Procédures sévères
Étude des interactions entre système nerveux et système immunitaire dans les troubles du comportement
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Pour relier la dépression humaine à l'inflammation chronique, des souris sont rendues durablement inflammatoires puis soumises à des tests censés mesurer un phénotype dépressif. 8 799 souris vont être utilisées, dont 4 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever tissus et organes vitaux. Elles reçoivent des composés jusqu'à trois fois par semaine pendant cinq à quatorze semaines, subissent des chirurgies pouvant atteindre deux heures, des poses d'implants, jusqu'à quatre ponctions sanguines et un hébergement individuel de un à sept jours après chirurgie. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de non invasifs sans dire lesquels, et signale que certains imposent une privation de nourriture ou de boisson pouvant aller jusqu'à seize heures.
Objectifs
Nous étudierons comment les signaux pro-inflammatoires, notamment certaines molécules, affectent le cerveau et le comportement. Des valeurs sanguines élevées de molécules pro-inflammatoires sont associées à la dépression chez l’être humain. De plus, il existe un groupe de maladies rares caractérisées par la production incontrôlée de molécules pro-inflammatoires, à l’origine d’un état inflammatoire chronique pouvant être associé à des troubles psychiatriques. Par conséquent, notre projet permettra de découvrir les mécanismes responsables qui relient la perturbation de l’humeur à un contexte inflammatoire chronique. Nous poursuivrons trois objectifs principaux qui structurent l’ensemble du projet : 1. Objectif 1 : Étudier les effets sur le comportement, le tissu cérébral et le système immunitaire, de l'administration ponctuelle, ou répétée, de molécules pro-inflammatoires. 2. Objectif 2 : Examiner le rôle des principales voies de communication entre périphérie et cerveau dans l’expression des phénotypes identifiés dans l’objectif 1. En particulier, nous étudierons les composants du système immunitaire, les nerfs périphériques et les barrières immunitaires du cerveau. 3. Objectif 3 : Tester l’efficacité de différentes approches pharmacologiques pour contrecarrer les effets des molécules étudiées sur le comportement, en ciblant les relais périphériques déterminés avec l’objectif 2. En particulier, nous évaluerons des antidépresseurs standard et alternatifs, et également des stratégies novatrices visant à réactiver le système immunitaire et réduire l’infiltration des cellules immunitaires dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Les approches conventionnelles pour l’étude des troubles de l’humeur et du comportement se focalisent sur des facteurs internes au cerveau, comme les niveaux des neurotransmetteurs, ou des facteurs externes, comme le stress. De manière innovante, notre projet propose d’examiner des facteurs présents à la périphérie du cerveau, en tant que déclencheurs de la dépression. Les expériences proposées permettront une avancée significative dans les connaissances scientifiques concernant la communication bidirectionnelle entre périphérie et cerveau, en général, et plus particulièrement ceux impliqués dans les troubles de l’humeur. À court et moyen terme, les données collectées permettront de découvrir des nouveaux mécanismes pathologiques et marqueurs diagnostiques ou pronostiques de la dépression dans un contexte inflammatoire. Il s’avère que cette forme de dépression est résistante aux traitements de première ligne et constitue ainsi un besoin médical non satisfait à ce jour. À long terme, nos recherches poseront les bases pour le développement de nouvelles thérapies et contribueront à atténuer la stigmatisation qui accompagne les maladies mentales.
Procédures
Dans ce projet, les souris seront soumises à différents types d’interventions, séparément ou parfois en combinaison : 1. Administration répétée de composés, au maximum trois fois par semaine, pour une durée de 5 à 14 semaines selon le traitement. 2. Procédures chirurgicales sous analgésie/anesthésie. Ces interventions ne durent pas plus de deux heures par souris. 3. Tests comportementaux non-invasifs pour évaluer le phénotype dit dépressif. Les tests seront effectués à raison de 2 tests par jour, chaque test ayant une durée limitée entre 5 minutes et 4 heures. Ces tests seront effectués sur une durée maximale de 2 semaines (5 jours, pause de 2 jours puis 5 jours). Les tests pourront être répétés pour évaluer la progression du phénotype et minimiser le nombre d’animaux nécessaires. 4. Ponction sanguine, environ 1 min par souris. Les prélèvements pourront être répétés au maximum 4 fois par individu, avec un intervalle d’au moins une semaine entre chaque prélèvement. 5. Hébergement individuel. Un hébergement individuel pourra faire suite aux procédures chirurgicales, pour un maximum de 1 à 7 jours en fonction des procédures.
Impact sur les animaux
Le projet implique la mise en place de modèles de dépression chez l’animal, soit par administration de composés pharmacologiques, soit par l’application de facteurs environnementaux stressants, et ceci durant plusieurs semaines. Ces conditions sont source d’angoisse pouvant nuire au bien-être et à l’état général des animaux. Cette nuisance est considérée comme sévère. Les procédures chirurgicales prévues ont une sévérité globale qualifiée de modérée. Certaines peuvent entraîner une période de récupération jusqu’à deux semaines. Après chaque chirurgie, les souris recevront les soins post-opératoires appropriés (thérapie antalgique, désinfection de la plaie) et seront surveillées pour la manifestation des points limites spécifiques. D’autre part, les animaux pourront être soumis à des gestes pouvant causer une détresse ou une douleur légère : 1. Administration des traitements pharmacologiques, y compris les anesthésiques/antalgiques et les solutions physiologiques. La piqûre d’aiguille pour les injections provoque une douleur légère de courte durée. Le gavage provoque un inconfort léger de courte durée. Selon le traitement, les injections pourraient être répétées plusieurs fois par semaine, pour une durée maximale d’environ quatre mois. 2. Implants. La présence des implants pourrait créer de l’inconfort. La durée maximale de l’expérience sera d’environ quatre mois. 3. Tests comportementaux. La manipulation des souris pourrait causer un stress léger. Pour le minimiser, les souris seront habituées à l’expérimentateur et à la pièce où les tests seront conduits. La durée maximale des tests sera d’environ deux semaines. Certains tests comportementaux prévoient une privation de nourriture ou de boisson jusqu’à 16 h avant la réalimentation. Cela induit un stress physique et une détresse modérée. 4. Prélèvement sanguin au niveau de la joue. La piqûre comporte une douleur légère de courte durée. Le prélèvement sanguin peut entrainer un stress physique léger ou modéré temporaire. 5. Anesthésie gazeuse. Elle peut provoquer un inconfort de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour évaluer les phénotypes histologiques et moléculaires, ce qui nécessite le prélèvement de tissus et organes vitaux.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe pas de stratégies alternatives aux études in vivo pour l’étude du système immunitaire, du fonctionnement du cerveau et du comportement, ainsi que pour évaluer la complexité des interactions entre périphérie et cerveau. Les approches in vitro comme les cultures cellulaires ne reproduisent que des aspects particuliers du phénomène en question et peuvent manquer des connections anatomiques et fonctionnelles qui jouent un rôle clé dans ce projet ancré sur le thème des interactions cerveau-corps. Les modèles in silico que nous envisageons à moyen terme, nécessitent d’abord une validation expérimentale pour optimiser leur valeur prédictive.
Réduction
Les expériences ont été conçues pour comprendre un nombre d’animaux minimal mais suffisant pour évaluer les différences de comportement entre les divers groupes expérimentaux (avec la prise en compte de paramètres statistiques nécessaires pour estimer la taille de l’échantillon comme la puissance, le niveau de significativité, la taille de l’effet et de variations dans la population). Étant donné que le comportement animal est susceptible de variations inter-individuelles, et que nous souhaitons tester plusieurs paramètres à partir des mêmes animaux en utilisant une batterie de tests comportementaux choisis sur la base de la littérature et de notre expérience, nous avons estimé un nombre minimum de souris de 10 individus par sexe par groupe expérimental. Pour minimiser le nombre de souris, les tests pourront être répétés sur les mêmes individus après un intervalle de deux à quatre semaines. Le nombre de souris par groupe s’élève jusqu’à 15 pour les procédures qui peuvent entraîner l’exclusion d’individus pour des raisons techniques (par exemple, implants mal positionnés, expression hors cible ou sous-optimale d’un transgène). Les échantillons biologiques prélevés provenant des mêmes souris post-mortem fourniront des données anatomiques, physiologiques et/ou moléculaires qui pourront être corrélées à la performance comportementale mesurée.
