Procédures sans réveil

22 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacun subit une coronarographie puis une ouverture du thorax, avant exsanguination et prélèvement du cœur, en une intervention d'environ 90 à 120 minutes. Le porteur cherche à valider un protocole d'imagerie des artères coronaires sur une machine de perfusion cardiaque, pour mieux évaluer des greffons avant transplantation. Il affirme que les petits animaux n'offrent pas un système vasculaire assez proche de l'humain et retient le porc, livré à environ 55 à 60 kg.

Objectifs

Les objectifs de notre étude sont les suivants : 1)Valider un protocole de coronarographie sur machine de perfusion cardiaque ex vivo ; 2)Définir un profil de biomarqueurs pour les dommages cardiaques induits par une exposition à des doses de RI faibles à modérées en caractérisant et en identifiant la cinétique des biomarqueurs circulants après irradiation du cœur perfusé ex vivo ; 3)Etudier la biodistribution du produit de contraste iodé et son impact sur la qualité de perfusion ex vivo et la viabilité myocardique ; 4)Etudier la faisabilité d’approches non invasives alternatives à la coronarographie pour le dépistage de la maladie coronaire sur le cœur perfusé ex vivo : application du coroscanner et de la micro-vasculoscopie.

Bénéfices attendus

La transplantation cardiaque est le traitement de référence de l’insuffisance cardiaque avancée avec un taux de survie >60% à 10 ans. Nous proposons dans ce projet de recherche de valider un protocole d’imagerie coronaire ex vivo par coronarographie, mais également d’évaluer la faisabilité du coroscanner dans cette indication ce qui permettrait d'évaluer correctement les greffons cardiaques préservés sur machine de perfusion ex-vivo avant la transplantation.

Procédures

L'ensemble des animaux seront soumis, sous anesthésie générale à coronarographie suivie d'une sternotomie médiane, avant exsanguination et prélèvement cardiaque. La totalité de la procédure sous anesthésie générale sera d'environ 90-120 min.

Impact sur les animaux

L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. S'agissant de procédures expérimentales sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure.

Devenir

L'ensemble des procédures impliquent l'explantation du coeur ce qui rend la réutilisation, le replacement ou l'adoption des animaux inenvisageable.

Remplacement

Nous avons pratiqué une expérimentation préliminaire sur modèle in silico simulant la position du cœur sur la machine de perfusion lors d’une exposition aux rayonnements faiblement ionisants.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, deux animaux seront utilisés à la phase préliminaire pour déterminer le protocole d’acquisition des images coronarographiques qui sera ensuite appliqué dans chacun des groupes (incidence des acquisitions, dose irradiée, quantité d’agent de contraste). Le nombre d’animaux par groupe sera fixé à 6 afin de pouvoir réaliser des tests de comparaison statistique entre les groupes. Au total 22 animaux seront utilisés pour cette étude.

Raffinement

Période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche. Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères. Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention). Procédures expérimentales réalisées par du personnel qualifié et expérimenté (chirurgiens séniors, techniciens anesthésistes) permettant un temps interventionnel réduit au maximum. Privilégier les ponctions vasculaires (artérielles et veineuses) percutanées échoguidées afin de réduire la souffrance, le risque de saignement et le risque infectieux.

Choix des espèces

Nous avons choisi un modèle porcin pour différentes raisons: -Les modèles ‘petits animaux’ ne permettent pas d’avoir un système vasculaire suffisamment proche de l'Homme (vaisseaux trop petits principalement), et nous ne pouvons pas de façon réaliste réduire toute la taille du système afin de l’adapter à de petits animaux -Le porc est un modèle de référence pour les procédure endovasculaires, bien documenté. Son anatomie cardiovasculaire facilite la réalisation de la coronarographie et des canulations artérielle et veineuse nécessaires pour sa perfusion isolée ex vivo. La modélisation chirurgicale est facilitée par l’usage du gros animal, ce qui contribue à limiter le nombre d'aniamux nécessaire. Les porcs sont livrés à environ 16 semaines d'âge soit environ 55-60 kg afin de faciliter les abords vasculaires périphériques par voie percutanée et d'avoir des diamètres de vaisseaux compatibles avec les dispositifs à évaluer.

