Procédures sans réveil
Etude de l’importance relative de Slc44a2 exprimé par les plaquettes et par les neutrophiles dans le processus de thrombose veineuse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
375 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 225 d'entre elles et sans réveil pour 150. Les 225 premières subissent une chirurgie de la veine cave sous anesthésie pour provoquer la formation d'un caillot, les 150 autres un prélèvement de sang terminal, afin d'étudier le rôle d'une protéine dans la thrombose veineuse. Le porteur affirme n'attendre aucune souffrance grâce à l'analgésie maintenue tout au long des procédures. Sur le remplacement, il indique qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne répond à l'objectif, sans autre précision.
Objectifs
Les thromboses veineuses représentent la 3ème cause de mort par maladies cardiovasculaires dans les pays industrialisés. Les thromboses veineuses, incluant les thromboses veineuses profondes et les embolies pulmonaires ont une incidence de 1/1000. Des stratégies thérapeutiques existent et sont en place afin également de contrôler le risque de récidive chez ces patients. Or, ces traitements ne suffisent pas car malgré ceux-là le taux de mortalité à 1 an est de 20%, et 25 à 50% des survivants auront des séquelles portant gravement atteinte à la mobilité et à la qualité de vie. Un polymorphisme affectant la protéine CTL-2 a été identifié par le laboratoire comme pouvant moduler le risque de thromboses veineuses de 30% chez l’homme. Cette protéine n’a été que peu étudiée, et aucune fonction dans la thrombose n’a été décrite à ce jour. Cette protéine est exprimée à la surface des cellules vasculaires notamment à la surface des neutrophiles et des plaquettes. Or les neutrophiles adhèrent aux sites inflammatoires des parois vasculaires lésées et interviennent dans les étapes précoces de la TV contribuant au recrutement plaquettaire conduisant à l’occlusion des vaisseaux. Les neutrophiles jouent un rôle majeur dans l’inflammation, cependant, les mécanismes par lesquels les neutrophiles exercent leurs fonctions pro-thrombotiques restent encore mal connus. Il semble ainsi essentiel de mieux caractériser les mécanismes impliquant le recrutement et l’activation des neutrophiles à la paroi vasculaire médiés par CTL-2 suite à une stase afin de pouvoir développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les phénomènes inflammatoires et/ou thrombotiques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de caractériser les mécanismes impliqués dans la thrombose veineuse mais aussi dans les maladies thrombo-inflammatoires.
Procédures
Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera effectuée sur 225 animaux destinés à la procédure 1 (durée=30 minutes de chirurgie initiale + 6h ou 48h de réveil en fonction des groupes + 10 minutes d'anesthésie pour récupérer le thrombus formé; soit un total de durée de 6 ou 48h +40 minutes). Les 150 animaux destinés à la procédure 2 seront soumis à un prélèvement terminal de sang sous anesthésie générale (durée=15 minutes).
Impact sur les animaux
Pas de souffrances attendue pour les animaux car l’analgésie sera maintenue tout le long des procédures. Nous veillerons au bien-être animal.
Devenir
Tous les animaux issus de la procédure 1 (225) seront sacrifiés après la procédure. Les autres animaux (150) seront soumis à la procédure 2 qui est sans réveil. Nous utiliserons un total de 375 animaux.
Remplacement
Aucune autre méthode alternative in vitro ou in silico ne permet de satisfaire l'objectif de remplacement à notre connaissance.
Réduction
Concernant l'objectif de réduction nous avons limité nos travaux aux expériences indispensables pour répondre à notre question scientifique. (avec risque alpha de 5% et une puissance atteinte de 80%).
Raffinement
L’objectif de raffinement a été pris en compte : nous ferons notre possible afin de diminuer les contraintes imposées aux animaux en renforçant leur confort: hébergement avec milieu enrichi (igloo de cages, enrichissement foisonnant à base de frisure de papier, nid végétal à base de fibres courtes de coton), anesthésie et analgésie pour supprimer la douleur et le stress, diminution du stress en séparant animaux lors de l'hébergement et l'expérimentation. Nous avons établi des points-limites, et nous avons prévu de maximiser les données obtenues en mesurant un maximum de paramètres pour chaque animal (i.e: formation d’un thrombus, poids et taille du thrombus, étude
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille facile à manipuler et à reproduire. De plus, les souris sont des mammifères et les données obtenues à partir de cette espèce sont beaucoup plus extrapolables à l’homme et la pathologie humaine que celles obtenues à partir d’espèces évolutivement inférieures. La souche C57Bl/6 a été choisie car les lignées conditionnelles knock-out (KO), et totales KO ont été créées dans cette dernière. De plus les protocoles expérimentaux utilisés ont été validés chez la souris principalement dans cette souche, par de nombreuses équipes dont la nôtre. Cette étude vient s'inscrire dans la continuité de notre travail sur CTL-2 déjà effectué chez la souris. Les animaux seront âgés de 9 à 12 semaines. Nous ne pouvons pas utiliser des animaux plus jeunes ou plus âgés car le diamètre de la veine cave doit être de taille similaire à ce qui est habituellement publié dans ce modèle pour pouvoir comparer nos résultats à ceux d’autres équipes. Une souris trop jeune aurait une veine cave inférieure trop petite et le ratio de rétrécissement du diamètre de la veine comparé à son diamètre initial s’y retrouverait ainsi plus important comparé à une souris plus vieille et avec une veine cave plus grosse.
Banque de tissus primates
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 microcèbes, des primates, vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil pour prélever leur sang et leurs organes. Le projet récupère les tissus d'individus en fin de vie, âgés, blessés ou malades, dont les points limites sont déjà atteints, pour constituer une banque destinée à d'autres équipes. Le porteur présente cette collecte comme une mesure de "réduction" du nombre de primates utilisés par la communauté scientifique. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale pour l'étude du vieillissement et des maladies neurodégénératives.
Objectifs
Le projet consiste à récuperer le sang et les tissus de primates en fin de vie. L'objectif du projet permet une rationalisation et une réduction du nombre d'animaux (primates) utilisés par la communauté scientifique. Les tissus prélevés sont le coeur, les poumons, le foie, la rate, le pancréas, le tube digestif, les reins, l'utérus, les testicules, les muscles des pattes postérieures, le diaphragme, le cerveau, la moelle épinière, les yeux, les bulles tympaniques (en fonction des demandes des équipes). Les tissus disponibles non utilisés par notre équipe sont en général conservés à -80°C ou post-fixés au paraformaldéhyde (sur demande des équipes). Une fiche individuelle des organes prélevés sur l'animal est conservée avec la date , le mode de conservation et le nom des équipes qui ont reçu les échantillons.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la mise à disposition de tissus précieux de primates à la communauté scientifique pour des études translationnelles vers l'humain. Un projet de dons d'organes primates est actuellement en cours par le GDR BIOSIMIA.
Procédures
En fin de vie, anesthésie des animaux par injection intrapéritonéale d'un mélange anesthésique et analgésique, puis injection intrapéritonéale d'héparine pour permettre l'exsanguination par prélèvement intracardiaque puis prélèvement du coeur et des autres organes. Une fois que l'animal est profondément endormi, la durée de l'intervention pour l'exsanguination et prélèvement du coeur est de 3 minutes.
Impact sur les animaux
En fin de vie, les points limites étant atteints, les animaux sont anesthésiés par injection intrapéritonéale d'anesthésique, ce qui peut engendrer un stress.
Devenir
si les soins apportés par le vétérinaire sont inefficaces et que les points limites sont atteints, les animaux seront mis à mort pour prélèvement de sang et des tissus pour banque de tissus fixés ou congelés
Remplacement
Il n'y a pas d'alternative non animale disponible pour l'étude du vieillissement et des maladies neurodégénératives dans la cadre de projet translationnel vers la santé humaine. La variabilité individuelle chez les primates miment la variabilité chez l'homme.
Réduction
ce projet rentre totalement dans le cadre de la réduction puisqu'il s'agit de partager des tissus de primates en fin de vie à la communauté scientifique
Raffinement
Les animaux sont anesthésiés par un mélange d'anesthésique et analgésique avant exsanguination intracardiaque
Choix des espèces
Le primate Microcebus murinus, phylogénétiquement plus proche de l’homme que les rongeurs, présente des caractéristiques physiologiques similaires à l'humain. Les animaux adultes en élevage qui présentent une altération forte de leur bien être (blessure, pathologie, âge avancé) et pour lesquels les points limites sont atteints seront utilisés
Etude de l’effet neuroréparateur de la stimulation du nerf vague dans un modèle d’AVC chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
277 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue puisque leur cerveau est prélevé, la plupart sous anesthésie sans réveil et 25 en gravité modérée. Une microchirurgie provoque une ischémie du cortex et pose une électrode autour du nerf vague, les animaux étant gardés jusqu'à 28 jours avec des tests sensori-moteurs quotidiens puis un enregistrement électrophysiologique sous anesthésie. Le porteur affirme que la stimulation du nerf vague est indolore et que le seuil des points limites n'a jamais été franchi lors de projets antérieurs. Il décrit les procédures comme d'une "stricte nécessité" ne pouvant être remplacées par des méthodes in vitro ou in silico.
Objectifs
A ce jour, il n’existe pas de solution thérapeutique capable de protéger ou réparer le système nerveux central après un accident vasculaire cérébral (AVC). Plusieurs laboratoires, dont le nôtre, ont démontré que la récupération fonctionnelle est freinée par un excès d’inhibition par le GABA, un neurotransmetteur inhibiteur, au sein des territoires adjacents à la lésion cérébrale et que la réduction de cet excès d’inhibition favorise la plasticité cérébrale, c'est à dire la formation de nouvelles connexions neuronales, ainsi que la récupération sensori-motrice. La stimulation du nerf vague (SNV) favorise cette récupération, mais son mécanisme d’action reste à démontrer. Ce projet s’inscrit dans la thématique du laboratoire.
Bénéfices attendus
L'objectif est de valider l'hypothèse que la SNV permet d'amplifier l'activité du cortex cérébral lors de la phase de réparation après un AVC expérimental, et ainsi d'améliorer la récupération des fonctions sensori-motrices perdues avec l'AVC.
