Procédures sévères
Etude pilote de l’efficacité d’une molécule en suspension sur les souris modèle de progéria G609G
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
222 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation reproduisant la progéria, une maladie de vieillissement accéléré, et reçoivent des injections répétées d'une molécule candidate avant mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur décrit un phénotype "dommageable", avec décrochage de poids et mortalité prématurée, qu'il ne cherche pas à soulager puisqu'il fait l'objet de l'étude. Il affirme que le modèle cellulaire ne permet pas d'explorer l'organisme entier et présente le passage in vivo comme une étape "indispensable" avant un essai chez l'humain.
Objectifs
Notre projet a pour objectif de tester l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de la Progéria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS), qui récapitule le tableau clinique de la pathologie humaine. Cette maladie génétique extrêmement rare se déclare dès l’enfance et conduit à l’apparition de signes cliniques assimilables à un vieillissement prématuré et à une mortalité précoce, vers l’âge de 13,5 ans, des suites d’infarctus du myocarde ou d’accidents vasculaires. Il existe donc un fort besoin médical pour ces patients. Cette pathologie est due à l’accumulation d’une protéine toxique dans le noyau des cellules. La quantité de cette protéine toxique présente chez les patients est directement corrélée avec la sévérité de la maladie. La réduction de la quantité de cette protéine toxique est donc une cible potentielle pour changer le cours de cette pathologie dévastatrice. Dans ce but, nous avons étudié in vitro, sur des cellules issues de patients HGPS, la toxicité ainsi que l’efficacité d’une famille de molécules innovantes ayant pour cibles des protéases cellulaires. Cette étude a permis d’identifier 11 molécules efficaces sur le critère sélectionné, à savoir la réduction significative de l’accumulation de la protéine toxique. La molécule ayant la meilleure efficacité thérapeutique sur le modèle d’étude a été sélectionnée pour poursuivre le développement. Elle a fait l’objet d’un développement de formulation compatible avec une exposition plasmatique satisfaisante et avec la voie d’administration envisagée par injection intrapéritonéale (la voie intraveineuse étant à proscrire chez ces souris ayant un arbre cardio-vasculaire fragilisé, comme chez les patients). Cette formulation a été testée chez la souris à différentes doses, avec une exposition plasmatique proportionnelle à la dose administrée, sans observer de signe clinique. Cette même formulation fait actuellement l’objet d’une étude de toxicité par injections unique ou répétées, à différentes doses, sur des souris du même fond génétique que celles utilisées dans ce projet, afin de déterminer le meilleur régime d’administration. L'étude d’efficacité sera ensuite réalisée en fonction des résultats de l'étude de toxicité, en appliquant le traitement optimal.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet nous permettra : - d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine ; - d’établir une relation pharmacocinétique/pharmacodynamique de la molécule-candidate. A plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir la preuve clinique de son efficacité chez l’Homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de Progéria.
Procédures
maintien d’une lignée à phénotype sévère, injections intrapéritonéales (2X/semaine, sur une durée de 4 semaines pour l'un des groupes, 10 semaines pour le 2è groupe), mise à mort par perfusion intracardiaque
Impact sur les animaux
Plusieurs inhibiteurs de protéases ont été étudiés chez la souris. Certains effets secondaires observés avec ces molécules seront pris en compte dans l’établissement des points limites (signes gastro-intestinaux non spécifiques, rares troubles neurologiques telles que l’ataxie ou la parésie), en plus des points limites bien connus du modèle murin de Progéria utilisé. Par ailleurs, l’étude de toxicité simple dose et doses multiples en cours nous permettra de mieux définir les organes cibles pour lesquels une toxicité est observée avec la molécule étudiée. Il est important de noter que dans ce but, cette étude de toxicité est menée sur des souris du même fond génétique que les souris utilisées pour cette étude d’efficacité. Enfin, le phénotype du modèle animal utilisé est considéré comme dommageable. En effet, il présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris homozygotes pour la mutation présentent un décrochage dans les courbes de poids, avec des poids ne dépassant que très rarement 17g pour les males et 15g pour les femelles. La lignée est également caractérisée par une mortalité prématurée. En effet, la moyenne de survie basée sur l’ensemble des publications utilisant ce modèle et présentant ce type d’étude est de 16,5 semaines environ. Enfin, des anomalies squelettiques sont également à noter, comme une lordokyphose, ou des anomalies cutanées avec un pelage pouvant devenir épars. Enfin, des problèmes cardiaques importants sont souvent responsables de la mort prématurée de ces souris.
