Procédures sans réveil

530 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil, et celles soumises au conditionnement de peur reçoivent chacune deux à quatre chocs électriques de 0,4 à 0,6 milliampère, associés à un son. Une chirurgie d'une heure leur implante des canules dans le cerveau pour y injecter des molécules qui agissent sur le récepteur de l'ocytocine, et toutes sont tuées pour l'étude de tranches de leur cerveau. Le projet doit comprendre comment la peur s'acquiert et s'éteint, ce qui permettrait selon le porteur d'"ouvrir des voies thérapeutiques" contre le stress post-traumatique. Il décrit lui-même une douleur, une peur et "une angoisse liée à la répétition du choc en l'absence d'échappatoire", qu'il dit inévitable car elle est "l'essence même du conditionnement de peur".

Objectifs

"Les troubles du stress post-traumatique (TSPT) sont des troubles psychiatriques qui surviennent après un événement traumatisant. Ils se traduisent par une souffrance morale et des complications physiques qui altèrent profondément la vie personnelle, sociale et professionnelle". Parmi ces troubles, on trouve une dérégulation du système de stress et une résurgence importante des souvenirs traumatisants, rendant la personne anxieuse face à des situations normalement non anxiogènes. Au sein du cerveau, la peur nait de l'interaction de plusieurs régions, parmi lesquelles l'amygdale joue un rôle prépondérant. De plus, cette structure est à la base des réponses autonomes, comportementales et émotionnelles de la peur, faisant de ce noyau une structure de choix pour l’étude des TSPT. Dans l'amygdale, l’ocytocine (OT) a été récemment identifiée comme étant un candidat pour le traitement de la peur pathologique. Ainsi, l’OT est un candidat de choix pour agir sur la modulation des réponses émotionnelles face à la peur ou son souvenir. Par ailleurs, un intérêt croissant émerge sur l'implication des cellules non neuronales tels que les astrocytes dans la régulation des circuits neuronaux. De plus, il a été récemment démontré que l'OT pouvait agir sur les astrocytes de l'amygdale via son récepteur présent sur ces cellules. Ce projet vise à élucider l’effet de l’activation des récepteurs à l’ocytocine (OTR) de l’amygdale via l’application de molécules modifiant l'activité de ce récepteur. Lors des études ex vivo, nous évaluerons l'activité des neurones et des cellules gliales sur des tranches de cerveau comportant l'amygdale centrale. Elles apporteront de nouvelles connaissances quant aux mécanismes d’action des TSPT, en observant particulièrement si une interaction neurone-glie est requise. Les études in vivo se feront à l’aide d’un modèle de TSPT et les observations seront menées sur l'expression de la peur conditionnée.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes cérébraux mis en place au cours de l'acquisition et de l'extinction de la peur ce qui permettrait d'ouvrir des voies thérapeutiques permettant de réduire les symptômes de personnes traumatisées ou excessivement anxieuses.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 principales interventions: A. Une biopsie du cerveau suivant une anesthésie dissociative. B. L'implantation de canules intracérébrales permettant d'administrer des agents pharmacologiques dans les structures cérébrales étudiées. Nos nous limiteront à 1 chirurgie (1h) et 1 injection intracérébrale (5 minutes) par animal. C. Le conditionnement de peur se dérouleras sur 3 jours. Elle dureras 20 minutes le premier jour puis 60 minutes les deux jours suivants.

