-inflammatoires de ces nouveaux composés ont été évaluées par différents tests in vitro, permettant de sélectionner les plus performants. A ce stade, les études alternatives (in-silico/ in-vitro/ex-vivo) ne permettent plus de répondre à l'objectif puisqu'il est indispensable de tester les composés dans un organisme vivant entier (barrière hématoencéphalique, environnemement vasculaire métabolisme hépatique etc) mimant la maladie. Les composés sélectionnés ont été évalués chez l'animal afin de confirmer (ou non) leurs effets bénéfiques ainsi que le schéma expérimental optimal (dose, administration, etc) par l'un des partenaires du projet, dans un modèle animal de trisomie 21 (souris transgénique). Les modalités mises au point précédemment seront utilisées dans le même modèle animal dans notre laboratoire. Nous disposons d'une méthode d'imagerie in vivo chez l'animal qui permet de quantifier l'inflammation cérébrale à l'aide d'un traceur radioactif utilisé dans différents modèles animaux ainsi que chez l'humain. Ce type d’étude ne peut être substitué par une méthode alternative in vitro car l’objectif final est d’utiliser ces mêmes traceurs en imagerie clinique. Dans la demande présente, nous souhaitons valider la méthode d'imagerie que nous avons prévue dans ce modèle animal de trisomie 21, ce qui n'a jamais été réalisé jusqu'à présent. C'est pourquoi notre demande porte sur l'exploration par imagerie d'un groupe d'animaux transgéniques ("Tg", porteur de la trisomie 21) comparé à un groupe de souris témoins ("wildtype",WT, non porteur de la trisomie 21), afin de vérifier que notre méthode permet bien de mesurer l'inflammation cérébrale des animaux "trisomie 21". Cette étape permettra d'évoluer vers un protocole de traitement avec les composés sélectionnés, protocole pour lequel nous ferons une nouvelle demande d'autorisation. Cette neuroinflammation sera explorée par imagerie in vivo en TEP (tomographie par emission de positons), avec une méthode parfaitement maîtrisée au laboratoire.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats du présent projet permettront d’établir le schéma expérimental qui sera utilisé dans la suite du programme ANR : dose de traitement(s), durée, délai entre traitement et imagerie. A plus long terme, le bénéfice attendu est de progresser dans la mise eu point d’un nouveau traitement pour la trisomie 21.
Procédures
Cette procédure durera environ 1h10, elle sera réalisée une seule fois sur l’animal sous anesthésie générale. Les animaux seront soumis à la mise en place d’un cathéter à la veine caudale sous anesthésie générale, la durée est de 10 min. Les souris seront ensuite imagées pendant 60 min. Pour la mise au point du geste technique, l'expérimentateur aura 3 essais pour la veine caudale de l'animal . La souris sera anesthésiée, , une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant le geste technique. La durée du geste sera d'une durée max de 15 min.
Impact sur les animaux
Le stress est minimisé par l’implication d’un personnel qualifié pour l’expérimentation animale. Les souris sont facilement stréssées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à être sortis de leur cage et à être manipulés en préhension. Les nuisances ou effets indésirables de la procédure 1 peuvent-être des hématomes suite à la l'introduction du cathéter dans la veine de la queue et un stress suite à la préhension et les bruits ambiants de la salle d'expérimentation. Les animaux seront habitués pendant la phase d'acclimation à la salle de l'imageur. Durant l'expérimentation la respiration, la température et le poids seront mesurés. Les souris seront observées deux fois par jour par la personne en charge de l’étude.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux sont réveillés et surveillés. A la suite de la décroissance radioactive (48h ), les souris seront mis à mort. En effet, il est indispensable de prélever les cerveaux 48h après l'imagerie afin de confirmer les résultats obtenus en imagerie avec des mesures ex-vivo ( immunohistochimie et autoradiographie).
Remplacement
A ce jour aucune expérience de ce type n'a été réalisée dans l'espèce humaine. Ce type d’étude ne peut être substitué par une méthode alternative in vitro ou sur cellules. Le recours à l'expérimentation animale est donc nécessaire, et cela d'autant plus que les études alternatives (in-silico/ in-vitro/ex-vivo) ne permettent plus de répondre à l'objectif puisqu'il est indispensable de tester les composés dans un organisme vivant entier (barrière hématoencéphalique, environnemement vasculaire métabolisme hépatique etc) mimant la maladie de la trisomie 21.
Réduction
L’utilisation de méthode d’imagerie au cours de ce protocole va permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé qui est néanmmoins dicté par les groupes expérimentaux réquis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée (degré de neuroinflammation). De plus, les animaux pourront être suivis par imagerie de manière longitudinale dans les prochaines étapes du projet, afin d’évaluer au mieux les nouveaux traitements en utilisant un nombre réduit d’individu.
Raffinement
Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à la salle d’expérimention pour diminuer leur stress. Ils seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les souris seront observées une à 2 fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle. Les animaux seront anesthésiés à 4% dans une cuve d’induction. Lors de l’imagerie les animaux seront maintenus à 2%. Une protection occulaire sera apliquée lors de l’installation du cathéter à la veine caudale. Nous appliquerons également une crème anesthésiante sur la queue de l’animal. L’animal sera maintenu durant toute l’expérimentation sur un tapis chauffant. Nous assurerons une surveillance accrue du rythme respiratoire et de la température corporelle de l’animal. En cas de detresse respiratoire, l'anesthesie est arrêtée et l'animal réveillé. Si l'animal est en hypothermie, nous procéderons à une augmentation de la température du lit thermorégulé de l'imageur. Si malgré ces actions, l'état général de l'animal ne s'améliore pas, nous arrêterons l'expérimentation.
Choix des espèces
La souris Tg Dp1Yey est actuellement le meilleur modèle animal de trisomie 21. De plus, la taille du cerveau de la souris est compatible avec la sensibilité et la résolution spatiale de la caméra microTEP (environ 1 mm). Adulte afin d'avoir une taille de cerveau compatible avec la technique d'imagerie utilisée dans ce protocole.
Evaluation de la performance et de la sécurité de nouveaux instruments de scellement et de coupe électrochirurgicaux
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
130 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie opérée puis tuée sans réveil. Sous anesthésie, chaque porc subit une à trois heures de chirurgie pendant laquelle 22 à 35 vaisseaux sont scellés par électrocoagulation, ou 6 à 7 avec résection d'organes et un mois de convalescence, pour valider de nouveaux instruments d'électrochirurgie. Le porteur signale des hémorragies et des infections postopératoires. Il affirme avoir écarté les tissus ex vivo et les vaisseaux synthétiques, jugés non représentatifs, avant de conclure au recours nécessaire à l'animal.
Objectifs
Le projet vise à développer et valider pour l’utilisation clinique de nouveaux dispositifs médicaux d’électrochirurgie qui permettent la division, l’hémostase, le scellement et la coupe de vaisseaux/tissus lors d’une dissection chirurgicale. Ces instruments de chirurgie sont requis pour permettre la coagulation et la coupe des vaisseaux sanguins pendant une opération. Ils sont applicables en chirurgie générale et dans les spécialités telles que la chirurgie urologique, vasculaire, thoracique, thoracoscopique, colorectale, bariatrique ou gynécologique. La qualité de l’hémostase sera évaluée par des tests de pression d'éclatement et des analyses de guérison tissulaire en histopathologie. Les améliorations de performance attendues sont centrées sur la diminution des saignements peropératoire en assurant : • La réduction de la durée de la procédure chirurgicale • L’amélioration de la qualité du scellement et la capacité à contrôler les saignements. • La précision de la zone d'application et la maitrise de la propagation thermique. • La réduction des dommages tissulaires involontaires
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est d’améliorer la sécurité, l’efficacité et le confort de nombreux de gestes chirurgicaux, quand la qualité de l’hémostase est un facteur clé dans la réussite de l’opération. Ces instruments d’electrochirurgie permettront de : - faciliter les procédures laparoscopiques et ouvertes - éviter les gestes fastidieux de sutures - diminuer les saignements intra-opératoires - réduire les complications post-opératoires liées au saignement - améliorer les résultats de la chirurgie et la récupération des patients
Procédures
Les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui dure entre 1 et 3 heures. L’opération consiste en la réalisation de scellements vasculaires par électrocoagulation sur 22 à 35 artères ou veines pour les animaux sans réveil, et sur 6 à 7 vaisseaux (impliquant la résection d’organes non vitaux) pour les animaux avec survie qui seront surveillés pendant une période de convalescence d'un mois.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les animaux sont les saignements (hémorragie per opératoire) pour les animaux sans réveil, auxquels se rajoutent les saignements post opératoires et l’infection pour les animaux en chronique.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin de la procédure. Des prélèvements post mortem sont nécessaires pour analyser les effets des dispositifs testés.