Raffinement
Les procédures expérimentales ont été conçues afin de minimiser tout inconfort, douleur ou souffrance prolongée de l’animal. Dans ce but, nous utiliserons des points limites précoces et spécifiques prédéfinis. Pour les tests de comportement, les souris seront habituées à l’expérimentateur et, si possible, à la pièce expérimentale avant les tests. Pour les procédures qui comprennent une chirurgie, les souris seront surveillées attentivement en post-opératoire pour la fermeture des plaies, les signes d’inconfort, douleur ou souffrance prolongée et leur bien-être général. Les interventions incluent la désinfection des plaies, la thérapie antalgique, l’administration de solution saline pour réhydratation, le renforcement de l’enrichissement des cages et/ou chauffage (dôme en papier, morceaux de coton ou papier), la séparation des souris agressives des souris blessés en cas d'agressivité répétée.
Choix des espèces
Le recours à la souris en tant que modèle animal est justifié par leur proximité génétique, physiologique, anatomique et bio/neurochimique par rapport à l’être humain. L’incomparable quantité de données présente dans la littérature scientifique sur ce modèle permet la comparaison, l’intégration et la validation des connaissances de notre projet, ainsi que l’optimisation des expériences prévues pour minimiser le nombre d’animaux nécessaires et maximiser leur bien-être. Sur un plan neuroanatomique, le modèle murin permet l'étude des circuits neuronaux et des modifications synaptiques associées aux comportements, ce qui est essentiel pour comprendre les bases biologiques de la dépression humaine. Enfin, au niveau comportemental, il existe plusieurs tests bien établis pour évaluer des comportements analogues à la dépression chez la souris. Collectivement, ces tests aident à identifier les comportements dépressifs et à évaluer l'efficacité des antidépresseurs. Nous utiliserons des souris adultes, à partir de 6 semaines après la naissance, car nous étudions l’impact des dysfonctions du système immunitaire sur le comportement et l’humeur à l’âge adulte.
Analyses des réactions inflammatoires et de l’angiogenèse dans une fenêtre dorsale avec la souris transgénique CX3CR1-GFP
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Une fenêtre translucide en titane est implantée chirurgicalement dans le dos des souris pour observer au microscope, à travers leur peau, l'inflammation autour de biomatériaux, de dispositifs médicaux ou de cellules tumorales. 342 souris transgéniques fluorescentes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever reins, foie et rate, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reste jusqu'à deux heures sous anesthésie générale par séance de microscopie, jusqu'à quatre séances en douze jours, et vit seul en cage. Le porteur écrit que l'implantation "provoquera des douleurs et de l'inflammation" tout en affirmant que l'animal ne sera pas limité dans ses mouvements, et présente l'hébergement individuel comme un hébergement "sans isolement social" au motif que les cages restent sur le même portoir.
Objectifs
L'objectif général est de suivre l'inflammation et la revascularisation dans un organisme vivant suite à l'implantation de dispositifs médicaux, de biomatériaux ou de cellules tumorales. Nous utilisons un modèle de souris transgéniques qui présente une fluorescence des tissus suite à différents signaux d'activation liés à l'inflammation et la revascularisation. Ces observations sont possibles grâce à l'utilisation de la technologie de microscopie intra-vitale dévelopée à travers une fenêtre translucide implantée sur le dos des animaux. Cette technique d'imagerie médicale offre une visualisation tridimensionnelle (3D) des cellules circulantes.
Bénéfices attendus
Les dispositifs médicaux implantables représentent une stratégie thérapeutique efficace dans de nombreuses pathologies ; ils permettent par exemple la réduction de la dégénérescence neuronale dans la maladie de Parkinson, la prévention des problèmes cardiovasculaires ou encore la surveillance et la réduction des complications chez les diabétiques. Plus précisément, notre approche constitue une étape clé dans la conception d’un pancréas bio-artificiel mais aussi dans la régénération de la peau chez les grands brûlés ou encore dans le diagnostic précoce d’un dysfonctionnement rénal. Enfin notre dernière étude dans ce projet porte sur des cancers très agressifs tels que les tumeurs pulmonaires, avec une efficacité très limitée des thérapies actuelles et une survie diminuée des patients. Ici, notre objectif final est l’amélioration de l’efficacité des stratégies d’immunothérapie.
Procédures
Les souris subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée maximale de 30 minutes. Deux à 4 séquences de microscopie (à 3, 6, 9 et 12 jours après l’implantation chirurgicale de la fenêtre) seront réalisées : les souris seront maintenues sous anesthésie générale pendant une durée maximale de 2 heures pendant la microscopie. Avant les séquences microscopiques (entre 6h et 2h), certaines souris subiront une injection intradermique. Au début de ces séquences, certaines souris subiront l’injection d’un traceur fluorescent par une canule implantée dans la veine caudale. La durée d'injection est entre 1 et 2 secondes. À la fin du suivi, les souris seront euthanasiées sous anesthésie afin d'analyser les reins, le foie et la rate.
Impact sur les animaux
L'implantation de la fenêtre dorsale provoquera des douleurs et de l'inflammation, qui devraient se résorber rapidement (en 2 à 3 jours). L'animal ressentira un gêne, mais ne sera pas limité dans ses mouvements, car une fenêtre en titane est très légère. L’hébergement individuel peut provoquer davantage de stress chez l’animal, comparé à celui hébergé en groupe. Pour les suivis en microscopie, l'animal sera sous anesthésie générale et ne ressentira aucune douleur lors de la cannulation pour une injection intraveineuse éventuelle, ou lors de la fixation sur un cadre pour limiter ses mouvements.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour pouvoir prélever les organes qui seront analysés dans le cadre de ce projet scientifique.
Remplacement
Pour nos applications in vivo les peaux et les pancréas artificiels, les membranes bio-compatibles ont été testés et sélectionnés après des évaluations in vitro sur cellules en culture. Ces tests ont porté sur leur cytotoxicité, leur stabilité dans des conditions physiologiques, ainsi que sur l’adhérence, la prolifération et la migration cellulaire à leur surface. En conséquence, les membranes retenues sont compatibles avec les études in vivo. La cytotoxicité des nanoparticules fluorescentes a été testée et leurs composants optimisés et validés sur des cultures cellulaires. Série 3 – Les cellules tumorales ont été testées in vitro à l’aide d’un modèle de tumeur-sur-puce. Après les études in vitro, nous avons optimisé les conditions de biocompatibilité et de stabilité, ce qui limitera nos tests in vivo. Désormais, il n'y a plus de recours possible aux methodes alternatives et in vitro pour analyser les effets inflammatoires systémiques. Pour l’instant, il n’existe pas de modèle in vitro permettant d’étudier l’ensemble des réactions inflammatoires.
Réduction
Pour reduire le nombre d'animaux transgéniques générés, on s'affranchit de l'âge (adulte) et du sexe sans conséquences scientifiques : on utilisera les souris produites par l'élevage calibré selon nos besoins expérimentaux. Nous incluons à la fois des souris mâles et femelles dans nos études afin de limiter l’euthanasie des souris excédentaires L’implantation de fenêtres dorsales permet un suivi longitudinal sur un même animal sur une période minimale de deux semaines, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux utilisés conformément aux principes des 3R. Les analyses statistiques seront effectuées de façon à optimiser le nombre d'animaux par groupe expérimentaux.
Raffinement
Depuis 2023, nous travaillons à l’amélioration du protocole d’implantation de fenêtres dorsales. Les anciennes fenêtres présentaient plusieurs inconvénients : elles étaient instables dans le temps. Nos derniers modèles de fenêtres ont été optimisés pour accueillir un diamètre de fenêtre plus grand en alliant la robustesse des anciennes fenêtres et la biocompatibilité ; ils sont faciles à stériliser et à réutiliser. Ce type de fenêtre résiste au moins 14 jours sur le dos de la souris, sans provoquer de complications majeures. Lors de la première semaine, les souris recevront du paracétamol dilué dans leur biberon et une injection sous-cutanée d'un analgésique avant l'implantation de la fenêtre dorsale. L’implantation chirurgicale des fenêtres sera réalisée simultanément avec l’implantation des dispositifs médicaux, biomatériaux ou des cellules tumorales évitant ainsi la nécessité d’une anesthésie générale supplémentaire. Les souris seront identifiées par tatouage (non invasif). Les injections répétées de traceurs fluorescents sont limitées grâce aux technologies microscopiques utilisées. Les souris seront hébergées individuellement, mais sans isolement social : leurs cages ventilées seront placées sur le même portoir afin de maintenir un contact visuel entre les animaux. Toutes nos observations en microscopie seront réalisées sous anesthésie légère. Les animaux seront maintenus à une température de 37 °C à l’aide d’un tapis chauffant et recevront un gel ophtalmique pendant toute la durée de l’expérience. Les points limites seront établis et respectés.