Impact sur les animaux

Pour les expériences ex vivo (point A), la nuisance se limite à l'insertion d'une aiguille pour injecter l'anesthésique. La procédure étant sans réveil, aucune autre nuisance n'est attendue. L'implantation de canules intracérébrales (point B) peuvent entrainer des démangeaisons et une légère douleur au site d'incision sont attendues après l'opération. Pour limiter au maximum ces effets indésirables, nous prendrons des dispositions pré-opératoires (injection d'analgésiques locaux ansi que d'anti-inflammatoires), pendant l'opération (gel hydrolique pour empêcher la déshydratation des yeux, couverture chauffante pour l'hypothermie) et en post-opératoire (suivi du poids et de l'apparence des souris, anti-inflammatoire dans l'eau de boisson). Enfin, pour le protocole de conditionnement de peur, le concept de cette expérience est de créer une peur à un son en associant ce dernier à un choc électrique ; la nuisance liée au choc ne peut donc pas être évitée. Celle ci comprend une douleur, une réaction de peur (liée au caractère aversif et imprédictible de l'apparition du choc) ainsi qu'une angoisse liée à la répétition du choc en l'absence d'échappatoire. Dans ce protocole, même si nous comptons réduire au maximum cette angoisse, elle ne peut être évitée car elle est l'essence même du conditionnement de peur. Les souris recevront 2 à 4 chocs d'une intensité de 0,4 à 0,6mA sur une session de 20 minutes. Ces valeurs seront déterminées lors d'expériences préliminaires visant à estimer quels sont les paramètres minimums permettant l'installation d'une peur conditionnée.

Devenir

Les animaux seront systématiquement mis à mort afin de réaliser une biopsie du cerveau et analyse ex vivo. Ainsi, les animaux sont toujours utilisés pour une procédure "sans réveil" à la fin des expériences.

Remplacement

Notre étude porte sur l’analyse de l’activité complexe de réseaux neuronaux qui ne peuvent être pour le moment reproduits in vitro ou in silico. Il n’est donc pas possible, à ce jour, de remplacer l’usage d’animaux vivants. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au strict nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Dans l'objectif de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous comptons réaliser les expériences ex vivo (électrophysiologie et imagerie calcique) sur les animaux utilisés lors du fear conditionning. Ces expériences ex vivo étant "sans réveil", cela n'apportera d'inconforts surnuméraires aux individus utilisés. Pour toutes les expériences, la normalité des données sera évaluée puis une ANOVA (ou son équivalent non paramétrique) et des tests post hoc seront effectués. Toutes les comparaisons seront faites à une seuil de significativité de 5%. L'effectif a été évalué en se basant sur les travaux réalisés précédemment dans l'équipe. Ce chiffre est une estimation du nombre d'animaux nécessaires pour obtenir 10 à 20 enregistrements, représentant une unité statistique robuste. L'utilisation d'un nombre d'animaux plus faible pourrait induire un biais et ainsi affaiblir les conclusions. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef.

Raffinement

Pour répondre aux besoins comportementaux des animaux, ils seront hébergés en cages collectives avec de l'enrichissement. Cet enrichissement comportera de la frisure et du coton pour qu'elles se fassent des nids de toute splendeur. Des bâtons à ronger seront aussi mis à disposition dans les cages d'hébergement. De plus, nous ajouterons des tunnels afin de rendre le change de cages moins stressant. Enfin, les souris étant des animaux sociaux, elles seront hébergées par cage de 2 à 5. Au cours des chirurgies, nous nous assurerons de la présence d'une couverture anesthésique et analgésique. Nous utiliserons aussi des tapis chauffant afin d'éviter la diminution de la température corporelle due à l'anesthésie. De l'ocrygel sera aussi placé sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Après la chirurgie, du Gel Diet seras placé dans la cage afin de faciliter l'hydratation et la prise de nourriture. Des points limites spécifiques aux procédures ont été établis ce qui permettra d'interrompre les procédures à tout moment et donc soustraire l'animal à la souffrance. Pour le conditionnement de peur, nous comptons réaliser des tests préalables sur : 1) le nombre de choc et 2) la l'intensité de ces derniers. Nous comptons essayer d'appliquer peu de choc (2) de faible intensité (0,4mA) et tester si cela suffit à produire un robuste conditionnement de peur. Si ce protocole s'avère être trop faible, nous augmenterons le nombre de choc jusqu'à un maximum de 4 et si cela n'est toujours pas suffisant, nous augmenterons l'intensité des chocs, le tout sans jamais dépasser 0,6mA, correspondant aux valeurs hautes observées dans la bibliographie du domaine.