Remplacement
Avant de débuter ce projet, toutes les alternatives ont été étudiées et prises en comptes. Des tests sur des tissus ex-vivo ont permis de démontrer qu’ils ne présentent pas le même comportement que des tissus vivants face à l’électrocoagulation.: Lors d'une chirurgie, les scellements sont créés dans des conditions physiologiques (température, présence de sang circulant dans le vaisseau, physiologie de l’hémostase, ergonomie…) qui peuvent impacter l’efficacité de la coagulation et les cycles de coupe. Les mêmes tissus retirés de leur hôte pendant plus de 4 à 8 heures ne se comportent plus de la même façon pour les tests de pression d'éclatement. Nous avons étudié des vaisseaux sanguins synthétiques ou artificiels conçus pour imiter les propriétés mécaniques des vaisseaux sanguins mais nous avons constaté qu'ils ne convenaient pas à cette application, car ils réagissent différemment à l’électricité qui doit circuler dans le corps. A ce stade de développement des dispositifs, il devient nécessaire d’avoir recours au modèle animal pour les tests d’efficacité et de sécurité à court et long terme.
Réduction
L’échantillonnage requis a été défini par analyse statistique, nous estimons à 130 l’effectif animal maximal nécessaire pour valider réglementairement 4 nouveaux dispositifs médicaux d'électrocoagulation et pour former et obtenir l'évaluation de chirurgiens spécialistes sur leur utilisation. Le dispositif de référence pourra être utilisé en contrôle sur les mêmes animaux et plusieurs scellements seront réalisés sur un même sujet afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les porcs sont hébergés en groupe sociaux dans de larges box enrichis de jeux à macher et de balles, ils sont douchés quotidiennement à l’eau tiède et reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques. Les conditions d’ambiances sont contrôlées et la température est maintenue entre 18 et 24°C. Une période d’acclimatation leur permet de s’habituer à leur environnement et au personnel soignant qui met en place un programme de familiarisation basé sur la distribution de récompenses. Le jour de l’intervention, les porcs sont tranquillisés avant d’être transportés dans la salle d’opération, ils sont maintenus sous anesthésie générale avec gestion de la douleur pendant toute l'opération. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil, ils sont remis en groupe social dès que leur état clinique le permet (cicatrisation des sutures). Une videosurveillance permet un suivi des comportements et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie, des points limites ont été définis pour arreter la procédure en cas de souffrance.
Choix des espèces
Parmi les différentes espèces animales, le porc est l’espèce de choix pour les approches abdominales et les études réglementaires de ce type en raison des similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme : Sa taille et son anatomie viscérale (espèce omnivore monogastrique) permet de reproduire des procédures avec les mêmes instruments, en chirurgie ouverte ou laparoscopique (technique coelioscopique qui consiste à opérer via de mini-incisions pour passer les instruments et une caméra). Les porcs seront utilisés entre 2 à 5 mois d’âge, lorsqu’ils auront atteint un poids de 35 à 65 kg afin d’avoir un nombre suffisant de vaisseaux sanguins compris entre 2 et 7mm de diamètre.
Formation continue en chirurgie digestive et gynécologique sur modèle porcin
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
150 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque porc subit plusieurs interventions abdominales successives, digestives et gynécologiques, réalisées par quatre à cinq chirurgiens durant six à sept heures, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des praticiens en exercice. Le porteur reconnaît que le traumatisme des viscères ne permet pas la survie de l'animal et décrit ces séances comme une offre de formation et une offre de prestation commerciale. Il indique que le remplacement n'est pas toujours possible, tout en signalant l'acquisition récente d'un simulateur de laparoscopie.
Objectifs
Les techniques chirurgicales évoluent constamment d’où la nécessité de suivre des formations continues afin de maintenir un niveau de connaissance satisfaisant pour opérer des patients humains (ou animaux s’agissant le cas échéant de chirurgiens vétérinaires) et assurer une médecine de qualité actualisée. Il s’agit de formation « à façon », conçues en fonction des besoins pédagogiques et d’entrainement chirurgical nécessaires à l’acquisition ou à la maitrise de nouvelles techniques chirurgicales. Elles peuvent faire partie de l’offre de formation continue pour les formations à destination des vétérinaires, ou bien de l’offre de prestation à destination de chirurgiens de médecine humaine. Dans tous les cas, elles sont validées par la direction de l’établissement, et les structures de bien-être animal concernées.
Bénéfices attendus
L'intérêt de ce projet réside dans l’offre de formation avec des approches chirurgicales innovantes en gynécologie et gastro-entérologie dans le but d’offrir un niveau d’expertise à des praticiens en exercice.
Procédures
Procédures chirurgicales intraabdominales (digestives et/ou gynécologiques: gastropexie, chirurgie bariatrique, anastomoses coliques, ovariohystérectomie). Les animaux sont anesthésiés en début de journée et euthanasiés à l'issue de la formation. Les procédures chirurgicales se succèdent ainsi que les équipes de chirurgiens en formation (8 heures d'anesthésie environ donc 6-7 heures de procédures chirurgicales)
Impact sur les animaux
En raison du contexte de l'apprentissage, chaque cochon subit plusieurs interventions intra-abdominales. Les complications rencontrées sont la douleur (gérée par un protocole d'analgésie multimodale), les risques de saignements (administration d'une fluidothérapie intra-veineuse au débit ajusté en fonction du besoin), anesthésie prolongée (surveillance et soutien des fonctions respiratoire et cardiovasculaire), lésion du nerf vague (entrainant le plus souvent une bradycardie prononcée jusqu'à l'arret cardiaque (prétraitemet avec atropine pour diminuer l'occurence et la grivité de la bradycardie), traumatisme des viscères abdominaux suite aux interventions (motivant l'euthanasie en fin de journée de formation).
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin des procédures chirurgicales. Pour des raisons de réduction, chaque animal subit l'ensemble des procédures chirurgicales prévues par le programme de formation, lesquelles sont réalisés par un groupe de 4 à 5 chirurgiens par animal. Il a été choisi d'utiliser au maximum chaque animal plutôt que de répartir l'ensemble des procédures sur plusieurs animaux. Cela justifie l'euthanasie en fin de procédure, l'issue des interventions ne permettant pas la survie de l'animal. Les chirurgiens pratiquent ainsi en fin d'intervention une autopsie pour visualiser directment le résultats des interventions réalisées.
Remplacement
Pour les besoins de formation à certaines techniques spécifiques le remplacement des animaux n’est pas toujours possible (néanmoins, l'établissement s’est récemment doté d’un simulateur de laparoscopie LapSim®)
Réduction
Le nombre d’animaux est fixé au minimum afin de permettre aux stagiaires de mettre en pratique les gestes enseignés (4 à 5 chirurgiens par animal). La formation inclut un apport de connaissance théorique en premier et puis la pratique sur simulateur en amont de l'intervention sur animal vivant. La manipulation des instruments est ainsi maîtrisée quand l'intervnetion est réalisée sur l'animal ce qui permet de réduire les manipulations des viscères en nombre mais aussi en qualité (moins traumatisantes du fait de gestes mieux contrôlés).
Raffinement
Afin de réduire le stress, les animaux arrivent à l’animalerie adaptée la veille de la session prévue. Les animaux reçoivent une ration identique à celle fournie par le fournisseur d’animaux, avec de l’eau à volonté (pipette et abreuvoir au choix de l'animal). Les procédures de préparation, d’induction de l’anesthésie, de mise en place de l’analgésie répondent aux exigences de l’analgésie multimodale pré-emptive et sont confiées à des vétérinaires anesthésistes/réanimateurs qualifiés. Une attention identique est portée au suivi des animaux pendant la phase opératoire grâce à l’ensemble des moyens de monitorage déployés pendant les interventions chirurgicales.
