Procédures sévères
Cellules souches et réparation osseuse – 5
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, dont 360 en gravité sévère. Une blessure osseuse est provoquée sous anesthésie chez des souris génétiquement modifiées, certaines recevant ensuite des molécules inhibitrices, avant prélèvement des tissus osseux. Le porteur décrit une réparation spontanée en trois semaines et affirme qu'aucune souffrance visible n'apparaît après le premier jour. Il classe pourtant 360 de ces animaux en gravité sévère, sans détailler dans le résumé ce qui distingue leur atteinte.
Objectifs
Les maladies du système musculosquelettique touchent une large proportion de la population, que ce soient des maladies génétiques affectant le développement et la croissance osseuse, les cancers, les maladies dégénératives liées au vieillissement telles que l’ostéoporose et l’arthrose ou encore les défauts de régénération suite à un traumatisme. Ce projet vise à mieux comprendre le processus de régénération osseuse afin de mettre au point de nouvelles applications thérapeutiques cellulaires et pharmacologiques. Ce projet a 2 objectifs principaux: - développer des stratégies thérapeutiques pour les défauts de régénération osseuse liés à des pathologies génétiques ou à un traumatisme musculosquelettique. Pour cela, les souris présentant un défaut de réparation osseuse sont traitées avec différents inhibiteurs spécifiques de voie de signalisation impliquées dans ces défauts de réparation et l’impact de ces traitements sur la régénération osseuse est évalué. - identifier l’implication de nouvelles voies de signalisation dans les défauts de régénération osseuse. Pour cela, les gènes spécifiques de ces voies de signalisation sont invalidés dans les cellules souches osseuses et l’impact de ces mutations sur le phénotype de réparation osseuse est évalué.
Bénéfices attendus
Les fractures représentent les blessures les plus fréquentes du système musculosquelettique. Bien que la réparation osseuse soit un processus très efficace, environ 20% des fractures présentent un retard ou absence de réparation. Le traitement de ces défauts de réparation est compliqué, nécessitant généralement une prise en charge chirurgicale. Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la régénération osseuse en condition physiologique et pathologique. D’un point de vue fondamental, il permettra une meilleure compréhension du rôle de différentes voies de signalisation dans la régénération osseuse physiologique et pathologique. Il s’agit également d’un projet permettant l’étude de nouveaux traitements sur les défauts de régénération osseuse. Les potentielles applications cliniques sont concrètes et ouvrivont la voie à l’utilisation de ces traitements chez les patients.
Procédures
Afin de répondre aux questions du projet, nous utilisons des modèles murins transgéniques, permettant l’inactivation des gènes d’intéret. Une blessure osseuse est induite sous anesthésie générale avec une analgésie péri- et post-opératoire (durée de la procédure entre 30 et 45 min). Afin de tester des approches thérapeutiques, certains lots de souris sont traités avec des molécules inhibitrices pour déterminer l’effet des traitements sur les atteintes osseuses (durée du traitement entre 2 et 4 semaines).
Impact sur les animaux
Le processus de régénération osseuse est spontané. Le cal est formé en une semaine stabilisant la fracture et les animaux sont guéris après 3 semaines lorsque le cal est entièrement ossifié. Ils ne présentent pas de signes visibles de souffrance 24h après la fracture. Ils boitent les premiers jours mais ont une activité normale dans la cage (marchent, grimpent, boivent, se nourrissent etc...) et ne présentent pas de signes visibles de souffrances (apparence physique externe normale, pas de signes de détresse).
Devenir
Les animaux sont sacrifiés à la fin de l’ensemble des procédures afin de permettre l’analyse tissulaire et cellulaire des tissus osseux.
Remplacement
Le processus de régénération osseuse est complexe et implique de multiples types cellulaires, dont l’activité coordonnée et les interactions sont indispensable. Ces évènements ont lieu dans un environnement tissulaire complexe impliquant des interactions entre l’os, les vaisseaux, le système immunitaire, le système nerveux et les muscles. Expérimentalement, il n'est pas possible de reproduire la complexité de cet environnement dans un système cellulaire in vitro, et il est nécessaire de recourir à l’utilisation de modèles murins. Toutefois, nous combinons les études in vivo avec des analyses cellulaires in vitro lorsque que nous cherchons à identifier des défiences au niveau d’un type cellulaire particulier
Réduction
Dans notre expérience et grâce à des analyses statistiques, nous avons déterminé un nombre réduit de temps à analyser et une taille d'échantillon de 10 animaux par groupe pour fournir des résultats statistiques valables. Avec une taille d'échantillon de 10 dans chaque groupe de comparaison, la probabilité de détecter une différence est supérieure à 80 %.
Raffinement
Le processus de régénération osseuse est spontané et est complet en moins de 3 semaines. Les animaux sont suivis de façon régulière. Ils ne présentent pas de signes visibles de souffrance 24h après la fracture. Ils boitent les premiers jours mais ont une activité normale dans la cage (marchent, grimpent, boivent, se nourrissent etc...) et ne présentent pas de signes visibles de souffrances (apparence physique externe normale, pas de signes de détresse). Nos expérimentations sont accompagnées d’une analgésie en péri- et post-opératoire. Des points limites ont été définis et permettent un suivi efficace des animaux et la mise en place de réponses adaptées le cas échéant. Pour le bien-être animal, des enrichissements (coton, maisonnette, papier) sont placés dans les cages. Ces éléments sont adaptés aux procédures proposées.
Choix des espèces
Mus musculus est une espèce de choix pour étudier les mécanismes de la réparation osseuse, car les étapes de réparation ressemblent aux étapes observées chez l’homme. Mus musculus permet d’analyser les bases génétiques de la réparation osseuse normale ou pathologique grâce aux nombreux outils cellulaires et moléculaires à notre disposition. La réparation osseuse est un processus physiologique très efficace en particulier chez Mus musculus permettant de controler et traiter la douleur et ne conduisant pas à des dommages durables. L’ensemble des procédures sont réalisées sur des animaux adultes, entre 2 et 6 mois pour les expériences de régénération osseuse et entre 6 et 16 mois pour le suivi de la physiologie osseuse.
Evaluation des effets thérapeutiques d’une nano molécule immuno-modulatrice dans un modèle murin de maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 360 en gravité sévère. Elles reçoivent des injections répétées d'une neurotoxine, le MPTP, pour reproduire une maladie de Parkinson, puis un dendrimère testé comme candidat-médicament. Le porteur signale une mortalité aiguë d'environ 10 % liée à la neurotoxine et un effet néfaste sur le système cardiovasculaire. La preuve d'efficacité recherchée reste au stade de l'espoir, présentée comme une "pré-maturation" du candidat.
Objectifs
La maladie de Parkinson est le deuxième trouble neurodégénératif le plus fréquent après la maladie d'Alzheimer. Les caractéristiques cliniques comprennent des tremblements, une rigidité musculaire, une lenteur des mouvements volontaires et une instabilité posturale. Ces symptômes sont attribués principalement à un déficit en dopamine dans le cerveau. Parmi les différents systèmes dopaminergiques du système nerveux central, la voie nigro-striée ascendante a été identifiée comme la plus gravement endommagée dans la maladie de Parkinson. Plusieurs traitements sont actuellement disponibles. Ils permettent une amélioration de la qualité de vie et une diminution des symptômes. Cependant, ces médicaments ne sont efficaces que sur une partie des patients et, fondamentalement, ne permettent pas la guérison de cette maladie. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles thérapies. A l’heure actuelle, ni la cause ni les mécanismes sous-jacents à la mort des neurones dopaminergiques nigro-striataux ne sont connus. Mais, il est maintenant communément admis que l’inflammation chronique contribue à la dégénérescence neuronale. Les cellules microgliales, macrophages résidents du système nerveux central, participent à l’instauration et au maintien de cette neuroinflammation chronique. Tout agent capable de moduler ces cellules et donc ce phénotype délétère sera un candidat-médicament de choix pour le traitement de cette maladie. Nous développons en ce moment dans le laboratoire, une molécule qui pourrait remplir cette fonction. En effet, nous avons précédemment montré que des molécules synthétiques de taille nanométrique, les dendrimères phosphorés, ont des propriétés anti-inflammatoires et immuno-modulatrices inédites. En particulier, nous avons apporté les preuves de concept in vivo du potentiel thérapeutique du dendrimère ABP dans des modèles murins de trois maladies inflammatoires chroniques : la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques et le psoriasis. Nous avons depuis des résultats in vitro qui prouvent que ce dendrimère ABP pourrait aussi être efficace pour combattre la composante inflammatoire dans la maladie de Parkinson. L'objectif global de ce projet est donc d'évaluer le potentiel thérapeutique de ce composé dans un modèle murin de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Au terme de ce programme de pré-maturation nous espérons apporter la preuve d’efficacité dans le modèle murin de maladie de Parkinson (modèle d’intoxication au MPTP) et valider le dendrimère ABP en tant que candidat-médicament pour combattre la maladie de Parkinson. Ainsi, nous souhaitons valider notre concept de rééducation de la microgliose réactive par le dendrimère ABP qui sera alors un candidat-médicament validé pour le traitement de la maladie de Parkinson. Pour rappel, la microgliose réactive est commune à la plupart des maladies neurodégénératives. De fait, le dendrimère ABP sera un candidat-médicament pour d’autres maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer et la sclérose en plaque amyotrophique. En outre, le rôle de la microglie dans l’étiologie d’autres pathologies neurologiques telles que l’autisme et l’épilepsie étant de plus en plus décrit, l’utilisation du dendrimère ABP pourrait aussi y être envisagée.
