Procédures sévères

360 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont irradiées puis reçoivent par voie intraveineuse des cellules sanguines humaines déclenchant une maladie du greffon contre l'hôte, avec des injections répétées et des gavages d'antibiotiques sur trente-cinq jours. Le porteur indique que les animaux développent une perte de poids et une atteinte cutanée avec perte de poils, et qualifie de "non douloureux" les injections et les prélèvements. Il affirme que l'accès aux organes cibles est très limité chez les patients et qu'il est "indispensable" de recourir à un modèle animal.

Objectifs

La greffe de cellules souches hématopoïétiques (= cellules permettant la production de toutes les cellules sanguines) est l'une des approches thérapeutiques dans le traitement de cancer du sang après une chimiothérapie. Dans le cas d'une allogreffe (les cellules souches hématopoïétiques d'un donneur compatible), une complication majeure peut apparaître: la maladie du greffon contre l’hôte (GVH). Cette maladie est due à la réaction des cellules du donneur contre les cellules du receveur, entrainant leur destruction, les organes cibles étant essentiellement, la peau, le tube digestif et le foie. Les avancées technologiques récentes ouvrent de nouvelles perspectives pour la compréhension du rôle du système immunitaire (système de défense contre les infections) dans le développement de la GVH humaine. Ce projet a pour but de caractériser le rôle d’une population particulière de cellules du système immunitaire en étudiant leur action régulatrice potentielle sur la survenue de la GVH.

Bénéfices attendus

La détermination du rôle régulateur potentiel de cette population de cellules d'intérêt contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes pouvant freiner le développement de la GVH humaine. Les approches thérapeutiques actuelles pour prévenir la survenue d’une GVH demeurant limitées par leurs effets indésirables, nos résultats permettront d’élargir le champ thérapeutique de cette maladie.

Procédures

Afin de comprendre comment la population de cellules particulière agit sur le développement de la GVH, nous allons utiliser un modèle parfaitement décrit dans la littérature scientifique du domaine. Des souris immunodéficientes (dépourvues de système immunitaire) seront soumises à une irradiation, étape d'une durée de 5 minutes non douloureuse permettant de "faire de la place" avant l'injection des cellules sanguines humaines qui seront à l'origine du développement de la GVH. En effet, un jour après l'irradiation, les souris recevront par voie intra-veineuse (injection non douloureuse dans la veine de la queue réalisée sur souris éveillées, durant moins d'une minute par souris) les cellules sanguines humaines avec ou sans notre population cellulaire d'intérêt. Pour identifier les mécanismes par lesquels notre population cellulaire d'intérêt agit sur le contrôle de l'apparition de la GVH, nous administrerons (par injection dans l'abdomen de souris éveillées, durant moins d'une minute par souris) une molécule connue pour bloquer l'action de nos cellules d'intérêt. Cette injection non douloureuse sera répétée trois fois par semaine pendant 21 jours. Des prélèvements sanguins (au niveau de la joue, geste non douloureux réalisé sur souris éveillées durant une minute par souris) seront effectués chaque semaine sur toute la durée (35 jours) de la procédure expérimentale. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition hebdomadaire. Nous évaluerons également le rôle de la flore intestinale sur l'activation de notre population d'intérêt et donc sur son rôle protecteur de la GVH. Pour cela, nous administrerons soit dans l'eau de boisson, soit par gavage (une fois par jour pendant 3 semaines, intervention durant une minute par souris) à l'aide d'une sonde adaptée, un mélange d'antibiotiques. Nous suivrons le développement de la GVH par l'apparition des signes cliniques mais également grâce à des prélèvements sanguins hebdomadaires.

Impact sur les animaux

Les souris développant une GVH vont présenter une perte de poids dans les 30 jours après le début de la procédure. Une atteinte cutanée sera également observable (poils hérissé puis perte de poils). La mise en place du modèle implique une étape d'irradiation à une dose qui ne devrait pas avoir d’effet néfaste sur le bien-être de l’animal. Nous y serons tout particulièrement vigilants avec une surveillance accrue de l’aspect des souris au courant de la première semaine. Les administrations répétées (dans l'abdomen ou gavage) pourront également avoir un impact sur le bien-être de l’animal, auquel nous serons tout particulièrement attentifs. De plus lors de l’administration (dans l’eau de boisson) d’antibiotiques, nous nous assurerons que les souris s’hydratent correctement.

Devenir

Tous les animaux de ces procédures seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes liés au système immunitaire ou connus pour être des organes cibles de la GVH seront prélevés pour analyse.

Remplacement

L’accessibilité aux principaux organes cibles de la GVH demeure très limitée chez les patients. L’étude des mécanismes de développement de la maladie ainsi que les évènements pouvant la réguler est très difficile chez l’homme et requiert donc l’utilisation d’un modèle animal. Nous avons néanmoins réalisé au préalable le maximum d’expériences in vitro pour démontrer qu'une population de cellules du système immunitaire très particulière est capable de réguler la prolifération et la fonction des cellules responsables de la GVH. A ce stade du projet, il est indispensable d'utiliser un modèle animal pour caractériser leur mécanisme d'action en vue d'une utilisation possible dans des essais thérapeutiques.

Réduction

Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisés au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures.)