Choix des espèces
Le choix des porcs est fondé sur plusieurs critères : - Animaux de grande taille (30-45 kg), aspect anatomique proche de l’homme; - La taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie
Etude d’un réseau nociceptif dans un modèle de souris de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
526 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'au sévère. Rendues parkinsoniennes, elles subissent une ou deux neurochirurgies et des tests comportementaux évaluant leurs capacités motrices et sensorielles, l'état pathologique affectant leur capacité à se nourrir et s'hydrater et provoquant une perte de poids. Le porteur indique vouloir comprendre les mécanismes cérébraux des douleurs de la maladie de Parkinson, dont les retombées thérapeutiques sont présentées comme une première étape. Il affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier ces transmissions de signaux sur animal vivant.
Objectifs
La maladie de Parkinson est classiquement associée à des symptômes moteurs, cependant il est maintenant reconnu que de nombreux symptômes non moteurs, incluant des douleurs chroniques, sont très communs. Ces douleurs dans la maladie de Parkinson suggèrent que les circuits cérébraux permettant de percevoir et traiter les informations douloureuses pourraient être dysfonctionnels. Cependant, il n’y a à ce jour aucune hypothèse permettant de les expliquer car ces réseaux n’ont jamais été étudiés, limitant ainsi les stratégies thérapeutiques permettant de les soulager. L’objectif de ce projet est d’étudier l’état fonctionnel d’un de ces réseaux cérébraux dans un modèle de souris parkinsoniennes.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson se caractérise par de nombreux symptômes incluant des douleurs qui ont un fort impact sur la qualité de vie des patients. Nous cherchons à comprendre certains mécanismes dans le cerveau qui induisent leur développement car ce n’est pas connu à l’heure actuelle. Comprendre la physiopathologie de ces symptômes est une première étape essentielle pour pouvoir ensuite développer des stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces.
Procédures
Les souris subissent des neurochirurgies pour une durée de 30 minutes, anesthésie incluse. Les souris peuvent subir une ou deux neurochirurgies. Les souris participeront également à des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités motrice et sensorielle impactées par le modèle de la maladie de Parkinson. La durée de ces tests est de 1 à 30 minutes et se feront durant une semaine, avec un test tous les deux jours.
Impact sur les animaux
Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur affectant l’autonomie des souris à s’hydrater et se nourrir et donc une perte de poids, n'impactant pas leur taux de survie grâce aux soins apportés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer les structures cérébrales d'intérêt. De ce fait, les animaux ne peuvent pas être réutilisés.
Remplacement
Il n'existe aucune alternative expérimentale nous permettant d'éviter l'utilisation d'animaux vivants pour évaluer les transmissions de signaux naturels dans le cerveau tel que dans ce projet ou des stimuli nociceptifs sont appliqués au niveau de la patte du rat. Les études comportementales prévues ne peuvent se faire que sur des animaux vivants.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Des études préliminaires permettent la mise au point des expériences. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.
Raffinement
Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur affectant l’autonomie des souris à s’hydrater et se nourrir et donc une perte de poids. Cependant, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience afin d’intervenir immédiatement et de manière appropriée. Les souris reçoivent des soins et une diète spéciale utilisée tel que le lait sucré concentré en plus de la nourriture enrichie humidifiée mise dans une coupelle en inox directement dans la cage. La cage de réveil est mise sur un tapis chauffant pour augmenter sa température. Afin de prévenir toute douleur post-opératoire supplémentaire pouvant affecter la récupération de l’animal, une injection d'un anti-inflammatoire sera effectuée avant la procédure chirurgicale. Une échelle de cotation de souffrance basée sur des signes indicatifs de gêne ou de douleur sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir les points limites adaptés et les critères d'arrêt de l'expérience.
Choix des espèces
L’utilisation de souris offrent des possibilités de manipulations cellulaires et génétiques plus fines que chez le rat, notre modèle actuel, pour manipuler plus spécifiquement différents sous types cellulaires ou différentes projections neuro-anatomique entre nos structures cérébrales d’intérêts dans ce projet, et étudier leurs conséquences sur l'activité des neurones ou le comportement des souris. Des animaux âgés d'au moins 8 semaines seront utilisés car les systèmes nerveux sont matures à ce stade.
Effets d’une perte auditive sur les centres auditif et activation du système auditif à partir d’une stimulation ultra-sonore
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
310 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont une partie menée sous anesthésie sans réveil et d'autres impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Ils subissent des mesures de potentiels auditifs, l'induction d'une surdité par traumatisme sonore ou substances ototoxiques, et une chirurgie avec électrophysiologie pouvant durer jusqu'à douze heures. Le porteur indique que la surdité chronique s'accompagne de déficits vestibulaires et auditifs, et que la lourdeur de la craniotomie rend improbable la survie des animaux. Il affirme que le cobaye est l'espèce "de choix" en audition et que l'étude in vivo est "indispensable", la restauration de l'audition par ultrasons restant une preuve de concept lointaine.
Objectifs
La perte auditive s’accompagne de deux conséquences majeures. La première est que l’intelligibilité de la parole est altérée. Dans les cas de surdité sévère, l’intelligibilité de la parole est même nulle. La deuxième conséquence d’une perte auditive est un remaniement plastique des centres auditifs, ce dernier pouvant être associé à des perceptions aberrantes, telles que les acouphènes et l’hyperacousie. Le premier but de ce projet est de comprendre plus avant les mécanismes plastiques mis en jeu après une perte auditive et en particulier d’étudier les effets de différentes pertes auditives sur cette plasticité centrale (sur l’activité spontanée corticale, notamment). Le deuxième but de ce projet, qui est étroitement associé au premier, est d’étudier la possibilité de stimuler le système auditif à partir de stimulation ultra-sonore (SUS). Cet aspect du projet vise à confirmer que la SUS peut restaurer l’audition, en excitant directement les neurones du système auditif dans une préparation in-vivo, en court-circuitant la cochlée (qui n’est plus fonctionnelle). En outre, la SUS peut également servir à moduler l’activité neuronale spontanée.
Bénéfices attendus
…. Dans une vision à long-terme, le projet est important dans la mesure où la stimulation ultra-sonore pourrait restaurer l’audition chez des sujets sourds. Il s’agit donc d’une preuve de concept pour cette approche originale. On note ici que la SUS permet théoriquement de stimuler les neurones avec une résolution spatiale beaucoup plus importante que la stimulation électrique. La stimulation électrique est actuellement utilisée dans les implants cochléaires (et les implants du tronc cérébral). Si elle permet de restaurer une intelligibilité de la parole en milieu favorable (non bruité), elle échoue en revanche à donner de bonnes performances en milieu défavorable (bruité). Enfin, en permettant de stimuler directement le système auditif, la SUS permet également de tester directement les propriétés des neurones auditifs centraux, sans passer par la cochlée qui présente une perte auditive, voire qui ne joue plus son rôle de transducteur (surdité profonde). Les SUS offrent donc un moyen pour appréhender directement l’état d’excitabilité des neurones centraux après une perte auditive, autrement dit leurs réponses modifiées après mise en jeu d’une plasticité. En outre, la SUS permet a priori de moduler l’activité des neurones centraux. Cette approche pourrait être utilisée pour réduire ou supprimer l’activité neuronale reliée à l’acouphène et/ou à l’hyperacousie, et ceci de façon non invasive et inoffensive.
Procédures
Les animaux sont soumis à 3 types d’intervention : -potentiels évoqués auditif précoces : durée 30 minute environ -induction d’une surdité par traumatisme auditif ou administration de substances ototoxiques : durée de 1h à 4h - procédure chirurgicale et électrophysiologie : durée maximale pouvant aller jusqu’à 12h
Impact sur les animaux
…. Lors de l’hébergement des animaux à l’animalerie, ils ne subissent aucune nuisance particulière excepté un léger stress possible lors de leur manipulation (limitée au minimum). Lorsque les animaux sont utilisés pour les enregistrements électrophysiologiques corticaux, ils rentrent alors dans une procédure sans réveil et sont anesthésiés de bout en bout du protocole. Les manipulations avec réveil après anesthésie sont 1) le recueil des potentiels évoqués auditifs précoces et 2) la perte auditive chronique par ototoxicité. Le réveil après le recueil des potentiels évoqués auditifs précoces ne posent pas de problème, excepté des effets secondaires toujours possibles de l’anesthésie (déshydratation, détresse respiratoire) mais qui sont très rares. En revanche, les animaux traités par furosémide et kanamycine peuvent montrer plusieurs effets indésirables. Tout d’abord, l’injection intraveineuse par la jugulaire nécessite une chirurgie pour exposer la veine et peut potentiellement entraîner des hémorragies et infections. Deuxièmement, les animaux montrent des problèmes vestibulaires (troubles de l’équilibre, tête penchée, déplacements maladroits) pendant quelques jours après le traitement, qui sont liés à la destruction des cellules sensorielles du système vestibulaire. Ces problèmes sont cependant atténués au bout de 4-5 jours. Ces effets secondaires n’empêchent cependant pas les animaux de se nourrir. Enfin, la perte auditive peut engendrer des acouphènes chez l’animal. A ma connaissance, on ne sait pas si les acouphènes sont un facteur de gêne chez l’animal.