8 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque porc subit une chirurgie de deux heures puis un arrêt cardio-respiratoire provoqué de dix minutes, avec deux prélèvements sanguins, pour tester un prototype de stimulation électrique externe pendant la réanimation cardiopulmonaire. Le porteur indique que les animaux restent anesthésiés en permanence et que la profondeur de l'anesthésie est vérifiée régulièrement. Le bénéfice annoncé, une meilleure reprise de l'activité cardiaque, est formulé au conditionnel.

Objectifs

L'arrêt cardiaque extra-hospitalier correspond à l'arrêt brutal et inattendu des battements du cœur, souvent appelé "crise cardiaque". Cette situation frappe environ 40.000 personnes par an en France et 300.000 à 400.000 en Europe. Lorsque cela survient, l'urgence est la mise en place de soins de réanimation cardiopulmonaire, s'appuyant sur un massage cardiaque, l'appel des secours et l'usage d'un défibrillateur semi-automatique. Une fois les services de secours médicalisés sur place, une réanimation cardiopulmonaire avancée est mise en place, incluant une intubation endo-trachéale (sonde dans la trachée) et une ventilation mécanique (respiration) du patient par des machines spécifiques. Des molécules peuvent aussi être administrées pour essayer de faire repartire le coeur. Dans certains cas, ces soins ne suffisent pas. Dans ce contexte, le but de l’étude est d’évaluer l’impact d’un nouveau prototype de stimulation électrique transthoracique (pacing). Ce dispositif pourrait permettre d'augmenter la performance d'un massage cardiaque lors d'une réanimation avec certains rythmes cardiaques particuliers (très faible fréquence cardiaque sans contraction effective). Pour montrer cette amélioration de la performance de la réanimation, il faut étudier la pression de perfusion coronarienne. Il nous faudra déterminer si le pacing permet d’obtenir une pression de perfusion coronarienne dépassant le seuil critique de 20mmHg pour obtenir une réanimation cardiaque efficace sur les animaux. Nous utiliserons un modèle porcin d’arrêt cardiaque présentant des rythmes ne nécessitant pas de choc électrique.

Bénéfices attendus

L’utilisation du prototype de stimulation transthoracique pendant la réanimation cardiopulmonaire permettrait une amélioration de la performance du massage cardiaque et in fine la reprise d’une activité électrique et contractile.

Procédures

Nous utiliserons 8 porcs. Pour cela, tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 2 heures et à un arrêt cardio-respiratoire d'une durée de 10 minutes. Deux prélèvements sanguins à l'état anesthésié seront réalisés pendant la procédure. Les animaux seront mis à mort à la fin du protocole.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux seront anesthésiés tout le long de la procédure. Nous vérifierons très régulièrement la profondeur de l’anesthésie afin de s’assurer qu’aucune souffrance ne soit possible pour l’animal. La profondeur de l'anesthésie est évaluée par la disparition du réflexe palpébral , une relaxation de la mâchoire et l'absence de réflexes de retrait de la patte.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole.

Remplacement

L’arrêt cardiaque est une situation qui induit une dysfonction de plusieurs organes après la réanimation. Le caractère intégratif de l’affection ne permet pas de la reproduire in vitro ou in silico (absence de Remplacement possible). L’étude de médicaments ou dispositif permettant de lutter contre ses séquelles doit se faire une vivo, en utilisant des animaux à des fins scientifiques.