Choix des espèces

Le modèle expérimental chez la souris est un standard pour ce type d'expérience et comporte une série de symptômes superposables avec la pathologie humaine. La grande majorité des expériences réalisées à ce jour concernant l'action de l'ocytocine au sein de l'amygdale ont été effectuées chez la souris. Ainsi, il nous pourrons aisément comparer et interpréter les résultats et pour la qualité des mesures effectuées, il est préférable de travailler chez cette espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, ce qui correspond à environ 5 semaines. En effet, nous nous intéressons ici à un mecanisme qui n'est pas développemental et pour cette raison nous souhaitons utiliser des animaux matures. Sachant que l'encéphale se développe encore jusqu'à la cinquième semaine, nous avons donc choisi d'utiliser des animaux à partir de 5 semaines.

398 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Chaque animal reçoit des injections répétées d'alcool ou d'interleukine, jusqu'à neuf fois, pour reproduire un stress périnatal et en étudier les effets épigénétiques sur le cerveau. Le porteur attend des effets comportementaux comme la prostration et l'agressivité, et les souris sont tuées à l'issue de chaque procédure pour prélever les tissus. Il juge le modèle souris "essentiel" pour tenir compte de l'architecture cellulaire complexe du système nerveux.

Objectifs

Plusieurs études suggèrent qu’un stress périnatal augmente la susceptibilité d’apparition de pathologies mentales à l’âge adulte. Ces stress périnataux pourraient induire des modifications épigénétiques à l’origine de l’augmentation de cette susceptibilité. Ces modifications épigénétiques se répercuteraient au niveau architectural puis fonctionnel dans le cerveau et conduiraient à des comportements pathologiques. L’amélioration du pronostic des pathologies mentales liées au stress repose donc sur la découverte de nouvelles stratégies neuroprotectrices. L’objectif de cette étude est de comprendre les mécanismes biologiques, moléculaires, épigénétiques et cellulaires, responsables d’anomalies du développement cérébral décrites chez l’homme suite à des stress périnataux: l’ingestion d’alcool chez la femme enceinte (syndrome d’alcoolisation fœtale SAF) et l’inflammation périnatale. Ces anomalies ont été associées à la présence de lésions cérébrales et de pathologies mentales. Les voies du stress, notamment celles impliquant le gène HSF2 sont particulièrement présentes au cours du développement neural et y jouent un rôle critique. Disséquer les mécanismes génétiques et épigénétiques possiblement causals dans ces troubles psychiatriques est une des voies vers le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce but, l’induction de stress répétés chez le souriceau (embryonnaire ou nouveau-né), déjà bien caractérisés et connus pour mimer les effets d’une intoxication alcoolique aigue ou l’inflammation périnatale chez la femme enceinte, sera réalisée afin d’étudier les effets cellulaires, et moléculaires au niveau de l’épigénome dans le cerveau de ces souriceaux, soit peu de temps après le stress, soit après plusieurs semaines. Une partie des travaux de ce projet sera réalisée en parallèle sur des modèles organoïdes, afin de limiter à terme, l'utilisation des animaux dans ce type d'étude. Cependant, une partie du travail repose sur le suivi à long terme des conséquences du stress périnatal, il est donc encore indispensable d'y associer des études chez l'animal.

Bénéfices attendus

Ces travaux s'inscrivent dans la compréhension des mécanismes moléculaires qui sont ciblés par un stress développemental, que ce soit lors de la vie foetale ou l'enfance, et qui ont des répercussions sur la vie adulte. Ce projet à trois visée à long terme, (1) l'anticipation des effets du stress et de leur répercutions par la prévention, notamment en identifiant les périodes de susceptibilité, (2) le développement d'approches diagnostiques basées sur les défauts identifiés et qui viseront à la prise en charge la plus précoce possible pour limiter les conséquences du stress et enfin, (3) le développement d'approches thérapeutiques qui cibleront les voies moléculaires identifiées.