Choix des espèces
L'espèce animale retenue correspond à un modèle expérimental largement documenté et correspond à l'espèce la plus pertinante et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de l'angoise de façon durable et sans qu'il soit possible de la soulager. Pour atteindre les objectifs, la souris est un modèle approprié et bien validé pour l’imagerie in vivo. Les souris, très petits mammifères, ont une taille très adaptée pour les études en microscopie intra-vitale et un positionnement sous l'objectif facilité. Le modèle de la souris transgénique est parfait car il permet l'observation de la fluorescence in vivo et permet de suivre une réaction inflammatoire dans le temps. Nous utilisons des souris adultes à partir de l’âge de six semaines. À cet âge, leur système immunitaire est mature et leur taille est suffisante pour permettre l’implantation d’une fenêtre dorsale.
Etude de l’effet de l’exposition à la silice sur le développement d’arthrites dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
Toutes tuées à l'issue pour prélever poumons, rate, ganglions, sang et articulations, 1 770 souris vont être utilisées, dont 1 510 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 260 un niveau léger. Elles reçoivent deux injections dans la queue sur animal vigile pour déclencher une arthrite au collagène, une instillation nasale de silice sous anesthésie deux fois par semaine pendant dix semaines, deux prélèvements sanguins et une chirurgie. Le porteur indique que la silice peut entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une surmortalité, et que les pattes gonflent au point de gêner les souris pour se nourrir. Il affirme que les expériences in vitro ne démontreraient pas de façon "irréfutable" l'effet de la silice sur une pathologie systémique, et conclut que les deux approches sont "toutes les deux nécessaires".
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie au cours de laquelle les patients développent des arthrites (inflammation des articulations). Elle entraine des douleurs et la destruction progressive des articulations et peut être responsable d’un handicap majeur chez les patients. Il s’agit d’une maladie auto-immune, c’est-à-dire faisant intervenir la production anormale par l’organisme d’anticorps dirigés contre lui-même. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la survenue de la PR, notamment des facteurs génétiques et des facteurs environnementaux. Les mécanismes à l’origine de sa survenue ne sont pas bien connus. Des expositions pulmonaires comme l’exposition à la fumée de cigarette ou à la silice (contenue par exemple dans la poussière) sont associées au diagnostic de PR. L’exposition professionnelle à la silice est un facteur de risque reconnu dans le développement de maladies auto-immunes. Au cours de la PR, des anomalies pulmonaires peuvent être observée chez 25 à 50 pourcent des patients. Afin de clarifier les processus mis en jeu, il est essentiel de comprendre les mécanismes impliqués localement. Le but de ce travail est d’identifier les mécanismes impliqués dans la survenue de la PR à la fois au niveau pulmonaire et articulaire. Dans ce contexte, nous étudierons l’effet de la préexposition à la silice sur l’incidence et la sévérité des arthrites et de la réponse immunitaire dans un modèle murin d’arthrite au collagène.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans la continuité de travaux menés sur la polyarthrite rhumatoïde (PR) ayant montré l’association entre exposition environnementale à la silice et PR. Les mécanismes expliquant ce lien ne sont actuellement pas connus. Ainsi, cette étude a pour objectif d’étudier l’effet d’une pré-exposition à la silice sur la survenue et la sévérité d’arthrites. L’objectif est d’analyser les mécanismes immunologiques impliqués dans les différents compartiments : pulmonaire, sanguin, lymphoïdes secondaires et articulaires. Ceci permettra de mieux comprendre le processus de développement de l’auto-immunité et de l’inflammation qui favorise ensuite le développement d’arthrites et induit la destruction articulaire. Ce projet peut avoir un impact important en rhumatologie. Il permettrait en effet de mieux comprendre le lien entre exposition environnementale et développement de la PR. Elucider les phases d’initiation de la PR est en effet fondamental pour développer des stratégies thérapeutiques précoces et efficaces.
Procédures
Les animaux seront soumis à une induction de la pathologie par des injections répétées sur animal vigile (2 fois par animal sur 3 semaines, moins de 1 minute par acte). Ils seront également exposés à la silice sous anesthésie (2 fois par semaine pendant 10 semaines, moins de 1 minute par acte). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animal vigile (2 fois pendant le projet, moins d’une minute par acte). Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie et analgésie (1 fois, 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les injections répétées dans la queue des souris peuvent entrainer des blessures à la queue, des irritations ou des saignements minimes. Le développement de l'arthrite chez les souris peut être responsable d'une limitation de leur mobilité. L’exposition à la silice peut générer un stress lié à la manipulation chez la souris. Elle peut entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité plus importante. L’anesthésie peut entrainer une détresse respiratoire ou une surmortalité. Deux prélèvements de sang sont prévus ce qui pourrait entrainer des douleurs légères et un risque d’hématome.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. Ceci permettra d'effectuer des prélèvements d'organes (poumons, rate, ganglions, sang et articulations) et de réaliser de nombreuses analyses in vitro complémentaires aux résultats cliniques obtenus.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de l’exposition à la silice présente dans l’environnement sur le système immunitaire et articulaire. A l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire la complexité d’un système impliquant des interactions entre poumon, cellules et organes du système immunitaire et des articulations. Par ailleurs, les expériences in vitro permettraient de démontrer l’activation potentielle de certaines cellules par la silice mais ne mais ne permettraient pas de démontrer de façon irréfutable l’effet clinique de cette molécule sur une pathologie systémique telle que la polyarthrite rhumatoïde. Les approches in vitro et in vivo sont donc complémentaires et toutes les deux nécessaires.
Réduction
Cette étude utilisera un total de 1770 animaux. Le nombre de souris nécessaire pour cette étude est défini sur la base des études précédemment réalisées sur le modèle d’arthrite au collagène. Le nombre d’animaux par groupe a été determiné pour obtenir un effet statistiquement significatif. Sur les animaux seront prélevés les poumons, le sang, la rate, les ganglions et les pattes afin d’obtenir un maximum d’information sur l’homéostasie immunologique dans les différents tissus et limiter ainsi la répétition d'expériences.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation en vigueur pour l’espèce concernée . Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur des animaux, notamment avec la mise en place d'une anesthésie. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance qu’auraient pu ressentir les animaux. Dès les premiers signes cliniques (gonflement de la patte injectée), des aliments sous forme de granulés seront placés directement dans la cage pour faciliter la prise de nourriture des souris. Les injections seront réalisées après anesthésie locale par cryoanesthésie. Concernant l'instillation nasale de silice, celle-ci sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l'instillation n'entraîne aucune lésion trachéale, ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu'à leur réveil complet. En fin de procédure, lors de l'anesthésie précédant l’euthanasie, la profondeur d'anesthésie sera vérifiée via l’observation des signes suivants: le relâchement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe palpébral, une respiration calme.
Choix des espèces
Nous avons décidé d’utiliser l’arthrite expérimentale au collagène de la souris qui est le modèle animal le plus utilisé pour établir un effet thérapeutique dans la polyarthrite rhumatoïde. L’induction des arthrites se fera sur des animaux de 11semaines après une préexposition à la silice. Les scores cliniques d'arthrite seront évalués pendant 3 à 8 semaines après l'induction. Le stade de développement des animaux est déterminé par la maturation du système immunitaire. Avant 8 semaines, le système immunitaire n'est pas assez mature pour répondre correctement à l'immunisation. A partir de 12 semaines, la capacité des souris à développer des arthrites décroit avec l'âge.
Impact de l’activation immunitaire maternelle sur les infections congénitales par le cytomégalovirus – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Une injection chez la rate gestante, un prélèvement de sang trois heures plus tard, puis une opération de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie générale pour atteindre les embryons et injecter le cytomégalovirus dans leur cerveau. Les ratons naissent, sont tatoués aux pattes le premier jour, pesés et testés chaque jour pendant deux semaines par le réflexe de retournement et celui d'éloignement du vide, le porteur ayant déjà observé chez eux des hyperextensions des membres et des crises d'épilepsie généralisées déclenchées par la manipulation. Vers le trentième jour, certains reçoivent une électrode implantée sous anesthésie et sont enregistrés trente minutes éveillés, d'autres passent à l'âge adulte des tests d'anxiété, de mémoire spatiale et de sociabilité. 1 828 rats sont concernés, dont 120 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, les mères étant tuées faute de pouvoir être réutilisées et la descendance mise à mort pour analyses. L'ajout de deux traitements à étudier a fait passer l'effectif déclaré de 996 à 1 828 animaux.