Procédures
Interventions sur animaux : 1) Injection intrapéritonéale de la neurotoxine MPTP ou PBS sur 720 souris vigiles (durée 5 sec ; 4x toutes les 2 heures sur 1 jour) 2) Injection intraveineuse du dendrimère ABP sous anesthésie générale sur 510 souris (durée 2 min): Phase 1 (150 souris) : 50 souris recevront 1 dose du dendrimère ABP ou PBS ; 50 souris recevront 2 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 50 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Phase 2 (360 souris) : Posologie préventive (180 souris) : 180 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours en traitement préventif puis, 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Posologie curative (180 souris) : 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. 3) Injection intracérébroventriculaire (Intervention chirugicale stéréotaxique) du dendrimère ABP sous anesthésie générale sur 510 souris (durée 20 min) : Phase 1 (150 souris) : 50 souris recevront 1 dose du dendrimère ABP ou PBS ; 50 souris recevront 2 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 50 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Phase 2 (360 souris) : Posologie préventive (180 souris) : 180 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours en traitement préventif puis, 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. Posologie curative (180 souris) : 60 souris recevront 3 doses du dendrimère ABP ou PBS ; 60 souris recevront 5 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours ; 60 souris recevront 10 doses du dendrimère ABP ou PBS espacées de 3 jours. 4) Mise à mort par perfusion intracardiaque (durée 3 min) : Toutes les souris (1020) du projet subiront cette intervention chirurgicale sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables de l’intoxication au MPTP, est la forte mortalité aiguë (pour la souche C57BL/6 de l’ordre de 10%). Les effets du composé sur le système nerveux central ne sont pas mis en cause. Par contre, il semble qu’ils soient reliés à une diminution de la température corporelle et à un effet néfaste direct sur le système cardiovasculaire. Ces effets sont visibles 24h.
Devenir
Les souris de la prodédure 1 (Génération des souris MPTP modèles de la maladie de Parkinson) sont utilisés dans les procédures 2 et 3. Ensuite, toutes les souris des procédures 2, 3 (Et donc 1) sont utilisées dans la procédure 4. Cette dernière procédure consiste à la mise à mort des animaux afin de prélever leur cerveau pour des analyses de biologie cellulaire et moléculaire. Ces analyses permettront de détailler les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’effet thérapeutique du dendrimère ABP. Les animaux ne seront donc pas gardés en vie car nous allons collecter leur cerveau pour procéder les expériences suivantes : 1) Mesure de la fluorescence émise par ABP dans le cerveau pour établir la distribution de la nanoparticule dans le cerveau après injection i.v. ou i.c.v.. 2) Extraction et mise en culture de la microglie pour évaluer par cytométrie en flux leur profil pro- ou anti-inflammatoire dans le modèle MPTP suite aux injections i.v. ou i.c.v. d'ABP. 3) Immunohistochimie afin d'évaluer l'effet protecteur d'ABP sur la neurodégénérescence des cellules dopaninergiques de la substance noire. 4) Exprériences de RT-PCRq pour étudier les gènes impliqués dans le profil pro- ou anti-inflammatoire de la microglie.
Remplacement
Les animaux sont utilisés après des analyses réalisées in vitro afin de confirmer des résultats démontrés et des hypothèses formulées à partir des travaux réalisés sur cellules. A ce stade de l’expérimentation, l’utilisation de l’animal est inévitable. Actuellement aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité. Les études sont systématiquement optimisées (doses inhibiteurs, durée du régime) d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire. De plus, les traitements sont administrés de la façon la moins invasive possible (par priorité : alimentation ou boisson/injection i.p./ injection i.v./injection i.c.v.).
Réduction
L’utilisation de l’animal est réduite au maximum et les effectifs des cohortes sont limités par l’outil statistique. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 10 souris par groupe expérimental et nous répéterons les expériences 3 fois afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera suivi tout au long de nos expériences et fera l’objet de procédures strictes. Les souris seront toujours hébergées en groupes dans des cages avec une surface réglementaire, avec un libre accès à l’eau et la nourriture. Un suivi des animaux a été mis en place en accord avec le comité de suivi du bien–être animal de notre établissement pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les animaux sont hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront à disposition des igloos, des bâtons à ronger et cotons pour la nidification. Les animaux sont suivis quotidiennement, permettant la détection précoce d’anomalies éventuelles. Un animal sera euthanasié s’il présente une prostration continue, une déshydratation ou une perte de poids supérieure à 20%. Des périodes d’acclimatations à l’hébergement comme à la manipulation permettront de limiter l’angoisse des animaux. La douleur liée à l’expérimentation sera limitée par l’utilisation systématique d’analgésiques. En outre, les responsables du projet ont été formés à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et garantissent de la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le travail de notre équipe s’inscrit dans la recherche et le développement de nouveaux médicaments pour combattre les maladies inflammatoires chroniques. Ainsi, le but de cette étude est de démontrer que le dendrimère ABP est un candidat médicament pour la maladie de Parkinson. On appelle « développement d’un médiatement », le processus de fabrication d’un nouveau médicament. Il englobe les différentes étapes (toutes essentielles), de la conception à la demande d’autorisation de mise sur le marché. L’étude préclinique est la seconde étape fondamentale de ce processus. Elle fait appel à l’expérimentation animale. Cette étape permet de définir la valeur thérapeutique potentielle d’une nouvelle molécule et d’obtenir les premiers éléments sur le comportement d’un candidat médicament (toxicité, efficacité, etc…). C’est un prérequis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. En effet, ces expériences in vivo ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées in vitro. Nous en sommes à cette étape concernant le dendrimère ABP dans la MP.L’expérimentation animale est indispensable au processus de création de nouveaux médicaments. Elle est donc rationnelle dans notre projet de développement d’une nouvelle molécule thérapeutique et elle sera réalisée en suivant les bonnes pratiques et en garantissant un traitement éthique des animaux.
Identification et manipulation des réseaux neuronaux encodant pour la valeur, la valence et la prépondérance des émotions de peur chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures de souffrance modérée et l'autre moitié sévère. Chaque animal subit deux chirurgies cérébrales puis une perfusion intracardiaque et un prélèvement du cerveau, pour cartographier les circuits neuronaux de la peur au moyen d'outils comportementaux, électrophysiologiques et optogénétiques. Le porteur déclare pourtant "aucun" effet indésirable attendu, alors que 768 souris sont classées en souffrance sévère. Il conclut qu'il "n'existe pas de méthode alternative", une culture cellulaire ne contenant pas les connexions neuronales étudiées.
Objectifs
L’objectif principal de ce protocole est double. Premièrement, développer et valider un protocole de comportement chez la souris libre de ses mouvements pour distinguer les termes de valeur, de valence et de la prépondérance. Deuxièmement, l’identification et la manipulation des réseaux neuronaux qui encodent les signaux mentionnés ci- dessus. Ces objectifs seront atteints en utilisant une combinaison d’outils comportementaux, électrophysiologiques, pharmacologiques et optogénétiques.
Bénéfices attendus
Le développement d’un protocole pour dissocier simultanément la valeur, la valence et la prépondérance nous permettra d’étudier comment les réseaux neuronaux dédiés encodent ces différents signaux. Cela nous permettra de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour des pathologies telles que l’anxiété ou le trouble de stress post-traumatique où la prise de décision de ces signaux est souvent inadaptée.
Procédures
Opérations chirurgicales : tous les animaux sont soumis à deux procédures chirurgicales Prélèvements de tissus : touds les animaux sont soulmisd au prélèvement du cerveau après perfusion intracardiaque à la fin de l'expérimentation
Impact sur les animaux
aucun
Devenir
Euthanaise de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau
Remplacement
L'identification et la manipulation des circuits impliqués dans l’encodage de valence, valeur et prépondérance de signaux de peur nécessitent l'utilisation d'un cerveau intact chez l'animal vigile. De plus, des méthodes telles que la culture cellulaire ou bien les coupes de cerveau ne contiennent pas les connections neuronales qui sont le sujet de nos travaux. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.
Réduction
le nombre d’animaux a été calculé par l’estimation de la variance observée avec ce type de données permettant d’atteindre une signification statistique. Ce nombre est de 15 souris par groupe mais par expérience 8 animaux par groupe sont suffisant et seront utilisés, soit un total de 1536 animaux pour la réalisation de ce protocole.
Raffinement
afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans le comportement de peur. De plus, nous utilisons ici des modèles transgéniques divers ce qui présente un intérêt scientifique fort. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal fin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.
Caractérisation des effets antiarythmiques de peptides dans un modèle murin du syndrome du QT long de type 3.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
184 souris vont être utilisées et toutes tuées, 160 sous anesthésie sans réveil et 24 dans des procédures de souffrance sévère. Les souris porteuses d'une mutation du canal sodique cardiaque, qui provoque des arythmies et une mortalité de 50 % dès sept semaines, sont euthanasiées à quatre semaines après un électrocardiogramme sous anesthésie, pendant lequel des peptides dérivés de venins sont testés. Le porteur reconnaît que la mutation entraîne un "phénotype dommageable" et justifie la mise à mort précoce par des raisons éthiques liées à la sévérité de la maladie. Les souris reproductrices, génétiquement modifiées, sont elles aussi tuées à quarante semaines.