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé. Les animaux seront euthanasiés si leur état se dégrade soudainement ou si le score déterminé à partir d'une fiche d'évaluation des signes cliniques indique des signes de souffrance.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinant, car un modèle reproduisant de nombreux signes de la GVH humaine est parfaitement décrit dans la littérature. De plus nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et la possibilité de les prendre en charge facilement et rapidement. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris immunodéficientes (dépourvues de système immunitaires) adultes conformément aux modalités de mise en place de ce modèle expérimental.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un phénotype migraineux leur est induit par injections répétées d'un donneur de NO, à 3 puis 12 mois, et le porteur précise que cette douleur ne pourra être soulagée ni par analgésique ni par anesthésique puisque ce sont ses conséquences qui sont étudiées. La sensibilité douloureuse est mesurée par les tests de von Frey et de Hargreaves, complétés de tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Il affirme que le suivi du vieillissement "requiert un système biologique intégré" et ne peut être modélisé in vitro, les bénéfices thérapeutiques restant présentés comme des perspectives.

Objectifs

La migraine est un trouble neurologique invalidant, d'origine génétique, environnementale et/ou hormonale, avec une prévalence estimée à 15% de la population. Elle se caractérise par des maux de tête sévères, généralement unilatéraux et lancinants qui peuvent être accompagnés de nausées, vomissements et de photophobie. Par ailleurs, la douleur chronique représente un stress pour l'organisme dont les conséquences à long terme sont encore peu connues. Des études cliniques ont corrélé une augmentation de l'ncidence des pathologies cardio-vasculaires et des cancers et une diminution de la durée de vie chez des patients qui présentent des niveaux chroniques de douleur. Ce projet vise à étudier les conséquences cellulaires et moléculaires de la douleur migraineuse chronique sur le métabolisme, et en particulier à déterminer si des canaux ioniques potassiques à deux domaines pores (famille des K2P), qui régulent la transmission de la douleur et dont des mutations chez l'homme induisent la migraine, exercent un contrôle sur les paramètres métaboliques impliqués dans le vieillissement. Ce projet nécessitera 480 animaux.

Bénéfices attendus

La migraine est considérée comme l'une des maladies les plus invalidantes au monde, affectant environ 15 % de la population mondiale. Elle se manifeste par une céphalée lancinante unilatérale et s'accompagne de multiples symptômes tels que nausées, vomissements, photophobie, phonophobie ou allodynie cutanée. En parallèle, différentes études cliniques ont permis de corréler une augmentation de l’incidence des pathologies cardio-vasculaires, des cancers et une diminution de la durée de vie, à des niveaux chroniques de douleur chez des patients humains. De plus, les souris déficientes pour TRPV1, un canal ionique impliqué dans la perception de la douleur thermique, sont caractérisées par une meilleure espérance de vie. Enfin, des mutations génétiques chez C. elegans et chez D. melanogaster modifiant la transduction des signaux sensoriels augmentent également la longévité des individus. Il est admis que les crises de migraine commencent par l'activation des neurones sensoriels dans les ganglions trigéminaux (TG). L'hyperexcitabilité des fibres TG innervant les méninges induit la libération de neuropeptides (par exemple la substance P et le peptide CGRP) qui déclenche la vasodilatation des vaisseaux sanguins environnants et une inflammation locale, conduisant à la migraine. De plus, les fibres C exprimant les canaux TREK1, TREK2 et TRESK innervent le le pancréas et leur stimulation induit la sécrétion de CGRP, provoquant l’inflammation et inhibant le relargage d’insuline. Ces données suggèrent fortement que l’activité des canaux ioniques et en particulier de TREK1, TREK2 et TRESK a un impact sur le métabolisme et le niveau général de santé de l’individu. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la migraine et plus généralement de la douleur chronique de manière à limiter son impact sur le métabolisme en collaboration avec la Fédération Hospitalo-Universitaire.