Réduction

S’agissant d’une étude de preuve de concept, cette étude inclura uniquement 4 animaux par groupe (un groupe Témoin et un groupe "Pacing")Le critère de jugement principal sera la pression de perfusion coronarienne, calculée au cours du massage cardiaque comme la différence entre la pression artérielle systémique et la pression atriale droite en fin de décompression. Ce critère permettra d’évaluer le prototype de stimulation électrique transthoracique. Les critères secondaires d’investigation seront les pressions artérielles systémiques systoliques, diastoliques au cours du massage cardiaque et la pression atriale droite. Nous comptabiliserons simplement le nombre d’animaux pour lesquels une pression de perfusion coronarienne supérieure à 20 mmHg peut être observée lors du pacing. Si cela se présente sur un seul animal, cela pourra justifier des études complémentaires sur un nom. Ce chiffre est plus lié à un nombre suffisant au-delà duquel, s’il n’est pas possible d’atteindre le seuil de 20mmHg de pressions coronarienne sur au moins un animal, nous pourrons estimer que le bénéfice est trop « rare » pour mériter des investigations plus lourdes.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des boxes individuels « contigus » avec la possibilité d’interagir (se sentir, s’entendre, se « renifler » à travers les grilles …). Si besoin, les jouets peuvent être renouvelés. Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques puissants, tout au long de la procédure.

Choix des espèces

Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme au vu de sa masse corporelle, de son anatomie cardiaque et des valeurs usuelles des paramètres hémodynamiques. Porcs de 30 kg.

300 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie permettant d'enregistrer et de stimuler le système nerveux sympathique, puis est mis à mort en fin d'intervention. Le porteur, une société, indique vouloir développer un dispositif médical contre l'obésité par stimulation électrique, et affirme qu'aucun test in vitro validé n'offre d'alternative pour un phénomène jugé trop complexe. Il présente les traitements actuels comme insuffisants pour justifier ce développement.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de développer un dispositif médical contre l’obésité par stimulation bioélectronique du système nerveux sympathique chez le rat. De nombreux arguments et données scientifiques sont en faveur de l’existence d’une modulation neuronale du système nerveux sympathique pour traiter l’obésité. En effet, les signaux acheminés (nommés afférences) par le système nerveux sympathique jouent un rôle important dans la prise alimentaire: -1/3 des neurones spinaux sont sensibles à la distension stomacale, également nommé gastroparésie trouble fonctionnel digestif caractéristique de l’obésité, généralement chronique et caractérisé par un ralentissement de la vidange de l’estomac, en l’absence de tout obstacle mécanique. -Les afférences sympathiques sont sensibles à l’augmentation de glucose dans le duodénum. - L’inhibition des afférences sympathiques augmente la prise alimentaire. La stimulation du système nerveux sympathique pourrait être une solution permettant de lutter contre l’obésité. Les traitements actuels sont inefficaces. En effet, les traitements existants les plus efficaces sont le by-pass gastrique et la chirurgie bariatrique dont les effets passent par le système nerveux sympathique. Cette hypothèse d’une implication du système nerveux sympathique a été testée chez le rat. Cependant, ces deux traitements sont très invasifs et entraînent des effets indésirables (troubles digestifs, vomissement…) chez l’humain. Le développement d’un dispositif médical permettant par électrostimulation du système sympathique la régulation de la prise alimentaire pourrait être un outil très prometteur afin de lutter contre l’obésité. Les avantages de ce dispositif seraient : - de cibler les effets de l’électrostimulation par une organisation régionale du système sympathique - d’activer un arc reflexe simple - Une localisation anatomique qui rendrait le positionnement du dispositif accessible par voie dorsale - Une mise en œuvre peu invasive. Un dispositif similaire d’électrostimulation a déjà été approuvé en 2014 par la FDA pour le traitement de douleurs dorsales réfractaires à la chirurgie.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’obésité (Muller et al. Nat Rev Drug Discov 2021). Les deux traitements les plus efficaces sont le by-pass gastrique et la chirurgie bariatrique qui sont des traitements lourds, engendrant de nombreux effets secondaires. Par conséquent, le développement de traitements moins invasifs, plus efficaces et sans effets secondaires est nécessaire pour lutter contre l’obésité.

Procédures

La procédure de ce projet est sans réveil. Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale afin de réaliser les enregistrements/stimulation du système sympathique. Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.

Impact sur les animaux

La procédure mise en œuvre dans ce projet est une procédure sans réveil. La chirurgie et les enregistrements/stimulations seront menés dans le respect de la règle des 3R avec des protocoles d’anesthésie/analgésie adaptés à l’espèce de façon limiter au maximum la douleur.