Objectifs
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du développement cérébral, pouvant notamment causer surdité, paralysie cérébrale, épilepsie, déficience intellectuelle, etc. Une influence sur la survenue ultérieure d'autisme ou de schizophrénie a aussi été évoquée. En dépit de leur fréquence et de leurs conséquences médicales et socio-économiques, les mécanismes des troubles neurologiques liés aux infections congénitales au CMV restent peu étudiés et mal connus. Ainsi, les options préventives et thérapeutiques restent limitées. L’étude de modèles animaux pertinents, notamment chez le rongeur, et utilisant les CMVs spécifiques de ces espèces, représente une approche indispensable pour appréhender ces mécanismes évolutifs, liés aux développements respectifs du système immunitaire cérébral et des réseaux neuronaux, et à leurs interactions réciproques, dans un contexte ou gestation et statut immunitaire maternel doivent aussi être pris en compte. L'objectif principal de ce projet est d'explorer chez le rat l'impact de l’immunité maternelle sur les conséquences de l'infection du cerveau en développement par le CMV, à différents niveaux d’analyse : aux niveaux moléculaire et cellulaire, au niveau des conséquences neurologiques pendant la période postnatale précoce, et à plus long terme sur la cognition, le comportement et la survenue d'activités épileptiques. MODIFICATION : L’étude de deux traitements supplémentaires nécessite une modification du projet initial, avec l’ajout de 832 animaux.
Bénéfices attendus
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du développement cérébral, avec des conséquences médicales sévères et un impact socio-économique important. Cependant, les mécanismes restent mal compris et peu abordés, et l'impact à long terme notamment reste mal connu. De ce point de vue, notre projet doit apporter des informations importantes pour apprécier ces conséquences, tout en ouvrant la possibilité de les prévenir en ciblant des altérations précoces du cerveau en développement.
Procédures
Une injection périphérique est pratiquée chez des femelles gestantes puis un prélèvement sanguin est réalisé 3h après l’injection. Après plusieurs jours de récupération, les mêmes femelles sont opérées sous anesthésie générale, afin d’accéder aux embryons et d’injecter le CMV dans les cerveaux embryonnaires. Dépendant du nombre d’embryons, la chirurgie dure de 30 à 45 minutes ; le muscle et la peau sont suturés. Au premier jour postnatal, les ratons d’une même portée sont tatoués au niveau des pattes avant et/ou arrière, et suivis quotidiennement pendant les deux premières semaines de vie (mesures de masse corporelle, réalisation de tests sensorimoteurs (test du réflexe de retournement lorsque l’animal est placé sur le dos, test du réflexe d’éloignement du vide lorsque la tête de l’animal est dans le vide, l’animal étant posé sur une plateforme élevée d’environ 8 cm), observation de la survenue de crises généralisées d’épilepsie) ; chaque session de tests dure environ 2-3 minutes. Autour du 30e jour postnatal, une chirurgie sous anesthésie générale est réalisée sur certains animaux pour implanter une électrode permettant d’enregistrer les activités corticales précoces. Ces enregistrements sont réalisés chez l’animal éveillé pendant environ 30 minutes, puis sous anesthésie générale légère pendant au maximum 2 heures. Au stade adulte, d’autres animaux sont évalués au cours de test cognitifs et comportementaux non-invasifs, sans restriction d'eau ni de nourriture (anxiété, reconnaissance et mémoire spatiales, sociabilité). Des sessions d’entrainement sont réalisées afin de minimiser le stress. Une fois ces tests terminés, une chirurgie sous anesthésie générale est réalisée sur certains animaux pour implanter un système sans fil permettant d’enregistrer les activités corticales. Ces explorations fonctionnelles (durée 72h) sont réalisées une semaine après la chirurgie chez l’animal vigile en activité dans sa cage. MODIFICATION : Deux traitements supplémentaires visant à éliminer un type cellulaire précis dans les cerveaux en développement sont pratiqués mais ils ne modifient pas les nuisances décrites ci-dessus : d’une part, un composé ajouté à la nourriture est administré pendant 4 jours consécutifs aux femelles gestantes ; d’autre part un composé est mélangé au CMV pour injection dans les cerveaux embryonnaires.
Impact sur les animaux
Le composé injecté aux femelles gestantes peut déclencher une réaction transitoire (hyperthermie, hypoactivité, et hypophagie) qui se normalise après 24h. Un prélèvement sanguin est réalisé à 3h post-injection. Après plusieurs jours de récupération, ces mêmes femelles sont opérées sous anesthésie générale pour accéder aux embryons et réaliser des injections dans les cerveaux embryonnaires. L'anesthésie des femelles gestantes peut engendrer des dépressions respiratoires, une hypothermie, une déshydratation. La chirurgie elle-même peut engendrer de rares et faibles hémorragies vaginales, des avortements partiels, une inactivité, une perte de poids, une inflammation des sutures. Les femelles gestantes sont isolées lors de la période post-opératoire jusqu’à la mise bas. Leur bien-être après chirurgie est évalué quotidiennement par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques. La majorité des femelles gestantes (>97%) récupèrent très bien après la chirurgie et la gestation se poursuit jusqu’à la mise bas. Chez les ratons nés après l’infection cérébrale au CMV in utero, un ensemble de phénotypes est attendu. Leur suivi quotidien au cours des deux premières semaines de vie postnatale a mis en évidence la survenue : d'hyperextension des membres inférieurs ; de crises d'épilepsie généralisées tonico-cloniques déclenchées par la manipulation ; d’un défaut de développement de réflexes sensorimoteurs évalués par le test d'éloignement du vide et le test de retournement. A plus long terme, nous anticipons des altérations fonctionnelles et comportementales chez les rats infectés par le CMV in utero, e.g. des activités épileptiques spontanées, des troubles du cycle veille/sommeil, des troubles cognitifs (mémoire spatiale) et des troubles de la sociabilité, mais cela doit être exploré et validé.
Devenir
Les femelles sont euthanasiés car elles ne peuvent pas être réutilisées. La descendance est mise à mort pour analyses post mortem.
Remplacement
Les mécanismes neuropathologiques des infections congénitales par le CMV reposent sur des interactions développementales multiples, entre la dynamique de l'infection virale elle-même, celle des réseaux neuronaux, et celle du système immunitaire cérébral, ceci dans un contexte de grossesse et d'un statut immunitaire maternel modifié. Il est évident que la plupart de ces évènements, leur évolution, ainsi que leur complexité et leurs relations réciproques, ainsi que leurs conséquences à long terme comme envisagé dans le projet, ne peuvent être modélisés in vitro y compris en utilisant des cérébroïdes, et encore moins in silico. Cette constatation est évidente pour les études cognitives et comportementales. Une partie de nos expériences d'enregistrements des activités épileptiques sera réalisée in vitro (coupes cérébrales), afin de réduire l’expérimentation sur l’animal vivant.
Réduction
Nous avons basé le nombre minimal d'animaux nécessaires sur la base de nos résultats antérieurs, et sur des calculs classiques de puissance statistique pour les tests les plus usuels. Nous optimisons la réduction des animaux utilisés de plusieurs manières : - chaque gestation et tous les embryons injectés in utero sont utilisés. - par ailleurs, le principe de réduction sera appliqué, car un animal jeune adulte passera à la fois les tests cognitifs et comportementaux, puis les enregistrements EEG ; les tissus cérébraux étant prélevés à l'issue de ces analyses. Ceci aura de plus l'avantage de permettre d'établir d'éventuelles corrélations entre plusieurs anomalies chez les mêmes animaux ayant passé l'ensemble des tests.
Raffinement
Le bien-être des animaux est évalué par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques adaptés, y compris les weekends et jours fériés, qui sont consignées dans un registre (avec une fiche de suivi post-opératoire pour les femelles gestantes, qui permet d'établir un score, et une fiche de suivi des cohortes de ratons injectés au CMV). Chaque rate et sa portée est hébergée dans une cage avec nourriture et eau à volonté. L’environnement est enrichi avec des matériaux souples (papier foisonnant, litière en carrés de cellulose vierge) et un tunnel en carton permettant la confection d’un nid. Les femelles gestantes subissent une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale, sur un tapis chauffant. Le rythme respiratoire des animaux est surveillé en permanence, et une injection intra-péritonéale de sérum physiologique est réalisée en fin d’intervention. Après leur réveil, les femelles sont placées sur un tapis chauffant pendant au moins 30 minutes. Un suivi post-chirurgical est réalisé : surveillance de la cicatrisation (nettoyage de la plaie et nouvelles sutures si détérioration), d’absence d'hémorragie vaginale, de la mise bas (euthanasie si retard de la mise bas supérieur à 24h), de la perte de poids (euthanasie si > à 20%), de l'hypothermie (froid au touché), des signes de douleur (prostration, agressivité, absence de réaction aux stimuli). En fonction du score obtenu, une injection d'analgésique ou d’anti-inflammatoire peut être pratiquée. Les ratons sont également suivis avec notamment une surveillance de leur état général et de leur prise de poids, et de l’apparition des phénotypes caractéristiques de notre modèle. Ces mesures sont quotidiennes pendant les 2 premières semaines postnatales. Au delà, seul le poids sera mesuré, d’abord quotidiennement jusqu’au 20e jour postnatal, puis 1 fois par semaine jusqu’au sevrage (au 30e jour postnatal). Ensuite, les animaux seront regroupés par sexe à 2-3 individus par cage dans un environnement enrichi (rouleaux de papier foisonnant et tunnel en carton). Le poids sera suivi une fois par semaine. Au stade adulte, les tests comportementaux seront effectués, ils seront précédés de plusieurs sessions d’habituation pour minimiser les effets du stress.