Procédures
Quatre procédures sont prévues dans cette demande. Ces 4 procédures seront réalisées, (avec des modalités différentes, clairement explicitées dans les paragraphes concernés) pour tous les animaux. A savoir : 1. une microchirurgie permettant de réaliser une ischémie du cortex cérébral ainsi que d'équiper l'animal avec une électrode de stimulation du nerf vague. Les animaux seront maintenus en vie 28 jours au maximum. La chirurgie durera environ 1h. Les performances motrices de l’animal seront sensiblement diminuées pendant les 48h suivant l’intervention, après quoi son état s’amméliorera de jour en jour grâce à la récupération sensori-motice. 2. des tests d'évaluation des capacités sensori-motrices. L'animal sera soumis aux tests sensori-moteurs pendant une quinzaine de minutes par jour de tests. 3. La stimulation du nerf vague (SNV) indolore et sans effet inconfortable pour l'animal sera pratiquée pendant la tâche comportementale ou alors sous anesthésie générale (30 min). 4. L'enregistrement électrophysiologique (2 h) sera pratiqué exclusivement sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Nuisances : - La microchirurgie au niveau du crâne et la suture de la peau à ce niveau entraînera une plaie sur 1 cm, qui sera traitée. - L'occlusion d'une branche de l'artère cérébrale induira une déficit partiel de la force musculaire du côté opposé à la lésion, le plus souvent réversible au cours des 3 semaines qui suivent. - La pose de l'électrode autour du nerf vague et la suture de la peau à ce niveau (cou) entraînera une plaie sur 1,5 cm qui sera traitée (résorption en quelques jours). Les muscles et les organes ne seront pas endommagés. Au total, notre expérience de plusieurs années sur ce modèle modéré d'AVC montre que les animaux supportent ces procédures sans complication et sans manifester une douleur ou une détresse que nous ne puissions traiter. - La stimulation du nerf vague, à l'intensité choisie, n'entraîne pas d'inconfort, de douleur ou de perturbation métabolique ou physiologique nuisible. Tout au contraire, il s'agit d'une stimulation employée chez l'animal et chez l'homme pour réduire les symptômes de dépression, pour limiter l'épilepsie ou pour inhiber la douleur. Le retour sur les précédant projets autorisés utilisant ces mêmes procédures ont montré que le seuil des points limites n'a jamais été franchi. Nous sommes donc confiant que le présent projet n'occasionnera pas d'effet inattendus.
Devenir
Le cerveau de tous les animaux utilisés dans ce projet sera prélevé pour des exploitations histologiques (analyses histopathologique et immunohistochimique).
Remplacement
Ce projet permettra d’analyser un mécanisme physiologique hautement intégré qui ne peut pas être reproduit de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. Les paramètres physiologiques concernés n'existent que dans la situation "in vivo''. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.
Réduction
Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante (277 souris mâles adultes), en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience. Le nombre d’animaux nécessaire a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études et de la littérature en vigueur. L’utilisation d'un modèle d'AVC modéré génère une lésion uniquement corticale de quelques millimètres cube (7 en moyenne) ce qui n’occasionne pas de handicap lourd chez les animaux ni de mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Concernant le critère de raffinement, les souris seront systématiquement anesthésiées lors des procédures invasives. Seul du personnel qualifié se chargera de réaliser les expériences, en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Des points limites sont définis au préalable. Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux bi-quotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuellement en vigueur (Directive 2010/63/UE). Pour limiter le stress des animaux, les cages seront isolées dans une pièce dédiée, à l'abri du bruit extérieur. Les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum et ils seront sous surveillance constante après le déclenchement de l’AVC expérimental.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est le mammifère non primate le plus proche (phylogénétiquement) de l’Homme : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé. De fait, la souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser l’ischémie cérébrale et le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux central et la physiologie vasculaire assez similaire à celle de l’Homme en font un très bon modèle pour cette pathologie. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifère (autres groupes de vertébrés ou invertébrés) ne permettrait pas d’obtenir des données aussi pertinentes et exploitables par la communauté scientifique et médicale. Les animaux seront âgés de 8-15 semaines en début du protocole, ce qui correspond à la maturité cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC. De plus, chez l’Homme, les AVC surviennent très majoritairement chez l’adulte.
Etude en IRM de l’effet d’un inhibiteur de kinases dépendantes des cyclines sur la formation de l’œdème cérébral chez le rat en cas d’ischémie cérébrale transitoire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
31 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, 26 dans des procédures classées sévères et 5 tués sans réveil comme témoins. Chez les 26 premiers, un accident vasculaire cérébral est provoqué par occlusion d'une artère du cerveau, suivie de deux passages en IRM, pour étudier l'œdème cérébral et un candidat-médicament. Le porteur indique un taux d'échec de 30 %, dont 25 % de mortalité, et cite parmi les atteintes l'hypothermie, des difficultés à se nourrir et une douleur liée à l'œdème. Il revendique un modèle in vivo "indispensable", les modèles in vitro ne reproduisant pas selon lui les mécanismes entre cerveau et sang.
Objectifs
La World Stroke Organization rapporte 13.7 millions d'Accidents Vasculaires Cérébraux chaque année, dont 5.5 millions sont fatales. 80% des AVC sont d’origine ischémique (AIC) et sont causés par l’obstruction d’un vaisseau sanguin cérébral. Cette interruption de la circulation sanguine bloque l’apport d’oxygène et de glucose nécessaire à l’activité cérébrale, endommageant progressivement les cellules et formant un œdème cérébral avec une composante cellulaire et une composante vasculaire. Les premières heures qui suivent un AIC sont déterminantes quant à ses conséquences, mais les approches thérapeutiques actuelles sont limitées dans le temps et ne peuvent contrer l’œdème qui ne peut être soulagé que par une chirurgie décompressive invasive : l’hémicrâniectomie. L’objectif aujourd’hui pour la recherche est de proposer un traitement neuroprotecteur permettant d’élargir cette fenêtre thérapeutique en protégeant les cellules et en limitant l’œdème cérébral. Notre équipe travaille sur un candidat médicament répondant à ces attentes. C'est un inhibiteur de kinases cyclines dépendantes dont les effets neuroprotecteurs et anti-œdémateux à 24 et 48h post-AVC ont été montrés dans différentes études indépendantes dans un modèle d’ischémie cérébrale focale transitoire chez le rat. Nos résultats histologiques préliminaires indiquent un effet potentiel de notre molécule sur l'œdème cellulaire. D'autre part, les biomarqueurs de pathologie neurodégénératives constituent un axe de recherche aux enjeux majeurs, cependant ils ne sont pas encore appliqués aux AVC. De plus en plus de recherches suggèrent que certaines molécules anormalement présentes dans le sang en cas d'AVC pourraient être utilisées pour le diagnostic et le suivi de cette pathologie. Parmi environ 150 candidats, nous avons sélectionné l'aquaporine-4, un canal perméable à l'eau situé à l'interface entre le sang et le cerveau particulièrement impliqué dans l'œdème cérébral et dont la présence dans le sang a récemment été rapportée dans une étude pilote chez l'homme. Cette étude a 2 objectifs : 1) évaluer l'effet de notre candidat médicament sur la formation de l’œdème cellulaire cérébral à un stade précoce de l’AVC en imagerie par IRM ; 2) identifier un potentiel marqueur sanguin de l’AVC chez le rat.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra dans un premier temps d’étudier l'effet de notre candidat médicament sur l'œdème cérébral en cas d'AVC ischémique en IRM. L’impact de notre molécule sur l’œdème n’a jamais été mesurée par cette technique. Dans un second temps, la comparaison des taux d’aquaporine 4 dans le sang des différents groupes nous permettra d’identifier un potentiel marqueur de l’AVC et d’investiguer l’effet de notre traitement sur ce marqueur. A terme, ce projet pourrait mener au développement d’une solution thérapeutique innovante pour le traitement des AVC.
Procédures
Au total, 31 rats mâles Sprague-Dawley adultes (6-8 semaines) seront utilisés dans cette étude, et inclus dans une procédure 1 intitulée « Etude de l’oedème cérébral en IRM après induction d’une ischémie cérébrale transitoire chez le rat ». Cette procédure comprend l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (ACM) permettant de reproduire un AVC ischémique (~30min), l’administration en aveugle du traitement ou de son placebo (~15min), deux passages à l’IRM (~30min chaque) à 6h et 24h post-AVC et la mise à mort des rats. Trois groupes de rats seront distingués au cours de cette procédure : un premier groupe de 13 rats recevra le traitement, un second groupe de 13 rats recevra le placebo, et un troisième groupe de 5 rats sera seulement mis à mort pour constituer un groupe contrôle sans AVC ni traitement. Ces rats contrôles ne passeront pas d’IRM. Par ailleurs, l’atteinte d’un point limite au cours du protocole entrainera la mise à mort immédiate de l’animal.
Impact sur les animaux
Les procédures expérimentales ont été conçues de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. La procédure a un taux d’échec de 30% : la chirurgie du modèle d’ischémie cérébrale par occlusion temporaire de l’artère cérébrale moyenne via l’insertion d’un filament dans l’artère carotide externe est un modèle complexe qui a un taux de mortalité de 25% et un risque d’un mauvais placement du filament qui n’induit pas d’AVC ischémique de 5%. Les nuisances attendues pour les animaux sont : (1) Une hypothermie : au cours de la chirurgie, le risque d’hypothermie est strictement monitoré à l’aide d’une sonde rectale et d’un tapis chauffant, cependant certains rats peuvent avoir du mal à réguler leur température corporelle après la chirurgie, c’est pourquoi des mesures seront prises pour prévenir tout risque d’hypothermie jusqu’à la mise à mort des animaux. (2) Une diminution de leur capacité à se nourrir et à s'abreuver : la zone d’opération se trouvant au niveau des muscles mandibulaires, les rats peuvent avoir du mal à mastiquer et à se redresser pour atteindre la mangeoire et le biberon d’eau. (3) Une douleur céphalée conséquente à l’œdème cérébral apparait dans les premières heures après la chirurgie. L’intensité de cette douleur dépend du degré de sévérité de l’AVC et est évaluée lors du test de suspension par la queue. Cette douleur peut également gêner le redressement pour atteindre la mangeoire et le biberon d’eau, malgré l’analgésie mise en place post-chirurgie. (4) Une gêne pour se déplacer : une paralysie de la patte avant droite apparait au cours des premières heures après la chirurgie. Cette atteinte est plus ou moins importante selon le degré de sévérité de l’AVC et est mesurée dans le neuroscore via le test de rotation. (5) Un stress au cours au transport : 5h et 24h après la chirurgie, les animaux seront transportés vigiles à l’aller et au retour dans une cage de transport entre l'animalerie et l'IRM. Ces quatre trajets de 10-15 minutes en voiture peuvent engendrer un stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort par une personne compétente selon une méthode de mise à mort réglementaire et les informations sont conservés pour les contrôles de la SBEA, du vétérinaire référent de l'établissement ou des services vétérinaires départementaux.