Devenir

Les animaux inclus dans une expérimentation seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale.

Remplacement

Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement ou test in vitro connu qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées dans ce projet. Le phénomène d’obésité ne peut être étudié correctement in vitro car il s’agit d’un phénomène complexe et doit donc être étudié chez l’animal, intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle expérimental in vivo est donc un prérequis à la phase de développement clinique. Nos expérimentations au sein de la société, même si elles nécessitent l’utilisation d’animaux, sont pratiquées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux et de bien-être pour les animaux en expérimentation. Toutes les expériences sont réalisées dans le respect éthique de la règle des 3 R.

Réduction

Le nombre de rat a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l'obtention de résultats exploitables. L'évaluation du nombre d'animaux nécessaire a été effectuée par un test statistique. Les résultats seront analysés avec GraphPad Prism. Nous adapterons les tests statistiques en fonction de la distribution des observables, qu'elle soit normale (tests paramétriques : t-test pour comparer 2 échantillons, ANOVA pour comparer le nombre d’échantillons) ou non (tests non paramétriques : Mann-Whitney ou Kruskall Wallis). De plus des dispositions sont prises pour éviter tout double emploi injustifié des procédures expérimentales. Cette procédure est menée au sein d'une société qui effectue une planification rigoureuse des expériences menées. Elle ne duplique en aucun cas une autre procédure expérimentale.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (par exemple : igloos, briques de bois à grignoter, ambiance sonore dans la salle, commutation progressive de la lumière, etc.). Suivra alors une période d’acclimatation de 5 jours minimum, pendant laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera réalisé. Les conditions d’hébergement et de soins, et les méthodes utilisées ont été choisies et conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Le contrôle mortalité des animaux sera effectué quotidiennement sans exception (Week-ends & jours fériés) par du personnel compétent et qualifié. Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement par l’observation des signes cliniques. Soins : Des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés.

Choix des espèces

L’espèce rat sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux sympathique dans la prise alimentaire sur ce modèle. Ce modèle sera par la suite transposé à l’humain. Utilisation d’animaux adultes car l’objectif est le développement d’un dispositif médical pour les sujets adultes.

110 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une ouverture de la cage thoracique et un enregistrement de l'activité cardiaque de moins de quarante-cinq minutes, avant l'euthanasie. Le porteur indique tester des peptides rendus sensibles à la lumière pour contrôler optiquement le rythme cardiaque, et affirme que seule l'expérimentation animale permet de valider l'intérêt clinique de l'approche. Il s'agit d'une preuve de concept, les perspectives thérapeutiques étant renvoyées à des étapes ultérieures.

Objectifs

Les troubles du rythme cardiaque d’origine génétique, médicamenteuse ou bien secondaires à une pathologie cardiaque ischémique conduisent dans de nombreux cas à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Les approches thérapeutiques actuelles requirent l’implantation d’un défibrillateur automatique ou bien l’utilisation de molécules anti-arythmiques dont la fenêtre thérapeutique est étroite en raison des effets secondaires associés à ces molécules. L'objectif de ce projet est de démontrer la possibilité de contrôler optiquement et in vivo l’activité électrique cardiaque dans un modèle de rat sauvage en utilisant des peptides préalablement rendus photo-sensibles. Les composés sont injectés sous forme inactive. L’illumination à 365-405 nm permet un clivage du groupement protecteur et donc l’activation du peptide dans les zones illuminées uniquement. Ces peptides ont été sélectionnés in vitro pour leurs effets sur des cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors d’études précédentes. Ainsi, par cette approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque, il sera par la suite possible de cibler les zones arythmogènes du cœur dans des modèles murins arythmiques ou bien chez le gros animal.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre : 1. de faire la preuve de concept du contrôle optique de l’activité de composés ciblant les canaux ioniques présents dans le cœur et impliqués dans la génération des arythmies cardiaques, et 2. de contrôler la survenue d’arythmies cardiaques en s’affranchissant des effets secondaires dans les zones du cœur non ciblées, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Procédures

La totalité des animaux sera soumise à une thoracotomie et un enregistrement électrocardiographique 6 dérivations. Le temps total de l’intervention sera inférieur à 45 min.