Devenir
Nous devons réaliser une craniotomie, la procédure chirurgicale est relativement lourde et nos expérimentations (électrophysiologie) sont très longues. Il est peu probable que les animaux survivent à ce traitement, et de surcroit sans souffrance. Pour ces raisons, tous les animaux sont mis à mort à la fin des 6 procédures.
Remplacement
Les recherches sur animaux vivants sont indispensables aux types de questions que nous posons. Concernant les effets de la stimulation ultrasonore, ce domaine de recherche est relativement récent et les mécanismes d’excitation peu connus. Il est donc indispensable de « passer » par de l’expérimentation chez l’animal pour comprendre plus avant les mécanismes de cette stimulation et si la stimulation sonore peut restaurer l’audition en cas de surdité. Des tests ont été réalisés en amont du projet (sur tranches de cerveau) pour déterminer les paramètres efficaces de la stimulation ultra-sonore et ainsi épargner des animaux. Concernant notre recherche sur l’effet de pertes auditives sur le système auditif central, nos travaux pourront en revanche « nourrir » les modèles computationnels futurs du cerveau et de ses modifications après une perte auditive de sorte que des vies d’animaux pourront être épargnées.
Réduction
Notre volonté est de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans notre projet est calculé au plus juste, en fonction de notre expérience, des contraintes expérimentales qui sont les nôtres, et des effets attendus, notamment sur l’état d’excitabilité des neurones corticaux après une perte auditive (calcul de puissance à partir des résultats déjà obtenus par notre équipe sur le cobaye). Il est important de noter que nous avons démontré par des expériences in vitro que les neurones du ganglion spiral sont sensibles aux ultrasons. Cela signifie que nous connaissons déjà les paramètres de stimulation nécessaires pour produire des réponses et que donc, moins d’animaux seront utilisés dans des expériences pilotes (pour balayer la gamme des paramètres de stimulation qui peut être conséquente). Après calcul de puissance, notre projet nécessitera 310 animaux au total.
Raffinement
Tout est mis en jeu dans notre projet pour minimiser la souffrance animale avec une utilisation systématique de l’anesthésie, doublée d’une analgésie locale avant chirurgie. Nous insistons sur le fait que toutes nos procédures sont maitrisées depuis plusieurs années et que la souffrance animale est minimisée. Les procédures 1, 2 et 4 sont sans réveil, ce qui minimise énormément les risques que les animaux souffrent (comparés aux préparations chroniques). Les procédures avec réveil sont les procédures 3 et 5 (surdité chronique). Une attention particulière sera donnée à ces animaux qui, comme dit précédemment, montrent des déficits vestibulaires et auditifs. Des aliments hydratés seront placés au fond de la cage et une surveillance quotidienne (2 fois par jour) durant les 5 jours suivant la chirurgie sera opérée. Nous utiliserons une échelle des points limites et engagerons si besoin la réaction adéquate en fonction de la situation.
Choix des espèces
Le cobaye est l’espèce de choix en audition (même si d’autres espèces sont utilisées) pour deux raisons. La première est que l’audition des cobayes (100 Hz – 32 kHz) est globalement déplacée d’une octave vers les hautes fréquences par rapport à l’audition humaine (50 Hz – 16 kHz). L’audition des cobayes est donc relativement proche de l’audition humaine. La deuxième raison est que l’oreille moyenne et en particulier la fenêtre ronde est aisément accessible chez cette espèce, permettant d’accéder facilement à la cochlée pour différentes applications (stimulation électrique ou ultrasonore de la cochlée, enregistrement de l’activité du nerf auditif, administration de substances ototoxiques etc.). En conclusion, pour les raisons listées ci-dessus, un grand nombre de laboratoires en audition dans le monde utilisent le cobaye. Les données disponibles chez cette espèce représentent donc la justification de l’utilisation de cette espèce pour nos recherches. Les animaux sont adultes et pèsent généralement autours de 250-300g à leur arrivée. Nous préférons réaliser nos expériences sur des animaux relativement jeunes mais matures car ils nécessitent moins d’anesthésie et sont donc plus stables lors de l’enregistrement de l’activité cérébrale.
Prélèvement de moelle osseuse chez des veaux pour établissement d’une lignée cellulaire à des fins de culture bactérienne
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
46 veaux non sevrés vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque veau subit un unique prélèvement de moelle osseuse au sternum sous anesthésie générale, d'une durée d'environ vingt minutes, avant d'être mis à mort. Le porteur indique choisir de jeunes veaux car la proportion de cellules souches diminue avec l'âge, et justifie l'anesthésie par le confort de l'animal et des manipulateurs. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative in vitro pour obtenir ces cellules bovines, l'objectif étant à terme d'établir une lignée cellulaire pour s'affranchir de l'animal.
Objectifs
Anaplasma phagocytophilum est une bactérie intracellulaire stricte (se développant dans les cellules), majoritairement transmise par les tiques. En Europe, c'est une bactérie d’importance économique majeure, notamment dans les élevages bovins où elle provoque des avortements. In vivo, cette bactérie infecte une catégorie de globules blancs mais qu'il n'est pas possible de maintenir en culture ou de cultiver sur le long terme. In vitro, les souches humaines et les souches équines et canines peuvent être maintenues en culture au sein de cellules de moelle osseuse immortalisées humaines ou de tiques. En revanche, les souches infectant les ruminants ne peuvent actuellement être cultivées que sur cellules de tiques. Or les cellules de tiques se divisent lentement et supportent mal les techniques de conservation par le froid, ce qui représente un obstacle à leur utilisation pour la culture bactérienne. De plus elles ne permettent pas d’étudier les interactions entre A. phagocytophilum et la cellule hôte des vertébrés. L’absence de lignées de cellules de moelle osseuse bovines limite aussi l’étude des facteurs responsables de la spécificité de souche pour certains hôtes vertébrés. Il est donc nécessaire d'établir une lignée cellulaire immortalisée de moelle osseuse in vitro pour la culture des Anaplasma infectant les bovins. L’utilisation de lignées cellulaires présente de nombreux avantages, elles permettent notamment de s’affranchir de l’obligation de réaliser régulièrement des prélèvements pour renouveler les cultures, ce qui leur confère aussi un intérêt en terme de bien-être animal. Une fois établies, les lignées sont composées d’une population cellulaire homogène permettant une standardisation des conditions de culture et des expérimentations pour une meilleure répétabilité.
Bénéfices attendus
Bénéfices à court terme : Cette étude conduira au développement d’une lignée de cellules permettant la culture des souches bovines d'une bactérie ne poussant que dans des cellules, A. phagocytophilum. Ce projet aboutira au dépôt de la/des lignée(s) cellulaire(s) dans une banque de cellules. Bénéfices à long terme : A plus long terme, comprendre les interactions entre la bactérie et les cellules bovines pour développer des moyens de lutte sanitaire ciblés contre cette bactérie dans les troupeaux de bovins. Ces cellules pourront aussi être utilisées par la communauté scientifique pour réduire certaines expérimentations in vivo dans d’autre domaines (autres agents pathogènes ou études de toxicité par exemple). Les techniques mises en œuvre dans ce projet pourraient aussi être appliquées à d’autres espèces animales pour lesquelles une lignée cellulaire n’est pas encore disponible alors qu'elle pourrait présenter un intérêt pour l’étude des interactions mammifère-A. phagocytophilum ; c'est le cas des cervidés sauvages.
Procédures
Les veaux prévus pour ce projet auront un unique prélèvement de moelle osseuse au sternum sous anesthésie générale et locale. La procédure dure au totale environ 20 min.