Procédures

Injections intrapéritonéales répétées d'alcool (3 injections séparées de 12h), ou Injections intrapéritonélaes répétées d'interleukine (jusqu'à 9 injections espacées de 12h, soit sur 5 jours), et/ou injections intrapéritonéales de BrdU/EdU (jusqu'à 3 injections espacées de 3h).

Impact sur les animaux

Les animaux subissent des stress contrôlés et modérés, mais sufisants pour reproduire des effets du stress observés chez l'humain. Des effets comportementaux sont principalement attendus, tels la prostration et l'agressivité, dont nous essaieront de limiter l'impact par les enrichissement environnementaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour prélevement des tissus à analyser.

Remplacement

Il est important de travailler sur ce modèle souris car ces études doivent tenir compte de l'architecture cellulaire et tissulaire complexe qui impacte sur la protéostasie, le métabolisme et les réponses cellulaires, surtout concernant les réponses neurales. Le système nerveux est par essence un système intriqué dédié à la réponse environnemental, vouloir préserver son intégrité dans nos études est donc essentiel, et pour le moment, seul le modèle animal répond à ce défi. Par ailleurs, nous disposons d'animaux transgéniques qui permettent de disséquer des voies complexes de le réponse cellulaire. C’est également la seule possibilité de coupler des phénotypes cellulaires, histologiques à des défauts comportementaux. Nous développons en parallèle des modèles de culture cellulaire complexe qui permettront à terme de limiter le nombre d'animaux utilisés mais pour le moment, ces modèles sont encore imparfaits et ne permettent pas encore de reproduire les phénotypes comportementaux.

Réduction

Les modèles de lésions cérébrales induits par l'alcool sont extrêmement reprocductibles et n'entrainent qu'une faible mortalité, de l'ordrede 5%. Il en est de même pour le modèle d'inflammation que nous utilisons. Ces deux aspects permettent de limiter le nombre d'animaux par groupe. Par ailleurs, l'utilisation de tests statistiques appropriés à l'étude des petits echantillons permet également l'utilisation d'un nombre limité d'animaux. En parallèle à nos travaux nous développons des modèles de culture d'organoides cérébraux, qui pourront être utilisés pour les validations d'effets, et développés à terme pour ce type d'étude.

Raffinement

Le bien être des animaux est au coeur de nos travaux puisque en étudiant le stress, nous sommes particulièrement attentif à leur environnement qui influerait sur nos résultats. Nous veillons à maintenir l'enrichissement approprié, à limiter la manipulation des animaux, et les changements d'environnement qui sont stressants pour les animaux.

Choix des espèces

Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles neuropathologiques. Par ailleurs, nos études sont axées sur des conséquences à relativement long terme sur la physiologie tissulaire, ce qu'il n'est pas encore possible de modéliser complètement dans les modèles complexes 3D. De plus, il nous est indispensable d’avoir accès aux animaux génétiquement modifiés pour nos analyses mécanistiques. Nous travaillerons sur : E15.5, E16.5, P7, P30 pour suivre la mise en place et la persistance ou l'aggravation des effets de l'alccol, à des etapes clés du développement neural. Le stade auquel le stress alcoolique est appliqué correspond au deuxieme trimestre de la grossesse chez l'humain. A ce stade l'alcool n'induit pas d'altérations majeures identifiables au niveau clinique, poutant les consequences comportementales sont bien caractérisées chez le jeune enfant. Il s'agit donc d'identifier une signature precoce du défauts induits par l'alcool. Les stades d'analyse choisis couvrent des periodes clés du developpement neural (pic de neurogenese cortical, etablissement de la myelination corticale, architecture cerebrale mature). P1, P3, P5, P45 pour les études de l’inflammation puisque cette période correspond au au 3eme semestre de gestation chez la femme durant lequel le développement du fœtus est particulièrement sensible à l’inflammation et cause de prématurité infantile avec des consequences connues chez le jeune enfant. Notre expérience a déjà montré que l’inflammation pendant le développement cérébral est un processus complexe qui doit être étudié dans le temps (notamment la mise en place de la myelination corticale et d'une architecture mature du cortex cérébral). Stades embryonnaires entre E11.5, E14.5 et E16.5 pour les études du rôle de HSF2, car ce sont les stades auxquels les protéines HSF sont exprimées et des étapes clés de la corticogenèse: début de neurogenèse, modification de l'expression de HSF2 dans le cortex cérébral, pic de la neurogenèse corticale et génération des neurones des couches supérieures.