Devenir
les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever les tissus en vue d'analyse post-mortem
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d’une étude in vitro menée sur des cellules de patients HGPS. Cependant, ce modèle cellulaire ne permet pas d’explorer l’intégralité des mécanismes métaboliques qui peuvent avoir lieu dans un organisme. Le passage au modèle in vivo est donc une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats d’efficacité et de pharmacocinétique interprétables. Dans ce sens la cohorte destinée à l’analyse du biomarqueur précoce comporte 7 animaux par groupe. L’estimation du nombre d’animaux par groupe nécessaire a été réalisée sur le critère principal suivant : comparaison du niveau moyen de progérine entre chaque groupe de traitement (comparaison de moyennes, test t, bilatéral). Nous avons comme hypothèse une diminution de 40% du niveau de progérine après traitement avec PGL217 par rapport au véhicule, avec un écart type de 30%. Avec un risque de première espèce alpha-0.05 et une puissance de 90%, le nombre d’animaux nécessaires par groupe est n=7 (estimation réalisée avec le logiciel R). Une seconde cohorte destinée à l’observation plus tardive d’un phénotype clinique mesurable comporte 10 animaux par groupe. Pour les deux cohortes, le nombre d’animaux utilisés a ainsi été optimisé pour permettre d’observer un effet du traitement.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gels, facile à ingérer par les souris. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle murin est le seul modèle envisageable pour tester des approches thérapeutiques dans le cadre de la pathologie HGPS, puisqu’il s’agit d’une maladie génétique qui a été modélisée sur la souris. Le modèle que nous utilisons récapitule à la fois la mutation génétique de la maladie, ainsi que la majorité des caractéristiques cliniques et de l’évolution de la pathologie observée chez l’Homme. Une seule autre espèce génétiquement modifiée existe, il s’agit d’un modèle de porc. Cependant, le phénotype de ce second modèle est moins documenté dans la littérature et la mise en place d’une telle étude serait plus complexe. Le choix de l’espèce est donc le plus approprié à l’objectif de l’étude proposée. Les animaux seront traités à partir de l'age de 5 semaines, avant que la pathologie ne se développe. La 1ère cohorte sera traitée jusqu'à l'age de 9 semaines afin d'analyser les biomarqueurs, précoces, la 2ème jusqu'à 15 semaines pour l'étude de l'efficacité tardive.
Effet des anticorps monoclonaux anti-RAMP2 et anti-RAMP3 dirigés contre les récepteurs de l’adrénomédulline sur la croissance tumorale.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des tumeurs humaines leur sont greffées (glioblastome, prostate, rein, poumon) puis traitées par des anticorps monoclonaux, la charge tumorale pouvant atteindre 1 500 mm³ et provoquer nécroses et métastases entraînant la mise à mort. Le porteur revendique un dispositif "ON/OFF" arrêtant les étapes suivantes en cas d'échec, censé réduire les effectifs. Il affirme que l'étude in vivo est "indispensable" pour prendre en compte le microenvironnement tumoral que le in vitro ne reproduit pas.