Impact sur les animaux
Possibilité de douleur ou stress pour l’animal : La ponction de moelle osseuse est un acte réalisé sur animal sédaté le plus souvent, avec ou sans anesthésie générale en pratique vétérinaire, l’animal étant en box de contention et/ou immobilisé à l’aide de cordes ou en décubitus latéral si le format de l’animal le permet. Par souci de confort et de sécurité pour l’animal et pour les manipulateurs, pour ce projet, la ponction sera réalisée sur animal anesthésié.
Devenir
Les veaux seront mis à mort en fin de procédure pour retour dans le circuit pédagogique.
Remplacement
Actuellement, il n'y a pas de méthode in vitro permettant la culture les souches de ruminants d'Anaplasma phagocytophilum et l'étude des intéractions hôté vertébré - agent pathogène. Le but de ce projet est in fine de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants pour la culture d’A. phagocytophilum et pour l’étude des interactions hôte vertébré – agent pathogène. Le tissu hématopoïétique est très sensible d’une part à l’hypoxie (en cas de mort de l’animal) et aux médicaments, ce qui nous interdit le recours à des cadavres d’animaux tout juste décédés. Notre but est d’obtenir le plus de cellules souches hématopoïétiques possible pour pouvoir attendre de ce projet qu’il soit fructueux.
Réduction
Ce projet nécessite l’optimisation de protocoles utilisés en médecine humaine, en particulier pour les étapes de prélèvement de moelle osseuse, de purification puis de culture des cellules souches hématopoïétiques et enfin d’immortalisation de ces cellules. Chaque animal ne sera prélevé qu’une seule fois et nous estimons que nous aurons recours à un maximum de 46 veaux. La moelle des individus jeunes étant beaucoup plus riche en cellules souches hématopoïétiques que celle des adultes le nombre de veaux impliqués dans cette étude sera plus faible que si ce projet était réalisé avec des animaux adultes. Il est aussi possible que la souffrance occasionnée soit moindre chez les veaux que chez les adultes, les prélèvements étant plus aisés à réaliser. Les personnes impliquées dans les étapes d’isolement des cellules souches hématopoïétiques, leur culture et leur immortalisation vont être formées pour maximiser nos chances de réussite. Une étude préliminaire visant à déterminer si les outils utilisés pour immortaliser les cellules humaines peuvent fonctionner sur des cellules bovines. A chaque étape d’optimisation du protocole, le nombre d’animaux utilisés pour l’étape sera contrôlé. Les prélèvements de bonne qualité après optimisation de l'étape n seront utilisés pour débuter les essais d'optimisation de l'étape n+1.
Raffinement
Les veaux auront un hébergement collectif, par 2, sur copeaux, respectant une alternance jour/nuit (12h/12h). Il seront nourris au seau avec du lait artificiel. Pour réduire au maximum les nuisances au bien-être animal lors des procédures expérimentales, chaque individu ne sera prélevé qu’une seule fois, sous sédation et anesthésie générale. Les animaux seront immobilisés pour éviter leur chute lors de la sédation ou lors de l'anesthésie. Pour prevenir une hypothermie, les animaux seront placés sur tapis chauffant. La totalité de la procédure prendra au maximum 20 minutes incluant environ 5 minutes pour le prélèvement de moelle. Les animaux seront mis à mort immédiatement après le prélèvement. Si pendant l'anesthésie les animaux montrent des signes cliniques d'hémorragie ou de défaillance cardiaque ils seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Il n’y a pas d’alternative à l’utilisation de bovins (Bos taurus) pour l’obtention de cellules souches myéloïdes de cette espèce animale. Les veaux sont des jeunes non-sevrés (1 à 1.5 mois, 40 à 70 kg). Le choix de collecter de la moelle osseuse sur des veaux à ce stade de développement est basé sur deux raisons : - La raison principale a trait au fait que la proportion de cellules souches dans la moelle diminue drastiquement avec la croissance et l’âge des animaux (sur la base des données humaines et vétérinaires disponibles). En effet, au fur et à mesure de la croissance, une partie de la moelle est remplacée par du tissu graisseux, limitant la quantité totale de cellules que l’on pourrait obtenir. Notre but étant d’obtenir un maximum de cellules souches pour les transformer, notre choix s’est porté sur des veaux plutôt que des bovins adultes pour ne pas multiplier les prélèvements chez des animaux adultes tout en maximisant nos chances d’obtenir une grande quantité de cellules souches à transformer. - La seconde raison porte sur l’ossification au cours de la croissance des animaux qui rend inaccessibles, chez les bovins certains sites de prélèvement intéressants pour ce projet, puisque riches en moelle.
Etude chez la souris de l’implication d’une protéine dans les maladies des vaisseaux cérébraux
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles nerveux
560 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil, par exsanguination et perfusion transcardiaque. Le porteur indique recourir à des souris génétiquement modifiées, analysées à différents âges de 10 jours à 12 mois, pour étudier la mort des cellules musculaires des petits vaisseaux cérébraux. Il précise que les lésions cérébrales sont bien tolérées et sans signe clinique, et que la mise à mort par exsanguination, susceptible de s'accompagner de souffrance, se fait sous anesthésie profonde. Il affirme que la manipulation génétique est "indispensable" et qu'aucun modèle in vitro ne peut se substituer, les bénéfices se limitant à l'identification de cibles thérapeutiques.
Objectifs
L'objectif à terme de ce projet est d’élucider les mécanismes moléculaires responsables de la mort des cellules musculaires lisses artérielles dans les maladies des petits vaisseaux cérébraux. Ces maladies sont responsables chez l'homme d'environ un tiers des accidents vasculaires cérébraux et sont une cause majeure de déclin cognitif lié à l'âge. Il n'existe à ce jour aucun traitement spécifique pour ces maladies, une des raisons étant que les mécanismes physiopathogéniques de ces maladies sont encore très mal connus. Un des dénominateurs communs à toutes les maladies des petits vaisseaux cérébraux est la mort des cellules musculaires lisses des artères cérébrales. Ces cellules jouent un rôle clé dans le contrôle de la perfusion cérébrale. De plus, la perte des cellules musculaires lisses des artères cérébrales est impliquée dans la survenue des hémorragies cérébrales. L’analyse protéomique des artères cérébrales de souris et de patients avec la maladie CADASIL a mis en évidence une protéine dont la production est anormale à un stade très précoce de la maladie CADASIL. Les résultats suivants suggèrent que cette protéine pourrait être impliquée dans la mort des cellules musculaires lisses artérielles, non seulement dans la maladie CADASIL, mais aussi dans d’autres formes génétiques ou sporadiques de maladies des vaisseaux cérébraux : 1) cette protéine est produite par les cellules musculaires lisses des artères cérébrales, 2°) l’élimination de cette protéine dans les souris CADASIL permet de prévenir la perte des cellules musculaires lisses artérielles, et 3°) cette protéine est également anormalement produite dans les artères cérébrales d’autres formes génétiques ou multifactorielles de maladies des petits vaisseaux. Les 3 objectifs spécifiques de ce projet sont : 1) d’élucider le rôle de cette protéine dans les vaisseaux cérébraux, 2°) d’étudier le mécanisme par lequel la production anormale de cette protéine contribue à la mort des cellules musculaires lisses artérielles dans la maladie CADASIL, et 3°) de tester l’hypothèse que la production anormale de cette protéine est également impliqué dans la mort des cellules musculaires lisses artérielles d’autres formes génétiques ou multifactorielles de maladies des petits vaisseaux.
Bénéfices attendus
La connaissance des mécanismes moléculaires de la mort des cellules musculaires lisses artérielles dans les maladies des petits vaisseaux cérébraux est fondamentale pour l’identification de cibles thérapeutiques et le développement de traitement pour ces maladies.
Procédures
Mise à mort par exsanguination et perfusion intracardiaque (durée 40 min).
Impact sur les animaux
La perte des cellules murales des vaisseaux peut conduire à des lésions histologiques du cerveau mais ces lésions sont extraordinairement bien tolérées chez la souris (pas de signes cliniques, survie normale) car d'apparition très progressive. La mise à mort par exsanguination au cours de la perfusion intracardiaque peut s’accompagner de souffrance mais celle-ci sera prévenue en réalisant la perfusion sous analgésie et anesthésie très profonde et terminale.
Devenir
mise à mort par exsanguination et perfusion transcardiaque de fixateurs ou de solution saline. La perfusion intracardiaque de fixateurs permet de fixer le cerveau in situ avant son prélèvement et donc de préserver la morphologie des tissus et des vaisseaux du cerveau , ce qui est indispensable dans notre projet. La perfusion de solution saline permet d'éliminer tous les composants protéiques ou cellulaires du sang des artères qui seront prélevées, ce qui est indispensable dans notre projet.