Procédures

Dans chacune des procédures, un phénotype migraineux sera induit chez les animaux à 2 stades de leur vie : à 3 mois et à 12 mois. Ce modèle de migraine classiquement utilisé en études pré-cliniques et cliniques consiste à induire des symptômes chroniques migraineux par injection systémique intra-péritonéale d'un "donneur de NO", l'isosorbide dinitrate (ISDN, Risordan ©, Sanofi) pendant 4 jours, à raison de 1 injection/jour. Chez la souris, une injection quotidienne d'ISDN pendant 4 jours induit une hypersensibilité mécanique douloureuse chronique quantifiée quotidiennement avec un appareil de von Frey dynamique qui consiste à appliquer une rampe croissante de pression sur la paume de la patte arrière avec un filament automatique et à mesurer la pression (en grammes) induisant le retrait volontaire de la patte par la souris qui témoigne d’une douleur mécanique. Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles déterminent un seuil avec possibilité d’échappement. Une allodynie chronique se développe progressivement, mise en évidence par une diminution des valeurs de force nécessaires (seuils) pour induire le retrait réflexe (volontaire) de la patte. L’hypersensibilité douloureuse mécanique (6 tests dans la vie de l'animal) et thermique (6 tests) des souris sera quantifiée par les tests de von Frey et de Hargreaves respectivement sur des groupes de souris indépendants. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline seront mesurés par prélèvement d'une goutte de sang (6 tests) sur des groupes de souris indépendants. Les mesures d'exercice spontané et de motricité seront réalisés 6 fois dans la vie de l'animal, sur 2 groupes de souris indépendants. Chacun de ces tests dure environ 3h excepté la mesure de l'exercice volontaire qui est évaluée après une semaine.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés 1) à la douleur migraineuse qui sera induite et qui ne pourra être soulagée ni par des analgésiques ni par des anesthésiques puisque ce sont ses conséquences que nous étudierons, 2) par les injections intrapéritonéales des molécules régulatrices des canaux ioniques, du glucose (test GTT) ou de l'insuline (test ITT), et 3) par les tests de comportement (mesure de reflexes volontaires). Pour cette raison, nous évaluons à un niveau sévère la gravité de nos procédures et nous compenserons par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures. La mise à mort sera effectuée pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Nos études préalables menées sur des neurones en culture et chez les rongeurs ont permis de caractériser le phénotype migraineux des animaux mutants pour les K2P d’intérêt et le profil pharmacologique des régulateurs de K2P en termes de spécificité de cible et de concentration active. De plus, les effets métaboliques analysés sur le long terme et le suivi du vieillissement des animaux requièrent un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant. Les pathologies associées au vieillissement (diabète, néoplasmes, etc) sont d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Leur apparition et leur gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro. De plus, nos résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet.

Réduction

Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique permanente) ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’évaluation des données obtenues se fera en appliquant un test statistique paramétrique (student t-test ou ANOVA si plus de deux groupes) ou non paramétrique afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables. Pour évaluer le nombre d'animaux utilisés, nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs.

Raffinement

Notre expertise dans le domaine de la douleur nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et nous porterons une attention particulière à limiter toute forme de stress de nos animaux (habituation en amont de chaque procédure). Aucun des animaux élevés pour ce projet ne présente de phénotype dommageable (Royal et al, 2019 ; Avalos-Prado et al, 2021). Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur. Dès l'entrée en procédure, les animaux seront soumis à un contrôle quotidien par le principal expérimentateur de façon à relever tout changement d'aspect (dos voûté, poil non entretenu) et de comportement (apathie, souris à l'écart), à mener leur habituation aux différents tests et à réaliser des injections intrapéritonéales si nécessaire. Ce suivi quotidien permettra aussi un contrôle visuel et expérimental (niveau de sensibilité douloureuse) de l'état de l'animal et de ses sites d'injection. Ainsi, tout animal qui présenterait des signes d'infection au site d'injection, de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement basal anormal (prostration, apathie..) ou d‘une pathologie quelconque (plaie...) serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans notre étude des conséquences de la douleur. Un suivi du poids corporel sera également effectué toutes les semaines par pesée. Une perte de poids comprise entre 10 et 15 % du poids de la semaine précédente conduira à une surveillance accrue de l'animal. Celui-ci sera euthanasié si son état ne s'est pas amélioré la semaine suivante. Un suivi tous les 2 jours sera aussi organisé après les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (pendant 6 jours). En plus du suivi par les expérimentateurs, les animaux seront suivis quotidiennement par l’équipe de l’animalerie de l’institut afin de détecter le plus rapidement tout signe de mal-être. Un formulaire permettant l'évaluation de la douleur sera rempli systématiquement. Les animaux seront sacrifiés à un score égal ou supérieur à 3 dans le tableau de l'évaluation de la douleur qui constituera notre base de travail.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle d'étude, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l'humain, et de la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons à notre disposition tous les outils déjà mis au point et validés pour pouvoir étudier les modèles de régulation des canaux ioniques TREK1, TREK2 et TRESK dans la souris. 2 âges: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux. Chaque animal sera utilisé à 3 et 12 mois pour réduire le nombre total d’animaux, et parce que chaque animal sera son propre contrôle interne.

75 porcs vont être utilisés, presque tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont infectés par un virus respiratoire, grippe porcine ou virus du syndrome dysgénésique et respiratoire, par voie intranasale ou intratrachéale, puis reçoivent des produits vétérinaires dont l'étude évalue l'efficacité en vue d'une mise sur le marché. Le porteur indique que l'infection provoque une atteinte de l'état général et la mort d'une partie des animaux, et que les prises de sang répétées génèrent du stress. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible car l'évaluation doit se faire sur l'espèce cible selon les lignes directrices européennes, et justifie la mise à mort par les besoins de l'étude et par la réglementation sanitaire.

Objectifs

Ce type de projet est mis en œuvre afin d’évaluer l’efficacité de produits (pharmaceutiques ou non) dans le cadre d'une pathologie respiratoire virale chez le porc. Les pathologies virales sont la grippe porcine (virus influenza) et la L’infection est induite par inoculation d’une souche de virus directement dans l'arbre respiratoire (administration intranasale ou intratrachéale). Les produits dont le projet vise à évaluer l'efficacité sont administrés selon les modalités prévues par l’AMM recherché ou existant. Au cours du projet, des données sont générées dans le cadre du suivi de l’évolution de la maladie chez les animaux: signes cliniques associés à la pathologie, poids des animaux, ingérés d'eau et d'aliment, mortalité. Des prélèvements peuvent également être réalisés (sang, sécrétions nasales, etc.) pour répondre aux objectifs du projet (évaluation sérologique, dénombrement de pathogènes, dosages du principe actif, recherche de médiateurs de l’inflammation par exemple). Généralement, les animaux sont euthanasiés en fin d'étude afin d'évaluer les lésions macroscopiques et microscopiques des organes (poumons, plèvre, cœur, péricarde, foie...).