Objectifs
Le syndrome du QT long (SQTL) congénital de type 3 est une maladie rare à transmission autosomique dominante due à des mutations gain-de-fonction du gène codant le canal sodique cardiaque Nav1.5. L'allongement de l'intervalle QT sur l'électrocardiogramme (ECG) est associé à un risque élevé d'arythmies cardiaques sévères pouvant conduire à des syncopes et des morts subites, le plus souvent au repos ou lors du sommeil. Ces symptômes apparaissent généralement à partir de la préadolescence, mais parfois plus tôt, ce syndrome étant suspecté d'être à l'origine d'une partie des cas de mort subite du nourrisson. Les bétabloquants, qui sont très efficaces pour prévenir les arythmies chez les patients atteints d'un SQTL de type 1 ou 2, ne montrent qu'une efficacité relative chez seulement 30-35% des patients atteints d'un SQTL de type 3. L'objectif de ce projet est de tester les effets antiarythmiques de peptides dérivés de toxines extraites de venins sur un modèle de souris porteuse de l'une des mutations identifiées chez les patients, la souris knock-in hétérozygote Scn5aWT/DelQKP1510-1512 (souris Scn5aWT/DelQKP). Ces peptides ont été sélectionnés in vitro pour leurs effets sur les deux cibles thérapeutiques potentielles identifiées lors de nos travaux antérieurs : le canal Nav1.5 lui-même, en inhibant le courant sodique persistant induit par la mutation, et le récepteur de la ryanodine de type 2, Ryr2 (canal calcique du réticulum sarcoplasmique), dont nous avons montré l'implication dans le déclenchement des arythmies in vitro sur des cardiomyocytes ventriculaires isolés de souris Scn5aWT/DelQKP.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'identifier : 1. au moins un inhibiteur du courant sodique persistant induit par la mutation de Nav1.5, capable de normaliser la durée de l'intervalle QT sur l'ECG et de prévenir la survenue des arythmies ventriculaires, offrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques, et 2. au moins un peptide stabilisateur de Ryr2 susceptible de prévenir la survenue des arythmies malgré l'allongement de l'intervalle QT, permettant ainsi de confirmer in vivo que Ryr2 participe effectivement au déclenchement des arythmies, et offrant là aussi une solution thérapeutique possible.
Procédures
Elevage pour l'obtention de souris Scn5aWT/delQKP, à phénotype sévère. Les souris Scn5aWT/delQKP seront euthanasiées à l'âge de 4 semaines, à l'issue d'un enregistrement de leur électrocardiogramme, limitant ainsi le risque de mort subite et d'insuffisance cardiaque, dont l'incidence augmente fortement après 4 semaines. Examen électrocardiographique. L'enregistrement d'un électrocardiogramme sera réalisé sous anesthésie en conditions contrôles et pendant l'injection de doses croissantes des peptides thérapeutique à tester. Cet examen durera 35 minutes sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les souris lors de la procédure expérimentale (procédure 2) mise en œuvre lors de ce projet sont leur contention et leur anesthésie par isoflurane. En effet, cette procédure consiste en l'enregistrement d'un ECG sous anesthésie avec euthanasie de l'animal en fin d'examen (classe sans réveil). En revanche, la mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, à partir de 4 semaines à une forte mortalité : 50% de mortalité à l'âge de 7 semaines. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Pour limiter les conséquences de ce phénotype sur le bien-être des animaux, deux décisions ont été prises : (1) pour l'entretien de la lignée (procédure 1), nous n'utilisons pas de souris porteuses de la mutation (voir paragraphe 5.10.3), et (2) notre étude sera réalisée à l'âge de 4 semaines, avant la survenue des premiers décès.
Devenir
Tous les souriceaux Scn5aWT/delQKP et contrôles inclus dans l'étude seront euthanasiés à l'âge de 4 semaines à la fin de la procédure 2 pour des raisons éthiques compte-tenu de la sévérité du phénotype cardiaque au delà de cet âge. Les souriceaux surnuméraires des portées seront également euthanasiés à 4 semaines à l'exception des souriceaux Scn5aWT/Neo-delQKP et Flp qui seront conservés pour renouveler les souris utilisées pour la reproduction. Les souris reproductrices sont euthanasiées à l'âge de 40 semaines et remplacées, dans la mesure où elles sont génétiquement modifiées et ne peuvent être utilisées pour d'autres études.
Remplacement
Cette étude est focalisée sur un modèle de pathologie cardiaque qui nécessite une exploration fonctionnelle in vivo. Seule l'expérimentation animale peut permettre de déterminer si le traitement testé présente un intérêt clinique en normalisant la durée de l'intervalle QT à l'ECG et/ou en prévenant les arythmies. Les peptides qui seront testés chez la souris ont été sélectionnés pour leurs effets sur nos deux cibles thérapeutiques à l'issue d'un screening réalisé sur des lignées cellulaires, réduisant ainsi le recours au modèle animal.
Réduction
Un maximum de 20 souris (10 souris sauvages et 10 souris mutées) par peptide nous semble nécessaire pour réaliser une étude statistique fiable. Toutefois, cette étude s'étalant dans le temps dans la mesure où l'on ne peut escompter qu'un maximum de 2 souris mutées par portée, une première analyse statistique sera réalisée après inclusion de 16 animaux (8 souris sauvages et 8 souris mutées). Si les effets observés sont statistiquement significatifs, les souris supplémentaires ne seront pas incluses, réduisant ainsi le nombre de portées nécessaires. Les effets des molécules le rythme sinusal, la conduction de l'influx électrique cardiaque et la repolarisation ventriculaire seront évalués par analyse de variance à une voie pour mesures répétées, complétée par un test de Tukey pour comparaisons multiples. Les effets des molécules sur la survenue des arythmies ventriculaires sera évaluée avec un test de Fisher.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels pour se camoufler, ou de papier pour fabriquer des nids. L'enregistrement de l'ECG sera réalisé sous anesthésie. Comme mentionné précédemment, la mutation conduit à un phénotype dommageable, puisqu'elle entraine des arythmies ventriculaires plus ou moins sévères chez les souris porteuses qui conduisent, à partir de 4 semaines à une forte mortalité : 50% de mortalité à l'âge de 7 semaines. Les souris qui ont peu ou pas d'arythmies (seulement un allongement de l'intervalle QT) survivent jusqu'à l'âge adulte mais développent une hypertrophie myocardique conduisant à terme à une insuffisance cardiaque. Nous avons donc choisi de ne pas conserver de souris mutées au-delà de l'âge de 4 semaines. Les souris mutées sont obtenues par croisement de souris porteuses de la cassette de recombinaison FRT-neomycin-FRT-delQKP (souris Scn5aWT/Neo-delQKP), qui n'expriment pas la mutation, avec des souris exprimant la flipase, permettant ainsi l'excision de la cassette neomycin et l'expression de la mutation chez 25% des souriceaux résultant de ces croisements. Les souris Scn5aWT/Neo-delQKP et les souris flipase n'ont pas de phénotype dommageable.
Choix des espèces
La souris est actuellement la seule espèce dans laquelle une mutation responsable de SQTL3 a été introduite. C'est un bon modèle de cette pathologie humaine, avec cependant une sévérité plus importante des arythmies par rapport aux patients. L'étude sera réalisée sur des souris de 4 semaines pour deux raisons. La première est scientifique : chez l'humain, les symptômes de la maladie étudiée apparaissent très tôt, avant l'âge adulte, ce qui est d'ailleurs observé sur le modèle de souris. La seconde raison est d'ordre éthique : au-delà de 4 semaines, la mortalité des souris mutées devient très élevée.
Transfert de gènes par voie intraveineuse et intracérébrale chez la souris saine : screening des nouveaux vecteurs AAVs optimisés pour la transduction du CNS
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
194 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 104 d'entre elles et sévère pour 90. Elles reçoivent des injections stéréotaxiques dans le cerveau sous anesthésie et des injections intraveineuses de vecteurs AAV, pour comparer des voies d'administration en thérapie génique des maladies neurodégénératives. Le porteur évoque une possible perte de poids et prévoit l'euthanasie des animaux dont l'état ne s'améliore pas. Il affirme que le recours aux souris est "essentiel", aucune culture cellulaire ne reproduisant selon lui la complexité du cerveau.
Objectifs
Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression des maladies neurodégénératives, une préoccupation croissante en santé publique. Des nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour progresser dans la prise en charge des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouvent la thérapie génique. Les vecteurs adéno-associés (AAV) sont administrés dans le cerveau pour tester de nouvelles stratégies thérapeutiques dans des maladies neurodégénératives. La modulation du métabolisme du cholestérol est une cible thérapeutique intéressante. Le bénéfice thérapeutique de la modulation du métabolisme du cholestérol par surexpression d'une enzyme clé du metabolisme du cholesterol cérebrale appelée CYP46A1, a été prouvé dans plusieurs études récentes. En effet, cette approche a été démontrée comme efficace dans les modèles murins de la maladie d’Alzheimer, de Huntington et enfin les Ataxies. Ces preuves de concepts ont été établies par injections intracérébrales de vecteurs AAV (AAV codant pour la protéine agissant sur le metablolisme du cholesterol, comme la proteine CYP46A1). Cependant, dans l’optique d’une application clinique chez l’Homme, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie. L’objectif de ce projet est donc de valider l’efficacité thérapeutique de l’administration par voie intraveineuse de vecteurs AAV modifiés de façon à passer la barrière hématoencéphalique, étant ainsi capable d’amener une transduction plus homogène dans le cerveau. Ceci avec le but de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale remplacée par une injection intraveineuse.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de valider l’efficacité thérapeutique de l’administration intraveineuse de vecteurs AAV codant pour des protéines différentes : CYP46A1, et/ou aussi des gènes rapporteurs comme la GFP et/ou aussi la luciférase. Le but final est de trouver un traitement efficace et de le valider chez la souris, en utilisant un mode d’administration le moins invasif possible, afin de pouvoir l’appliquer chez l’Homme et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives
Procédures
deux procédures : 1. Injections stéréotaxiques sous anesthésie générale (durée 70min), animal endormi, avec une prise en charge analgésique afin d'eviter la douleur, par l'administration d'analgesique avant et après la chirurgie. 2. injections intraveineuses sous anesthésie générale (durée 5min), animal endormi.