Remplacement
La complexité des interactions vaisseaux –cerveau- débit sanguin fait qu’il est fondamental d’étudier ces anomalies sur l’animal vivant, soumis à l’ensemble des systèmes régulateurs, de façon parfaitement intégrée. De plus, la complexité de ces interactions fait qu’on ne sait pas modéliser correctement ce système in vitro. Pour ces raisons, nous ne pouvons pas substituer au modèle animal un modèle in vitro ou computationnel.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Nous avons calculé la taille des échantillons en nous basant sur des jeux de données collectées au cours d’expériences précédentes similaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies avec du coton . La mise à mort sera effectuée sous analgésie et anesthésie générale profonde. Nous veillerons au bienêtre des animaux en mettant en place une grille de score et en utilisant des points limites adaptés, un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de souffrance. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé au préalable avec des analgésiques.
Choix des espèces
La souris est un animal vertébré chez lequel, d'une part, l'organisation du système vasculaire cérébral est assez proche de l'homme et d'autre part les manipulations génétiques sont aujourd’hui réalisables. Ces manipulations génétiques sont indispensables pour la réalisation de ce projet. La majorité des animaux utilisés seront des souris jeunes âgées de 2 mois à souris âgées de 12 mois car il est nécessaire de pouvoir analyser la progression des lésions au cours de la maladie. Un nombre limité d'animaux seront analysées à l’âge de 10 jours afin d'étudier le développement des vaisseaux.
Comprendre le rôle du CD36 intestinal dans l’apparition des maladies métaboliques et de l’inflammation associée : utilisation de « faux lipides » bio-sourcés et dérivés d’acides gras naturels.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Après une mise à jeun de douze heures, elles sont gavées d'agonistes d'un récepteur intestinal, anesthésiées pour un prélèvement de sang, puis tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs tissus. Le porteur présente au conditionnel la piste d'une cible contre l'obésité et le diabète. Il affirme le remplacement "impossible" et juge "indispensable" de recourir au modèle animal pour une approche intégrée de plusieurs organes.
Objectifs
L’obésité est associée à une inflammation de faible intensité ainsi qu’aux maladies cardiovasculaires et au diabète. L’obésité peut notamment s’expliquer par une consommation excessive de lipides. L’intestin et plus précisément le récepteur CD36 intestinal pourrait jouer un rôle central dans le développement de l’obésité et de l’inflammation associée. Une consommation excessive de lipides pourrait, via le dysfonctionnement de CD36, altérer les paramètres postprandiaux associés à l’obésité. Ces données ont été obtenues chez des souris totalement déficientes en CD36. La contribution physiologique spécifique de CD36 intestinal n’a donc pas été prouvée. De plus, les voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation de CD36 n’ont pas encore complètement été identifiées. Ce projet a donc un objectif double : 1) Évaluer la contribution effective du CD36 intestinal dans les perturbations physiologiques associées au développement de l'obésité. 2) Comprendre le fonctionnement du récepteur CD36 au niveau intestinal en identifiant les voies de signalisation intracellulaires induites par son activation. Pour ce projet, nous utiliserons des souris wild-type et génétiquement modifiées, n’exprimant pas le récepteur CD36 spécifiquement au niveau intestinal, et des souris contrôles correspondantes, exprimant le récepteur CD36 au niveau intestinal. Nous utiliserons des molécules ciblant CD36. Ce sont des molécules dérivées d’acides gras naturels et ayant la caractéristique d’activer spécifiquement le récepteur CD36. Nous disposons de deux agonistes différents pour réaliser ces expériences (nommé A et B pour des raisons de confidentialité). Si nos hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait être une cible thérapeutique pour limiter l’obésité.
Bénéfices attendus
Si les hypothèses sont validées, alors le CD36 intestinal pourrait in fine être une cible thérapeutique et/ou nutritionnelle dans le traitement des pathologies liées à un excès de lipides, comme l’obésité, le diabète de type 2 ou encore les maladies cardiovasculaires. L’identification des voies de signalisation intracellulaires induites par l’activation du récepteur CD36 permettrait de mieux comprendre le fonctionnement de ce récepteur, ses impacts physiologiques et donc de faciliter une potentielle utilisation de ce récepteur comme une cible thérapeutique. De plus, si les agonistes montrent des effets bénéfiques sur les paramètres postprandiaux alors ils pourraient eux aussi être très utilisés comme éventuelle molécules thérapeutiques pour optimiser l’absorption intestinale des lipides, réduire l’hypertriglycéridémie postprandiale, réduire l’endotoxémie postprandiale et donc l’inflammation au sens large. Ces agonistes pourraient donc, via le récepteur CD36, permettre de lutter contre l’épidémie inquiétante d’obésité et des maladies associées.
Procédures
L’administration des agonistes et de l’huile se fait par voie orale (gavage). Chaque souris est gavée une ou deux fois. C’est un geste légèrement invasif mais indolore qui ne dure pas plus de 4 ou 5 secondes. La souris est de suite reposée dans sa cage de vie. Les souris sont ensuite anesthésiées pour prélèvement sanguin( 30 secondes maximum), puis euthanasiées par dislocation cervicale, sous anesthésie, pour réaliser des prélèvements de tissus d’intérêt.
Impact sur les animaux
Le projet requiert de mettre à jeun les souris pendant 12 heures ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Celui-ci est diminué par le fait que pendant cette période les souris sont laissées dans leur cage avec un enrichissement supplémentaire de leur mileu de vie (frisons en carton, petits abris en carton ou en plastique).
Devenir
La totalité des animaux sera euthanasiée en fin de procédure. Pour la procédure 1 nous avons besoin de récupérer du sang et des tissus pour réaliser des dosages plasmatiques et des mesures d’expression protéique/génique tissulaire. Pour la procédure 2, nous travaillons sur des segments isolés d’intestin, nous avons donc besoin de prélever l’intestin et donc d’euthanasier les souris au cours de la procédure.
Remplacement
Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires et le nombre d’expériences réalisées sur chaque animal, nous avons adopté la stratégie suivante : • Réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à une analyse statistique robuste de cette expérience à l’aide de tests non paramétriques, sachant qu’il y a des variations individuelles dans la réponse intestinale aux lipides • Les 2 procédures se clôturent par un test du charge lipidique identique, ce qui permet en cumulant les effectifs des deux procédures d'atteindre de nombre requis d'individus pour une analyse statistique correcte.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement (carrés de coton, tunnels en polycarbonates…) de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées, en surveillant le maintien de la température corporelle grâce à une table chauffante spécifique. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3R. De plus, des points limites en adéquation avec ce projet ont été définis. En cas d’atteinte d’un de ces points limites, l’animal concerné sera retiré du projet. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.
Choix des espèces
La souris est utilisée car son métabolisme présente de nombreuses similarités avec celui de l’Homme, en particulier au niveau oro-intestinal. Elle exprime les mêmes protéines clés de la détection des lipides et de la synthèse des lipoprotéines par l’intestin qui sont régulées de la même manière. Ce modèle est largement documenté dans la bibliographie scientifique. Dans ce projet, nous travaillons sur des lignées de souris OGM présentant une délétion spécifiquement au niveau intestinal. Les animaux seront utilisés au stade adulte à partir de 8 semaines afin de s’affranchir des effets de la puberté dans les résultats obtenus.
Modèle d’ischémie reperfusion chez le rongeur (2022-B-021)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Rats : 1440
490 souris et 1440 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à sévère, certaines menées sous anesthésie sans réveil. Le thorax est ouvert et l'irrigation du coeur interrompue pendant quinze minutes à une heure, suivie d'une reperfusion pouvant durer jusqu'à quatre heures, pour reproduire un infarctus et tester des molécules en développement. Le porteur décrit une douleur et un stress liés à la chirurgie, une perte de poids et une mise à jeun pouvant atteindre seize heures. Il conclut que la mesure des paramètres cardiaques ne peut être réalisée que sur des animaux vivants et juge "indispensable" l'analyse histologique qui impose leur mise à mort.