Bénéfices attendus

Le projet vise à mettre sur le marché un produit qui permet la prophylaxie sanitaire de maladies virales du porc dont l'incidence a un impact économique non négligeable (Grippe porcine et syndrome dysgénésique et respiratoire porcin).

Procédures

Interventions sur animaux vigiles : - Prises de sang pouvant être répétées sans toutefois dépasser 7,5 % du volume circulatoire par semaine, 10 % sur deux semaines et 15 % sur un mois. - Inoculation du virus (voie intratracheale ou intranasale) - Mesure de la température rectale - Pesées - Prélèvement autres (nasal, salive, feces...)

Impact sur les animaux

Les pathologies virales provoquent une atteinte de l'état général des animaux (morbidité) et, en l'absence de traitement ou lors d'inéfficacité du traitement, la mort d'une partie des animaux (mortalité). Les manipulations des animaux, en particulier les prises de sang qui peuvent être répétées dans le temps, provoquent un stress sur les animaux.

Devenir

L'euthanasie des animaux est imposée par les besoins de l'étude (examen anatomopathologique; prélèvements tissulaires) ou par la santé publique (élimination de la chaine alimentaire d'un animal ayant reçu un produit hors AMM ou sans AMM).

Remplacement

Il n'y a pas de stratégie de remplacement possible, l'évaluation de l'efficacité du produit devant être effectué sur espèce cible (selon les lignes directrices européennes).

Réduction

La réduction du nombre d'animaux est systématiquement recherché en optimisant la conduite de l'étude (dont extension des objectifs à d'autres projets) et en appliquant des analyses statistiques nécessitant moins d'animaux à puissance égale. Utilisation de modèles intégrant des facteurs aléatoires à la place de modèles à facteurs fixes uniquement (régressions mixtes contres ANOVA). Utilisation de régressions logistiques, éventuellement avec facteurs aléatoires, plutôt qu'un Chi2.

Raffinement

L'hébergement des animaux fera systématiquement appel à un enrichissement du milieu. Des techniques de manipulation limitant le stress pour les animaux seront systématiquement recherchées, en relation avec la SBEA de la structure. Des points limites adaptés à l'espèce et des critères d’arrêt de souffrance sont prévus.

Choix des espèces

Dans le cadre d’essais réglementaires pour la mise sur le marché de médicaments vétérinaires, l’étude doit être menée sur l’espèce cible au stade physiologique visé. Les animaux destinés à être utilisés dans les procédures expérimentales n’appartiennent pas à la liste des espèces identifiées comme devant provenir d’élevage ou de fournisseurs agréés (liste figurant à l’article 1er de l’arrêté sur la fourniture des animaux). Porcelets en post-sevrage et en engraissement.

2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur déclenche chez elles un cancer du poumon par instillation dans la trachée, pour étudier l'origine et la progression des tumeurs selon le rôle d'une protéine. Il indique que les souris développent une maladie pulmonaire avec des difficultés respiratoires en stade avancé, et fixe des points limites sur le rythme respiratoire. Il affirme que les cultures cellulaires ne récapitulent pas la complexité de l'organe et qu'il faut "valider in vivo".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les facteurs modulant l’initiation et la progression tumorale en fonction de l’origine des tumeurs (alvéolaire ou broncho-alvéolaire) en utilisant des modèles murins exprimant la mutation KRAS caractérisés dans la littérature. Notre hypothèse de travail étayée par de nombreux résultats obtenus au laboratoire est que CD98hc module l’initiation et la progression tumorale en fonction de l’origine alvéolaire ou broncho-alvéolaire des tumeurs. Ce projet a été évalué de manière positive par plusieurs comités d'experts, des financements ont déjà été obtenus. Des demandes d'autorisation expérimentale sur l'animal ont été préalablement accordées pour caractériser le rôle de CD98hc dans l’apparition et la progression des cancers pulmonaires. Les résultats obtenus suite à cette étude ont permis de mettre en évidence une expression différentielle de CD98hc dans les cellules broncho-alvéolaires ou alvéolaires.

Bénéfices attendus

L’adénocarcinome pulmonaire est un cancer très agressif, dont l’espérance de vie à 5 ans est d’environ 5%. De plus, les cancers exprimant une mutation KRAS sont réfractaires aux traitements anti-cancéreux actuels. Ainsi, trouver un traitement est primordial pour soigner ces cancers. CD98hc a été décrit comme étant impliqué dans l’initiation et le maintien des leucémies. De plus, nos résultats préliminaires suggèrent un rôle de CD98hc dans l’initiation et la progression des adénocarcinomes pulmonaires dépendants de KRAS et la survie des cellules cancéreuses. Cette étude in vivo va nous permettre de mieux comprendre le rôle de CD98hc en fonction non seulement de l’origine des tumeurs mais également du génotype tumoral. De plus, comme CD98hc est une protéine transmembranaire pouvant être inhibée in vivo par l’utilisation d’anticorps anti-CD98hc, cela pourrait représenter une cible de choix dans le traitement des cancers pulmonaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions : - anesthésie (procédure 1) 20 min - instillation intratrachéale (procédure 1 ), 1x 1 minute environ - injection intrapéritonéale (procédure 2/3) , procédure 2: 5x 1min. procédure 3: 1x 1min - prélèvement sanguin (procédure 1 et 2), pour le modele KRAS/P53 uniquement, tout les 15 jours, 200ul de sang, temps d'intervention: 5min.