Choix des espèces
Les animaux que nous utilisons, en l'occurrence les rats, sont des rongeurs de petite taille et d’élevage facile, avec une gestation d'une durée adaptée aux exigences des travaux de recherche. Ils possèdent un système nerveux central dont le développement présente de nombreuses similitudes avec celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est cependant suffisamment complexe pour être représentative. D'une manière générale, ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes pathologiques du développement cérébral. Le rat est particulièrement adapté à des études électrophysiologiques, cognitives et comportementales. Dans le projet présenté ici, le choix de l'espèce est aussi orienté par l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus de rat recombinante, car les cytomégalovirus, y compris ceux de rat, sont spécifiques d'espèce. Les rates gestantes seront âgées d'environ 10 semaines à 6 mois. Les infections in utero seront réalisées au début du dernier tiers de gestation, ce stade d'infection tenant compte de l'état de développement cérébral, d'impératifs méthodologiques, et conduisant à reproduire les conséquences neurologiques postnatales rappelant la pathologie humaine modélisée ici. L’étude des activités épileptiformes in vitro sera réalisée autour du 15e jour postnatal, période classique où le cerveau immature, correspondant à la période néonatale chez l'homme, présente une plus forte susceptibilité aux activités épileptiques. Les enregistrements des activités corticales précoces seront réalisés autour du 30e jour postnatal, une période classiquement utilisée pour ce type d’enregistrements. La recherche d'effets à plus long terme du CMV sera réalisée chez des jeunes rats (40e jour postnatal et au delà), permettant la réalisation efficace de tests cognitifs et comportementaux, ainsi que des enregistrements électro-encéphalographiques sur plusieurs jours consécutifs.
Identification de nouvelles molécules à visée anti-fibrotique dans un modèle murin – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
1 642 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs reins et leur foie, dont 1 052 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent deux injections par semaine pendant six semaines d'un produit qui provoque la fibrose, puis des gavages quotidiens par cycles de sept jours ou des injections de traitement deux fois par semaine, avec pesées bihebdomadaires et prélèvement sanguin sous anesthésie avant la mise à mort. Trente d'entre elles sont hébergées vingt-quatre mois pour vieillir, et une lignée déficiente pour le gène col4a3 perd l'audition vers six à huit semaines avant de développer une fibrose rénale. Le porteur écrit que neuf souris par groupe suffisent et que le nombre total estimé s'élève à 986 animaux, alors que le projet en déclare 1 642.
Objectifs
La fibrose est définie comme une cicatrisation anormale des tissus constatée après agression de ces derniers. Cette affection est irréversible et s'aggrave au cours du temps. Ce phénomène peut affecter la plupart des organes dont les poumons, les reins, le foie ou encore le coeur et représente un problème majeur de santé publique. En effet, 45% des décès dans les pays industrialisés seraient liés à la présence d’une composante fibrotique. Cependant, les mécanismes à l'origine de ce processus restent actuellement largement méconnus. De ce fait, un des enjeux majeurs de ces dernières années consiste à mieux appréhender les causes et les mécanismes de cette maladie afin de développer de nouveaux marqueurs diagnostiques, pronostiques et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les modèles cellulaires ne permettant pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, le recours à l'animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel anti-fibrotique d'un candidat médicament. Les objectifs de notre projet sont les suivants : - Identifier de nouvelles molécules présentant un potentiel anti-fibrotique dans des modèles murins de fibrose hépatique et rénale. Ces molécules ont été sélectionnées préalablement dans notre laboratoire à la suite de tests in vitro. Pour cela, nous utiliserons différents modèles murins couramment décrits dans la littérature scientifique permettant d'induire (ou développant spontanément) des lésions de fibrose hépatique ou rénale. De plus, la fréquence de la plupart des pathologies fibrotiques étant fortement augmentée après 50 ans, nous inclurons dans notre étude des souris âgées pour être plus représentatifs de la pathologie humaine. - Confirmer le rôle instrumental d’un gène, miR-21, dans la fibrose dans un modèle de souris déficientes pour ce gène. En effet, les résultats préliminaires obtenus in vitro nous ont permis de démontrer l'implication de ce gène dans la fibrose. Nous souhaitons donc confirmer nos résultats dans un modèle complexe.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel anti-fibrotique de 5 molécules dont l’intérêt a été démontré in vitro au préalable en utilisant à la fois des souris jeunes et âgées. A terme, ce projet devrait permettre d’obtenir la preuve de concept de l’utilisation de ce type de molécules dans la prise en charge des patients atteints de fibrose, pour lesquels les options thérapeutiques restent à l’heure actuelle très limitées.
Procédures
Partie 1 : 30 souris hébergées pour étudier leur vieillissement subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. Durée totale = 24 mois Partie 2 : 360 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 2 injections par semaine pendant 3 semaines du traitement ou de son contrôle (30 sec/intervention). 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage par jour (60 sec/intervention) pendant 1 cycle de 7 jours, répété 2 fois avec un intervalle de 2 semaines entre les 2. 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage (60 sec/intervention). Elles seront également pesées 2 fois par semaine pendant 4, 6 ou 7 (en fonction du groupe) semaines (1 min/pesée) et subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. Durée totale = 7 semaines. Partie 3 : 360 souris recevront 1 injection de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 2 injections par semaine pendant 3 semaines du traitement ou de son contrôle (30 sec/intervention). 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage par jour (60 sec/intervention) pendant 1 cycle de 7 jours, répété deux fois avec un intervalle de 2 semaines entre les 2. 180 souris recevront 2 injections par semaine pendant 6 semaines de l’inducteur de fibrose ou de son contrôle (30 sec/intervention) puis 1 gavage (60 sec/intervention). Elles seront également pesées 2 fois par semaine pendant 5, 7 ou 8 semaines (en fonction du groupe) (1 min/pesée) et subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) avant leur mise à mort. Durée totale = 8 semaines. Partie 4 : Étape 1 : 224 souris recevront 2 injections ou non / sem. pendant 6 semaines (30 sec). Étape 2 : 668 souris recevront 2 injections ou non / sem. pendant 6 semaines (30 sec) puis seront isolées pendant 16h pour le recueil passif des urines (répété 3 ou 4 fois en fonction des groupes). Un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (2min30) sera réalisé sur l'ensemble des souris avant leur mise à mort. Durée totale = 9,5 semaines à 24 mois en fonction des groupes.
Impact sur les animaux
Notre projet implique l’induction de lésions de fibrose hépatique ou rénale chez la souris. De plus, les souris déficientes pour le gène col4a3 présentent à 6-8 semaines une perte auditive neurosensorielle modérée et développent à 10 semaines une glomérulosclérose associée une fibrose rénale.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes (reins et/ou foie) dans le but d’étudier la fibrose et la sénescence dans ces organes.
Remplacement
Des résultats préliminaires in vitro obtenus au sein de notre laboratoire nous ont permis de : - démontrer l’implication de certains gènes tel que miR-21 ou de processus cellulaires comme la sénescence dans la fibrose. - pouvoir sélectionner 5 candidats médicaments pour nos évaluations de potentiel anti-fibrotique. Cependant, les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le développement des lésions de fibrose. En effet, le processus de fibrose étant un processus dynamique mettant en jeu de nombreux types cellulaires, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier et de ce fait nécessite de recourir à l’expérimentation animale.
Réduction
Nos études in vitro effectuées en amont au laboratoire nous ont permis de réduire significativement le nombre de molécules d’intérêt à tester et de ce fait, de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour notre recherche. En ce qui concerne le nombre d’animaux utilisés dans notre étude, en émettant l'hypothèse d'une fréquence de l'événement de 10% sans traitement et de 75% avec traitement, il est nécessaire d'inclure 7 souris par groupe. Du fait de la variabilité de réponse pouvant être observée lors du processus de fibrose, nous envisageons d’utiliser 9 souris par groupe expérimental. De plus, les modèles utilisés dans ce projet sont complémentaires et utilisent des procédures déjà mises au point et couramment décrites. Les différentes procédures mises en œuvre pour ce projet ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Pour la mise en œuvre de ce projet qui durera 5 ans, le nombre total d'animaux estimé est de 986 souris.