Remplacement
S’il existe des modèles alternatifs in vitro recréant des conditions ischémiques sur des cultures de cellules cérébrales, ils ne permettent pas d’étudier les mécanismes inflammatoires complexes et coordonnés entre différents tissus (cerveau-sang), formés de multiples types cellulaires, ni le développement de l’oedème cérébral et sont donc inappropriés à notre étude. De plus, ce projet s’inscrivant dans la continuité de notre étude de l’effet du traitement test sur le cerveau du rat en cas d’AVC, il est indispensable d’utiliser le même modèle expérimental pour intégrer et comparer nos résultats. Cependant, en accord avec les exigences de remplacement et de réduction, des tests in vitro ont préalablement permis de sélectionner la molécule traitement parmi plusieurs candidats médicaments et de définir une gamme étroite de concentrations efficace in vivo.
Réduction
Un test sur un rat mort récupéré de notre précédent projet a été effectué au préalable pour vérifier la faisabilité de l’expérience et mettre au point les paramètres de l'IRM, évitant l'inclusion de rats supplémentaires dans l'étude pour le réglage de l'IRM. La procédure n°1 d’étude de l’effet du traitement sur l’oedème est réalisée sur le nombre d’animaux minimal tout en permettant d’accomplir son objectif. D’après nos précédentes études et en se basant sur la méthode statistique d'estimation développée par Noordzij et al. (2010), un effet sur l’oedème cérébral est observable et significatif à partir de 8 rats par groupes. L’induction de l’ischémie cérébrale a un taux d’échec d’environ 30%, comprenant la mortalité (25%) et le risque d’un mauvais placement du filament qui n’induit pas d’AVC ischémique (5%), c’est pourquoi nous prévoyons 13 rats par groupes. Nous estimons que 5 rats non ischémiés seront suffisants à l’acquisition de données de « contrôle » étant donné qu’il n’y a aucun risque de perte. Les tests statistiques utilisés par la suite seront Student ou ANOVA (données paramétriques), ou Mann Whitney ou Kruskal-Wallis (données non paramétriques).
Raffinement
Pour limiter leur stress et selon les mesures de raffinement, une période d’acclimatation de 1-2 semaines sera respectée à leur arrivée. Les rats opérés seront gardés par 2 pour réduire leur stress avant et après chirurgie. Le transport en voiture entre l’animalerie et l’IRM pouvant engendrer un stress chez l’animal, un temps de calme de 20-30min sur tapis chauffant sera respecté avant toute manipulation de l'animal à l’aller et au retour. Au cours de la chirurgie, l’hypothermie est compensée par l’utilisation d’un tapis chauffant thermostaté à 37°C relié à une sonde rectale et par une couverture de survie. Après la chirurgie, la cage des rats sera posée sur un tapis chauffant à l’animalerie et à l’IRM pendant les phases de calme et de réveil de l’anesthésie. Un pack de gel chauffé à 30-37°C sera placé dans le fond de leur cage pendant leur transport et sous leur ventre pendant les 30 minutes d’IRM. Pour contrer les difficultés à se nourrir et à s’abreuver après la chirurgie, des pipettes à tige longue seront mises à leur disposition et des croquettes humidifiées (pellets mélangés à de l’eau) seront placées dans le fond de leur cage. L’option des DietGels a été écartée puisqu’ils contiennent du glucose, composé influençant le volume de l’œdème ; les alternatives sans glucoses ont été testées mais les animaux ne s’y intéressent pas. En accord avec le vétérinaire référent, une stratégie d'analgésie par injection sous-cutanée de lurocaïne 0,5% (7mg/kg) préopératoire sur le site d’incision associée à la buprénorphine post-opératoire (0,03-0,05mg/kg 2x/jour) a été privilégiée. Du gel ophtalmique sera également appliqué avant la chirurgie afin de protéger les yeux des animaux. Ils bénéficieront d'un soin adapté par l'utilisation d'anesthésique et analgésique avant l’IRM et avant leur mise à mort.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront adultes, âgés de 6-8 semaines, pesant 320g +/- 40g, notre étude principale portant sur des pathologies principalement observées chez l’adulte et visant à traiter les patients victimes d’un AVC. Nous avons choisi la même espèce de rat pour cette étude pilote que pour nos études sur l'AVC puisqu'il s'agit d'une mise au point propre à l'espèce. Nous travaillons sur un modèle d'ischémie focale transitoire chez le rat, espèce que nous avons sélectionnée pour son système vasculaire cérébral très similaire à celui de l’homme, en faisant un modèle de choix pour reproduire un AIC. De plus, ce type d’ischémie cérébrale est déjà bien décrit chez le rat et de nombreuses données sont disponibles, nous permettant d’anticiper et de comparer nos résultats. Le rat est également l’espèce de référence dans les études de pharmacologie et les études précliniques. L’utilisation du rat évite de mettre en place de nouvelles études préliminaires pour valider le modèle, et donc d’augmenter le nombre d’animaux nécessaire.
Evaluation de l’impact d’approches thérapeutiques sur la force musculaire de modèles murins de maladies neuromusculaires
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
180 souris vont être utilisées dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles proviennent d'un autre projet où elles ont reçu par voie intramusculaire ou générale des molécules candidates ou une solution saline, puis subissent une mesure de la force musculaire de vingt à trente minutes avant d'être tuées pour prélever leurs muscles. Le projet vise à trier des candidats-médicaments contre la myopathie de Duchenne, un "réel bénéfice thérapeutique" pour les patients restant renvoyé au conditionnel. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet aujourd'hui de tester le bénéfice fonctionnel de ces traitements sur la fonction musculaire.
Objectifs
Ce projet de recherche vise à développer des outils moléculaires de transfert de gène et d’approches antisens dont l’objectif principal est l’identification d’un ou plusieurs candidats susceptibles d’être utilisés dans de futurs essais cliniques pour des pathologies neuromusculaires et en particulier sur la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le challenge est d’autant plus grand qu’il s’agit de maladies qui nécessitent un traitement du corps entier. Au-delà de l’atteinte purement musculaire nécessitant un traitement du corps entier par voie systémique, le coeur et le système nerveux central (aspect cognitif) représentent aujourd’hui les cibles à traiter pour espérer un réel bénéfice thérapeutique. Ainsi, face à ces contraintes physiopathologiques, les stratégies thérapeutiques et les outils moléculaires développés se doivent de répondre efficacement à ce défi. L’évaluation générale de ces différentes approches sur les modèles murins de maladies neuromusculaires fait l’objet d’une autre demande d’autorisation préalablement acceptée. Cette autorisation regroupe notamment la description des procédures d’administration des molécules thérapeutiques (par voie locale ou systémique).
Bénéfices attendus
L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques susceptibles d’être utilisées dans de futurs essais cliniques pour le traitement de la DMD. Les bénéfices attendus de ce projet sont donc de pouvoir sélectionner les molécules candidates présentant le plus fort potentiel thérapeutique permettant une amélioration significative de la fonction musculaire chez les modèles animaux etudiés, et à plus long terme chez les patients DMD traités.
Procédures
Dans le présent projet, les animaux subiront une procédure unique (d’une durée de 20 à 30 minutes), classée sans reveil. Cependant, les animaux seront ré-utilisés d’un autre projet dans lequel les souris auront reçu les molecules thérapeutiques ou la solution saline contrôle par voie intramusculaire ou systemique (procédures modérées).
Impact sur les animaux
Il s’agit d’une procédure sans réveil pratiquée depuis de nombreuses années dans l’établissement utilisateur (pour d’autres projets). Par expérience, les effets indésirables associés sont très limités. Lors de la procédure, les animaux seront sous profonde anesthésie gazeuse ainsi que sous analgésie. Les risques ou nuisances possibles liés à cette procédure sans réveil sont des risques anesthésiques et incluent un possible réveil ou une détresse respiratoire. »
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de collecter l’ensemble des tissus d’interet (notmament muscualire) et de valider l’impact du traitement au niveau moléculaire (Analyse ARN, protéine, etc.)
Remplacement
Dans notre respect de la règle des 3R, nos outils thérapeutiques font systématiquement l’objet d’une évaluation in vitro des modèles cellulaires afin de ne sélectionner que les meilleurs candidats et d’éviter ainsi le recours systématique à des méthodes d’évaluation in vivo. Cependant, dans le cas d’un développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux s’avère indispensable pour sélectionner les molécules les plus prometteuses et qui permettent d’envisager un reel beenfice thérapeutique chez les futurs patients traités. Il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro permettant de tester le bénéfice fonctionnel (notamment sur la fonction musculaire) de ce type de traitement.
Réduction
Seules les molécules ayant démontré une efficacité à la fois in vitro dans des modèles cellulaires et dans des analyses préliminaires in vivo (études pilotes sur un nombre d’animaux réduits (n=3-4) afin de valider la restauration de protéine dystrophine dans les muscles traités (projet « Evaluation d’approches de thérapie génique et de stratégies antisens pour des maladies neuromusculaires »), seront utilisées dans le présent projet visant à mesurer la fonction musculaire. Les évaluations fonctionnelles réalisées dans le cadre de ce projet sont réalisées en routine depuis de nombreuses années dans l’établissement et le nombre d’animaux requis pour atteindre les objectifs scientifiques est par conséquent bien établis et déjà réduit au strict minimum (n=10 par groupe, soit un nombre total de 180 animaux au maximum).
Raffinement
Le personnel expérimental vérifiera que les animaux se portent bien dès leur arrivée dans l’Etablissement utilisateur et ce jusqu’au début de la procédure sans réveil (à la suite de laquelle les animaux seront directement euthanasiés). Si jamais un point limite était atteint, l’animal serait immédiatement euthanasié. Lors de la procédure, les animaux seront sous analgésie et profonde anesthésie gazeuse. Si l'animal se réveille ou est mal endormi, l'expérimentateur procèdera une nouvelle fois à une induction mais plus importante (3% par exemple). Il vérifiera qu'il n'y ait aucune réponse à stimulation tactile avant de procéder à la chirurgie. En cas de détresse respiratoire due à l'anesthésie, le flux d'isoflurane sera coupé 15 secondes. Lorsque la respiration redevient normale, l'isoflurane sera relancé et baissé à 2%. Après quelques minutes, les réponses à la stimulation tactile seront vérifiées à nouveau. En cas de réveil survenant lors de l'opération, l'animal sera euthanasié immédiatement.