1 300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 900 opérés sous anesthésie sans reprise de conscience et 400 soumis à des gestes de niveau modéré. Ils subissent une trachéotomie, un cathétérisme et des prélèvements cardiaques sous anesthésie, une partie étant d'abord sensibilisée à un allergène pour déclencher un choc anaphylactique, pour comparer les effets cardiovasculaires de médicaments selon la voie d'administration. Le porteur reconnaît des risques de nécroses cutanées aux sites d'injection de l'adjuvant chez les animaux sensibilisés. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle alternatif et présente ce projet comme préparatoire à des expériences ultérieures chez le chien.

Objectifs

Nous souhaitons explorer, par différentes voies d'administration, les effets d'entités pharmacologiques sur la sphère cardio-vasculaire, sur aninal normotendu ou soumis à un choc anaphylactique. Dans ce dernier cas, l'effet recherché sur une amélioration de la fonction cardio-vasculaire après induction d'un choc anaphylactique sur animal sensibilisé. Dans tous les cas, les investigations se feront sur animal anesthésié.

Bénéfices attendus

Démontrer par des données pré-cliniques que l'efficacité d'un nouveau traitement peut être obtenue par une autre voie d'administration et être potentiellement augmentée dans le cadre du choc anaphylactique et ce en comparaison d'un traitement de référence.

Procédures

Les animaux conscients subiront des gestes invasifs modérés (administration sous cutanée pour prémédication ou sensibilisation à l'ovalbumine ; intraveineuse ou intramusculaire pour induction de l'anesthésie au mélange kétamine/xylazine). Tous les autres gestes chirurgicaux (trachéotomie, cathétérisme, prélèvements sanguins ou cardiaques) se feront sous anesthésie générale (anesthésie gazeuse à l'isoflurane). La durée maximale sous anesthésie sera de 2h30 avant euthanasie.

Impact sur les animaux

A l'exception de la phase de sensibilisation à un allergène conduite sur animaux conscients, le projet est essentiellement conduit sur des animaux anesthésiés et les principales nuisances vont donc être relatives aux gestes invasifs pratiqués pour l'induction (sous cutanée et intraveineuse) et le maintien (trachéotomie pour une ventilation assistée) d'une bonne anesthésie générale sous isoflurane. Pour les animaux sensibilisés, les risques de souffrance concernent le développement de nécroses et lésions cutanées survenant au niveau des sites d'injection de l'adjuvant.

Devenir

La mise à mort par surdosage à l'Exagon est systématique à l'issue de la procédure expérimentale.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle alternatif pour appréhender sur la fonction cardio-vasculaire les effets comparés d'un même traitement, selon différentes voies d'administration, chez des animaux normotendus ou soumis à un choc anaphylactique.