Impact sur les animaux

Les animaux vont développer un cancer pulmonaire avec les nuisances liées a cette pathologie comme une difficulté respiratoire en stade avancé. Cette difficulté respiratoire s'observe par un ralentissement et un changement de la respiration (accélération ou ralentissement). Au moindre signe de détresse respiratoire et/ou de douleurs associées (prostration), les animaux seront euthanasiés.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés en fonction des cinétiques de chaque procédure.

Remplacement

Les lignées cellulaires humaines et murines seront utilisées dès que possible. Quelques publications décrivent les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude de l'initiation tumorale. Elles sont actuellement mises en place et seront envisagées aussi souvent que possible. Cependant, ces cultures sont encore très expérimentales et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe, c’est pourquoi nous avons besoin maintenant de valider nos résultats in vivo en ayant recours à des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum en utilisant la méthode statistique prédictive de Monte Carlo. Nos groupes expérimentaux sont composés de 20 animaux (10 animaux pour l’étude statique (les resultats seront analysés avec un t test corrigé (logiciel Prism)) et 10 animaux pour les analyses de cytométrie, d’extraction d’ARN et d’extraction protéique) en accord avec la pénétrance de la procédure et aucune distinction de sexe n’est nécessaire. Néanmoins, si après l'analyse de la première expérience nous constatons une différence entre les mâles et les femelles, nous utiliserons alors que l'un ou l'autre des sexes en fonctions des résultats obtenus.

Raffinement

Ces expériences ont été pensées en tenant compte du bien-être animal. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect de la réglementation européenne en cours afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront également suivis quotidiennement . Les points limites ont été définis comme suit : -Respiration rapide > 250 bpm (compter pendant 1 minute les mouvements de la cage thoracique). -Respiration lente < 80 bpm -Suffocation : la souris ne peut plus respirer, les mouvements de la cage thoracique sont amples. -Halètement (à confirmer 20 minutes plus tard) : La respiration est forte et saccadée.

Choix des espèces

La mutation KRAS représente environ 25% des adénocarcinomes pulmonaires, la mutation p53 représente 50 à 70% de ces cancers. Ainsi, l'utilisation de ces modèles murins (KRAS G12Dflox/+ et KRAS G12Dflox/+; p53flox/flox) permet une bonne représentation génétique des cancers pulmonaires humains. Une comparaison pourra être établie entre nos travaux et la littérature abondante dans ce domaine. Ces modèles permettent une très bonne approche des processus impliqués dans l’initiation et la progression tumorale. L'inhibition de CD98hc dans ces modèles se fera soit par adénovirus soit en croisant ces modèles avec les souris K14 et K19 et injection de Tamoxifen 4OHT. Nous utiliserons des souris adultes âgées d’au moins 8 semaines (souris adultes).

1 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur induit chez elles un cancer du poumon par instillation dans la trachée, puis administre des injections répétées pendant deux mois pour étudier si la rigidité de la tumeur modifie la réponse à l'immunothérapie. Il reconnaît que sa manipulation peut augmenter la dissémination des métastases et fixe un point limite à 10 % de perte de poids. Il affirme que les cultures cellulaires ne récapitulent pas la complexité de l'organe et qu'il faut "valider in vivo".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer si la modulation de la rigidité matricielle impacte la réponse des cancers pulmonaires aux immunothérapies et ce de plusieurs façons : 1)Soit en inhibant notre protéine d'interet (impliquée dans le remodelage de la matrice extracellulaire) au niveau des cellules tumorales à l’aide des modèles KRASG12Dfl/+ et KRASG12Dfl/+, p53fl/fl. Ces modèles sont très bien documentés et bien caractérisés. 2)Soit en inhibant cette protéine au niveau des fibroblastes pulmonaires à l’aide du modèle FSP1Cre. Ce modèle a été très bien décrit. Notre hypothèse de travail étayée par de nombreux résultats obtenus au laboratoire est que la modulation du microenvironement matriciel pourrait impacter la réponse de ces cancers à l’immunothérapie. Ce projet a été évalué de manière positive par plusieurs comités d'experts, des financements ont déjà été obtenus.

Bénéfices attendus

L'immunothérapie est une arme thérapeutique actuellement en plein essor dans le cancer du poumon. Néanmoins, bien que prometteuse pour certains patients, une grande majorité de patients ne répondent pas ou peu à l'immunothérapie. Notre projet, base sur des résultats préliminaires solides permettrait de mettre en évidence un levier thérapeutique potentiel. Non seulement CD98hc pourrait être un marqueur de résistance mais aussi une cible thérapeutique potentielle.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions : - instillation intratrachéale (1x au début de l'expérience - durée de l'intervention: 2 minutes) - injection intrapéritonéale (2x par semaine pendant 2 mois- duréee de l'intervention 1minute) - prélèvement sanguin (toutes les deux semaines pendant 2 mois - durée de l'intervention: 10 min) - injéction sous-cutanée (1x au début de l'expérience- durée de l'intervention: 10 min) Pour chaque intervention les animaux seront anesthésiés afin de diminuer le stress.