Choix des espèces
Seuls des modèles murins sont utilisés dans ce projet de recherche. Les modèles murins mdx, mdx52 et mdx5CV sont les modèles les plus couramment utilisés pour l’évaluation préclinique de molécules thérapeutiques pour la DMD car ils reproduisent le défaut génétique observé chez les patients, à savoir une mutation dans le gène DMD invalidant la production de protéine fonctionnelle. Ces modèles permettent une évaluation de l’efficacité de nos outils au niveau moléculaire comme fonctionnel. Les animaux utilisés seront des souris d’âges adultes afin d’évaluer la réversion d’un phénotype neuromusculaire pathologique déjà présent. Les animaux utilisés seront des souris d’âges adultes afin d’évaluer la réversion d’un phénotype neuromusculaire pathologique déjà présent.
Apport de la thérapie génique pour traiter les déficits visuels, auditifs et d’équilibre dans des modèles murins du syndrome de Usher de type 1B
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
5 694 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 954 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 620 un niveau léger et 120 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections dans la cochlée ou sous la rétine sous anesthésie, puis des tests auditifs, des tests d'équilibre (rotarod, suspension par la queue, nage) et des électrorétinogrammes, pour évaluer une thérapie génique contre le syndrome de Usher. Le porteur indique que les souris déficientes présentent surdité et troubles de l'équilibre et n'attend aucune aggravation. Il affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit le fonctionnement de la rétine et de l'oreille interne.
Objectifs
Le syndrome de Usher de type 1B (USH1B), causé par une mutation dans le gène MYO7A, représente plus de la moitié des formes héréditaires de surdicécité. Il n’existe à ce jour aucun traitement pour prévenir et/ou corriger les déficits sensoriels responsables de ces atteintes auditives et visuelles. Depuis peu, la thérapie génique est l’une des pistes explorées pour soigner ces déficits. Notre objectif est d’évaluer l’effet d’une telle approche dans des modèles murins du syndrome de Usher de type 1B (USH1B). Nous testerons deux stratégies de transfert de gènes (via des vecteurs viraux ou via des liposomes) dans des souris génétiquement modifiées (déjà créées ou à créer, mâles et femelles, nouveau-nés et adultes).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables des pertes visuelles et auditives décrites dans le syndrome de Usher de type 1B et de développer des stratégies thérapeutiques capables de prévenir et/ou retarder la maladie. A court terme : - L’utilisation de souris humanisées nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables de la maladie dans les cellules sensorielles de la rétine et de l’oreille interne. - L’injection des formes courtes de la Myosine 7A (mini-MYO7A) nous permettra de mieux comprendre le rôle des différents domaines constituant la Myosine 7A et leur implication dans le syndrome de Usher de type 1B. - Nous identifierons les méthodes les plus efficaces pour exprimer la protéine non mutée ou réparer la protéine mutée et déterminerons l’efficacité de la thérapie génique dans la correction des troubles auditifs, vestibulaires et visuels chez des souris porteuses de mutations dans le gène Myo7A. A long terme : Nous espérons avec ce travail développer des outils utilisables dans des essais pré-cliniques et cliniques et qui permettront de prévenir ou retarder la cécité et la surdité chez les patients atteints du syndrome de Usher de type 1B. Ceci inclut : - la découverte d’un mini gène fonctionnel et prêt pour de potentiels essais cliniques, - la mise en évidence d’approches nouvelles pour le transfert de gène non viral, - la mise en évidence de l’efficacité in vivo de l’édition de gène pour la correction de mutations spécifiques, Les méthodes que nous allons développer pourraient permettre de traiter d’autres maladies affectant des gènes de grande taille.
Procédures
Chirurgie : Les animaux seront soumis à des injections intracochléaires ou à des injections sous-rétiniennes. Ces injections se feront sous anesthésie gazeuse et analgésie, elles seront uniques et ne dureront pas plus de 10 minutes. Tests auditifs : Les souris injectés au niveau de l’oreille interne seront soumises à des tests auditifs dès l’âge de 3 semaines. Ces tests pourront être répétés à 1, 2 et 3 mois. Les souris seront anesthésiées par voie intrapéritonéale puis exposées à de brefs stimuli sonores d’intensité et de fréquence croissantes. Les potentiels auditifs évoqués seront enregistrés à l’aide d’électrodes sous-cutanées placées à proximité du nerf facial. Les produits de distorsion des oto-émissions acoustiques seront enregistrés à l’aide d’une sonde placées à l’entrée du conduit auditif. L’ensemble de ces enregistrements ne durera pas plus de 30 minutes par session. Tests d’équilibre : Les souris injectées au niveau de l’oreille interne seront également soumises à des tests comportementaux destinés à évaluer leur fonctions vestibulaires. Leurs déplacements seront analysés à l’aide d’un système de vidéo (2 minutes). Leur capacité d’équilibre sera quantifié à l’aide d’un système rotarod (31 minutes) et d’un test de maintien sur une plateforme surélevée (2 minutes). Leur capacité d’orientation dans l’espace sera évaluée grâce à un test de suspension par la queue (15 secondes) et par un test de retournement (15 secondes). Un test de nage sera finalement réalisé (30 secondes) avant le retour en cage d’hébergement. Tests Visuels : Les souris injectées au niveau de la rétine seront soumises à des électrorétinogrammes (ERG) entre 2 et 11 mois post-injection. Elles seront placées à l’obscurité 3 heures avant leur anesthésie par voie intrapéritonéale, puis exposées à de brefs flashes lumineux d’intensité croissante. Les réponses électriques générées par les photorécepteurs et neurones rétiniens seront enregistrés à l’aide d’électrodes placées sous les paupières. Des ERG seront également réalisés entre 0 et 60 minutes après désensibilisation à la lumière (exposition de 3 minutes à une intensité lumineuse déterminée). Prélèvement d’organes : Les tissus seront récupérés post-mortem.
Impact sur les animaux
Les souris déficientes en myosine VIIa (souris shaker-1) sont atteintes de surdités et présentent des troubles de l’équilibre. Les déficits visuels sont peu marqués et ne provoquent aucun changement comportemental. Les nouvelles lignées de souris que nous souhaitons créer pourraient présenter des phénotypes similaires. Aucune aggravation de phénotype n’est attendue pour ces nouvelles lignées de souris déficientes en Myosine-7a. Les injections intracochléaires et sous-rétiniennes seront réalisées sous anesthésie gazeuse et analgésie, en conditions optimales d’asepsie et avec un contrôle rigoureux des animaux en post-opératoire. Aucune dégradation de l’état des animaux n’est attendue, hormis un risque limité de cataracte. Bien au contraire, nous espérons que le remplacement ou la correction du gène muté Myo7a contribuera à rétablir les fonctions d’équilibre voire l’audition des souris injectées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car ne pouvant être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.
Remplacement
Nous ne disposons pas à ce jour de système in vitro capable d’intégrer les mécanismes complexes impliqués dans le fonctionnement de la rétine ou de l‘oreille interne que sont : 1) la perception du stimulus visuel ou mécanique par les photorécepteurs ou les cellules ciliées sensorielles ; 2) la transduction de ce stimulus en un signal électrique ; 3) la transmission de ce signal électrique aux cellules ganglionnaires de la rétine ou aux neurones spiraux de la cochlée ; 4) le transfert via ces neurones et leurs relais de l’information jusqu’au cerveau. Le modèle animal demeure donc le seul outil disponible pour étudier les cascades physiopathologiques impliquées dans la cécité ou la surdité et pour tester l’efficacité thérapeutique de traitements préventifs ou curatifs.
Réduction
Afin de déterminer le nombre minimum d’individus par groupe expérimental, nous avons retraité les données issues de souris normales et mutantes avec un outil statistique. Afin d’éviter un éventuel « effet cage », les souris d’une même cage seront subdivisées pour recevoir au moins 2 traitements différents. Nos données quantifiées seront analysées grâce à un logiciel. Selon la taille et la distribution des échantillons, nous utiliserons différents tests paramétriques ou non paramétriques. Pour certaines procédures, les mêmes animaux seront utilisés pour nos tests comportementaux et auditifs, puis mis à mort pour collecte des tissus.
Raffinement
Un igloo et des copeaux de carton seront ajoutés dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification. Nous renforcerons l’enrichissement des cages hébergeant des souris présentant un trouble de l’équilibre, par l’ajout de deux tubes en carton et de bâtonnets en bois. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des souriceaux. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront régulièrement inspectés pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort.
Choix des espèces
Les cellules et les molécules impliquées dans le fonctionnement de l’œil et de l’oreille interne sont comparables chez l’homme et la souris. Les pathologies qui nous intéressent ont déjà des modèles murins. Ces modèles, complétés de ceux que nous souhaitons créer, vont nous permettre d’explorer les preuves de concept thérapeutique que nous pourrons transposer, du moins conceptuellement, chez l’homme. Les injections sous-rétiennes se feront sur des animaux âgés de 30 jours, soit à un stade où l’espace sous-rétinien est bien formé. Les injections intracochléaires se feront sur des souris âgées de 1 jour, soit à un stade immature où les cellules sensorielles ne sont pas encore trop affectées. La mise à mort se fera entre 6 jours et 11 mois post-injection pour évaluer les effets à court, moyen et long terme d’une correction génique.
Travaux Pratiques d’introduction à l’expérimentation animale et de physiologie animale
- Enseignement supérieur
Rats : 140
70 souris et 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, les souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et les rats dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil. Les souris servent à des étudiants pour apprendre la contention et une injection de sérum physiologique, les rats sont opérés sous anesthésie avec pose d'une canule dans la trachée et de cathéters dans la jugulaire et la vessie, pour des mesures de ventilation et de diurèse. Le porteur indique que le règlement de l'animalerie interdit toute réintroduction et que les corps sont congelés pour des travaux pratiques de dissection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive satisfaisante ne remplace ces séances.
Objectifs
Dans le cadre de notre formation universitaire, régi par un programme pédagogique national, nos étudiants sont amenés à "mettre en oeuvre les techniques d'expérimentation animale pour mieux comprendre le fonctionnement, la physiologie des systèmes/appareils des organismes animaux. Ils doivent ainsi acquérir les compétences suivantes: 1) Manipuler les animaux de laboratoire; 2) Respecter la réglementation, les règles de la bioéthique; 3) Maîtriser les techniques liées à l’expérimentation animale utilisées en physiologie animale. Ces compétences de base doivent leur permettre ensuite de mettre en œuvre les techniques d'expérimentation animale pour des études de toxicologie, de pharmaco-cinétique, ou encore des études du métabolisme.