Impact sur les animaux
Une perte de poids dû à l'injection de AAV pourrait être observé (5 à 7% du poids totale), bien que les concentrations des AAVs utilisées ont déjà été évaluées in vitro et dans nos précédentes études afin d'éviter toute toxicité chez la souris. Si ces effets seront observés, des actions seront menées par les expérimentateurs. L’animal sera euthanasié si les actions menées ne permettent pas d'améliorer son état.
Devenir
- Procédure 1 et procédure 2 : mise à mort, Les souris seront euthanasiées 3-8 semaines après les injections de la procedure 1 ou 2 ( le temps d'expression des AAVs etudiés) - pour les differentes etudes biocellulaires et biomoleculaires
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, nous avons déjà utilisé des souris sauvages pour mettre au point des protocoles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Réduction: Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (194) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteurs à injecter et les temps d'analyses.
Raffinement
Raffinement: Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et anti-inflammatoire, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est d’évaluer et de comparer des sérotypes d’AAV modifiées et donc améliorer l’expression des transgènes, étape importante pour maximiser l’effet d’un traitement dans une future thérapie génique après injection d’un AAV exprimant des gènes thérapeutiques dans la structure cible. Nous commencerons par valider nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. Les souris qui seront utilisées sont des souris adultes (4-8 semaines), dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnés d’injection dans le cerveau. Ce protocole a déjà été validé dans notre laboratoire. Les animaux sont identifiés par tatouage après une semaine d’acclimatations.
Étude et manipulation du corépresseur transcriptionnel Sin3A dans les processus de la mémoire à long-terme chez la souris C57BL/6 adulte et âgée
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections intracérébrales de virus AAV et de shRNA, puis passent une batterie de tests comportementaux (open-field, labyrinthe en croix surélevé, conditionnement à la peur) avant une perfusion intracardiaque, pour étudier le rôle de la protéine Sin3A dans la mémoire de la souris jeune et âgée. Le porteur reconnaît que les animaux peuvent développer prostration, perte de poids supérieure à 20 % et stress lié au conditionnement par la peur. Les retombées thérapeutiques contre le déclin cognitif lié à l'âge sont annoncées comme une perspective, tandis que le remplacement par des méthodes sans animaux est écarté au motif qu'il ne reproduirait pas la mémoire à l'échelle de l'animal entier.
Objectifs
Comprendre les événements biologiques conduisant à l’apparition des troubles cognitifs est un enjeu majeur de la recherche fondamentale en neurosciences. Une dérégulation des mécanismes épigénétiques et de l’expression des gènes impliqués dans la mémoire semble être une des causes de déficit cognitif lié à l'âge. Nous faisons l'hypothèse que la protéine Sin3A, un répresseur de l'expression des gènes, joue un rôle majeur dans la cognition et dans ses troubles associés. Nous altérerons l’expression de la protéine Sin3A pour identifier, au niveau cellulaire et moléculaire, les mécanismes impliquées dans le fonctionnement cérébral et les capacités cognitives, ainsi que leurs altérations liées à l'âge. Ce projet a comme objectifs : 1. de créer un nouveau modèle murin pour l'étude du corépresseur transcriptionnel SIN3A dans les processus de mémoire ; 2. de comprendre le rôle du corépresseur transcriptionnel SIN3A dans la mise en place de la mémoire à long-terme chez la souris adulte et âgée ; 3. d'étudier les conséquences d'une inactivation de ce corépresseur transcriptionel SIN3A sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la mémoire à long-terme ; 4. de proposer une nouvelle approche pour restaurer un décificit cognitif (apprentissage et mémoire) lié à l'âge. Ce travail éclaircira le rôle des modifications épigénétiques dans la mémorisation à long terme et fournira de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des troubles cognitifs liés à l'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet examinera et comparera systématiquement les mécanismes comportementaux, anatomiques, électrophysiologiques, cellulaires et moléculaires des troubles cognitifs associés à l'âge chez la souris. De plus, ce projet fera progresser de façon spectaculaire les connaissances actuelles sur les troubles cognitifs dans le cerveau âgé. Outre sa contribution à la résolution des problèmes économiques et sociaux associés aux troubles cognitifs survenant au cours du vieillissement, ce projet fournira des informations importantes sur le rôle du corépresseur transcriptionnel SIN3A dans les fonctions cognitives. Ce point est très important au vu du nombre croissant de publications sur le dysfonctionnement de la mémoire dans le vieillissement. Nous sommes convaincus que les résultats de ce projet seront exploités par une large communauté de neuroscientifiques, de pharmacologues et d'industries pharmaceutiques intéressés par les aspects développementaux du cerveau et de ses troubles. En outre, l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent le déficit de mémoire lié à l'âge, fournira de nouvelles perspectives dans la compréhension du déficit cognitif lié au vieillissement.
Procédures
1. Injection intracérébrale d'adenovirus associé (AAV5)-CamK2-mCherry (cette procédure concerne 92 animaux du projet et dure environ 60 min par animal). 2. Injection intracérébrale de shRNAs (cette procédure concerne les 312 animaux du projet et dure environ 60 min par animal). 3. Injections de 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) (cette procédure concerne 92 animaux du projet et dure moins de 5 secondes par animal). 4. Le test de l'open-field (cette procédure concerne 288 animaux du projet et dure environ 30 min par animal). 5. Le labyrinthe en croix surélevé (cette procédure concerne 288 animaux du projet et dure environ 5 min par animal). 6. Conditionnement à la peur surélevé (cette procédure concerne 288 animaux du projet et dure environ 6 min par animal). 7. Perfusion intra-cardiaque surélevé (cette procédure concerne 96 animaux du projet et dure environ 20 min par animal).
Impact sur les animaux
Certains animaux de ce projet peuvent développer des signes de souffrance tels qu'un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos vouté, une expression faciale modifiée, une fuite ou défense à la manipulation, ou une perte de poids>20% (basée sur des pesées quotidiennes). Des douleurs post-chirurgies et post-injections peuvent également apparaitre. Enfin, les animaux soumis à des tests comportementaux peuvent développer un état de stress notamment ceux qui sont soumis au test de conditionnement par la peur.
Devenir
A l'issue de chaque procédure expérimentale, l'ensemble des animaux (soit 312 au total) sera mis à mort pour poursuivre les investigations cellulaires et moléculaires.
Remplacement
De nombreux modèles animaux mimant les pathologies humaines ont été mise au point, grâce auxquels de nouvelles approches fondamentales et thérapeutiques de ces maladies ont été développées. La présence chez la souris de gènes équivalents à ceux de l’homme et la possibilité de manipuler simplement le génome de la souris ont conduit à une multiplication du nombre de modèles murins. Le modèle murin permet de comprendre la fonction d’un gène par la dysfonction en l’invalidant, ou de tester une hypothèse en vérifiant si une mutation observée conduit à la maladie ou s'il s'agit d'un simple polymorphisme du gène. De plus, les rongeurs sont capables de réaliser des apprentissages de différentes natures (simple et complexe) et nous pouvons analyser leur mémoire d’un point de vue comportemental (tests de mémoire), structural (études morphologiques), cellulaire (études des réseaux neuronaux) et moléculaire (études des gènes). Ainsi, l'utilisation d'un modèle animal dans ce projet ne peut être remplacé par des modèles in vitro ou in sillico.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante, d’après nos observations et celles rencontrées dans la littérature.
Raffinement
Tous les animaux sont hébergés selon les normes de bien être en vigueur (4 individus, présence d'enrichissement). Ils seront observés quotidiennement et des points limites ont été définis. Tous les signes de souffrance détectés lors de l'observation quotidienne tels qu'un isolement et une indifférence par rapport au milieu extérieur, une diminution du comportement exploratoire, une attitude prostrée avec dos vouté, une expression faciale modifiée, une altération de l’état du pelage, une fuite ou défense à la manipulation, ou une perte de poids>20% conduiront à la mise à mort des animaux en accord avec le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Le fond génétique C57BL6/JRj sera utilisé dans ce projet ; il est particulièrement bien adapté pour les analyses comportementales et métaboliques que nous comptons mener. Nous pourrons donc comparer directement nos observations avec celles de la littérature. Cela permet aussi d’éliminer les mises au point potentielles, et donc réduire l’utilisation de souris. Les protocoles décrits ci-dessous, relativement classiques, sont aussi bien maitrisés par les personnes impliquées dans ce projet. Des jeunes adultes âgés de 3 mois ainsi que des souris âgées de 16-18 mois seront utilisés dans ce projet afin d’étudier les conséquences d’une inactivation de la protéine SIN3A dans un cerveau mature et vieillissant. L’utilisation de ces deux stades (adulte et âgé) nous permettra également d’étudier cette protéine SIN3A au cours du vieillissement cérébral.