Objectifs
Selon l’organisation mondiale de la santé, la première cause de mortalité dans le monde est l’infarctus du myocarde. Ce projet a pour but de développer deux types de modèles afin de tester et démontrer l’efficacité de molécules en développement. Le premier modèle (infarctus aigu) permet de recueillir de nombreux paramètres cardiaques qui servent à tester de nombreuses molécules en développement. Le second modèle (infarctus du myocarde chronique) est utilisé pour tester l’efficacité d’une molécule en développement sur différents paramètres cardiaques afin de voir si cette dernière améliore la survie et restaure les fonctions cardiaques chez les personnes ayant subi un infarctus du myocarde..
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester l’efficacité de molécules en développement afin de trouver un candidat médicament susceptible de traiter les pathologies liées à l’infarctus et ainsi d’améliorer la prise en charge / le pronostic de ces patients.
Procédures
Au cours de sa vie, un animal ne pourra être impliqué que dans une procédure de cette demande de projet. Pour tous les animaux l’identification (quelle que soit l’identification) dure 30 secondes. Pour les procédures comportant l’anesthésie chimique, le temps d’injection de l’anesthésique est estimé à 30 secondes. Les temps d’intervention sur l’animal estimés pour chaque procédure sont les suivants : - Mise en place de la sonde dans le coeur en passant par la carotide (20 min), mise en place de l’électrocardiogramme (20 min), ouverture du thorax de l’animal (20 min) + interruption de l'irrigation localisée d'une partie du coeur (ischémie) pouvant aller de 15min à 1h00 + reperfusion cardiaque pouvant aller de 30 min à 4h00 soit un total de 6h00. - Mise en place d’un cathéter en veine jugulaire (15min), mise en place d’un cathéter en fémorale ou carotide (15min), ou mise en place de la sonde dans le coeur en passant par la carotide (20 min), mise en place de l’électrocardiogramme (20 min), ouverture du thorax de l’animal (20 min) + ischémie cardiaque pouvant aller de 15min à 1h00 + reperfusion cardiaque pouvant aller de 30 min à 4h00 soit un total de 6h15. - Ouverture du thorax + réalisation de l’ischémie cardiaque + fermeture du thorax (30 min) pour la première étape puis pour la seconde étape mise en place d’un cathéter en fémorale ou carotide (15min) ou mise en place d’une sonde dans le coeur en passant par la carotide (20min), mise en place d’un électrocardiogramme (20min) soit au total un maximum de 40 min. Les différents types d'administration prendront moins d'une minute par animal.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures de ce projet incluant des gestes chirurgicaux, un certain niveau de douleur et de stress sont attendus nécessitant une anesthésie et analgésie pré et post-opératoires appropriées. Une perte de poids et une réduction de l’activité peuvent être observées dans les 72h suivant les interventions Dans le cadre de ce projet, les signes cliniques de la pathologie (exemple : essoufflement de l’animal, prostration, yeux mi-clos, …) sont attendus et feront l’objet d’un suivi spécifique. Une mise à jeun (durée maximum de 16h00) pourra également être mise en place. Les animaux auront alors toujours accès à l'eau. Cette mise à jeun pourra avoir un impact sur l’induction de la pathologie en maximisant la zone touchée par l'ischémie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des trois procédures car il est indispensable de réaliser des analyses histologiques pour quantifier la taille de l’ischémie.
Remplacement
Des modèles animaux artificiels (exemple : rats ou souris mannequins, peau synthétique) existent afin de permettre à l’expérimentateur en formation d’acquérir certains gestes de base tels que la pose de points de suture ou des injections et prélèvements simples. Cependant, la chirurgie présentée dans ce projet ainsi que la mesure des paramètres physiologiques dans ce type de modèle ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants.
Réduction
Une mise au point du modèle préalable aux études permettra une réduction du nombre d’animaux impliqué dans les études. C’est pour cette raison qu’une procédure dédiée à la mise au point des modèles d’ischémie, a été incluse dans ce projet. Pour la mise au point du modèle, nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux surnuméraires ou issus d’un précédent projet, (après avis favorable de la structure du bien être animal et du vétérinaire désigné) ce qui rentre dans le cadre d’une réduction du nombre d’animaux utilisés. L'ensemble de ces conditions s'inscrivent dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux. Les modèles d'infarctus du myocarde aigu et chronique seront réalisés sur un nombre limité d’animaux mais suffisant pour pouvoir réaliser des tests statistiques pertinents en fonction de l’effet attendu de la molécule testée.
Raffinement
L’expérimentateur s’assurera que toute manipulation sera conforme à la réglementation en vigueur et entrainera un minimum de stress ou de douleur chez l’animal. Préalablement à toute expérimentation, des points limites (exemples : yeux mi-clos, prostration, poils hérissés, essoufflement, etc …) sont définis en accord avec la littérature scientifique et la réglementation en vigueur. La mise en place des points limites permettra un meilleur suivi des animaux lors de la réalisation des différentes procédures de ce projet mais également de maintenir leur bien-être tout au long de l’expérimentation ainsi que la mise en place d’une prise en charge précoce et adaptée de l’animal si cela est nécessaire. Dans le cas où le bien-être de l’animal serait dégradé après 48h de traitement, une euthanasie sera réalisée immédiatement sur décision du directeur d’étude et /ou du vétérinaire désigné. Avant tout acte de chirurgie, l’anesthésie ainsi que l’analgésie nécessaires au suivi pré et post opératoire de l’animal devront être validées par le vétérinaire désigné. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur couverture chauffante avec rétrocontrôle de la température afin que les animaux soient maintenus à 37°C. L’ajout de système de réchauffement complémentaires pourra être utilisés en cas de baisse de température de l’animal (exemple : bouillotes, etc..). Le réveil des animaux s’effectuera dans un environnement permettant le maintien de la température corporelle (ex: lampe chauffante, enceinte thermorégulée, etc…). Les animaux inclus dans le modèle chronique seront hébergés individuellement après chaque chirurgie jusqu’à la fin du suivi post opératoire (7 à 10 jours) et/ou après cicatrisation totale de l’animal. Afin de limiter le stress dû à l’hébergement en cage individuelle et de maximiser le bien-être de l’animal, de l’enrichissement spécifique à chaque espèce sera utilisée (exemple : igloo, bûchette, coton, etc…). De plus, quelques soit la procédure, les animaux pourront être hébergés individuellement 24h avant le début de la chirurgie afin de minimiser l’impact du stress dû à l’hébergement individuel en post-chirurgie et standardiser l’impact de l’individualisation des animaux.
Choix des espèces
D'un point de vue scientifique, nous disposons d'un grand nombre d'articles et de données validées sur le rat et la souris dans ce type de modèle de maladie. C'est pour cette raison que nous souhaitons inclure ces deux espèces dans notre projet. Ce type de modèle de maladie est réalisé chez des animaux adultes car il s’agit de reproduire des maladies de l’Homme adulte.
Photopharmacologie en lumière infra-rouge proche.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
853 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie dans des procédures terminales sous anesthésie, les autres à un niveau de souffrance modéré. La plupart subissent une chirurgie du cerveau de quarante minutes pour injecter des nanoparticules ou des virus, avec selon les cas l'implantation de canules, de fibres optiques ou d'électrodes, et des enregistrements de cinq heures. Le projet vise à piloter par lumière infrarouge les récepteurs de la dopamine et de l'acétylcholine pour étudier les interactions sociales entre souris. Le porteur signale des douleurs crâniennes, des saignements, des pertes de poids et des bagarres entre animaux, et affirme que cette recherche n'est réalisable que sur l'animal.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de développer des technologies permettant de contrôler par la lumière infra-rouge proche les récepteurs des neurotransmetteurs chez la souris, pour des études de circuits neuronaux et des comportements. Pour cela, nous utiliserons des outils photochimiques synthétiques nouvellement développés, qui permettent la libération rapide de drogues et d’autres neurotransmetteurs par la lumière, ou bien qui modulent de manière bidirectionnelle l’activité d’un récepteur neuronal avec de la lumière. Leur utilisation chez la souris en comportement est très restreinte, notamment parce que ces sondes sont normalement stimulées par la lumière UV ou visible, qui pénètre très mal dans les tissus, et donc nécessitent d’un apport local de lumière qui est invasif. Pour surmonter ce problème, nous proposons d'utiliser des nanoparticules de conversion ascendante, des chromophores (dans notre cas, substance qui possède des électrons capables d’absorber l’énergie et d’être excités, à des longueurs d’onde spécifiques, et qui va en retour en transmettre d'autres) inorganiques qui ont la propriété physique de convertir la lumière infrarouge proche (qui peut pénétrer assez profondément au sein des tissus biologiques) en lumière visible. Ces particules sont déjà utilisées dans des études en cancérologie ou en neuroscience, mais leur utilisation avec des drogues dans le cerveau n’est pas encore démontrée. Ces nanoparticules seront couplées à l’utilisation de drogues photosensible, permettant un contrôle non invasif des récepteurs endogènes du cerveau chez les souris en comportement. Les stratégies développées ici seront applicables à la plupart des récepteurs, circuits neuronaux et modèles animaux, ainsi notre projet a un potentiel pour changer le paysage de notre compréhension de la neuromodulation, à la fois dans le domaine de la santé et de la maladie.