Impact sur les animaux

La procédure expérimentale mise en œuvre lors de ce projet nécessite la mise en place d’une thoracotomie. La gestion préopératoire de la douleur doit empêcher la survenue d’effets indésirables. Il s’agit d’une procédure sans réveil qui ne nécessite donc pas d’analgésie post-opératoire. Une étude précédente a démontré en aigu et chez la souris, l’absence d’effets indésirables de l’injection d’un peptide protégé comme réalisé dans cette étude. De plus l’ensemble de la procédure sera faite sous anesthésie avec sacrifice de l'animal en fin d'examen.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés par injectionintrapéritonéale de dose léthale de pentobarbital sodique (120 mg/kg) après sédation.

Remplacement

Cette étude requiert une exploration fonctionnelle afin de valider in vivo une approche de contrôle optique de l’activité électrique cardiaque. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si l’approche testée présente un intérêt clinique en limitant la survenue d’arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur nos cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.

Réduction

Un maximum de 110 rats seront utilisés dans cette étude. Au fur et à mesure de l'inclusion des données, des analyses statistiques seront réalisées. Si une différence statistiquement significative entre les rats du groupe contrôle et ceux recevant une illumination apparait (une valeur de p

Raffinement

Avant la procédure, Les rats seront hébergés par couple en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie (isoflurane) avec une prise en charge analgésique adaptée. Les peptides à tester, sous leur forme protégée, ayant été sélectionnés pour leur absence d’activité sur leurs cibles, nous n'anticipons pas de douleur ou d'effets indésirables suite à leur injection. Toutefois, si l'un des peptides devait entrainer des effets indésirables détectables sous anesthésie, comme des difficultés respiratoires ou des convulsions, l'examen serait interrompu et le rat euthanasié. Au cours de la chirurgie, un saignement abondant non maitrisable ou bien une extubation de l’animal conduirait à une euthanasie de celui-ci.

Choix des espèces

Le rat constitue un bon modèle pour l’études des arythmies cardiaques et de part la taille du cœur, offre une approche plus aisée que la souris pour le contrôle optique et localisé de l’activation des composés injectés. L'étude sera réalisée sur des rats adultes de 8-10 semaines pour faciliter les abords chirurgicaux.

60 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil pour prélèvement du coeur. Des mères sont immunisées pour produire un auto-anticorps censé traverser le placenta, et le porteur attend une mort subite des souriceaux par bloc cardiaque, sans signe avant-coureur, en analogie avec la mort subite du nourrisson. Les femelles et les nouveau-nés sont euthanasiés après enregistrement d'un électrocardiogramme. Le porteur affirme que l'usage de modèles in vitro "n'est pas envisageable", rendant selon lui l'animal "indispensable".

Objectifs

Le syndrome de mort subite du nourrisson (SMSN) correspond à la mort subite et inattendue d’un nourrisson apparemment en bonne santé âgé de moins d’un an. La plupart du temps, la mort survient pendant le sommeil, sans raison apparente. Plusieurs facteurs de risque de SMSN (y compris la position de sommeil et l’environnement) ont été identifiés. Cependant malgré les mesures préventives, le SMSN demeure la principale cause de décès chez les nourrissons. Les chercheurs continuent de s’interroger quant aux raisons pour lesquelles les nourrissons peuvent mourir sans cause apparente. À la recherche d’une réponse, les investigations se sont principalement concentrées sur les gènes, mais les mutations ne sont une cause sous-jacente que dans la minorité des cas. Lors d’une étude clinique récente, nous avons identifié un auto-anticorps dirigé contre le canal TRPV2 (une séquence spécifique et extracellulaire) du cœur en lien avec le SMSN. Une cause auto-immune du SMSN n’a pas encore été étudiée à ce jour et constitue l’objectif du présent projet