Bénéfices attendus
Ces TP sont extrêmement importants dans le cursus de ces étudiants. La formation doit les amener à être directement opérationnels en laboratoire de recherche. Cette première approche permet ainsi de les confronter à la réalité de l’expérimentation animale, et de les sensibiliser au respect absolu de la réglementation, en particulier aux procédures de raffinement. Ils permettent de lever l’appréhension d’un certain nombre d’étudiants et de les conforter ou non dans leur désir de travailler sur l’animal et de s’engager dans cette démarche. Le 1er TP d'introduction au semestre 1 (sur la souris) leur permet d’aborder plus sereinement les TP de physiologie (sur le rat) qui ont lieu au semestre 2. Le résultat pédagogique est extrêmement satisfaisant, car les étudiants sont extrêmement impliqués et se montrent transformés (positivement) entre le début et la fin des TP. Les TP du semestre 2 représentent une réelle "plus value" pour nos étudiants qui peuvent être amenés à manipuler des animaux dans leurs fonctions ultérieures. Le retour des étudiants est unanime.
Procédures
Dans le cadre du TP d'introduction à l'expérimentation animale, les souris seront manipulées par les étudiants dans un premier temps pour se familiariser avec l'animal de laboratoire (30 minutes à 1 heure), puis pour apprendre la contention de base (1 heure à 1h30), mais également pour réaliser une injection sous cutannée ou intrapéritonéale de sérum physiologique (30 minutes). Dans le cadre des TP de physiologie animale, les rats seront manipulés selon une procédure d'anesthésie sans réveil. Différentes procédures seront menées sur ces animaux : pose d'une canule dans la trachée (30 minutes), pose d'un cathéter dans la veine jugulaire (1 heure), et pose d'un cathéter dans la vessie (30 minutes). Concernant le TP sur la ventilation, le protocole de mesure de la ventilation est ensuite estimé à environ 20 minutes maximum. Concernant le TP sur la diurèse et la pression artérielle, le protocole de mesure est ensuite estimé à environ 1 heure maximum. Dans tous les cas, aucun prélèvement ne sera effectué.
Impact sur les animaux
Concernant le TP d'introduction, hormis un stress lié à la manipulation des souris pour l'apprentissage de la contention, aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu. Concernant les TP de physiologie, la buprénorphine peut entrainer une faible dépression cardio-vasculaire.
Devenir
Le règlement de l’animalerie interdisant la ré-introduction d’animaux après expérimentation, tous les animaux sont euthanasiés (dose létale de pentobarbital) à l'issue des TP. Une fois euthanasiés, les animaux sont congelés et utilisés ultérieurement pour des TP d’anatomie/dissection.
Remplacement
Il n’existe actuellement aucune méthode substitutive satisfaisante qui permettrait le remplacement de ces séances telles qu’elles ont été conçues pour préparer les étudiants à la réalité des procédures en laboratoire de recherche et au respect de la règle des 3R.
Réduction
Le nombre total d’animaux concernés pour l’ensemble des cinq années et 28 étudiants pas promotion (partagés en 2 groupes de 14 étudiants) est de 210, dont 70 souris et 140 rats. En effet, dans le cadre du TP d’introduction, chaque année, 14 souris seront utilisées (une souris par étudiant), les souris du groupe du matin étant ré-utilisées pour le groupe de l’après-midi. Afin de réduire le nombre de rats (28/an contre 42/an précédemment), nous avons décidé de supprimer une séance de TP par rapport aux années précédentes. La saisine actuelle ne comprend par conséquent que 2 protocoles expérimentaux sur les rats, contre 3 les années précédentes. Ainsi, sur 5 ans, 70 rats de moins seront utilisés dans le cadre de cette formation. Par ailleurs, les animaux euthanasiés seront congelés et utilisés pour des TP d’anatomie/dissection.
Raffinement
La formation ne dispose pas d’animalerie. Nous utilisons donc l’animalerie de l’UFR dédiée à la recherche qui existe sur le site. Les animaux sont réceptionnés au minimum 5 jours avant chaque TP. Les animaux sont stabulés dans des cages ayant une surface de 410 cm2 et une hauteur de 12cm (souris) ou ayant une surface de 820 cm2 et une hauteur de 15cm (rats) contenant de la litière mélangée à du coton. Des "maisons dômes" en carton et des tunnels en plexiglass rouge sont ajoutés aux cages des souris et des rats, respectivement. Une surveillance quotidienne est effectuée par le personnel de l'animalerie. Il y a 4 souris ou 2 rats par cage, la température de l'animalerie est de 21°C +/- 2, la nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Une alternance jour/nuit de 12h est respectée. Dans le cadre des TP d’introduction/contention, chaque étudiant est invité à faire une démonstration de contention à l’enseignant. Si l’enseignant estime la contention réalisée correctement, il invite ensuite l'étudiant (uniquement dans le cadre du volontariat) à pratiquer une injection de sérum physiologique par voie sous-cutanée ou par voie intrapéritonéale sous le contrôle exclusif de l’enseignant habilité et formé aux gestes garantissant le bien-être des animaux. Dans le cadre des TP de physiologie animale, les rats seront anesthésiés avant l'arrivée des étudiants selon un protocole mis au point avec l'aide d'un vétérinaire. Une prémédication permet de réduire la dose du mélange anesthésique administré, mais aussi de rendre l’anesthésie plus facile et surtout permet une analgésie plus efficace, plus profonde, et plus longue. Au cours de la séance, si le rat montre des signes de réveil, l'injection d'une dose supplémentaire d'anesthésiant sera pratiquée par les enseignants.
Choix des espèces
Le rat et la souris seront utilisés lors des séances de travaux pratiques. Ces deux espèces mammifères ont une physiologie assez proche de l’homme. La souris sera utilisée pour les travaux pratiques sur l’apprentissage de la contention car c’est un petit animal facile à appréhender pour des étudiants n’ayant pas l’habitude de manipuler les animaux. Par ailleurs, nous avons choisi de réaliser ce TP avec des souris de souche OF1 ou Swiss réputées calmes et non agressives. Pour les autres TP le rat sera utilisé car il y aura nécessité de réaliser des procédures au niveau des abords veineux et la taille du rat est mieux adaptée. Les animaux ne sont pas identifiés. Ils seront utilisés à maturité sexuelle afin de ne pas avoir des animaux trop petits et faciliter les expériences. Les rats utilisés ne proviennent pas de notre animalerie qui n'est pas une animalerie d'élevage. Il s'agit d'anciens mâles reproducteurs (animaux de réforme). Concernant les souris, nous ne sommes pas en mesure d'utiliser des souris de réforme de notre animalerie pour plusieurs raisons. En premier lieu, l'animalerie n'est pas une animalerie d'élevage et n'est donc pas en mesure de fournir 14 souris de réforme à une date précise. Le responsable de l'animalerie pourra le confirmer. Par ailleurs, la quasi totalité des souris de l'animalerie sont de la souche B6, connue pour être nerveuse et agressive, ce qui n'est pas idéal pour un TP d'initiation à l'expérimentation animale, à la contention.
Développement d’un pancréas bioartificiel : validation de matrices d’encapsulation d’îlots pancréatiques de rats et humains.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 791 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 008 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 783 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète est induit par injection de streptozotocine, suivi de chirurgies abdominales pour prélever le pancréas ou implanter des modules d'encapsulation d'îlots, avec un suivi de 91 jours et des tests répétés de tolérance au glucose. Le porteur indique qu'une dégradation rapide de l'état des rats diabétiques peut survenir malgré l'insuline, ceux perdant plus de 20 % de leur poids étant mis à mort. Il affirme le recours aux animaux "indispensable" pour évaluer le biomatériau.
Objectifs
La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie prometteuse du diabète de type 1. Celle-ci vise à remplacer les cellules béta pancréatiques (sécrétrices d’insuline) défectueuses par l’injection d’îlots sains (issus de dons multi-organe) par voie intra-portale dans le foie de patients diabétiques. Cette stratégie thérapeutique qui permet une régulation glycémique plus physiologique et moins contraignante que les injections pluriquotidiennes d’insuline.
Bénéfices attendus
La transplantation d’îlots pancréatiques comporte de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Ainsi, l’encapsulation d’îlots pancréatiques permettrait de protéger leur destruction par les réactions inflammatoires et de rejet. De plus, au vu de la pénurie d’organe inhérent à toute greffe d’organe, l’encapsulation permettrait d’utiliser des îlots pancréatiques d’espèces différentes. Par ailleurs, l’implantation de d’îlots encapsulés dans l’omentum permet de se soustraire de ces réactions inflammatoires médiées par le sang à l’origine d’une destruction massive des îlots post transplantation. Ainsi, notre stratégie permettrait de maintenir à long terme la survie et la fonction des îlots et d’appliquer la stratégie de transplantation d’îlots pancréatiques à un plus grand nombre de patients diabétiques.
Procédures
- Procédure 1 : L’injection de streptozotocine se fera en intra péritonéale à l’aide d’une aiguille 23G. L’injection réalisée sur animal vigile par une seule injection et l’intervention (et la contention) durera quelques secondes. Chez les rats devenus diabétiques, mise d’implants à insuline afin de permettre un maintien à l’équilibre de la quantité de sucre dans le sang (glycémie) et de prendre du poids (nécessaire à la transplantation des îlots). Procédure réalisée sous anesthésie générale d’environ 10 minute. Une mesure de glycémie quotidienne avec un glucomètre à partir d’une micro goutte de sang prise à la queue pour vérifier l’efficacité de notre insulino-thérapie. - Procédure 2 : Isolement d’îlots de rat qui seront inclus dans nos hydrogels. Pour le prélèvement du pancréas, une laparotomie abdominale et une cathétérisation du canal cholédoque seront réalisé sous anesthésie générale. Après quoi l’animal est euthanasié puis le pancréas prélevé (procédure sans réveil). - Procédure 3 : L’implantation des modules d’encapsulation dans l’omentum des rats se fera après incision de l’abdomen (2 cm). Chirurgie réalisée sous anesthésie générale d’une durée d’environ 15 minutes. Des anti-inflammatoires seront administrés post-chirurgie pendant 3 jours. Concernant le suivi de la survie et de la fonction des îlots implantés, celui-ci durera 91 jours. Pour cela, quotidiennement la prise de poids et la glycémie capillaire (lecteur de glycémie) seront mesurées. Hebdomadairement, une prise de sang sera effectuée pour la réalisation de divers dosage plasmatique (marqueurs de fonction de la greffe, marqueurs de l'inflammation...). Une fois par mois un test de tolérance au glucose sera réalisé. Ce test est nécessaire afin de déterminer la fonction réelle de la greffe. Ce test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capilaire à l’aide d’un lecteur de glycémie toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 6h (accès à l'eau ad libitum). Une prise de sang de 200 μL(incision de l'extrémité de la queue) et une mesure de la glycémie seront effectuées à jeun juste avant l'injection intraéritonéale du glucose.