Etude du rôle d’un récepteur au froid (« TRPM8 ») dans l’hypothermie thérapeutique sur un modèle d’infarctus du myocarde chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
204 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent deux chirurgies, dont une thoracotomie avec intubation, pour provoquer un infarctus du myocarde et étudier le rôle d'un récepteur au froid dans l'effet de l'hypothermie thérapeutique. Le porteur décrit une couverture analgésique morphinique et un suivi post-opératoire par grille de score. Il affirme devoir prouver l'implication de ce récepteur "sur organisme vivant" après des années d'études in vitro.
Objectifs
L'infarctus du myocarde reste encore aujourd'hui l'une des principales causes de décès dans le monde. Une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeux au cours de l'infarctus ou des stratégies validées de cardioprotection reste donc nécessaire. Plusieurs données de la littérature démontrent en particulier un effet bénéfice de l'hypothermie thérapeutique (HT) dans certains contextes d'ischémie-reperfusion (I/R). Ce bénéfice a notamment été mis en évidence chez un modèle murin d'arrêt cardiaque développé au sein du laboratoire (diminution de la mortalité notamment) Décrypter l’intégration complexe des mécanismes médiés par l’hypothermie dans le contexte de l’I/R est nécessaire pour améliorer rationnellement les protocoles d’hypothermie thérapeutique en clinique. Parmi les récepteurs sensibles aux variations de température, le principal récepteur au froid est le canal appelé « TRPM8 » (Transient receptor potential cation channel subfamily M (melastatin) member 8). L'objectif du projet est de décrypter le rôle de TRPM8 dans l'effet cardioprotecteur de l'hypothermie thérapeutique, dans le cadre de l'ischémie-reperfusion cardiaque. Ce mécanisme offre comme perspective le développement d’agents pharmacologiques régulant l’activité des récepteurs au froid pour potentialiser ou restaurer l’effet protecteur du froid sur les lésions de reperfusion dans le cas d’un syndrome métabolique. A terme, l'objectif sera de développer une stratégie thérapeutique mimant ou améliorant l'effet protecteur de l'hypothermie thérapeutique. En effet, la procédure d'hypothermie thérapeutique est compliquée à mettre en place chez l'Homme et ne peut être initiée que tardivement dans la prise en charge des patients (car réalisable uniquement en structure hospitalière) Le projet impliquera 204 animaux maximum
Bénéfices attendus
En conclusion de ce projet, nous espérons obtenir une température cible pour notre HT. Cette température servira pour nos futurs protocoles liés à l’étude de la HT. Nous devrions observer une diminution de la taille d’infarctus, et/ou une potentielle diminution de la mortalité. Ce projet nous permettra également de valider l’implication du canal TRPM8 dans le bénéfice de la procédure HT. Cette implication nous permettra de travailler sur des substituts pharmacologiques mimant l’effet de la HT, facilitant ainsi la prise en charge thérapeutique des patients (la procédure d'hypothermie thérapeutique est compliquée à mettre en place chez l'Homme et ne peut être initiée que tardivement dans la prise en charge des patients).
Procédures
Les souris seront soumises à deux procédures chirurgicales, d’une durée totale respective de 90min puis 15min (sous anesthésie générale), espacées de 24H.
Impact sur les animaux
La procédure chirurgicale d’ischémie-reperfusion cardiaque (modèle d’infarctus du myocarde), implique une thoracotomie sous anesthésie générale profonde et couverture analgésique adaptée, avec intubation de l’animal. Il s’agit d’une technique maîtrisée au laboratoire depuis plusieurs années. Les soins (analgésie, enrichissement) et le suivi post-opératoires (surveillance post-opératoire, points limites) associés ont ainsi été optimisés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour permettre l’analyse de la taille d’infarctus (prélèvement cardiaque).
Remplacement
Le canal TRPM8 a été étudié in-vitro depuis de nombreuses années, notamment au laboratoire. Ces études ont permis d’établir le potentiel de TRPM8 comme cible thérapeutique. Nous devons désormais prouver l’implication de ce canal dans l’hypothermie thérapeutique suite à un infarctus du myocarde, dans une étude physiologique sur organisme vivant.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés au plus juste pour permettre l’obtention de résultats analysables statistiquement. Dans un objectif de réduction, seuls des animaux mâles seront utilisés pour la procédure 1 « pilote ». Le choix de recourir à des animaux C57bl/6J provenant d’un fournisseur (et non de notre élevage) permet ainsi de ne pas faire naître inutilement des animaux (femelle ou génotype inadapté) via notre élevage. Les résultats obtenus dans la procédure 1 (pilote) pour les températures sélectionnées seront directement intégrés à la procédure 2 afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire dans la procédure 2. Afin d’utiliser au mieux les animaux issus de l’élevage des lignées dans la procédure 2 (et éviter la mise à mort d’animaux non utilisables dans le projet), les expériences porteront sur les mâles et les femelles (pour un effectif total de 84 animaux). Ainsi, ce n’est que si un effet genre est observé sur ces premiers résultats, que les effectifs devront être adaptés (doublés) pour conserver une exploitation statistique fiable des résultats en séparant l’effet mesuré sur les mâles et celui mesuré sur les femelles. Le projet impliquera donc au maximum 204 animaux : 48 pour la procédure 1 puis 156 pour la procédure 2.
Raffinement
La chirurgie est réalisée sous anesthésie profonde (fixe), et couverture analgésique (morphinique et anesthésique local pour les abords) maintenue si besoin jusqu’à la mise à mort de l’animal (morphinique administré toutes les 6-8h selon la fiche d’observation/score). Au réveil, les animaux sont hydratés (300μL de sérum physiologique en sous-cutané) et placés en couveuse chauffées, où ils bénéficient d’eau sous forme gélifiée, et de nourriture de consistance molle, directement dans la litière, en plus du biberon et de la nourriture standard. Des capsules d’eau gélifiée enrichie en glucose et vitamines sont également disponibles si besoin. Un suivi du réveil est assuré à l’aide d’un « scoring » de symptômes, principalement respiratoires, comportementaux et morphologique, établi à deux temps post-opératoires clefs, dans le but d’intervenir de manière rapide et efficace, le cas échéant en concertation avec le chef de projet et/ou le vétérinaire référent.
Choix des espèces
La physiologie de la souris étant « proche » de celle de l’Homme nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Au sein de notre laboratoire et dans la communauté scientifique, la souche C57Bl/6 est largement utilisée pour les maladies cardiovasculaires, ce qui supporte notre choix (les animaux transgéniques utilisés dans ce projet sont sur fond C57bl/6J). De plus, le choix de ce modèle nous permet justement le recours à des modèles génétiquement modifié (animaux invalidés pour le gène du récepteur au froid TRPM8) Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 7 à 20 semaines. Des souris plus jeunes ne présentent pas d’intérêt thérapeutique associé. Les souris plus âgées augmentent le risque de décès et de complications post-opératoires.
Rôle des mastocytes MrgprB2 dans la physiologie et physiopathologie intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 140 relevant de la gravité sévère. Elles subissent l'insertion d'une bille de verre dans le côlon, des gavages, des injections de toxine diphtérique et l'induction d'une colite par le DSS, pour étudier le rôle de certains mastocytes dans la motilité intestinale. Le porteur indique que la colite provoque un stress et prévoit la mise à mort des souris perdant plus de 20 % de leur poids ou présentant des saignements abondants. Il qualifie le modèle murin d'"élément clé et incontournable" pour cette étude.
Objectifs
Des travaux ont récemement montré que l'intéraction entre les mastocytes MRGPRB2 de la peau et les neurones responsables de la douleur, les nocicepteurs, est à l'origine du dévelopemment d'une maladie allergique de la peau, la dermatite atopique . Une cartographie précise et exaustive des différentes niches dans lesquelles résident les mastocytes MRGPRB2 a également permis de mettre en évidence que ces mastocytes MRGPRB2 se retrouvent au niveau des muscles lisses du tube digestif, en contact étroit avec les neurones du plexus myentérique. De plus, il a été montré que ces mastocytes régulent les contractions intestinales ex vivo. Les objectifs du projet seront donc : 1) De déterminer l'impact de ces mastocytes sur le transit intestinal in vivo dans des conditions physiologiques. 2) De déterminer les acteurs cellulaires et moléculaires du dialogue avec le système nerveux entérique et 3) D'étudier la dérégulation de ces intéractions dans le cadre d'inflammations intestinales.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à 1) déterminer le rôle précis des mastocytes MRGPRB2 dans le phénomène de transit intestinal, 2) déterminer les acteurs moléculaires et cellulaires (autres que les mastocytes) impliqués dans la régulation du transit par les mastocytes MRGPRB2, et 3) déterminer si cet axe est impliqué dans le développement de maladies inflammatoires de l'intestin, qui sont souvent caractérisées par des troubles du transit. Sur un plan fondamental, ce projet permettra donc d'identifier un nouveaux rôle de "niche" des mastocytes MRGPRB2 associé au tube digestif en condition physiologique et physiopathologique. Sur un plan translationnel, il permettra d'établir si ces mastocytes MRGPRB2 peuvent représenter des cibles pharmacologiques intéresssantes pour moduler le transit intestinal.
Procédures
Les animaux ne seront soumis à aucune procédure chirurgicale, ni prélèvement sur animal vigile. - Sous anesthésie, certains seront soumis à une injection intraveineuse (envrion 20s par animal) et à l'insertion d'une bille de verre dans le colon (environ 20s par animal) - Certains seront soumis à un gavage intragastrique necessitant une contention de l'animal classique qui sera effectuée par une personne ayant l'habitude de cette expérience (environ 10s par animal). -Certains seront soumis à des injections de toxine diphtériques par voie intraperitonéale qui seront effectuées par une personne ayant l'habitude de cette manipulation (environ 10s par animal). Ce projet regroupe donc 4 interventions différentes qui prendront chacune en moyenne 10 à 20s.