Réduction

Pour éviter de trop fortes fluctuations chez un animal vigile, nous avons fait le choix du lapin anesthésié et déjà montré que ce modèle était approprié pour réduire la variabilité des mesures recueillies. Toutefois, la phase de sédation est primordiale et doit être conduite avec une attention particulière, dans le calme, en évitant au maximum les désagréments auprès de l’animal (gestes brutaux, contrainte physique). L’injection du sédatif doit être réalisée de façon lente pour éviter la survenue d’apnées fatales, en favorisant un produit qui n’induise pas de douleur à l’injection. Selon l'amplitude des réponses obtenues sur le(s) paramètre(s) d'intérêt, nous avons constaté qu’un effectif compris entre 6 à 15 lapins par groupe expérimental est raisonnable et généralement suffisant pour effectuer une approche statistique des données. Les analyses statistiques sont de deux types : soit en comparant les données de cinétiques aux données mesurées en conditions basales (within group analysis), soit en comparant les données sous traitement à celles recueillies aux mêmes temps dans le groupe contrôle (between group analysis). Le plus souvent, sont rapportées des analyses de variance, suivies d'un test post-hoc approprié lorsque des différences significatives (dès p

Raffinement

Les animaux sont hébergés individuellement à leur arrivée jusqu’au jour expérimental (qui survient en général dans la semaine qui suit). Pour le bien-être des animaux et limiter le stress inhérent à cette espèce, nous veillons à mettre à disposition dans les cages d’hébergement une plateforme surélevée, une balle en plastique, une buchette à ronger et une hutte en polycarbonate rouge dans laquelle le lapin peut venir se réfugier s’il ressent le besoin de s’isoler. Sans traitement particulier, les animaux ne doivent pas présenter de signes de douleur à ce stade expérimental. Toutefois, le personnel zootechnicien est sensibilisé pour communiquer directement à l’expérimentateur tout comportement « suspect » d’un animal anxieux, soit observé durant la période d’acclimatation (un animal qui tape systématiquement fortement du pied lors d’une entrée dans la pièce ou lorsque l’on s’approche près de sa cage), soit le jour même de l’expérimentation au moment de sa manipulation pour sa sortie (comportement excessif de fuite, vocalisation…). L’animal est disposé dans un SAS de transfert avec son étiquette d’identification sur laquelle sont annotées son poids et ces remarques éventuelles, il n’y reste que quelques minutes avant que l’expérimentateur ne vienne le chercher. Si l’animal n’a toujours pas retrouvé un certain calme au moment de l’induction de l’anesthésie, il est préférable que l’expérimentateur soit assisté d’un collègue au moment de réaliser son geste invasif (injection intraveineuse), celui-ci pourra par exemple continuer de gratter le dos de l’animal ou la base du cou pour le déstresser momentanément. En cours d'expérimentation, la perte des réflexes aux stimulis externes (cornée, pincement oreille ou extrémité d’une patte postérieure) est contrôlée de façon régulière ; la concentration d’isoflurane dispensé est augmentée si nécessaire.

Choix des espèces

Du fait de sa très grande sensibilité sur la sphère cardio-vasculaire, le lapin a été couramment utilisé au laboratoire pour évaluer les risques de cardio-toxicité pro-arythmique de candidats médicaments. Dans la littérature, il a été montré chez le lapin que la sensibilité des barorécepteurs sous isoflurane était préservée. Les animaux utilisés seront choisis à l'âge de jeunes adultes, en lien avec la visée thérapeutique humaine (adultes)

242 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et, pour une partie, menées sous anesthésie sans réveil. Une inflammation ou une lésion douloureuse leur est provoquée par injections de CFA ou de capsaïcine et par chirurgie, afin de tester un inhibiteur de la kinase p38 sur l'allodynie mécanique. Le porteur décrit une gêne due à l'irritation et indique que les tissus nerveux sont prélevés après mise à mort, les enregistrements électrophysiologiques terminaux étant réalisés sans réveil. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole car l'intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux.