Bénéfices attendus

Les résultats attendus sont que les auto-anticorps dirigés contre le TRPV2 chez les souris mères traversent la barrière placentaire pour atteindre et interagir avec le cœur de leur progéniture. En vue du rôle majeur des canaux TRPV2 dans le nœud auriculo-ventriculaire du cœur, il est attendu à ce que les auto-anticorps provoquent un bloc auriculo-ventriculaire, identifiable sur un ECG. Par ailleurs, en analogie à la SMSN humaine, il sera possible d’observer une mort subite de souris nouveau-nées. Par conséquent, nous accorderons notre attention sur le taux de survie/mortalité des souriceaux pour ainsi déceler une éventuelle corrélation entre la mort subite et la présence d’auto-anticorps anti-TRPV2. Une telle découverte serait une avancée majeure dans le domaine clinique : non seulement elle nous permettrait pour la première fois de disposer d’un marqueur prédictif pour la SMSN, mais elle permettrait également un changement de paradigme en prévention et thérapie de la SMSN.

Procédures

Enregistrement d'un électrocardiogramme sous anesthésie.

Impact sur les animaux

L’enregistrement des ECGs sera effectué sous anesthésie générale et durera au maximum 15 minutes par animal. Il est attendu d’observer des morts subites chez les souris nouveau-nées, dans la mesure où il s’agit d’un modèle SMSN. Aucun phénotypage dommageable n'est attendu chez les femelles immunisées.

Devenir

A la fin de la procédure sans réveil, toutes les souris femelles et les souriceaux seront euthanasiés sous anesthésie afin de réaliser un prélèvement sanguin par ponction cardiaque et le prélèvement du coeur pour des études histologiques.

Remplacement

Le SMSN est la cause la plus fréquente de décès de nourrissons âgés de moins d’un an (35-55%). Afin d’étudier les mécanismes sous-jacents du SMSN, l’usage de modèles in vitro n’est pas envisageable, rendant l’utilisation d’animaux indispensable pour comprendre le lien entre SMSN et l’auto-anticorps anti-TRPV2.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. La taille des lots a été déterminée à l'aide du logiciel G power (voir paragraphe 3.4.10). Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Une analyse statistique sera réalisée à l'issue de l'étude : les paramètres quantitatifs seront évalués par analyse de variance associée à un test de comparaisons multiples, alors que l'incidence des morts subites chez les nouveau-nés sera évaluée avec un test de Khi carré. Enfin, les souris mâles utilisées pour l'obtention des portées étudiées seront proposées aux utilisateurs de l'UTE IRS-UN pour une réutilisation dans d'autres études.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler et/ou de papier pour fabriquer des nids. Lors de l’enregistrement de l’ECG ainsi que lors l'euthanasie, les animaux seront sous anesthésie et sous surveillance constante des manipulateurs. Les souris adultes immunisées ne devraient pas présenter de phénotype dommageable. Toutefois, en cas d'apparition d'un signe clinique sévère ou de trois signes cliniques notables selon le tableau fourni en annexe, malgré un traitement analgésique, l'animal serait euthanasié par dislocation cervicale sous anesthésie à l'isoflurane. Il existe un risque de mort subite par bloc auriculoventriculaire complet chez les souriceaux immunisés par leur mère. Dans ce cas, il n'existe pas de signe avant-coureur, le bloc conduisant à une mort très rapide. Dans le cas improbable où un souriceau présenterait un autre phénotype dommageable détectable par l'apparition d'un signe clinique sévère ou de trois signes cliniques notables selon le tableau fourni en annexe, celui-ci serait anesthésié et un ECG serait enregistré avant euthanasie selon la procédure 2.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus utilisée en recherche, notamment dans le cadre d’un modèle d’auto-immunité expérimentale. De plus, notre équipe possède une expertise sur l’ensemble des procédures associées, notamment l’enregistrement d’ECG sur les souris nouveau-nées. Les souris seront âgées de 1-4 semaines lors des enregistrements d’ECG, à un âge équivalent à la première année de vie chez l’humain. Le SMSN faisant l’objectif de notre étude, nous enregistrerons les ECG à l’âge de 1 à 4 semaines, période équivalente à la première année d’une vie humaine. Un ECG sera également enregistré sur les souris femelles adultes.