Impact sur les animaux
- Nous avons l'habitude de travailler avec les souris mutantes utilisées (MRGPRB2-cre; IDTR, MRGPRB2-cre; IDTA,Sash,TAC1 déficientes,MRGPRB2 mutantes,MRGPRB2 cre-TPH1 floxed) qui ne présentent pas de défaut de comportement, de déficiences immunitaire profondes ou de létalité à l'état basal. Nous pourrions révéler des défauts de motilité, mais c'est l'objet du présent projet. -L'injection des AAVs ne cause pas d'inflammation chez la souris. -Les protocoles utilisés pour évaluer les temps de transit sont peu invasifs (gavage ou introduction d'une bille de la taille d'un feces dans le colon) et seront conduits par des personnes expérimentées. La manipulation pouvant cependant générer un stress pour les souris, elles seront dès que possible anesthésiées à l'isoflurane pour minimiser leur stress pendant les procédures. -L'induction de l'inflammation par le DSS causera un stress chez l'animal. Celui ci sera cependant suivit quotidiennement pour évaluer son état général (mobilité, toilettage, sociabilité avec les autres animaux de la cage), son poids, ainsi que la consistance de ses féces et la présence de sang dans les selles. Si jamais un animal perd plus de 20% de son poids initial, présente un état général non satisfaisant (immobilité, abscence de toilettage, abscence d'intéractions), ou qu'il présente des saignements abondant dans les selles (nettement visible à l'oeil nu), il sera écarté de l'expérience et sacrifié pour minimiser ses souffrances.
Devenir
Les animaux seront sacrifiés à l'issue de chaque procédure pour analyser les intéractions entre les mastocytes et le système nerveux entérique. Une banque de tissus sera également constituée pour répondre aux questions scientifiques suivantes sans avoir à réutiliser des animaux, et sera mise à dispostion de la communauté scientifique sur demande aux porteurs du projet.
Remplacement
Ce projet vise à étudier l'effet des mastocytes MRGPRB2 situés dans le muscle le long du tube digestif sur la motilité intestinale en conditions physiologiques et physiopathologiques. Il n'existe pas à ce jour de modèle cellulaire satisfaisant qui puisse rendrent compte de la diversité des intéractions étudiées dans le contexte de ce projet. Devant la complexité de ces phénomènes, due notamment à l’implication de différents organes et types cellulaires, le recours aux modèles animaux est indispensable. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier l'impact des mastocytes MRGPRB2 sur la motilité intestinale dans des condtions normales et dans le développement des maladies inflammatoires de l'intestin mimant les maladies humaines. Les expériences qui seront réalisées in vivo ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombres déterminés sur la base de la littérature et de l'expérience des porteurs du projet, pour des tests statistique de type Mann Whitney ou unpaired t-test pour la comparaison de deux moyennes, ou de type two-way ANOVA avec post test de type Bonferoni pour l'analyse de données à deux variables (suivi du poids au cours du temps pour le modèle de colite au DSS par exemple).
Réduction
Réduction du nombre d'animaux: L'expérience des porteurs du projet dans l'analyse de ces divers modèles et la présence des données préliminaires nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous prévoyons d'utiliser 10 animaux contrôles versus 10 animaux malades . Ce nombre pourra éventuellement varier à la baisse en fonction des résultats expérimentaux obtenus avec chaque génotype analysé pour chacun des modèles étudiés. L'utilisation d'AAV nous permettra aussi de travailler sur des souris WT, et d'éviter la mise en place d'élevage de souris transgéniques ce qui réduira le nombre d'animaux produits. La première partie du projet nous permettra également de déterminer le test le plus robuste de transit intestinal dans nos conditions, et nous nous restreindrons à un seul test pour les deux parties suivantes du projet, ce qui diminuera le nombre d'animaux nécessaires. Enfin, le maximum de tissus d’intérêt sera récupéré sur chaque souris et stocké en vue de répondre à d’éventuelles questions scientifiques ultérieures, sans avoir à utiliser de nouvelles souris. De plus, une banque de tissus prélevés sur les différents modèles de souris utilisés au laboratoire sera constituée et mise à disposition de la communauté scientifique, dans le but d'éviter un emploi d'animaux redondant.
Raffinement
Lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Nous analyserons les paramètres suivants : poids (prise du poids initial à l'arrivée des animaux puis suivi constant et régulier (au moins 2 fois par semaine) lors des pathologies, température (par thermomètre sonde rectale, à l'arrivée des souris et durant le développement des pathologies) , signes extérieurs de stress tels que le comportement, la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine ou bien une perte de température corporelle de - 8°C (un critère courant de morbidité utilisé dans plusieurs modèles), les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, la majorité des animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponible chez la souris et sous un fond C57BL/6 standardisé et bien contrôlé. Enfin, la physiologie des différents organes chez la souris présentent de nombreuses similarités avec celle des organes humains, ce qui permet l’induction de modèles pathologiques mimant les maladies humaines observées chez les patients. Pour la majorité des expériences, les animaux seront utilisés entre 8 et 16 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature. Uniquement pour la procédure 1 (injection des AAV ), les animaux seront utilisés à 4 semaines, puis laissés au repos 4 autres semaines pour ensuite être utilisés dans les autres modèles expérimentaux entre 8 et 12 semaines.
Impact de l’absence d’une molécule dans la production d’anticorps chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
972 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 216 relevant de la gravité sévère. Elles reçoivent des immunisations, des prélèvements sanguins répétés et, pour une partie, une irradiation aux rayons X avant greffe de moelle osseuse, pour étudier une molécule des lymphocytes B producteurs d'anticorps. Le porteur indique qu'aucune analgésie n'est prévue, au motif que les analgésiques créeraient un "biais expérimental" sur le système immunitaire. Il affirme qu'un "organisme vivant entier" est nécessaire pour reproduire les interactions de la réponse immunitaire.
Objectifs
Suite à une infection ou une vaccination, notre système immunitaire (ligne de défense de notre organisme contre les envahisseurs étrangers ou dangereux) met en place une réponse impliquant différentes cellules qui combattent l’infection et nous protègent contre une future exposition. Parmi ces acteurs cellulaires, les lymphocytes B jouent un rôle central dans cette réponse en reconnaissant les agents infectieux et en produisant des anticorps qui vont se fixer à ces agents et ainsi favoriser leur neutralisation et leur élimination. L’objectif de notre projet est d’étudier de façon précise le rôle d’une molécule particulière exprimée par les lymphocytes B à leur surface et décrite comme ayant un rôle dans la persistance de ces cellules productrices d’anticorps à longue terme.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’apporter de nouveaux éléments dans la compréhension de la biologie des lymphocytes B producteurs d’anticorps. Cette caractérisation fondamentale nous permettra à plus long terme de mieux comprendre les mécanismes de la réponse vaccinale afin de pouvoir l’améliorer chez les individus à risque (patients immunodéprimés ou atteints de cancer, population âgée, nourrissons).
Procédures
Afin de comprendre comment la molécule d’intérêt agit sur la qualité de la réponse immune (production d’anticorps, localisation et prolifération des lymphocytes B, producteurs d’anticorps), nous allons étudier la réponse vaccinale dans un modèle de souris génétiquement modifiées n’exprimant pas cette molécule. Les connaissances actuelles sur ce modèle murin ne montrent pas d’altération de leur bien-être. Toutes les souris seront soumises à un protocole d’immunisation. Cela consistera à injecter dans l’abdomen de souris éveillées une substance qui mimera l’effet d’une infection bactérienne. Cette injection non douloureuse sera soit unique soit répétée une fois à 28 jours d’intervalle. Afin de suivre la production d’anticorps, des prélèvements sanguins (au niveau de la joue, geste non douloureux réalisé sur souris éveillées) seront effectués au maximum cinq fois sur toute la durée (49 jours) de la procédure expérimentale. Le volume sanguin prélevé est faible et compatible avec une répétition espacée d’au moins 4 jours. La prolifération des lymphocytes B sera évaluée en administrant un produit permettant de quantifier ce phénomène (injection dans l’abdomen puis dans l’eau de boisson pendant 6 jours). Afin de déterminer si les défauts observés dans la réponse vaccinale sont dus à une anomalie des lymphocytes B producteurs d’anticorps, nous réaliserons des expériences consistant à créer des souris chimères. Pour cela des souris normales seront irradiées (étape non douloureuse permettant d’éliminer les cellules du système immunitaire réalisée par exposition à des rayonsX) avant de recevoir par injection intra-veineuse (injection sur souris éveillée dans la veine de la queue) des cellules obtenues à partir de la moelle osseuse de nos souris transgéniques. Les cellules injectées permettront de récréer un nouveau système immunitaire. La réponse vaccinale sera alors mesurée grâce à un protocole expérimental similaire à celui déjà décrit (injection intra-péritonéale suivi de prélèvements sanguins). La durée du protocole sera dans ce cas de 10 semaines (6 semaines pour la création des souris chimères et 4 semaines pour le protocole de vaccination). Enfin, nous injecterons par voie intra-veineuse (veine de la queue sur souris éveillée) des lymphocytes B producteurs d'anticorps, exprimant ou non la molécule d'intérêt afin de suivre leur devenir (prélèvement d'une goutte de sang 18, 36 et 48h après l'injection et dans les organes récupérés après l'euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Dans le cas du protocole d’immunisation (injection dans l’abdomen de la souris), la douleur maximale ressentie sera le jour de l’immunisation et ne dépassera pas la douleur induite par la piqure. Dans le cas des procédures impliquant une irradiation des animaux préalablement à l’injection de cellules par voie intra-veineuse, un risque d’infection et de déshydratation pourraient apparaître. Cependant, les conditions d’hébergement des souris ainsi que leur suivi quotidien permettront de prévenir ce risque et d’agir dans un délai très court (compensation de la perte en eau par ajout d’une gelose hydratée notamment).