Objectifs
La croissance des tumeurs malignes nécessite un débit sanguin adapté, fourni par des vaisseaux néoformés, permettant l’apport d’éléments nutritifs et d’oxygène nécessaires à cette croissance pathologique. Ce phénomène est le résultat d’actions coordonnées entre les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement de la tumeur. Parmi les facteurs potentiels, une protéine fortement impliquée notamment dans le phénomène de vascularisation intra-tumorale a été mise en évidence : l’Adrénomédulline (AM). L’implication de l’AM dans le processus tumoral a fait l’objet de nombreux articles de recherche scientifique publiés dans des journaux internationaux. Son rôle a également été valorisé par plusieurs publications sur différents modèles tumoraux in vitro mais également in vivo. L’utilisation d’anticorps polyclonaux anti-système de l'AM, provoque une diminution de la croissance tumorale in vivo sur des modèles de xénogreffes tumorales. Cependant les anticorps polyclonaux ne peuvent être utilisés en thérapie humaine. Ainsi dans cette optique, des anticorps monoclonaux ont été développés. Cette étude permettra d’évaluer l’efficacité des différents anticorps monoclonaux produits sur différents modèles tumoraux et de les valider comme potentiel outil thérapeutique.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est de démontrer que les anticorps monoclonaux bloquants anti-récepteurs de l’AM dirigés contre la région extracellulaire peuvent déstabiliser la vascularisation tumorale par apoptose des cellules vasculaires endothéliales et promouvoir une régression tumorale faisant de ces anticorps un outil thérapeutique visant à améliorer le traitement des cancers et permettant de répondre à l’échappement de certains patients aux thérapeutiques actuellement utilisées.
Procédures
3 procédures expérimentales vont être menées: 1/Test d’angiogenèse sur souris C57BL6. Nous aurons différents groupes d’expérimentation : 1 groupe contrôle placebo recevant une solution saline ; 1 groupe positif traité avec un anticorps polyclonal ayant montré dans une étude in vivo antérieure une efficacité ; 5 groupes correspondant aux 5 anticorps monoclonaux anti-RAMP2 validés comme efficaces in vitro ; de même 5 groupes pour les 5 anticorps monoclonaux anti-RAMP3 validés in vitro. Pour chaque groupe, 10 souris seront nécessaires. Nous aurons donc besoin pour une expérimentation de 12 groupesx10 souris soit 120 souris. Cette expérience sera réalisée en duplicate pour valider les résultats obtenus et montrer leur reproductibilité, nous aurons donc besoin de 240 souris C57BL6. Les souris seront mises à mort au 21ème jours. 2/Effet anti-tumoral sur des xénogreffes hétérotopiques de cellules tumorales humaines issue de glioblastomes, prostate, rein et poumon. Suite à l’angiogenèse in vivo, seuls les 3 meilleurs anticorps monoclonaux anti-RAMP2 et les 3 meilleurs anticorps anti-RAMP3 seront utilisés. Il y aura toujours un groupe placebo et un groupe contrôle positif traité avec l'anticorps polyclonal. Pour les modèles du cancer de la prostate, du rein et du poumon, on a 8 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe = 80 souris par modèle soit pour 3 modèles = 240 souris. Pour le modèle du glioblastome (prise tumorale 100%), on a 8 groupes x 7 souris = 56 souris. Cette expérience sera dupliquée, ce qui fera un maximum de 592 souris athymiques. Le temps de traitement sera dépendant de la vitesse de croissance tumorale et du suivi clinique des animaux. 3/Effet anti-tumoral sur des xénogreffes orthotopiques de cellules tumorales humaines issue de glioblastomes, prostate, rein et poumon. Pour les anticorps monoclonaux, suite aux expériences hétérotopiques, seuls les 2 meilleurs anticorps anti-RAMP2 et les 2 meilleurs anticorps anti-RAMP3 seront utilisés, nous aurons toujours un groupe placebo et un groupe contrôle positif. Pour chaque modèle, on a donc 6 groupes d’expérimentation x 10 souris par groupe = 60 souris, soit pour l’ensemble des modèles 4x60 = 240 souris. Cette expérience sera dupliquée pour montrer sa reproductibilité ce qui montera le besoin en souris à 480. Le temps de traitement sera dépendant de la perte de poids de l'animal et du suivi clinique, sans modification le temps maximum de traitement sera de 5-6 semaines.