200 souris et 100 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil par exsanguination puis dissection. Ils ne servent pas à produire des connaissances mais à mettre au point des protocoles d'histologie et à former étudiants et collaborateurs à ces techniques. Le porteur justifie le recours aux animaux par la baisse du nombre de pièces anatomiques disponibles et par le souci de ne pas "gaspiller" des tissus issus de projets scientifiques. Il affirme qu'il n'est "pas possible de remplacer l'utilisation des animaux" puisque l'histologie porte sur des pièces anatomiques.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer et valider des protocoles d’histologie (2D et 3D), pour la plateforme. En effet, l’histologie reste la méthode de référence pour visualiser post mortem les biomarqueurs ou les différents types cellulaires présents dans un tissu biologique. La réduction du nombre d’animaux dans les études fait qu’il n’y plus de reliquat de pièces anatomiques non utilisées dans les projets. Il n’est pas pertinent de compter uniquement sur les animaux dédiés à une étude pour à la fois mettre en place un protocole d’histologie et réaliser une étude complète, les zones d’intérêt étant parfois très petites (structures cérébrales) ou le protocole d’histologie difficile à mettre au point (multi-marquage et histologie 3D). Ce projet vise donc à utiliser des animaux afin à mettre au point de nouveaux protocoles d’histologie avant de les utiliser pour les projets scientifiques, tels que les études de vieillissement ou les études sur le cancer. Les développements méthodologiques que sont les multiples marquages, l’histologie 3D, ou révélation de la vascularisation d’un organe entier nécessitent de nombreuses mises au point. Les multiples marquages permettent de visualiser sur une même coupe de tissus plusieurs marqueurs, permettant la visualisation de colocalisations de marqueurs ou le dénombrement de différentes cellules dans une même région. Les nouvelles techniques d’histologie en 3D nécessitent également beaucoup de mises au point, pour obtenir un immunomarquage visible en profondeur, en rendant transparent la pièce anatomique. La visualisation de la vascularisation d’un organe entier, en rendant transparent la pièce anatomique, est particulièrement intéressante pour corréler avec l’imagerie IRM mais également très difficile à mettre en place, nécessitant de nombreux ajustements. Ce projet vise aussi à obtenir assez de pièces anatomiques pour pouvoir vérifier un protocole déjà validé sur une espèce sur une autre espèce ou une autre souche. Enfin, et de façon non négligeable, il est nécessaire de disposer de pièces anatomiques pour former les étudiants et les collaborateurs, aux techniques d’histologie, sans gaspiller une pièce « précieuse » car issue d’un projet scientifique. La prise en main des techniques (découpes, immunomarquages et microscopie) nécessitant un apprentissage important, notamment sur la découpe au cryostat.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est la mise au point de nouveaux protocoles complexes d’immunomarquages en 2D et 3D pour pouvoir réaliser ensuite des études complètes en histologie sur les projets scientifiques de la plateforme. Le bénéfice est également de pouvoir réaliser la formation des étudiants sans gâcher des pièces anatomiques « précieuses » car issu d’un projet et de pouvoir contrôler les résultats sur un animal sain en cas de résultat inattendu (ex : perte neuronale dans une souche de rat).

Procédures

Une procédure chirurgicale sans réveil, comportant une exsanguination perfusion puis une dissection afin de recueillir des organes d’intérêt. La procédure est déclinée en plusieurs possibilités : 1 : procédure standard d’exsanguination perfusion, puis recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever. 2 : Injection intracardiaque, intra-artérielle ou intraveineuse préalable d’un marqueur coloré (colorant vasculaire), avant exsanguination perfusion et recueil des organes. Le produit est laissé agir 5 min avant de commencer la procédure d’exsanguination perfusion, durée totale estimée à environ 30-40 minutes, en fonction du site d’injection et du nombre d’organes prélevés. 3 : Injection d’un marqueur coloré (colorant vasculaire) pendant la procédure d’exsanguination perfusion et recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever. 4 : Injection d’un marqueur coloré (remplissage vasculaire) à la fin de la procédure d’exsanguination perfusion et recueil des organes, durée totale estimée à environ 15 à 20 minutes en fonction du nombre d’organes à prélever.