Devenir
Tous les animaux de ces procédures seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure et les différents organes liés au système immunitaire seront prélevés pour analyse.
Remplacement
Les réponses du système immunitaire sont des processus complexes dépendants de nombreux types de cellules et de l’environnement dans lequel sont ces cellules. Aucune procédure de remplacement permettant d’éviter le recours à l’expérimentation animale n’est connue à ce jour. Il est donc nécessaire d’avoir un organisme vivant entier pour cette étude afin de reproduire in vivo toutes les interactions mises en place lors du processus de la réponse immunitaire suite à une infection.
Réduction
Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisés au minimum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d'analyses possibles sur les cellules obtenues à partir d'un même animal (récupération dans une seule expérience d’un grand nombre d’organes du système immunitaire afin de réaliser le maximum d’analyse et de conserver des prélèvements pour des études ultérieures.)
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Chaque semaine nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant de déterminer des points limites précoces qui conduiront à l'euthanasie des animaux. L'analgésie des souris n’est pas prévue. En effet, ces animaux étant utilisés pour des procédures visant à étudier le système immunitaire, les analgésiques créeraient un biais expérimental rendant les résultats inexploitables, de ce fait notre table de score est stricte pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour réaliser les expériences de ce projet. Ce modèle animal est pertinent dans notre étude, car il existe un modèle transgénique, n’exprimant pas la molécule dont nous souhaitons étudier le rôle, parfaitement décrit. La molécule murine présente une ressemblance très forte avec celle exprimée chez l’Homme, permettant de transposer facilement les résultats à l’espèce humaine. De plus nous avons une bonne connaissance des signes de souffrance chez la souris et la possibilité de les prendre en charge facilement et rapidement. Les souris utilisées dans le cadre de ce projet seront des souris adultes avec un système immunitaire totalement développé et fonctionnel.
Electrochimiothérapie vertébrale: évaluation de la toxicité médullaire sur un modèle porcin.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles musculosquelettiques
14 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, huit d'entre eux étant opérés sous anesthésie sans réveil. Ils subissent une électrochimiothérapie de la colonne vertébrale d'une durée de trois heures, pour évaluer la toxicité du traitement sur la moelle épinière. Le porteur indique que six animaux sont réveillés après l'intervention et peuvent alors développer des lésions neurologiques, comme un déficit moteur des membres postérieurs. Il affirme qu'aucune méthode alternative, simulation ou modèle numérique, ne permet de modéliser cette toxicité.
Objectifs
Les patients souffrants de métastases osseuses vertébrales sont à risque de développer une compression médullaire lorsque les cellules tumorales envahissent le canal rachidien où se trouve la moelle épinière et les nerfs. On parle alors « d’épidurite métastatique ». C’est une complication grave puisqu’elle entraine d’importantes douleurs et un risque de handicap sévère et définitif : la paraplégie. La fréquence des compressions médullaires par épidurite métastatique est estimée à 5% des patients atteints de cancer. Elle est plus particulièrement fréquente chez les patients souffrants de cancer de la prostate, du sein ou du poumon.
Bénéfices attendus
La réalisation d’un traitement d’électrochimiothérapie en utilisant une chimiothérapie sans toxicité neurologique, telle que la bléomycine, permet d’espérer une destruction sélective des cellules tumorales sans séquelle neurologique. Le but du projet est donc de vérifier l’innocuité de l’électrochimiothérapie sur la moelle épinière en utilisant un modèle porcin. En l’absence de toxicité, ce traitement pourra être envisagé chez des patients souffrants d’épidurite métastatique pour évaluer l’efficacité anti-tumorale.
Procédures
L’ensemble des traitement d’électrochimiothérapie sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. Deux animaux seront utilisés en phase préliminaire pour valider la faisabilité de l'étude et 12 autres pour le projet à proprement parlé. Si les résultats des deux animaux préliminaires le permettent, ceux-ci seront inclus dans le groupe expérimentation (groupe 1 - N=6). Les animaux du groupe test et du groupe 1 (procédures aigus) seront sous anesthésie générale pendant la durée de la procédure (3 heures) avant d'être euthanasiés. Les animaux du groupe 2 (N=6) subiront la même procédure que ceux du groupe 1 mais seront réveillés et euthanasiés à J+3 (N=3) et J+28 (N=3).
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. Pour le groupe 3 (n=6) les animaux seront réveillés après le traitement d'électrochimiothérapie. Le risque, qui aura théoriquement été préalablement écarté lors des procédures du groupe 2 est l'apparition, après le réveil, de lésions neurologiques (déficit moteur des membres inférieurs ou sphincterien).
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés afin de pouvoir réaliser l'étude anatomopatholgique des segments de moelles exposés à l’électrochimiothérapie.
Remplacement
Notre projet prévoit d’utiliser un modèle animal porcin car il n’existe actuellement pas de méthodes alternatives (simulation sur mannequin haute-fidélité́, simulation numérique) permettant de modéliser les éventuelles toxicités de l’électrochimiothérapie sur la moelle épinière : courant électrique et chimiothérapie.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire, chaque animal sera son propre témoin.
Raffinement
L’ensemble des procédures expérimentales sera réalisé sous anesthésie générale balancée. A aucun moment l’animal ne sera conscient ni susceptible de ressentir la douleur. Les animaux du groupe 3 (N=6) seront évalués cliniquement, après leur reveil, à la recherche de signe de lésion neurologique (déficit moteur des membres inférieurs ou sphincterien) ou de tout autre signe de souffrance. Cette évaluation aura lieu deux fois par jours de J0 à J3 selon la grille d'évaluation (Annexe 1-2). Une attention particulière sera portée sur l'éventuelle altérration du comportement général (recherche de signe de passivité ou d'apathie) et de la locomotion (réticence à se déplacer, trouble de l'équilibre, paralysie...). L’atteinte d’un point limite est déterminée par un score basé sur des signes comportementaux, d’apparence générale permettant de quantifier la souffrance de l’animal (Annexe 1-2). En cas de doutes ou de constat d’un mal-être, l’information sera remontée au responsable du bien-être animal qui fera une contre-expertise du score. Selon le score obtenu, le responsable du bien-être animal prescrira des examens systématiques qui seront fait sous sédation et préviendra le vétérinaire désigné de la situation. La prise en charge de l’origine de la douleur devra entrainer la baisse du score. En cas de détérioration du score, le responsable du bien-être animal contactera le vétérinaire désigné pour effectuer des examens plus approfondis et définir la conduite à tenir. Pour améliorer le confort et le bien-être des animaux, les animaux seront hébergés en zone de réveil après l'intervention afin de s'assurer de leur parfaite récupération puis dès que cela sera possible, ils réintègreront la zone d'hébergement avec leurs congénères afin de réduire leur stress, à raison de deux par box. Du personnel animalier mettra quotidiennement à disposition un environnement stimulant (activité́ de fouissage, distributeur d’aliments, planche à gratter).
Choix des espèces
Le porc est l’animal le plus approprié pour notre étude à la fois du fait des caractéristiques physiologiques proches de l’homme, mais également en raison de son anatomie et la taille de ses vertèbre et de sa moelle épinière qui se prêtent aisément à la mise en place des aiguilles d’électrochimiothérapie.
Effets de différentes souches probiotiques productrices d’un métabolite d’intérêt sur l’hypersensibilité viscérale liée au stress chez le rat : approfondissement des mécanismes d’action mis en jeu.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1680 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 720 relevant de la gravité sévère. Des rates Wistar subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes, une distension colorectale douloureuse sous contention de 45 minutes et un stress d'immobilisation de deux heures, pour tester cinq souches probiotiques contre la douleur du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur indique qu'un saignement anal peut survenir pendant la distension, auquel cas la procédure est arrêtée. Il affirme que la complexité du syndrome ne peut être reproduite sur des modèles in vitro.
Objectifs
Notre projet vise à évaluer l’efficacité de 5 souches probiotiques pour le traitement et/ou la prévention du syndrome de l’intestin irritable (SII). Nous évaluerons ainsi les effets d’un traitement de 5 ou 10 jours avec ces souches productrices d’un métabolite d’intérêt sur la douleur viscérale en condition de stress chez le rat et déterminerons la persistance de l’effet antidouleur de ces souches après un arrêt du traitement (période de « wash out ») de durée variable selon les souches testées. Nous comparerons les effets des souches à une souche non productrice ainsi qu’à un mutant de chacune de ces souches ne produisant plus le métabolite afin de démontrer l’importance de celui-ci et de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la modulation de la douleur. De manière complémentaire, l’effet de l’ensemble de ces souches sera évalué après un seul jour de traitement. Outre l’évaluation de la sensibilité viscérale chez les animaux traités, des prélèvements seront effectués 5 jours ou 10 jours après gavage des animaux en conditions basales ou de stress aigu et avec ou non période de « wash out », afin d’identifier les molécules potentiellement actives et ainsi décrypter les mécanismes d’action mis en jeu
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer la durée de traitement nécessaire et suffisante ainsi que la persistance de l’effet antidouleur après arrêt du traitement des souches d’intérêt, apportant de nouvelles réponses sur les mécanismes impliqués dans les effets observés. A terme, ces explorations permettront de proposer de nouvelles pistes de traitement des symptômes douloureux des patients SII associés à un profil anxieux et/ou stressé développant des manifestations digestives douloureuses.