Impact sur les animaux

Il a été démontré que le "softening de tumeur" pourrait augmenter les metastases. En modulant l'expression de la protéine d'interet dans le compartiment tumoral ou dans le microenvironnement, le risque est une augmentation de la dissemination tumorale dans le groupe controle. C'est pourquoi nous allons suivre les cellules tumorales circulantes régulierement et analyser les differents organes en coupe histologique. Le marque mTmG pourrait également etre utile dans la détection des métastases.

Devenir

A la fin de l'étude, nous devons analyser la taille, le nombre et le grade des tumeurs pulmonaires. Les animaux seront tous euthanasiés en fonction des cinétiques de chaque procédure.

Remplacement

L’utilisation de lignées cellulaires humaines et murines seront utilisées dès que possible. Quelques publications décrivent les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude de l'initiation tumorale. Elles sont actuellement mises en place et seront envisagées aussi souvent que possible. Cependant, ces cultures sont encore très expérimentales et ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe, c’est pourquoi nous avons besoin maintenant de valider nos résultats in vivo en ayant recours à des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum (analyse statistique prédictive selon la méthode de Monte-Carlo). Nos groupes expérimentaux sont composés de 20 animaux (12 animaux pour l’étude statique et 8 animaux pour les analyses de cytométrie, d’extraction d’ARN et d’extraction protéique) en accord avec la pénétrance de la procédure et aucune distinction de sexe n’est nécessaire. Néanmoins, si après l'analyse de la première expérience nous constatons une différence entre les mâles et les femelles, nous utiliserons alors que l'un ou l'autre des sexes en fonctions des résultats obtenus.

Raffinement

Ces expériences ont été pensées en tenant compte du bien-être animal. Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect de la réglementation européenne en cours afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront également suivis périodiquement à l’aide d’une fiche de score. Toute alteration de la respiration (plus rapide, plus lente), ainsi qu'une perte de plus de 10% du poids de la souris sont considérés point limite entrainant la mise a mort de l'animal.

Choix des espèces

La mutation KRAS représente environ 25% des adénocarcinomes pulmonaires, la mutation p53 représente 50 à 70% de ces cancers. Ainsi, l'utilisation de ces modèles murins (KRAS G12Dflox/+ et KRAS G12Dflox/+; p53flox/flox) permet une bonne représentation génétique des cancers pulmonaires humains. Une comparaison pourra être établie entre nos travaux et la littérature abondante dans ce domaine. Ce modèle permet une très bonne approche des processus impliqués dans la l’initiation et la progression tumorale. Dans cette étude, nous utiliserons des souris agées d'au moins 3 semaines.

470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit l'implantation d'une tumeur cérébrale, sa résection chirurgicale, une irradiation et une chimiothérapie reproduisant le protocole administré aux patients, avec suivi par bioluminescence. Il indique que la tumeur et les traitements peuvent provoquer désorientation, perte d'équilibre, troubles de la mémoire et de l'apprentissage, les animaux étant tués par dislocation cervicale. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun test in vitro ne récapitule le microenvironnement tumoral et présente l'implantation chez la souris comme "indispensable".

Objectifs

Le projet vise à élucider le rôle de la phosphatase PRL-2 dans le développement de tumeurs cérébrales (appelées glioblastomes) primaires et récurrentes. La famille de gènes des protéines Tyrosine Phosphatases (PTP) comprend plus de 107 gènes dans le génome humain, dont beaucoup jouent un rôle important dans les cancers humains (PTEN et PTP1B). Dans cette famille, PRL-2 a été identifiée comme une protéine oncogène (qui stimule la tumeur) dans de nombreux types de cancer. Supprimer PRL-2 dans les cellules cancéreuses du sein entraîne une diminution de la croissance tumorale. Puisque PRL- 2 est élevée dans le glioblastome, nous avons examiner la contribution de cette phosphatase dans le développement de ce cancer. Nous avons observé que PRL-2 fournit une importante propriété cancéreuse aux tumeurs cérébrales et contribue au faible pronostique de survie chez les patients. L'inhibition de PRL-2 serait alors une nouvelle stratégie thérapeutique potentielle pour les tumeurs cérébrales. En utilisant l'implantation des cellules tumorales chez la souris, nous examinons l'agressivité des lignées cellulaires tumorales lorsque l’expression de PRL-2 est modifiée dans la souris (vaisseaux sanguins) ou dans les cellules tumorales. Aussi, après de nombreuses expériences préliminaires in vitro, et in vivo avec nos modèles de greffe de tumeurs, nous voulons valider nos modèles d’étude de radiothérapie et chimiothérapie (traitement temozolomide (TMZ) utilisé chez les patients) sur un minimum d’animaux in vivo pour tenir compte du contexte physiologique, du microenvironnement et répondre à la problématique des chirurgiens. En plus de la chimio-radio thérapie, nous inclurons une resection de la tumeur c'est à dire nous opérerons à nouveau les souris portant une tumeur afin de retirer cette tumeur. La resection tumorale combinée à la radio et chimio thérapie sont le traitement standard des tumeurs chez les patients correspondant au protocole de Stupp. Après ce traitement la majorité des tumeurs ont une récurrence. La proposition de recherche fournira une compréhension plus globale de PRL-2 dans le développement agressif du glioblastome primaire et récurrent.