Impact sur les animaux
Pour détecter toute souffrance, nous observons quotidiennement le comportement des souris : mobilité, alimentation, agressivité, prostation, déshydratation, abcès, hémorragies. La souris ne devra pas perdre plus de 20 % de son poids et la charge tumorale ne devra pas excéder 10% du poids de l'animal ou un volume de 1500mm3. Ce suivi clinique sera effectué par la pesée des animaux (2 fois/semaine mais tous les jours si la perte de poids est supérieure ou égale à 10%) et par mesure de la masse tumorale avec un pied à coulisse dans le modèle hétérotopique (3 fois/semaine). Si un des critères pré-établis selon la grille d'évaluation de la souffrance ou de détresse mise en place, il sera mis à mort immédiatement. Des phénomène de nécrose peuvent également être observés sur les xénogreffes hétérotopiques. Ils sont associés au développement tumoral des glioblastomes sans traitement au préalable ceci étant due probablement à la vitesse de croissance tumorale très importante. Les autres modèles tumoraux peuvent également présenter des phénomènes de nécrose de la tumeur suite à un traitement anti-angiogénique. Enfin des métastases peuvent apparaître, les animaux seront alors immédiatement mis à mort.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Prélèvement de tissus après mise à mort : sous hotte stérile prélèvements du Matrigel, des tumeurs et des organes afin de réaliser des études permettant l'analyse de la croissance tumorale et du microenvironnement en fonction des traitements appliqués.
Remplacement
Le processus de développement d'une substance originale comme médicament exige, après l'étude in vitro sur des cellules en culture, de valider son utilisation in vivo. En effet préalablement à cette étude in vivo, des études ont été menées sur 12 anticorps anti-RAMP2 et 12 anticorps anti-RAMP3 pour déterminer leur efficacité sur la prolifération de cellules tumorales, sur la migration/invasion des cellules endothéliales et sur leur capacité à bloquer l'angiogénèse in vitro. Suite à ces résultats, nous avons pu réduire le nombre d'anticorps à tester in vivo ainsi parmi les 24 anticorps, seuls les 5 anticorps anti-RAMP2 et les 5 anticorps anti-RAMP3 les plus efficaces ont été retenus pour passer à l'étape in vivo. Cette étude in vivo sur modèles tumoraux ne peut être remplacée car elle est indispensable pour prendre en compte le microenvironnement tumoral sachant de nombreuses études publiées au niveau internationnal montre que ce compartiment est un partenaire très actif avec la cellule maligne influançant le processus tumoral, celui-ci n'étant pas pris en compte in vitro. Il est également nécessaire de déterminer s'il existe des effets physiologiques de ces anticorps. Les retours d'expériences in vivo sont donc indispensables au développement de potentiel médicament et sont des pré-requis à l'étude clinique.