Procédures
Tous les animaux de ce projet reçoivent un traitement par gavage. Les animaux pour l’évaluation de la sensibilité viscérale sont soumis à une procédure chirurgicale durant 20 min sous anesthésie générale (implantation d’électrodes intramusculaires). Après une période de convalescence et de repos puis de traitement, les crampes abdominales vont être enregistrées pendant une phase de distension colorectale durant 20 minutes. Cet enregistrement se fait en condition basale puis le lendemain en condition de stress aigu (maintien des pattes avant le long du corps de l’animal pendant 2 heures). Pendant les phases d’enregistrement, les animaux sont placés dans des tunnels de contention (45 min ). Pour l’étude de l’effet « wash out », une période de repos/ arrêt du traitement est appliquée. Puis un deuxième enregistrement de crampes abdominales pendant la distension colorectale avant et après un stress aigu est réalisé. Pour l’étude des mécanismes d’action mis en jeu dans les effets anti-douleur des souches testées, une prise de sang est réalisée à la queue au milieu du traitement. Un stress de contrainte est réalisé à la fin du traitement et après la période de « wash out ». Les animaux sont ensuite anesthésiés et euthanasiés pour effectuer les prélèvements nécessaires.
Impact sur les animaux
La douleur liée au gavage est évitée en utilisant une sonde à bout arrondi adaptée à la taille de l’animal et en réalisant un geste rapide et bien maitrisé. Pour la mesure de viscérosensibilité, les douleurs liées à la chirurgie sont prises en charge (analgésie pré et post-opératoire /anesthésie). La déshydratation et l’hypothermie sont prévenue par une injection post opératoire de sérum physiologique à chaque animal et par un maintien au chaud pendant les phases chirurgicales, de réveil et de convalescence. Le stress lié à la manipulation des animaux est évité en prévoyant de phases d’habituation aux différentes manipulations et de repos. La douleur ressentie pendant les phases d’enregistrement des crampes abdominales (indice de douleur) due à la distension colorectale est progressive et dure 20 minutes. La douleur n’est plus ressentie après l’arrêt de la procédure car les enregistrements reviennent à un niveau équivalent à celui de départ. Il n’y a pas de dommages observés sur les animaux mais un effet indésirable possible pendant ou après la distension est un saignement au niveau anal. Dans ce cas la procédure est arrêtée immédiatement.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. La procédure 1 étant une procédure sévère, les animaux ne peuvent pas être gardés en vie à la fin de la procédure ou participer à une autre étude. Les animaux de la procédure 2 sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements
Remplacement
L’utilisation du modèle rat se justifie par le nombre important d’études bibliographiques et d’outils méthodologiques utilisant ce modèle pour étudier la pathologie du SII qui de par sa complexité ne peut être reproduite sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre de souches bactériennes sélectionnées (5) a été fixé suite aux essais de criblage réalisés par les partenaires du projet sur un panel de 152 souches vis-à-vis de leur capacité de production de la molécule d’intérêt in vitro. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe expérimental a été optimisé en tenant compte de la variabilité interindividuelle en se basant sur les études précédentes utilisant le même modèle. Ces effectifs, n=12 pour les études de viscérosensibilité et n=8 pour les prélèvements de sang et d’organes, sont suffisants pour atteindre une validité statistique. La possibilité d’utiliser les mêmes animaux a été étudiée mais n’a pas été retenue. En effet, les deux procédures décrites ici doivent-être menées de façon distincte pour permettre d’obtenir des résultats pertinents et robustes.
Raffinement
Les animaux utilisés seront des animaux sains provenant d’un élevage agréé. Ils seront hébergés dans des conditions normalisées et suivis quotidiennement pour leur apporter tous les soins nécessaires et assurer leur bien-être. Leur milieu sera enrichi en buchettes de peuplier pour satisfaire leur besoin de ronger. Toutes les mesures ont été prises pour réduire l’inconfort (période d’adaptation, habituation, récupération) et prévenir toute douleur ou anxiété susceptible d’être subie par les animaux (anesthésie/ analgésie, soins post opératoire, détection de toute anomalie ou apparition de mal être). Si malgré les mesures prises, une souffrance était constatée la procédure serait arrêtée.
Choix des espèces
Le modèle de stress aigu chez le rat est largement validé par la communauté scientifique pour étudier la physiopathologie du SII. Ce modèle permet de reproduire les caractéristiques décrites chez les patients SII : douleur viscérale, augmentation de la perméabilité intestinale, micro-inflammation intestinale. Les animaux seront des rats Wistar femelles adultes de 200g à 220g. L’utilisation d’animaux adultes est nécessaire pour évaluer les effets des souches probiotiques sur une barrière intestinale parfaitement mature, sachant qu’en condition périnatale la barrière intestinale présente des caractéristiques biologiques complètement différentes de celles observés chez l’animal adulte.
Etude de la dynamique fonctionnelle du circuit CRF-locus coeruleus dans la résilience au stress chronique de défaite sociale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
1 635 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent deux chirurgies cérébrales, injection stéréotaxique de virus et implantation de fibres optiques, puis un protocole de stress chronique de défaite sociale de dix jours provoquant anhédonie, anxiété et apathie, pour étudier la résilience au stress. Le porteur reconnaît que cette gêne "ne peut être soulagée" puisqu'elle est l'objet même de l'étude, et signale des blessures possibles liées aux agressions entre souris. Il affirme que ces troubles psychiatriques ne peuvent être étudiés sans animaux vivants.
Objectifs
La depression touche plus de 350 millions de personnes dans le monde et représente la première cause d'invalidité dans le monde. La depression est precipitee par des evenements stressants. Cependant, certains individus ne developpent pas de profil pathologique apres exposition au stress, une qualite definie comme la resilience. Une région du cerveau appelée « locus coeruleus » a un role majeur dans le circuit de la resilience. Comment ce systeme est controle lors de la reponse au stress reste a definir. Les neurones exprimant l’hormone CRF ont des connexions directes avec le LC et pourraient être impliqués dans cette réponse. Selon leur structure d’origine, ces neurones ont des caractéristiques neurochimiques differentes. L’objectif de ce projet est d’etudier i) la regulation fonctionnelle du locus coeruleus par ces differents sous-circuits CRF et ii) les roles de ceux-ci dans la resilience au stress chronique.
Bénéfices attendus
Environ 30% des patients dépressifs ne répondent pas aux traitements antidépresseurs conventionelle. Ce projet a un interêt majeur puisqu'il permettra d'ameliorer la comprehension de la neurobiologie de depression et de la resilience afin de concevoir de nouvelles approches therapeutiques plus efficaces pour ces patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 procédures chirurgicales (Injection stereotaxique de virus AAV et implantation de fibres optique). Chaque procédure aura lieu sous anesthésie pour une durée de 1 ou 2 heures chacune. Les animaux seront également soumis à une protocole de stress chronique de défaite sociale pendant 10 jours.
Impact sur les animaux
La nature de cette expérience aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie) qui ne peut être soulagée étant donné que l’objectif de ce projet est d’étudier les effets du stress et de la dépression sur le cerveau. Des blessures ou lésions induites par les agressions physique lors de la procédure de stress par défaite sociale chronique peuvent être observées. Les souris CD1 agressives seront isolées à leur arrivé à l’animalerie pour éviter les combats entre elles.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les animaux seront mis à mort par décapitation ou par perfusion intracardique. A l'issue des procédures 2 et 3, les animaux seront mis à mort par perfusion intracardique.
Remplacement
L’objectif de ce projet de recherche étant d’étudier l’émergence de troubles psychiatriques en réponse au stress, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Notre projet necessite l’emploi de plusieurs techniques experimentales. Compte tenu de la litterature et de notre experience, nous utiliserons les tests statistiques [t-test, test ANOVA, sur mesures repetees ou non] pour analyser nos donnees. Ces tests necessitent d’avoir un nombre minimum d’animaux pour atteindre les seuils statistiques de significativite en fonction des experiences realisees.
Raffinement
La nature de certaines de nos expériences, en particulier celles dont le but est de déterminer les effets du stress et de la dépression sur le cerveau, aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie) qui ne peut être soulagée. Par contre, si un animal est en souffrance, alors, il sera euthanasié. Pour limiter l’angoisse des animaux, ceux-ci seront habitues a l’experimentateur, au dispositif et a la piece d’experimentation pour eviter un stress supplementaire. Les procedures chirurgicales seront realisees sous anesthesie generale et des protocoles analgesiques seront mis en place pour limiter la douleur des animaux. Des points limites ont ete etablis pour chaque procedure.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude de la fonction des circuits cérébraux dans le cerveau des mammifères : i) l’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine ; ii) L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et l'électrophysiologie du cerveau de la souris sont bien caractérisées ; iii) Il existe une vaste littérature sur le comportement de la souris, l'apprentissage et la mémoire. Par ailleurs, il est possible d'utiliser une batterie de souris Génétiquement modifiées. La souris est donc le modèle le plus adapté étant donné également sa petite taille et sa reproduction rapide. Les études seront réalisées à l’âge adulte (8-12 semaines).