Raffinement
Le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques en expérimentation animale. Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi avec des cotons de nidification, et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin de réduire leurs stress et angoisse. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé de manière à s’assurer qu’ils ne présentent pas de signes de souffrance nécessitant l’arrêt des procédures et leur mise à mort. La souffrance sera évaluée par l’observation de paramètres de poids, de comportement et d’apparences reportés dans une grille standard permettant d’établir un score à ne pas dépasser. Tout animal dépassant ce score sera exclu du protocole et mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle murin constitue un modèle de choix pour l’étude de la fibrose tissulaire de par notamment les nombreuses similitudes avec la pathologie observée chez l’homme. Le choix des lignées utilisées est dépendant des protocoles déjà existants et décrits dans la littérature. La fréquence de la plupart des pathologies fibrotiques étant fortement augmentée après 50 ans, nous inclurons dans notre étude des souris jeunes adultes et âgées pour être plus représentatifs de la pathologie humaine. Seul le modèle de fibrose rénale spontanée inclura de jeunes souris de 4 semaines en raison du développement précoce des lésions de la pathologie.
Étude du rôle de cellules immunitaires dans un modèle murin de fibrose pulmonaire.
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Jusqu'à 120 injections par animal, une par jour, et quarante-cinq minutes d'anesthésie pour une irradiation du thorax : 800 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement des tissus. L'irradiation provoque au bout de plusieurs semaines une fibrose pulmonaire, avec difficultés respiratoires, perte de poids et baisse d'activité. Le porteur cherche à établir le rôle des neutrophiles et des pièges qu'ils libèrent dans cette cicatrisation anormale du poumon, complication de la radiothérapie thoracique chez les patients. Il retient des femelles de sept à neuf semaines issues de souches réputées pour leur forte sensibilité à la fibrose expérimentale, et note que les femelles se montrent moins agressives entre elles, ce qui limite le stress lié à la vie en groupe.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines cellules de défense de notre organisme, appelées neutrophiles, et les pièges qu’elles libèrent (appelés NETs), peuvent jouer un rôle néfaste dans la formation de cicatrices anormales dans les poumons, appelées fibrose pulmonaire. La fibrose pulmonaire est une maladie grave où le tissu pulmonaire devient rigide et perd sa capacité à assurer une bonne respiration. Elle peut apparaître après certains traitements anticancéreux, comme la radiothérapie thoracique, utilisée pour soigner des cancers du poumon ou du sein. Nos travaux en laboratoire suggèrent que les neutrophiles et les NETs contribuent à l’aggravation de la fibrose en activant d’autres cellules qui fabriquent de la cicatrice. Ce projet a donc pour but de vérifier ce rôle dans un modèle chez la souris, en reproduisant une irradiation similaire à celle reçue par les patients. L’objectif final est d’identifier de nouvelles pistes de traitement pour prévenir ou limiter la fibrose pulmonaire radio-induite, afin d’améliorer la qualité de vie des patients traités par radiothérapie.
Bénéfices attendus
Si ce projet aboutit, il pourrait ouvrir de nouvelles pistes pour prévenir ou limiter la fibrose pulmonaire, une complication grave qui peut survenir après certains traitements anticancéreux comme la radiothérapie. En identifiant précisément le rôle des neutrophiles et des NETs dans cette maladie, nos recherches pourraient déboucher sur le développement de nouveaux médicaments ciblés capables de réduire la formation de cicatrices dans les poumons. Ces avancées permettraient non seulement d’améliorer la qualité de vie des patients traités par radiothérapie, en réduisant le risque d’insuffisance respiratoire, mais aussi d’apporter des connaissances utiles pour d’autres maladies où la fibrose pulmonaire est un problème majeur. Ce projet contribuera donc à la fois à la recherche fondamentale et à l’émergence de solutions concrètes pour la santé humaine.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les souris seront soumises à plusieurs interventions, toutes réalisées par du personnel formé afin de limiter au maximum le stress et la douleur. Une séance unique sera réalisée au début de l’étude (J0). Pour cette étape, les souris seront anesthésiées, garantissant une immobilité totale et l’absence de perception de la douleur pendant la procédure (45 minutes). Cette anesthésie permet un sommeil profond et suffisamment prolongé pour la durée de l’irradiation. Injections : certaines souris recevront les traitements testés sous forme d’injections. Chaque injection dure environ 20 secondes. Selon le traitement, ces injections seront réalisées quotidiennement (jusqu’à 120 fois par animal pour les inhibiteurs) ou trois fois par semaine (environ 40 fois pour les anticorps). Les sites d’injection seront alternés pour limiter les irritations locales. Pesées hebdomadaires : une fois par semaine, les souris seront brièvement manipulées (environ 15 secondes) pour être pesées, afin de suivre leur état de santé. Ces interventions sont de courte durée, non chirurgicales, et accompagnées d’un suivi régulier permettant de garantir le baneien-être des animaux tout au long de l’étude.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette étude, certaines interventions peuvent entraîner des effets indésirables chez les souris. L’irradiation thoracique peut provoquer, après plusieurs semaines, des difficultés respiratoires dues à la formation progressive de cicatrices dans les poumons (fibrose pulmonaire). Ces effets apparaissent progressivement. Les injections peuvent entraîner de légères irritations locales, telles qu’une rougeur ou un gonflement au point d’injection. Ces réactions sont généralement temporaires. De manière générale, certains animaux peuvent présenter une perte de poids, une baisse d’appétit ou une diminution de l’activité en lien avec le développement progressif de la fibrose pulmonaire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des expériences, afin de prélever les tissus en vue d’analyses biochimiques et histologiques pour répondre aux objectifs scientifiques définis.
Remplacement
Avant d’utiliser des animaux, des expériences ont été réalisées sur des cellules en laboratoire (fibroblastes, macrophages, neutrophiles et cellules pulmonaires). Ces modèles ont montré que les neutrophiles et les pièges qu’ils libèrent (NETs) jouent un rôle dans le développement de la fibrose. Cependant, les mécanismes observés ne peuvent être entièrement reproduits en dehors d’un organisme vivant, car ils dépendent d’interactions complexes entre les cellules immunitaires, les tissus et la réponse à l’irradiation. L’utilisation de souris est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été calculé de manière rigoureuse grâce à une analyse statistique, afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum le nombre de souris utilisées. Les travaux préliminaires réalisés dans d’autres modèles de fibrose ont permis d’optimiser les conditions expérimentales et de définir précisément le nombre minimal de 10 animaux par groupe, garantissant la validité scientifique des données.
Raffinement
Tout au long de l’étude, des mesures sont mises en place pour réduire au maximum la douleur et le stress des animaux. Ils sont hébergés en groupe dans des cages ventilées et enrichies, afin de favoriser un comportement naturel et leur bien-être. Les souris sont observées chaque jour afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’anomalie. Elles sont anesthésiées lors de l’irradiation pour éviter toute douleur ou stress. Si un signe important de souffrance apparaît (perte de poids importante, difficulté à respirer, prostration), l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort de manière éthique afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
Nous cherchons à comprendre le rôle de certaines cellules du système immunitaire, appelées neutrophiles, dans le développement de la fibrose pulmonaire. Cette maladie correspond à une cicatrisation anormale du poumon qui le rend moins souple et gêne progressivement la respiration. Elle peut apparaître après certains traitements anticancéreux, comme la radiothérapie thoracique. La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce type d’étude, car son système immunitaire et ses mécanismes de réparation des tissus sont très proches de ceux de l’être humain. De plus, certaines souches de souris sont reconnues pour leur forte sensibilité à la fibrose pulmonaire induite expérimentalement, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables, reproductibles et comparables aux données déjà publiées dans la littérature scientifique. Nous utiliserons uniquement des souris femelles adultes jeunes, âgées de 7 à 9 semaines. À cet âge, elles ont atteint leur maturité physique et immunitaire, ce qui garantit une réponse stable et représentative. Par ailleurs, les femelles présentent moins de comportements agressifs que les mâles, ce qui limite le stress lié à la vie en groupe et améliore leur bien-être pendant l’étude. Ce choix d’espèce, d’âge et de caractéristiques garantit des données pertinentes pour la santé humaine tout en assurant le bon déroulement de l’étude et le respect du bien-être animal.