Bénéfices attendus

Ce projet est en complément d'un précédent projet visant à étudier le role de PRL2 dans le développement de tumeur cérébrale. Ici, nous élargirons nos résultats à des conditions plus proches de ce qui est observé en clinique chez les patient, ce qui constitue un bénéfice pour l'étude du role de PRL2 dans la récurrence des tumeurs cérébrales. Pour cela, nous allons appliquer le protocole thérapeutique des patients, le protocole de Stupp, aux modèles murins. Ce protocole consiste en la resection de la tumeur primaire puis traitement par radio et chimiothérapie. Grace à cette étude, on pourra valider PRL2 comme une nouvelle cible thérapeutique afin d'améliorer le traitement des patients.

Procédures

Injections de tamoxifène en intrapéritonéale pendant 8 jours (moins d'une minute par souris). Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales: une implantation de tumeur (10 min), une resection tumorale (10 min). Irradiation (10min). Injection de temozolomide (2 par jour pendant 8 jours non consecutifs). Suivi par bioluminescence: 6-25 min, une à deux fois per semaine.

Impact sur les animaux

Douleur légère mais répétée d’injections intrapéritonéales avec plusieurs molécules sans effet secondaire pour le tamoxifène. L'irradiation et le témozolomide peuvent induire des symptomes ressemblant à l'anxiété, des troubles de la mémoire spatiale et d'apprentissage chez la souris. Les souris seront exposées à des douleurs post chirurgies à l’issue des 2 stéréotaxies. Le développement de tumeurs cérébrales peuvent générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes neurologiques invalidants (désorientation, désequilibre). De manière générale, chaque manipulation est génératrice de stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale car tous les animaux sont utilisés pour l'impantation tumorale qui conduit aux points limites décrits précédemment.

Remplacement

Nous avons déjà mis en évidence par des tests fonctionnels in vitro que PRL2 est impliquée dans les caractéristiques oncogéniques de cellules de glioblastome humaines. Or, nous savons que le microenvironnement tumoral est une composante essentielle à la régulation de la tumeur. Bien que des tests in vitro existent pour mimer ce microenvironnement, aucun n'est capable de récapituler précisément ce qu'il se passe in vivo. L'implantation de tumeur chez la souris est donc indispensable pour tenir compte de la structure 3D, de la composition chimique, de l'interaction avec d'autres types cellulaires, avec la matrice extracellulaire, avec le flaux sanguin.

Réduction

Les études statistiques seront réalisées grâce au test Anova car nous comparons en général plus de 2 groupes, c'est donc le test statistique adapté à ce type d'expérience. Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons calculé sur le logiciel R le nombre minimal de souris par groupe pour atteindre de bons résultats statistiques, et c'est 8 souris pour le Kaplan-Meyer (atteinte de points limites). Nous prevoyons donc 10 souris par groupe pour éviter de finir une expériences avec moins de 8 souris par groupe en cas de problème pendant la procédure. Enfin, femelles et mâles seront utilisés. Par ailleurs, nos modèles murins de tumeurs se développent de manière très reproductible, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences.

Raffinement

Durant les expériences, nous assurons un confort des animaux (gel sur les yex pour éviter de désèchelent durant l'anesthésie, tapis chauffant pour réguler la température corporelle). Des enrichissements (cocons et maisons rouges) sont placés dans les cages en tout temps et les hébergements sont collectifs. Nous assurons un suivi des animaux tout au long du projet, quotidiennement. Ceci nous permet de prendre en charge toutes les douleurs par une médication adaptée. Pour cela, nous utilisons des points limites spécifiques et adaptés à notre modèle (tumeur cérébrale). Nous procédons selon un arbre décisionnel évitant des souffrances inutiles grâce à des critères d’arrêt de l'expérimentation suffisamment précoces.

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle Rag gamma2C-/- car il permet d'implanter des tumeurs humaines sans que le système immunitaire ne rejette la greffe. La greffe récapitule la tumeur observée chez des patients. Les deux autres lignées murines sont immunocompétentes, elles possèdent toutes les cellules immunitaires. Elles permettent d'etudier le role du microenvironemment dans le développement tumoral. Dans tous les cas, nous utilisons des souris de 7 à 9 semaines (adultes). Les expériences peuvent durer longtemps et nous voulons que le vieillissement n'intervienne pas dans le développement de la tumeur et le maintien en forme des souris.

6 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit une infection à Salmonella par voie orale entraînant perte de poids et diarrhée, complétée par une inoculation par anses intestinales sous chirurgie sans réveil, puis la mise à mort pour prélever les organes. Il précise que les souris de fond génétique sensible sont euthanasiées dès l'apparition de difficultés à se mouvoir. Sur les bénéfices, il affirme que comprendre l'interaction du pathogène avec son hôte est "indispensable" au développement de traitements.