Impact sur les animaux

Procédures sans réveil.

Devenir

Une procédure sans réveil pour histologie

Remplacement

L’histologie concerne les pièces anatomiques, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux.

Réduction

Les études rats étant moins nombreuses que les études sur souris, le nombre de 20 rats/an a été déterminé par le nombre de projets nécessitant ce type de mise au point. Les études souris sont beaucoup plus nombreuses mais nous avons déjà accumulé également plus de données histologique, nous pensons donc que 40 souris /an seront suffisantes, en tenant compte des besoins de formation. Soit un total maximal de 100 rats et 200 souris en 5 ans. Il est estimé qu’environ 10 à 15 % de ces animaux seront utilisés pour les action de formation et 85 à 90% pour des actions de mise au point en histologie. Une partie des animaux peuvent être des animaux de réforme issus de projets antérieurs, ou des élevages du CEA, n’ayant subi soit aucune procédure, soit des procédures légères ou modérées n’ayant pas entrainés de signes cliniques persistants. Les actions de formations seront réalisées sur ces animaux. Les mises au point peuvent également être réalisés sur ces animaux à l’exclusion des animaux suivants : - Animaux ayant des signes cliniques, pathologiques ou non. - Animaux d’un âge trop avancé pour l’expression des biomarqueurs d’intérêt (en fonction des marqueurs) - Animaux qui ont reçu un traitement (y compris produits de contraste) - Animaux qui ont subi des procédures chirurgicales lourdes (craniotomies …) - Animaux qui ont subi des procédures pouvant entrainer une inflammation (ouverture de la barrière hémato-encéphalique) - Animaux issus de souche atypique, de souche immunodéficiente ou encore ayant un métabolisme pathologique (sans forcément présenter des signes cliniques - Animaux de l’élevage ayant déjà montré une déficience cellulaire/moléculaire (sans signes cliniques) Les animaux jeunes et sains sont privilégiés pour ces mises au point, limitant les facteurs pouvant troubler l’analyse de l’expression des marqueurs et permettant d’avoir des points de comparaisons avec des animaux ayant une pathologie ou un traitement. Des animaux d’élevage n’ayant absolument subi aucune procédure, peuvent cependant servir pour les mises au point en histologie quand cela concerne l’expression des biomarqueurs liés à l’âge, à condition que la souche soit identique à celle prévue dans le projet lié à l’âge et que les animaux n’ont pas déjà été identifié comme déficients/anormaux pour les marqueurs d’intérêts. Les animaux provenant d’autres animalerie que celle de notre plateforme, seront gardés en quarantaine à réception jusqu’à utilisation.

Raffinement

Procédure sans réveil Une antalgie sera réalisée par injection sous-cutanée de Buprénorphine (0,06 mg/kg pour les souris et 0,03 mg/kg pour les rats), 30 minutes avant anesthésie.. Les animaux seront anesthésiés par une injection intrapéritonéale d’un mélange Kétamine/Xylazine (100/10 mg/kg, dose de 10 ml/kg).

Choix des espèces

La plupart des projets scientifiques sont réalisés sur le rongeur, les mises au point techniques se sont donc en priorité sur ces espèces. Des souris de 6-8 semaines environ, pour un poids de 20-25 g, et des rats de 8 semaines environ, pour un poids de 300 g, seront utilisés de préférence, sauf pour mettre au point des études histologiques sur des animaux plus âgés, où des animaux de plus de 6 mois seront utilisés. En effet, les tissus et en particulier le cerveau montre des différences importantes au cours du temps, avec par exemple la diminution de certains types cellulaires et l’augmentation de dépôts protéiques susceptibles d’interagir avec les anticorps et de donner de faux positifs.