Etude de traitements par thérapie génique dans deux modèles de neuropathie chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Tout rat dont les signes de douleur dépassent le cadre prévu par l'étude est mis à mort. 356 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tués à l'issue pour prélever leurs structures nerveuses. Ils développent une neuropathie provoquée soit par cinq administrations d'un réactif espacées d'une semaine chacune, soit par chirurgie, après une première opération destinée à injecter le traitement, puis subissent pendant neuf semaines des tests de réaction à des stimuli tactiles et thermiques répétés cinq fois. Le porteur reconnaît que ces tests peuvent déclencher une douleur au moment de la stimulation et que la neuropathie s'exprime par une hypersensibilité ou une douleur spontanée chronique, l'enjeu déclaré étant de vérifier si des vecteurs viraux atténuent ces symptômes.
Objectifs
La douleur neuropathique résulte d'une lésion ou d'un dysfonctionnement du système nerveux central ou périphérique dont les causes sont multiples, pouvant inclure entre autres des lésions nerveuses traumatiques ou faire suite à certaines catégories de traitements (notamment des anti-cancéreux). Touchant 7 % de la population générale, elles doivent conduire à l’emploi d’un arsenal thérapeutique différent de celui d'autres types de douleurs. Le traitement repose souvent sur des traitements de type antidépresseurs, antiépileptiques, ou non médicamenteux (p. ex., kinésithérapie, neuromodulation). Il n'existe à ce jour pas de traitement 100% efficace des douleurs neuropathiques, dont la prise en charge peut s'avérer complexe (douleurs chroniques, très durables dans le temps, d'où l'impossibilité de donner des antalgiques puissants tels que les opioïdes du fait de leurs effects secondaires), avec un accès inégal de la population aux spécialistes adaptés à la prise en charge de ces pathologies. Ce projet vise à évaluer des traitements qui interviendront au niveau génétique via l'administration de vecteurs viraux afin de diminuer les symptômes associés à différents types de neuropathie. Ce projet permettra de tester, dans deux modèles standard de douleur neuropathique chez le rat, ces nouvelles thérapies contre les douleurs neuropathiques.
Bénéfices attendus
Il n'existe à ce jour pas de traitement permettant de soigner l'ensemble des douleurs neuropathiques, dont la prise en charge peut s'avérer complexe (douleurs chroniques, durables dans le temps), avec un accès inégal de la population aux spécialistes adaptés à la prise en charge de ces pathologies. Ce projet permettra de tester, dans des modèles de douleur neuropathique chez le rongeur, des candidats de thérapie génique permettant de diminuer la douleur, dans le but de développer de nouvelles thérapies présentant une bonne efficacité dans la prise en charge de la douleur et l'amélioration de la qualité de vie des patients, le tout sans effet secondaire marqué.
Procédures
Une phase d'administration chirurgicale du traitement (durée de quelques minutes, 1 fois, sous anesthésie). Une phase d'induction, soit par 5 administrations espacées d'une semaine chacune d'un réactif (environ 1 minute par administration, sous contention), soit par chirurgie (1 fois, 5 à 10 minutes, sous anesthésie). Le comportement général des animaux sera évalué (observation sans manipulation, de l'ordre de quelques minutes) et des tests comportementaux (réaction à des stimuli tactiles ou thermiques, de l'ordre de 1 à 5 minutes). Chaque test sera réalisé 5 fois (sur des semaines différentes). L'étude durera 9 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux dans ce projet vont développer une neuropathie, qui peut se manifester par une hypersensibilité à la douleur ou une douleur spontanée, de manière chronique. L'administration de la thérapie (ainsi que l'induction chrirugicale de la neuropathie) nécessitera une phase chirurgicale pouvant entraîner une douleur post-opératoire malgré les soins péri-opératoires (incluant un analgésique). Les manipulations réalisées au cours des procédures peuvent entraîner un stress lors du test (e.g. stimulation tactile au niveau d'une patte). Les tests comportementaux basés sur la stimulation tactile ou thermique d'une zone potentiellement douloureuse, bien qu'il s'agisse de tests d'allodynie (c'est-à-dire stimulation en soi non douloureuse), peuvent entraîner une douleur au moment du test, et/ou un stress léger (pas de contention pour ces tests, mais les animaux seront manipulés hors de leur cage d'habitation pendant quelques minutes).
Devenir
Euthanasie pour prélèvement de structures nerveuses (impossible maintien en vie après ce prélèvement).
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction au sein du corps entier, ce qui est un point particulièrement important dans ces modèles car les lésions nerveuses induites entraînent des effets à différents niveaux de l'organisme, avec notamment une intégration centrale. Ces conditions spécifiques ne peuvent actuellement pas être reproduites in vitro, et l'étude de l'efficacité de la thérapie génique nécessite l'utilisation d'animaux présentant une douleur neuropathique. Cependant, les candidats traitements étudiés dans ce projet ont fait l'objet d'un tri et notamment d'une étude de biodistribution préalable, afin de vérifier qu'il ciblent bien les structures nerveuses d'intérêt (avant de passer sur un modèle de douleur).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test a été optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet et la comparaison entre deux traitements. Le nombre d’animaux a été déterminé par une analyse de puissance tenant compte de la structure de l'étude et utilisant les données comportementales des deux modèles évalués dans ce projet au sein de l'établissement utilisateur. Les études sont dimensionnées de manière à détecter une différence minimale de 30 % dans la réponse à la douleur entre les groupes traités et le groupe témoin. Ce seuil de 30 % a été choisi pour sa pertinence clinique, car il correspond au niveau minimal de soulagement de la douleur considéré comme cliniquement significatif chez les patients. Pour chacun des paramètres étudiés, des tests standards paramétriques seront appliqués. Aussi, les études réalisées dans ce projet seront complétées par une évaluation des potentiels effets secondaires, afin d'éviter d'utiliser d'autres animaux à cette seule fin.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Pendant la phase chirurgicale, les animaux sont anesthésiés et analgésiés, le programme d’anesthésie et d’analgésie étant défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De plus, la phase de chirurgie est raffinée au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins péri-opératoires adaptés, définis avec le vétérinaire en charge du bien-être des animaux.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles largement employés pour étudier une grande variété de douleurs neuropathiques, que ce soit des modèles de lésion, de neuropathie consécutive à une maladie, ou encore à un traitement par chimiothérapie. Il s'agit également de l'espèce dans laquelle des tests préalabales de biodistribution ont été réalisés pour la thérapie étudiée. Rongeurs sevrés (environ 5 semaines au 1er jour de l'étude) car les douleurs neuropathiques étudiées dans ce projet ne sont pas des maladies pédiatriques.
Développement d’un traitement innovant des douleurs chroniques liées aux cancers
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Injectés de cellules cancéreuses puis soumis à des chimiothérapies, 720 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes. Chaque animal reçoit une injection hebdomadaire de la molécule à tester pendant six à huit semaines, sous la peau, dans une veine ou dans le canal rachidien, et son hypersensibilité est mesurée chaque jour, la sensibilité thermique trois fois au cours de l'étude. L'objectif déclaré est de fixer la dose et la fréquence optimales d'un candidat médicament dont le porteur indique qu'il a déjà montré son efficacité in vitro et in vivo. Tout traitement antalgique reste proscrit une fois le modèle de douleur établi, alors que le porteur décrit par ailleurs une acclimatation, un enrichissement des cages et une grille de score censés limiter la souffrance.
Objectifs
Les cancers qui touchent 18 millions de personnes par an dans le monde conduisent chez plus de 50% des patients à des douleurs chroniques. Les douleurs chroniques liées aux cancers sont de type neuropathique et/ou inflammatoire et sont soit induites par la tumeur et les métastases soit provoquées par les traitements du cancer. La prise en charge de ces douleurs est difficile car elles sont persistantes et rebelles aux traitements usuels. Les médecins sont donc démunis devant les patients en souffrance, d’où la nécessité de trouver de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques. Le projet consiste à tester l’efficacité d’une molécule médicament que nous venons de développer pour traiter différents types de douleurs liées aux cancer. Notre molécule médicament a déjà démontré son efficacité pour le traitement des douleurs chroniques dans une étude in vitro et in vivo préalable. Aujourd’hui notre objectif est de tester in vivo son efficacité pour soulager les douleurs chroniques liées aux cancers et de déterminer la dose et la fréquence optimales du traitement. Des injections de la molécule médicament seront effectuées sur 2 types de modèle de douleurs liées aux cancers : les douleurs cancéreuses liées à une tumeur et les douleurs consécutives à une chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de démontrer l’efficacité de notre molécule thérapeutique pour soulager les douleurs liées aux cancers et nous espèrons ainsi pouvoir proposer une nouvelle piste thérapeutique pour les patients atteints de cancer qui souffent de douleurs chroniques conséquentes à cette maladie. Les résultats précliniques de ce projet pourront soutenir la mise en place d’un essai clinique avec cette molécule.