Impact sur les animaux
Suite à la procédure d’induction du diabète et/ou la perte progressive de la fonction du greffon, une dégradation rapide de l’état sanitaire des animaux diabétiques pourrait survenir malgré l’administration d’insuline et la transplantation des îlots. Cela pourrait se manifester par une diminution marquée de l’activité ou à l’inverse une hyperactivité, une diminution du toilettage, une perte de poids rapide supérieure à 20%, une polyurie, des hyper et hypoglycémies. Néanmoins, l’insulino-thérapie et la greffe d’îlots devraient empécher cela. Si aucune
Devenir
- Procédure 1 : « Induction du diabète par injection intra-péritonéale de Streptozotocine et mise de pompe à insuline en sous-cutanée. » Les rats devenus diabétiques poursuivent l’étude et seront utilisés dans la procédure 3. Les rats non devenus diabétiques seront euthanasiés selon la méthode décrite au 3.3.3 (« euthanasie sans préservation de sérothèque et tissuthèque (atteinte du point limite) »). - Procédure 2 : « Isolement d’îlots pancréatiques de Rat. » L’ensemble des animaux de la procédure seront euthanasiés selon la méthode décrite au 3.3.3 (« Prélèvement pancréas »). - Procédure 3 : « Implantation intra-omental des hydrogels + îlots et suivi métabolique des rats par mesure glycémique, par évaluation de la prise de poids, par tests de tolérance au glucose (IPGTT) et dosage plasmatique de biomarqueurs. » A la fin de cette procédure tous les rats seront euthanasiés selon la méthode décrite au 3.3.3 (« euthanasie sans préservation de sérothèque et tissuthèque (atteinte du point limite) ») car il s’agira de la fin de l’étude. Nous pourrons ainsi prélever le sang total pour réaliser des dosages plasmiques de marqueurs de survie et de fonction du greffon, de paramètre statuant sur la régulation de la glycémie, sur l’état inflammatoire etc… Nous prélèverons les modules d’encapsulation pour analyse (histologique ...). Enfin, nous prélèverons également les organes impliqués dans la régulation de la glycémie et impactés par le diabète afin de faire des analyses histologiqsues, de protéomique et de génomique.
Remplacement
L'étude consiste à déterminer l’efficacité de biomatériaux sur la fonction du greffon chez un sujet diabétique, ainsi, le recours à des animaux est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. Cette étude nécessitera 1791 rats.
Raffinement
Le respect du principe de raffinement intervient en premier lieu au niveau des conditions d’hébergement : les animaux auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, bénéficieront de conditions de température et d’hygrométrie régulées et conformes aux règles en vigueur, ainsi que de cages enrichies à l’aide de cylindres en PVC rouges. Les rats sont placés dans des cages de 1500cm², en fonction de leur poids (jusqu’à 200 g ils sont 6 par cage), entre 200 et 300 g ils sont 5 et ensuite un rat est enlevé par tranche de 100g). Nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes de préanesthésie, d’anesthésie et de prise en charge post-opératoire. Enfin, des points limites prédictifs et précoces ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Le Rat est la principale espèce utilisée dans de nombreuses d’études sur le diabète. En effet, lors de l’induction ou l’apparition du diabète, les rats diabétiques partagent des caractéristiques similaires à la physiopathologie du diabète chez l’Homme, notamment une glycémie à jeun supérieur à 1,26 g/L et des taux d’HbA1c (reflet de l’équilibre glycémique sur les semaines antérieures) comparables. Les rats employés pour ces études sont de souche Lewis, souche consanguine provenant d'un élevage agréé. Ils ont été préférés aux souris à cause de leur taille qui permet une aisance de manipulations, facilite les interventions chirurgicales, et permet une étude à plus long terme (environ deux mois dans de bonnes conditions par rapport à leur état diabétique). Les rats pour cette étude seront uniquement utilisés à un stade jeune adulte (Age : 8 semaines) possédant un système immunitaire. De plus, à ce stade de développement, les animaux présentent un poids idéal pour réaliser les isolements. En effet, c’est à partir de cet âge que le canal cholédoque possède une taille suffisamment grande pour réaliser facilement la cathéterisation permettant l’injection de l’enzyme utilisée pour la digestion du pancréas. Cela permettra d’obtenir un rendement d’isolement optimal.
Atteintes microcirculatoires et modification de la cinétique des anti-infectieux aux cours des états de choc par péritonite chez le porcelet anesthésié et ventilé.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
100 porcelets vont être utilisés dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque porcelet subit pendant treize heures l'induction d'un choc septique par péritonite, une ouverture chirurgicale de l'abdomen et la pose de cathéters, pour mesurer la diffusion des anti-infectieux dans les tissus. Le porteur précise qu'un réveil est impossible car le choc et les souffrances d'organes seraient douloureux. Il indique aussi que ces animaux servent à former des médecins réanimateurs, formation qu'il présente comme "indispensable" à leur pratique.
Objectifs
Les états de choc sont la principale cause de décès des patients de réanimation. Ils sont à l'origine d'atteintes vasculaires responsables d'un mauvais fonctionnement des organes. Mieux comprendre les facteurs influençant ce mauvais fonctionnement des organes pourrait modifier le pronostic des patients. Deux types de traitements sont couramment utilisés. Le premier est le remplissage vasculaire (RV). Il consiste à perfuser au malade des produits pour augmenter son volume de sang. C'était l'objet de travaux précédents qui portaient sur l'évaluation de l'efficacité de différents liquides de RV pour traiter les états de choc infectieux chez le porcelet endormi (anesthésié) et sous respirateur. L'autre principal traitement des chocs infectieux est la prescription de médicaments pour tuer les bactéries ou les champignons (antibiotiques et antifungiques) responsables de l'infection. L'efficacité de ces médicaments dépend de leur quantité dans le sang et de leur capacité à aller dans les organes. L'objectif de ce projet consiste à étudier la concentration des anti-infectieux dans un modèle de choc infectieux pour mieux comprendre leur répartition lors de l'infection et pouvoir adapter les doses et les temps d'injection. Il s'agit de la deuxième étape d'étude sur cette thématique, faisant suite à un premier modèle de choc créé par injection intraveineuse de toxine de la bactérie Eschérichia Coli. Dans cette nouvelle étude nous avons décidé de tester un modèle de choc plus physiologique en induisant une péritonite (infection abdominale). Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure sans réveil qui consistera dans un premier temps à induire un choc infectieux, puis ensuite à traiter les animaux avec le médicament à tester. Tout au long de de la procédure les animaux resteront anesthésiés et ventilés mécaniquement, leur évitant ainsi stress et douleur liée au choc. Nous étudierons la concentration des antibiotiques non seulement dans le sang, mais également dans les tissus par une technique de microdialyse qui permet de collecter des échantillons en temps réel et de réaliser des mesures sans avoir à prélever les tissus. L'atteinte des vaisseaux quant à elle sera étudiée par microcope laser. Cette technique avait déjà été utilisée dans nos projets précédents.
Bénéfices attendus
L'augmentation de la perméabilité vasculaire observée lors du choc septique et l'oedème tissulaire qui en découle influence la diffusion et la concentration des anti-infectieux dans l'organisme. Connaître cette atteinte microvasculaire et la modification de la pharmacocinétique des anti-infectieux lors du choc septique est fondamentale pour la prise en charge optimale des patients. L'étude pharmacologique nécessite un modèle reproductible stable, permettant une modélisation fiable. Le modèle porcin remplit toutes les conditions pour permettre de répondre à cette problématique. De plus, les groupes étudiés vont permettre de continuer l'étude de la micro-circulation par microscopie confocale lors du choc septique.
Procédures
La procédure complète se déroulera sur 13 heures : 1 heure environ pour la préparation de l'animal, 4 heures pour l'induction du choc septique, et 8 heures pour la collecte des données. En raison du choc septique et des souffrances d'organes, un réveil est impossible car responsable de douleur. La phase la plus douloureuse est la réalisation d'une microlaparotomie au niveau abdominal pour la mise en place d'une sonde urinaire. Elle sera réalisée après l'injection intraveineuse de sufentanil afin de prévenir la douleur. Cette ouverture chirurgicale permet également d'avoir accès au mésentère de l'intestion grêle afin de réaliser des images par Cellvizio (endomicroscope confocal laser) pour l'évaluation de la porosité des vaisseaux (ces images sont réalisées après injection intraveineuse de dextran 70 kda couplé à la fluorescéine).
Impact sur les animaux
Les animaux ne seront soumis qu'à une seule procédure sans réveil qui consistera dans un premier temps à induire un choc infectieux, puis ensuite à traiter les animaux avec le médicament à tester. Tout au long de de la procédure les animaux resteront anesthésiés et ventilés mécaniquement, leur évitant ainsi stress et douleur liée au choc induit. Nous étudierons la concentration des antibiotiques non seulement dans le sang, mais également dans les tissus par une technique de microdialyse qui permet de collecter des échantillons en temps réel et de réaliser des mesures sans avoir à prélever les tissus. L'atteinte des vaisseaux quant à elle sera étudiée par microcopie confocale. Cette technique avait déjà été utilisée dans nos projets précédents.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Il s'agit d'une étude descriptive qui a pour objectif de démontrer une théorie pharmacocinétique. Il n'existe pas de méthode alternative permettant d'atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques.
Réduction
L'étude de la pharmacocinétique (devenir du médicament dans l'organisme) des anti-infectieux se fait par modélisation mathématique qui nécessite 8 données pour chaque temps de prélèvement. Afin d'anticiper des pertes dues à l'état de choc mais qu'il est difficile de prévoir, il a été décidé de relever ce nombre à 10. Ainsi pour chaque anti-infectieux, nous utiliserons un groupe de 10 porcelets et chaque animal sera son propre témoin. En considérant l'étude de 2 anti-infectieux par an, nous envisageons d'utiliser 20 animaux par an, soit 100 animaux sur 5 ans. L'ensemble des analyses statistiques sera effectuée par une équipe de médecins statisticiens agréés qui a validé ce modèle de cinétique dans des publications internationales. De plus, les animaux de ce projet permettront en parallèle de former les médecins réanimateurs à la réalisation de gestes sous échographie et à la prise en charge du choc infectieux, indispensable à leur pratique professionnelle et requise pour la validation de leur formation.