Objectifs

Salmonella est une bactérie pathogène importante en santé publique. Elle est responsable, suivant le sérotype, d’infections systémiques létales, de gastroentérites ou encore d’un portage asymptomatique chez l’homme et les animaux. Chez l’homme, la fièvre typhoïde touche encore 22 millions de personnes chaque année et on estime à 1,3 milliard le nombre de cas de gastroentérites à Salmonella chaque année dans le monde. Comprendre les mécanismes d’interactions d’un pathogène avec son hôte est indispensable au développement de méthodes de prophylaxie ou de thérapeutiques. Notre projet vise à (1) identifier les gènes de Salmonella impliqués dans la colonisation, la réponse de l’hôte, la virulence et la persistance de cette bactérie chez son hôte et à caractériser leur rôle ; et/ou (2) à tester des inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité des salmonelles. Elle permet

Bénéfices attendus

Comprendre les mécanismes d’interactions d’un pathogène avec son hôte est indispensable au développement de méthodes de prophylaxie ou de thérapeutiques. Notre projet vise à (1) identifier les gènes de Salmonella impliqués dans la colonisation, la réponse de l’hôte, la virulence et la persistance de cette bactérie chez son hôte et à caractériser leur rôle ; et/ou (2) à tester des inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité des salmonelles. Après caractérisation des gènes et/ou développement/analyse d’inhibiteurs in vitro, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider les résultats obtenus in vitro, c’est à dire l’implication du gène d’intérêt dans la fitness et/ou la virulence de Salmonella, l’efficacité de l’inhibiteur. Elle permet également de caractériser plus finement le rôle du gène d’intérêt in vivo.

Procédures

Les animaux seront soumis à une infection à salmonella par voie orale. Ils pourront ensuite être soumis à des prélèvements sanguins afin d'étudier la perméabilité intestinale, à un suivi par imagerie in vivo. L'inoculation de salmonella sera également réalisé grâce à la méthode des anses intestinales (chirurgie sans réveil).

Impact sur les animaux

Dans le cas de l'infection par voie orale les animaux pouront perdre du poids et développer une diarrhée

Devenir

Mise à mort afin de réaliser le prélèvement des organes

Remplacement

Une caractérisation préalable des gènes est réalisée in vitro pour permettre la sélection des gènes les plus pertinents et pour orienter le choixdes voies d’inoculation à mettre en œuvre

Réduction

L'utilisation du système d'imagerie in vivo permet de suivre les souris au cours du temps et permet donc l'étude de la cinétique de la colonisation sur une même souris là où il aurait fallu les sacrifier à différents temps sans cela. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux. De plus, nous avons déjà validé certaines de nos approches expérimentales in vitro permettant d'optimiser l'utilisation des animaux. Les rongeurs utilisés sont consanguins et de même âge réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Une étude statistique est réalisée sur les données brutes d’immunohistochimie ou de FACS obtenues à partir des organes prélevés. Les tests appliqués sont des tests non paramétriques (Kruskall-Wallis one-way analysis of variance suivi d’un Mann-Whitney en post-test). Pour les niveaux de colonisation des organes par Salmonella, les tests utilisés sont des tests paramétriques (ANOVA suivi d’un post-test Tukey-Kramer) car le cumul de l’ensemble des données que nous avons obtenues depuis plus de 10 ans concernant ce caractère montre que ces données suivent une loi normale. Ceci nous permet lorsque nous souhaitons uniquement comparer le niveau de colonisation de plusieurs souches de diminuer le nombre d’animaux pour obtenir la même puissance de test.

Raffinement

Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit grâce au suivi rapproché quotidien des animaux, l’enrichissement de leur environnement (coton ou sopalin afin qu'ils puissent faire un nid) et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). De plus une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant l'expérimentation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Dans le cas du modèle de portage, les souris CBA/J ne présentent aucun symptôme. Pour les souris de fond génétique Balb/C ou C57Bl/6, un animal est euthanasié lorsqu’il présente des difficultés à se mouvoir après une stimulation et que l’expérimentateur juge que l’animal décèdera dans la ½ journée suivante c’est-à-dire avant la prochaine visite de l’expérimentateur afin d’éviter toute souffrance inutile. Ceci est rendu possible grâce à l’expérience acquise par l’équipe depuis plus de 15 ans. Les expérimentateurs « novices » travaillent en binôme tant qu’ils n’ont pas acquis l’expérience nécessaire De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Lorsque la procédure le nécessite les animaux seront anesthésiés à l’isofurane.

Choix des espèces

La souris est donc particulièrement pertinente pour étudier les infections à Salmonella en choisissant la bonne lignée de souris puisque nous reproduisons ainsi une infection naturelle. Le modèle gastroentérite a été montré dans la littérature comme reproduisant l’infection et la réponse immunitaire au cours d’une gastroentérite chez le veau, où Salmonella est responsable naturellement d’une gastroentérite. L’utilisation de ce modèle murin de « gastroentérite » est justifiée par rapport au modèle bovin par le moindre coût, la moindre lourdeur et la plus grande disponibilité des animaux. Les souris utilisées sont adultes, elles ont entre 8 et 10 semaines et ce, conformément aux modèles établis dans la littérature