Objectifs

Aigue, la douleur est physiologique, nécessaire à notre survie. Chronique ou persistante, par suite d’une inflammation (douleur inflammatoire) ou d’une lésion nerveuse (douleur neuropathique), la douleur n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire détresse et souffrance. Les traitements ne sont souvent que partiellement efficaces et peuvent s’accompagner d’effets secondaires importants. Il faut donc découvrir de nouveaux antalgiques. Etonnamment, si notre connaissance des mécanismes de la douleur s’est considérablement accrue, cette avancée ne s’est accompagnée d’aucun progrès thérapeutique majeur. Une des raisons à cet échec est qu’il n’existe pas un mais des symptômes douloureux. En effet, inflammatoire ou neuropathique, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes douloureux : douleurs spontanées et/ou provoquées, par une stimulation normalement douloureuse (exacerbation de la douleur ou hyperalgésie) ou non (allodynie).Parmi une série de composés chimiques synthétisés par un institut de Chimie, nous avons identifié une molécule ayant un effet anti-allodynique à la fois très puissant et prolongé sur des modèles murins d’allodynie mécanique inflammatoire comme neuropathique. Ce composé se révèle être un inhibiteur sélectif de la kinase p38alpha. Ces résultats prometteurs nous amènent à poursuivre l’étude de l’effet anti-allodynique de ce composé pour en faire un candidat médicament anti-allodynique. Ce projet vise à répondre à plusieurs questions. Ce composé a-t-il un effet : -sur les douleurs spontanées comme sur l’hypersensibilité mécanique ? -sur toutes formes d’allodynies mécaniques inflammatoires ? -suite à une administration chez des animaux naïfs : afin d’investiguer de potentiels effets secondaires-par voie systémique comme par voie locale utilisée lors du ‘screening’?.Ces tests seront suivis d’analyses par quantification protéique et analyse immunohistochimique des tissus prélevés sur les animaux mise à mort à l’issue des tests comportementaux. Ces tests comportementaux seront complétés d’analyses électrophysiologie in vivo.

Bénéfices attendus

Nosu aimerions prouver l’effet anti-allodynique de ce composé pour en faire un candidat médicament anti-allodynique. L’allodynie mécanique est un symptôme très fréquent, observé chez 20-50% des patients neuropathiques et 60-80% des migraineux chroniques. On sait maintenant que son apparition est liée à l’activation d’un circuit neuronal local–dans la corne dorsale (CD) de la moelle épinière ou le sous-noyau caudal du Trijumeau (Sp5C)– transmettant l’information tactile aux voies de la douleur. Or, bien qu’anatomiquement toujours présent, ce circuit ne devient fonctionnel qu’en conditions pathologiques. Ce processus nécessite l’activation d’enzymes dans la CD/Sp5C dont la p38 mitogen-activating kinase (p38). La p38 semble donc une cible pertinente pour le développement de nouveaux médicaments anti-allodyniques. L’inhibition de cette kinase diminue bien le comportement douloureux spontané et l’allodynie mécanique chez l’animal en conditions inflammatoires et neuropathiques.

Procédures

Toutes les injections seront pratiquées sous anesthésie générale: - injection locale 1*4min puis injection sous cutanée de CFA 1*1min ou injection systémique 1*3min puis injection de CFA1*1min - injection locale 1*4min puis injection sous cutanée de capsaicine 1*1min ou injection systémique 1*3min puis injection de CFA1*1min - chirurgie 1*1h puis injection sous cutanée de CFA 1*1min puis contrôles 3*5min puis tests 12*5min (procédure sans réveil)

Impact sur les animaux

Dans le cas des expérimentations comportementales, la douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » et les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer ses gestes habituels. Les effects indésirables prévus seraient une gêne dûe à l'irritation.

Devenir

A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une quantification protéique ou une analyse immunohistochimique. A l 'issue des enregistrements électrophysiologiques (procédure sans réveil), les tissus ne peuvent pas être prélevés et les animaux seront euthanasiés par injection systémique d’une dose létale d'anesthésique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Pour les enregistrements électrophysiologiques un nombre de 10 à 15 animaux par groupe est nécessaire. Les données sont traitées selon les données de la littérature et sont analysées à l’aide d’une ANOVA à une voie suivie d’un test post-hoc de Newman-Keuls.

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, systémiques, locales ou sous-cutanées, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.