Raffinement
Nous attacherons une importance majeure au raffinement des conditions d’hébergement et d'enrichissement pendant la période d'acclimatation d'une semaine. - Contact et observations quotidiennes par les soigneurs (apparence physique externe, comportement , réponses comportementales aux stimuli externes...). Toute anomalie est remontée au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondi, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. - Environnement adapté et enrichi : les animaux sont hébergés en groupe. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. - Procédure expérimentale réalisée par du personnel qualifié et expérimenté. L’animal reste sous anesthésie générale jusqu'au décès. Au cours des expérimentations, les animaux seront anesthésiés profondément Lors des quelques gestes invasifs et possiblement douloureux, un morphinique sera utilisé (SUFENTANIL 10 μg/h). La mise en place des cathéters sera réalisée sous échographie, évitant l'ouverture cutanée à l'exception de la ponction à l'aiguille. En raison du choc septique et des souffrances d'organes, un réveil est impossible car responsable de douleur. C'est la raison pour laquelle tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Choix des espèces
Le porc est un bon modèle d'étude cardio-vasculaire proche de la physiologie humaine. Le comportement hémodynamique et la vascularisation sont également proches de l'Homme, ce qui permet de se former sur l'animal avant l'usage chez l'Homme. De plus, notre équipe de recherche a acquis une expérience de plusieurs années sur ce modéle de grand animal permettant d'optimiser au mieux le modèle. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 2-3 mois, pour des raisons techniques d'une part (poids entre 25 et 35 kg, permettant des groupes homogènes) et pour des raisons de coût d'autre part.
Enregistrement ultrasonore, électrophysiologique et métabolique chez le macaque rhésus en expérimentation terminale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 macaques rhésus vont être utilisés dans une procédure menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque macaque subit une chirurgie du cortex visuel primaire puis jusqu'à douze heures d'enregistrements électriques, vasculaires et métaboliques sous stimulation visuelle, pour étudier le couplage neurovasculaire. Le porteur présente ces animaux comme déjà "destinés à l'euthanasie" pour raisons médicales ou comportementales et décrit leur usage comme une "valorisation" relevant de la réduction. Il ajoute que la proximité du cerveau du macaque avec celui de l'humain rend l'espèce irremplaçable.
Objectifs
Ce projet a pour finalité l’étude du couplage neurovasculaire chez l’animal anesthésié lors d’une expérimentation sans réveil. Deux grands principes seront étudiés dans ce projet : le couplage neuro-vasculaire, par l’enregistrement simultané de l’activité électrique neuronale à l’aide d’électrodes et de l’activité vasculaire à l’aide de l’imagerie fonctionnelle ultrasonore ainsi que le couplage « métabo-vasculaire » par l’enregistrement simultané de grandeurs métaboliques (comme la quantité locale de lactate, de glucose ou d’oxygène) et de l’activité vasculaire. Ces grandeurs seront enregistrées dans le cortex visuel primaire de macaques rhésus destinés à l’euthanasie dans un principe de valorisation et de réduction du nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques lors de procédures sans réveil uniquement. Le couplage neurovasculaire est une dynamique essentielle et encore mal comprise du fonctionnement neuronal, en effet, il permet d'apporter les nutriments et l'oxygène nécessaire au bon fonctionnement des neurones. Cette étude vise à mieux comprendre les dynamiques physiologiques mises en oeuvre lors de l'augmentation du besoin métabolique des neurones et de la glie afin d'affiner notre compréhension du couplage neurovasculaire. Par ailleurs, le cortex visuel est choisi car il permet d'effectuer des études passives et anesthésiées, une stimulation de la rétine pouvant engendrer des réponses vasculaires et neuronales malgré l'anesthésie. Les animaux engagés dans cette procédure seront exclusivement des animaux sur lesquels une réforme est envisagée aux vues de leur âge, état de santé, temps d'engagement dans des projets scientifiques. Les animaux n’auront pas été utilisés dans une procédure expérimentale entraînant une douleur intense, de l’angoisse ou une souffrance mais pourront présenter un état de bien-être dégradé et/ou une atteinte de leur santé, indépendamment des projets scientifiques dans lesquels ils ont été engagés. Ils ne seront pas compatibles avec les conditions de replacement telles que décrite dans la réglementation. L’objectif rejoint le principe de réduction puisque l’animal est ainsi valorisé dans une procédure sans réveil. Il est également prévu de distribuer les tissus biologiques n’ayant pas d’intérêt scientifique pour l’équipe, au sein d'un réseau de don d’organes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une compréhension plus fine du couplage neurovasculaire chez le macaque rhésus (sain ou ayant une maladie chronique, en fonction des propositions d’importation pour euthanasie reçues) afin de mieux comprendre le lien entre activité neuronale et activité vasculaire, mais aussi entre activité métabolique et vasculaire d’un point de vue intégré. En effet, les enregistrements vasculaires doivent être effectués sur l’animal vivant afin d’obtenir des données exploitables. celles-ci ne peuvent pas avoir lieu sur un animal décédé ou sur un organe en tranche car il est nécessaire d’avoir une activité cardiaque pour avoir une activité vasculaire. Grâce au réseau du don d’organes, les tissus biologiques éventuellement récupérés pourront être bénéfiques à la réalisation d’autres objectifs scientifiques, différents de ceux prévus dans cette étude.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure de classe sans réveil d'une durée maximale de 12 heures comprenant une chirurgie réalisé en condition d'aseptie au niveau du cortex visuel primaire ainsi que des enregistrements de l'activité vasculaire (par ultrasons fonctionnels), électriques (par électrophysiologie) et métaboliques (avec des électrodes adaptées à ces enregistrements) durant des stimulations visuelles.
Impact sur les animaux
L’unique procédure de ce projet est une procédure sans réveil, il n’est pas attendu de nuisances particulières en dehors de la douleur liée à la chirurgie ou d'un risque d’hémorragie, de convulsions ou mauvaise réaction à l’anesthésie.
Devenir
Euthanasie des animaux. Il s’agit d’une expérimentation terminale dans un processus de valorisation scientifique d’animaux destinés à l’euthanasie. A l'issue de cette dernière, un don de tissus sera effectué dans une optique de réduction de nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques afin de valoriser l'animal.
Remplacement
Le remplacement de l’animal n’est pas envisageable pour atteindre les objectifs fixés dans ce projet, les couplages « neuro-vasculaire » et « métabo-vasculaire » nécessitant un fonctionnement normal du système cardio-vasculaire, il n’est pas possible d’utiliser des systèmes computationnels ou autres dispositifs alternatifs à l’utilisation d’animaux. Le singe rhésus est utilisé pour sa proximité anatomo-fonctionnelle avec le cerveau humain et ne peut être remplacé par une autre espèce.
Réduction
Seuls des animaux en fin de procédure dont l’euthanasie est envisagée pour des raisons médicales ou comportementales seront utilisées dans ce projet. En aucun cas un animal naïf ou réutilisable en tant que modèle pour la recherche scientifique ou replaçable ne sera prévu pour cette procédure. Plus largement, les animaux destinés à entrer dans ce projet sont également tracés pour la distribution des tissus biologiques au sein du réseau d'un réseau de don d'organe, permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche, en faisant bénéficier au plus grand nombre de tissus simiens suite à l’euthanasie. Un total de cinq animaux est prévu sur ce projet.
Raffinement
La méthodologie utilisée dans ce projet a auparavant été mise au point chez le rongeur de laboratoire et il s’agit d’une mise en place chez le primate anesthésié avant l’utilisation de ce protocole chez le primate éveillé. Les protocoles anesthésiques et analgésiques sont quant à eux mis à jour et raffinés par la SBEA dans une démarche d’amélioration continue des pratiques. La douleur liée à la chirurgie est prise en charge de manière multimodale par des antalgiques. Par ailleurs afin de minimiser le stress et l’angoisse des animaux importés à des fins d’expérimentation terminale, ceux-ci seront importés uniquement deux jours avant la date prévue d’euthanasie (arrivée dans l’animalerie à J-2, stabulation à J-1 et euthanasie à J0) pour limiter la durée d’un hébergement individuel et ne pas perturber les animaux présents dans l’animalerie, ils seront maintenus en isolement dans un pièce d’hébergement (pas de contact visuel, sonore, olfactif). Un enrichissement adapté (vidéo, jouets manipulables, etc.) sera distribué. Pour les animaux déjà présents dans l’animalerie, ceux-ci sont hébergés dans les mêmes conditions qu’auparavant tel que décrit dans l’agrément de l’animalerie avec dans la mesure du possible un hébergement en paire ou ou avec un contact visuel et olfactif de ses congénères, une alimentation adaptée à l’espèce ainsi qu’un programme de bien-être et d’enrichissement spécifique. Des points limites sont également définis dans la procédure expérimentale.
Choix des espèces
Les macaques possèdent une architecture cérébrale semblable à celle de l’Homme, avec notamment un cortex plissé présentant de nombreux gyri et sulci. De plus, leur métabolisme est plus proche du métabolisme humain que ne l’est le métabolisme du rongeur, les deux espèces (hommes et macaques) appartenant à l’infra-ordre des catarrhiniens. De plus, le cortex visuel des primates est particulièrement développé et sa structure est stable à travers les espèces de catarrhiniens, donc l’étude vasculaire, électrophysiologique et métabolique chez le primate anesthésié est une expérimentation appropriée pour la compréhension du fonctionnement du système nerveux central chez l’Homme. Les animaux seront à un stade adulte. Il s’agit d’animaux adultes destinés à l’euthanasie pour des raisons médicales ou comportementales (maladie chronique, âge avancé, troubles du comportement, etc.) dans un but de réduction du nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques.
CIME – Caractérisation en Imagerie du Muscle squelettique de souris par Elastographie
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
20 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles subissent une imagerie échographique puis une IRM des pattes antérieures pour comparer les propriétés mécaniques des muscles de souris saines et de souris déficientes pour le gène KLF10. Le porteur souligne le caractère peu invasif de l'imagerie, l'anesthésie servant surtout à immobiliser l'animal, mais prévoit une mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie en fin de procédure. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit un muscle fonctionnel et que la souris est le seul animal porteur de cette déficience génétique.