Bénéfices attendus
Cette étude et les technologies développées ici présentent un fort potentiel non seulement à des fins de recherche sur des modèles animaux, mais aussi pour des applications thérapeutiques chez l'homme. Le ciblage des médicaments sur des populations neuronales particulières pourrait améliorer l'efficacité thérapeutique, tout en diminuant les effets secondaires associés à une sélectivité insuffisante dans les approches conventionnelles. Les stratégies développées ici devraient être applicables à la plupart des récepteurs, cellules, circuits et modèles animaux. Nous nous concentrerons principalement sur les interactions sociales entre des souris vivant en groupe, en manipulant de manière non invasive les voies dopaminergiques et cholinergiques sur des souris vigiles, à l'aide de molécules pharmacologiques spécifiques au type cellulaire et contrôlable par la lumière infrarouge proche. Cela permettra de déterminer comment les récepteurs de la dopamine et de l’acétylcholine contribuent à conduire ou à inhiber les interactions sociales. La réalisation du projet pourrait aider à améliorer notre compréhension de la physiologie normale et à mieux comprendre l'étiologie et le traitement des maladies neuropsychiatriques, en offrant une occasion unique de tester les avantages des médicaments ciblant les cellules pour les troubles neurologiques et neuropsychiatriques.
Procédures
Injections de nanoparticules ou de particules virales dans le cerveau : procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale (durée 40 min), une fois par animal, sur l'ensemble des animaux, soit 800 animaux. 2) Prélèvement du cerveau: procédure terminale, réalisée sous anesthésie profonde, sur 100 souris. 3) Enregistrements électrophysiologiques in vivo (durée 5h) : procédure terminale, procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie profonde, sur 352 souris. 4) Implantation de canule : procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale (durée 40 min), une fois par animal, sur 77 animaux. 5) Implantation de fibres optiques ou de diodes électroluminescentes: procédure réalisée sous anesthésie générale (durée 40 min), une fois par animal, sur 231 animaux. 6) Implantation de puces pour radio-identification: procédure réalisée sous anesthésie générale (durée 5 min), une fois par animal, sur 154 animaux. 7) Prélèvement de liquide cérébro-spinal : procédure terminale, réalisée sous anesthésie générale (durée 20 min), sur 53 animaux.
Impact sur les animaux
Les chirurgies au niveau du crane peuvent engendrer d’éventuelles douleurs au niveau des canaux auditifs, ou bien au niveau du crane. L’ouverture de la peau au niveau du crane, ainsi que les craniotomies, peuvent produire des saignements locaux. L’anesthésie peut faire baisser la température de l’animal, ainsi que sa respiration. Après une chirurgie, on peut s’attendre à une perte de poids drastique et continue, une perte/instabilité des implants, des signes d'infection grave autour de la zone de l'implant, une perte d'appétit et/ou une consommation atténuée de liquides, des anomalies comportementales et/ou morphologiques incurables. Les bagarres entre animaux dans une même cage peuvent aussi arriver, blessant superficiellement ou gravement certaines souris. Finalement, certains effets indésirables liés à la stimulation optique peuvent survenir et troubler l'activité locomotrice.
Devenir
A l'issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés, afin de récupérer les cerveaux pour analyses histologiques et moléculaires, ou bien pour vérifier le site d’enregistrement electrophysiologique.
Remplacement
Notre objectif est de tester de nouvelles technologies optiques et chimiques (nanoparticules, composés cagés…) pour manipuler les récepteurs des neurotransmetteurs situés dans les régions profondes du cerveau, de manière non invasive, et d’étudier l’impact de cette manipulation sur l’activité cérébrale et sur les comportements, notamment sociaux. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux. Il y a plusieurs avantages à utiliser la souris comme modèle pour notre recherche : Un nombre croissant de recherches a révélé des homologies génétiques, anatomiques et fonctionnelles chez les rongeurs et les primates, notamment au niveau neuronal et au niveau des récepteurs. Par exemple, les fonctions dopaminergiques, cholinergiques et glutamatergiques sont similaires chez les rongeurs et les primates. En outre, plusieurs comportements cognitifs ont été conceptualisés sur la base des découvertes chez les primates et répliqués avec succès chez les rongeurs. De plus, l'existence de nombreuses souris génétiquement modifiées permet l'utilisation de techniques permettant une visualisation, une manipulation et un enregistrement restreints dans l'espace et dans le temps de l'activité cérébrale spécifique à un type de cellule. Par exemple, afin de réaliser des expériences d'optopharmacologie, nous utiliserons des lignées de souris transgéniques dans lesquelles des récepteurs manipulables pourront être ciblés sélectivement sur une population neuronale spécifique. En manipulant ces récepteurs neuronaux avec des drogues sélectives et photosensibles, nous pourrons, espérons-le, révéler des cibles sélectives pour de nouveaux traitements plus ciblés.
Réduction
Le nombre d'animaux, pour ce projet, est déterminé sur la base d'une littérature vaste et robuste dans des domaines similaires (etudes employant de l’optogénétique par exemple) mais aussi sur notre expertise personnelle en photopharmacologie. Afin de réduire l'utilisation de souris au minimum, nous nous imposerons un cahier des charges strict. Pour ce faire, les procédures ont été pensées pour qu'une même souris puisse passer dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. Nous utiliserons dans la mesure du possible tant les souris mâles que femelles, afin d’utiliser toutes les souris issues d’une même portée.
Raffinement
Les animaux seront placés dans une animalerie aux conditions d’hébergement standard (température de 22°C et avec une photopériode de 12h jour et 12h nuit). Du nid végétal sera déposé dans les cages de manière à enrichir l’environnement des animaux et leur permettre de fabriquer un nid. Lors des etudes en environnements sociaux, l'espace alloué pour chaque souris ainsi que l'enrichissement sont supérieurs aux cages conventionnelles de stabulation. Les souris sont pesées tous les jours et suivies en temps réel via des caméras infra-rouge nous permettant de mesurer à distance le comportement des souris. Il nous est donc possible d'intervenir rapidement en cas de quelconque soucis. De plus, le bien-être des souris est conditionné par la mise en place de protocoles visant à réduire les éventuelles souffrances animales (administration d'analgésique lors de chirurgies ou après agression entre congénères).
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle de la souris car d’un point de vue anatomique et fonctionnel, les systèmes dopaminergiques méso-cortico-limbiques sont bien conservés, chez l'ensemble des mammifères et en particulier chez les rongeurs. Plus particulièrement, la distribution des récepteurs nicotiniques et les afférences cholinergiques sont organisées de manières similaires que chez l'homme. Ce n’est pas le cas chez les invertébrés, les poissons ou les oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulation des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles animaux. Si les modèles d’invertébrés et poisson peuvent être utilisés pour étudier certains mécanismes dopaminergiques, l’organisation anatomique est trop différente pour qu'ils puissent être utilisés pour comprendre la modulation nicotinique du système dopaminergique. Finalement la souris étant un mammifère social qui vit en groupe, c’est un modèle pratique pour pouvoir étudier le comportement social en groupe chez les animaux sociaux. Des modèles d’autres mammifères sociaux (rat, singe) ne se justifient pas car les outils génétiques nécessaires pour disséquer les mécanismes sous-jacents sont peu nombreux chez ces espèces. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (> 8 semaines). Pour les études nécessitant une transduction virale, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 7-8 semaines le jour de l’injection virale, afin d'observer un temps de transduction nécessaire par le virus concerné (entre 2 et 4 semaines). Les expériences d’électrophysiologie ou de comportement seront réalisées à partir de 4 semaines après l’injection virale, temps nécessaire à l’expression du transgène. L’implantation des fibres optiques ou des électrodes d'enregistrement se fera à partir de 8 semaines d’âge.