Réduction
Ce projet sur 5 ans présente un nombre maximum de souris de 1312 cependant ces études seront menées avec un système de ON/OFF et en affinant le nombre d'anticorps à tester. Préalablement à cette étude in vivo, des études ont été menées sur 12 anticorps anti-RAMP2 et 12 anticorps anti-RAMP3 pour déterminer leurs efficacités sur la prolifération de cellules tumorales, sur la migration/invasion des cellules endothéliales et sur leur capacité à bloquer l'angiogénèse in vitro. Suite à ces résultats, nous avons pu réduire le nombre d'anticorps à tester in vivo à 5 anticorps et par conséquent le nombre de lots d'animaux à utiliser. Ainsi une première étude d'angiogénèse sera réalisée avec 5 anticorps anti-RAMP2 et 5 anticorps anti-RAMP3. Si l'expérience est infructueuse, elle sera arrêtée. Si des résultats positifs sont obtenus, l'étude sur xénogreffes hétérotopique (étape 2) sera lancée mais avec un maximum de 3 anticorps anti-RAMP2 et 3 anti-RAMP3 à tester. Pour l'étape 3 s'agissant de l'étude sur xénogreffes orthotopiques, seuls les modèles tumoraux positifs à l'étape 2 et un maximum de 2 anticorps ant-RAMP2 et 2 anti-RAMP3 seront lancés. Cependant si les résultats sont négatifs à l'étape 2, l'étude sera arrêtée après les modèles hétérotopiques. Ce nombre de 1312 souris correspond aussi à un nombre de souris n=10 par groupe d'expérimentation sauf pour le modèle hétérotopique du glioblastome où n=7. Ce nombre de 10 souris (ou 7) par groupe d'expérimentation nous permet d'avoir un échantillonnage statistiquement interprétable au niveau de la réponse au traitement et de faire face aux problèmes de prises tumorales. Pour analyser les résultats obtenus nous utilisons le test de variance ou de Fischer PLSD, Statview 512. Pour valider les résultats, les expériences devront être dupliquées pour prouver leur reproductibilité et leur non-dépendance par exemple au lot de production des souris.
Raffinement
Les expérimentations seront débutées au plus tôt 15 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Les souris seront hébergées dans des cages de tailles adéquates. Un enrichissement du milieu par igloo teintés en polycarbonate qui réduit le stress induit par les facteurs environnementaux et les interactions sociales sera utilisé. Les facteurs physiques de l'environnement (lumière, bruit, température et renouvellement) d'air sont contrôlés et adaptés au modèle murin. Les souris seront surveillées quotidiennement par un personnel expérimenté. Pour diminuer la souffrance au moment de l'acte chirurgical, une analgésie pré et post-opératoire sera appliquées. Le temps d’analgésie post-opératoire sera adapté en fonction du suivi clinique des souris. Au moment de l'injection du Matrigel ou des cellules tumorales, une anesthésie gazeuse sera réalisée. Dans le cas du modèle orthotopique, une anesthésie fixe sera utilisée. Si des nécroses de la tumeur apparaissent, nous soulagerons la douleur des souris par application d'une analgésie adaptée. Pour détecter toute souffrance, leur comportement est observé régulièrement : mobilité, alimentation, agressivité, prostration, déshydratation, abcès et hémorragies. La souris ne devra pas perdre plus de 20% de son poids et la charge tumorale ne devra pas représenter plus de 10% du poids de l'animal sans excéder 1500mm3. Ce suivi clinique sera effectué par la pesée des animaux et la mesure du développement des tumeurs avec un pied à coulisse dans le modèle hétérotopique. Si un des critères pré-établis survient chez l'animal, il sera mis à mort immédiatement par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Pour les tests d’angiogénèse in vivo, nous utiliserons des souris C57BL6, modèle général polyvalent. L’immunocompétence de ces souris est importante car l’objectif est d’étudier l’ensemble des cellules recrutées par l’AM au sein du Matrigel, cellules pro-angiogéniques et cellules du système immunitaire. Certes il y a un risque d’immunisation active des souris contre l’anticorps injecté cependant le temps de traitement de maximum 15-20 jours va permettre de limiter au maximum ce biais potentiel. Ce modèle a été validé et publiés dans de nombreux articles internationaux. Pour les études sur la croissance tumorale, la souris athymique nude, laquelle a un système immunitaire déficient, a été choisi afin de pouvoir implanter des cellules cancéreuses (lignées cellulaires humaines établies) permettant la formation de tumeur. Les souris seront âgées de 7-8 semaines afin d'avoir un poids adulte stable. Pour les souris C57BL6, cet âge est également adapté à l’immunocompétence attendue dans le modèle d'étude de l'angiogénèse in vivo.