Objectifs
Chez l’homme, le gène étudié a une influence majeure sur le développement et le fonctionnement du cerveau, du pancréas, des os ainsi que des muscles, du sein et des ovaires. Son expression anormale a une influence sur le développement de cancers, de maladies osseuses et de pathologies cardiaques. Toutefois, alors que fortement exprimé dans les muscles, son lien avec le fonctionnement musculaire reste aujourd’hui encore sous-étudié et incompris. Dans ce contexte, dans ce projet, nous comparons le développement des muscles chez des sujets sains avec des sujets chez qui le gène étudié ne s’exprime pas (lignées de souris présentant la déficience de ce gène) afin d’en isoler l’influence. La comparaison entre sujet sain et déficient s’effectuera alors grâce à des approches in vivo par imagerie médicales, par IRM et par ultrasons (approche nommée élastographie), afin de comparer les propriétés mécaniques des muscles des pattes antérieures. A l’exception de l’anesthésie, non utilisée chez les patients humains mais nécessaire pour immobiliser temporairement les animaux, ces approches in vivo, non invasives et sans douleur par imagerie ici adaptées aux petits animaux sont couramment utilisées dans différents services hospitaliers en routine clinique.
Bénéfices attendus
Le rôle du gène étudié a été mis à jour initialement dans les cellules osseuses. Compte tenu de l'avancée des découvertes actuelles, le gène KLF10 pourrait avoir une très grande importance dans de nombreuses maladies musculaires (telle que la myopathie de Duchenne caractérisée par des lésions musculaires importantes) et pendant la cicatrisation musculaire. La perspective de cette étude sera de caractériser le rôle étudié dans les pathologies musculaires pour aboutir à moyen terme à un protocole de diagnostic sans douleur basé sur l’imagerie médicale et à plus long terme à de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes incluses dans la procédure expérimentale effectuée successivement sur chaque animal : 1) Imagerie échographique des pattes antérieures de l’animal sur une machine commerciale clinique pour imagerie anatomique et mesure des caractéristiques mécaniques des muscles. (procédure de 30 minutes) 2) Installation dans un imageur IRM petit animal pour l'imagerie de l’anatomie, de l’orientation des fibres musculaires et des propriétés mécaniques des muscles par élastographie (procédure de 30 minutes). Ces acquisition seront effectuées sous anesthésie monitorée des animaux, en imageant deux sortes de muscles afin d’en dissocier les caractéristiques : un muscle aux fibres rapides et un muscle aux fibres lentes.
Impact sur les animaux
De par la nature minimalement invasive du protocole d'imagerie (au maximum insertion d'une aiguille d'acupunture), les effets indésirables correspondent exclusivement à un potentiel inconfort lié à l'anesthésie, incluant un possible refroidissement, et au potentiel stress pouvant être ressenti par l'animal avant expérimentation. Afin d'y remédier au maximum, une période d'acclimatation sera respectée, le milieu enrichi par du papier cardé, les armoires régulés en température et en humidité et un tapis chauffant sera utilisé pendant la durée totale de l’expérimentation. Les seuls effets indésirables notables sont liés à la souche utilisée. L’inhibition de ce gène est susceptible d’engendrer des changements structurels des muscles squelettiques tels que de l'hypertrophie, le passage de fibres à contractions lentes en fibres à contractions rapides ou encore des changements dans la masse musculaire.
Devenir
A l'issu de chaque procédure d'imagerie, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie. Cette méthode sera appliquée en fin de procédure ou en cas d’atteinte des points limites. La vérification de la mort se fera par observation de l’arrêt respiratoire et cardiaque, ainsi que par observation de l’opacité des yeux.
Remplacement
Bien qu'un modèle alternatif tissulaire de muscle in vitro soit en cours de développement, il ne peut reproduire les phénomènes que nous souhaitons étudier. L’utilisation d’un animal est donc une nécessité et ne saurait être remplacé à l'heure actuelle.
Réduction
Nous utiliserons des tests statistiques nous permettant d’évaluer le rôle du gène étudié dans le fonctionnement du muscle. Le nombre d’animaux tient compte des besoins expérimentaux et statistiques tout en réduisant le nombre d’animaux au minimum.
Raffinement
Concernant les souris KLF10-KO, le phénotype ne présente aucune douleur/souffrance aux animaux. Toutes les souris seront acclimatées à l'animalerie 4 à 8 j avant le début des expérimentations. Les souris disposeront de nourriture et d’eau à volonté, avec un maximum de 2 animaux par cage. L’environnement est contrôlé (température et humidité), avec un éclairage artificiel avec photopériodes 7h-19h. Du papier cardé sera disposé dans les cages afin d'enrichir le milieu. Le jour de la procédure, les animaux seront anesthésiés individuellement par voie gazeuse. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée par le réflexe palpébral. L’hypothermie due à l’anesthésie sera évitée grâce à un tapis chauffant pendant la durée totale de l’expérimentation. De l'ocrygel sera appliqué sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Toute la procédure sera effectuée avec l'objectif de maximiser le bien-être des animaux et de limiter la souffrance et la détresse. Nous avons mis en place un suivi des animaux et des traitements de la douleur.
Choix des espèces
Il n'existe à l'heure actuelle aucune modèle alternatif permettant de reproduire un muscle fonctionnel (lent ou rapide). Nos précédentes études nous ont permis d'établir la robustesse et l'intérêt pour cette problématique de santé public de ce modèle de souris inhibant l'expression du gène étudié. La souris constitue aujourd'hui le seul animal présentant un modèle avec inhibition de l'expression de ce gène. Les tests seront effectués sur les muscles squelettiques de souris adultes (3 mois, phénotype non dommageable dans cette tranche d’âge). Ce stade a été choisi pour rester dans la continuité de précédents travaux déjà publiés. Un des objectifs majeurs de nos travaux est de développer un modèle numérique du muscle de souris sain et avec déficience du gène étudié (modèle essentiellement basé sur les données acquises par imagerie médicale) pour la compréhension puis le diagnostic des effets de ce gène.
Formation aux techniques de prélèvement et d’injection
- Formation professionnelle
Rats : 600
1 200 animaux non-humains, 600 souris et 600 rats, vont être utilisés dans des procédures classées sans réveil, pour former le personnel aux gestes de prélèvement et d'injection. Chaque animal peut subir jusqu'à deux voies de prélèvement et deux voies d'injection, avec un maximum de trois essais infructueux par méthode, avant d'être tué au CO2. Le porteur présente cette formation comme un moyen d'améliorer le "bien-être" animal et la fiabilité des résultats, et prévoit d'utiliser des animaux de réforme voués à l'euthanasie. Il affirme que ces gestes ne peuvent être appris de façon réaliste sur simulateur et juge l'usage de l'"organisme entier" incontournable.
Objectifs
Les mauvais gestes de prélèvement ou d'injection chez les petits animaux peuvent engendrer des dommages ou du stress pour l'animal. Ces perturbations peuvent avoir un impact significatif sur le bien-être de l’animal et sur la valeur scientifique des résultats. L’objectif de ce projet est d'assurer une formation continue de qualité pour notre personnel ou utilisateurs afin d'améliorer le bien-être animal, de diminuer le nombre d'animaux utilisés dans les différents projets et de contribuer au bon déroulement des protocoles expérimentaux.
Bénéfices attendus
Ce projet fait appel à différentes procédures expérimentales à visée éducative. Il a pour but de raffiner les procédures de prélèvement et d'injection afin d’éviter la souffrance des animaux, de réduire le nombre d’animaux et d’obtenir des résultats scientifiques plus fiables et reproductibles.
Procédures
Les injections (per os - gavage, intraveineuse directe, intrapéritonéale, sous cutanée) seront faites sur animaux vigiles (rat et souris). Une anesthésie générale à base d’Isoflurane (4% pour induction et entre 1.5 à 2.5% pour le maintien) et une analgésie à base de buprénorphine (0.05mg/kg pour les rats et 0.1mg/kg pour les souris 30 minutes avant les manipulations) seront utilisées pour tous types de prélèvements sanguins. Nous prévoyons au maximum deux voies de prélèvements et deux voies d’injection par animal. Le nombre d’essai infructueux ne dépassera pas 3 par méthode. Le temps de manipulation pour chaque animal est estimé à 5 minutes. Après quoi, l’assistance de l’encadrant est demandée pour effectuer un dernier geste technique. Le volume total des prélèvements/animal ne dépassera pas 10 % du volume sanguin total (souris et rat).
Impact sur les animaux
Les injections seront faites avec du sérum physiologique au volume adapté au poids de l’animal (stérile, isotonique, ph physiologique et réchauffé) qui ne cause aucune douleur pour les animaux. Pour les prélèvements le nombre d’essai devrait se limiter à trois (ponctions). Par la suite l’assistance de l’encadrant doit être demandée. L’arrêt de saignement doit être assuré avant de retourner l’animal dans sa cage. Dans le cas d'une mauvaise manipulation, l’encadrant jugera du besoin de remplacement de l’animal, ou le cas échéant si un point limite est atteint de la mise à mort de l’animal.
Devenir
A la fin de chaque séance de formation, les animaux ayant subi des interventions d’injection et/ou de prélèvement ne seront pas conservés en vie pour éviter des souffrances inutiles, ils sont mis à mort par CO2.
Remplacement
L’apprentissage des procédures de prélèvement et d’injection chez les petits animaux comme la souris et le rat ne peut être simulée de façon réaliste et didactique. En outre, il n’est pas possible d’apprendre à faire par des prélèvements rétro-orbitaires ou sous maxillaires sur des vaisseaux artificiels. L’usage de l’organisme entier est incontournable.
Réduction
Les études statistiques requises habituellement dans les études scientifiques ne peuvent pas être appliquées car le projet est pour but éducatif. Le nombre des animaux est évalué en fonction du nombre des participant à cette formation. Pour réduire le nombre d’animaux commandés, nous utiliserons des souris et des rats provenant de notre établissement (animaux de réformes ou de génotype non désirés destinés à l’euthanasie).
Raffinement
Avant les procédures, Les animaux sont hébergés en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton pour les rats, des maisonnettes en plastique et dôme pour les souris, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. L'alimentation et l'eau seront distribué à volonté. Les injections seront faites avec du sérum physiologique qui sera réchauffé à l’aide d’un bain-marie ou tapis chauffant afin d’éviter la diminution de la température corporelle lors de l’administration.
Choix des espèces
Notre animalerie héberge principalement des rats et souris. La majorité des demandes de travaux pour les procédures d’injection et de prélèvement dans notre établissement utilisateur concernent principalement les deux espèces souris et rat. Afin de rentabiliser le nombre de souris, nous allons utiliser des souris de réforme en provenance de notre établissement qui doivent être mise à mort : souris en fin de reproduction, ou souris sauvage issus des différents accouplements des lignées transgéniques (2-3 mois). Dans le but de faciliter la contention, manipulation et injection pour les participants, nous utiliserons des rats adultes de 300 à 350 g commandés chez un fournisseur agréé.