Procédures
Il est prévu d’utiliser 720 rats pour ce projet. Les animaux seront soumis à deux types d’intervention : des injections de cellules cancéreuses et des chimiothérapies. Notre molécule thérapeutique, dont nous souhaitons évaluer l’efficacité pour soulager les douleurs chroniques liées aux cancers, sera injectée une fois par semaine soit en sous-cutané soit en intraveineux soit en intrathécal durant 6 à 8 semaines. Chaque type d'injection dure entre 2 à 3 min par animal. Les animaux seront anesthésiés pendant les injections. Une surveillance post-injection sera assurée par l’expérimentateur et les zootechniciens. Les animaux seront ensuite observés quotidiennement au cours de l'expérimentation et nous utiliserons une grille de score d'évaluation de la douleur et/ou souffrance pour évaluer l'état général et la douleur des animaux. Différents paramètres sont observés tels que l'apparence, l'alimentation, le comportement naturel et la respiration. Les animaux seront pesés et leur hypersensibilté sera évaluée quotidiennement à l'aide de tests de référence, la duré de ces gestes techniques est de maximum 4 min par animal. La sensibilité thermique aux températures sera quant à elle évaluée trois fois au cours de l’expérience, en début, après induction de la douleur et en fin de l’étude. Cette dernière évaluation dure 3 minutes par animal. Les jours où la sensibilté thermique est évaluée, les tests d'hypersensibilité ne sont pas réalisés.
Impact sur les animaux
Ce projet porte sur la douleur est nécessite l’utilisation de procédures sévères pour induire des douleurs neuropathiques et/ou inflammatoires. Il est donc attendu que les animaux présentent des symptômes de sensibilité douloureuse. L’objectif du projet étant l’évaluation du soulagement de ces symptômes douloureux par notre molécule médicament, l'utilisation de médicaments anti-douleur suite à l'établissement du modèle de douleur est proscrite. Une surveillance post-injection sera assurée par l’expérimentateur et les zootechniciens. En effet, une tuméfaction au point d’injection des cellules cancéreuses pourrait apparaitre.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés et les organes seront prélevés pour analyses.
Remplacement
- Remplacer : la douleur est une réponse de l’organisme entier face à une agression. Ce phénomène ne peut donc être étudié autrement qu’en utilisant l’organisme entier lui-même. Il n’est actuellement pas possible de remplacer le modèle animal pour ce type d'analyse. Néanmoins, il est possible d’étudier in vitro certains mécanismes utilisés par la réponse douloureuse et c’est ainsi que nous avons pu identifier le gène cible du traitement. Nous développons un modèle in vitro de cellules souches humaines différenciées en neurones sensoriels pour mieux comprendre le fonctionnement de notre gène cible dans les neurones de la douleur. Cependant, pour étudier le rôle de cette molécule dans la réponse douloureuse globale, le recours à l’animal est obligatoire.
Réduction
- Réduire : le nombre de rats utilisé sera réduit au minimum afin de limiter l’utilisation d’animaux vivants mais de manière à avoir des effectifs compatibles avec les tests statistiques utilisés. Le nombre d’animaux par lot est basé sur la littérature où un effet statistiquement significatif est mis en évidence à partir d’un seuil de 6 mâles et 6 femelles par lot. L’étude nécessitant de nombreuses cohortes associé au fait que notre étude précédente avec cette molécule médicament donnait des résultats très homogènes dans un même lot, nous avons choisi de constituer des lots de 6 animaux par sexe pour réduire au maximum le nombre d’animaux et respecter la règle des 3R.
Raffinement
- Raffiner : pour limiter l’angoisse due aux tests pratiqués, une acclimatation est réalisée durant laquelle les animaux à leur arrivée sont laissés 5 jours dans les cages pour qu’ils s’habituent aux locaux de notre animalerie. Durant une semaine, les animaux sont ensuite manipulés et présentés aux différents appareils de tests comportementaux qui seront utilisés dans l’étude, mais aucun test n’est pratiqué, afin que les animaux s’habituent à l'expérimentateur ainsi qu’aux différents équipements de test. Cette étape d'habituation permet aux animaux de s’habituer à l’environnement, à l'expérimentateur et de limiter le stress lié à la procédure. Les cages auront un enrichissement du milieu. Ce milieu est constitué d’un tunnel cylindrique pour procurer un sentiment de sécurité à l’animal, du papier cartonné pour stimuler les instincts naturels de nidification et de jeu et des copeaux de pin pour réchauffer les rats en cas d’hypothermie. Les points limites sont répertoriés dans une grille de score d’évaluation avec une notation de 0 à 2 pour chaque point limite. Un suivi journalier des animaux sera effectué. En cas de score égal ou supérieur à 4, une observation attentive de l’animal sera effectuée et des soins appliqués lorsque cela est possible. Un animal avec un scoring entre 4 et 6 est observé de manière attentive c’est à dire 4 fois par jour par l’expérimentateur et l’équipe de zootechnie jusqu’à 3 jours. Si aucune amélioration n’est observée les animaux sont sortis du projet et euthanasiés par asphyxie au CO2. Les animaux avec un score inférieur à 4 sont observés 1 fois par jour, tous les jours. Et les animaux avec un scoring supérieur à 6 sont sortis du projet et euthanasiés par asphyxie au CO2.
Choix des espèces
Pour l'étude pharmacologique, la formulation chimique de notre molécule médicament est spécifique du génome du rat et de l’homme et nécessite des tests comportementaux chez le rat plutôt que chez la souris pour l'obtention de résultats transposables à l'homme. Ce projet nécessite d’utiliser des animaux au stade adulte qui correspond au stade d’expression optimale de notre cible thérapeutique. Tous les animaux arriveront au sein de l’animalerie au stade post-natal de 5 semaines. Ce stade a été déterminé par nos expériences antérieures. En effet, en arrivant à 5 semaines au laboratoire et après la période d’acclimatation et d’habituation, les animaux sont alors à un stade adulte de 6,5/7 semaines adéquat pour la réalisation des différentes procédures.
Compréhension des mécanismes de l’oncogenèse du cancer de foie pédiatrique grâce à la technique d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue de souris.
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Une injection sous pression de plasmides dans la veine de la queue déclenche la formation de tumeurs du foie chez 890 souris, dont 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Les animaux reçoivent ensuite des anticancéreux à l'état vigile, jusqu'à une fois par jour pendant quinze à trente jours, avec une séance d'imagerie hebdomadaire sous anesthésie gazeuse. L'objet est d'identifier les gènes qui déclenchent le cancer du foie pédiatrique et de tester jusqu'à dix candidats-médicaments en cinq ans. Le porteur écrit qu'aucun signe de souffrance n'est détecté chez ces souris passé la demi-heure qui suit l'injection, alors que 600 d'entre elles sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) et notamment le cancer pédiatrique (hépatoblastome) sont des pathologies complexe, en raison de ses caractéristiques qui influencent son évolution et la résistance aux traitements. A ce jour le seul traitement pour l’hépatoblastome est la chimiothérapie avec une efficacité limitée et des effets secondaires et une toxicité non-négligeable. L'identification de gènes impliqués dans le déclenchement du processus de tumorigenèse est difficile en raison de la présence de plusieurs altérations qui n'ont pas d'impact fonctionnel. Nous avons généré un modèle murin qui récapitule le programme du développement du cancer du foie pédiatrique. L'utilisation de ce modèle à des stades précoces (avant l'apparition des tumeurs) permet de tester l'implication fonctionnelle de gènes qui coopèrent pour induire la formation de tumeurs. Nous avons conçu un programme de recherche interdisciplinaire pour identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans l'initiation des tumeurs hépatiques et leur évolution en cancer du foie, ainsi que leur mode de coopération. Ces objectifs seront réalisés en exprimant dans les cellules du foie les différents gènes d’intérêt. Ce projet nous permettra de tester l’implication fonctionnelle de nouveaux gènes (seuls ou en combinaison) agissant comme régulateur du processus de cancérisation dans le foie sain. Cette stratégie nous permettra de tester directement l’implication de gènes candidats dans la formation des tumeurs pédiatriques dans un foie sain et d’évaluer de nouveaux candidats médicaments qui permettraient une meilleure réponse au traitement des tumeurs.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d'identifier les gènes fonctionnellement impliqués dans la formation et l'évolution de tumeurs hépatiques pédiatriques ainsi que leur mode de coopération entre gènes. L'analyse par imagerie non-invasive permettra de suivre de manière longitudinale la formation, l'évolution et la régression des tumeurs. L’évaluation de nouveaux candidats-médicaments permet d’augmenter les taux de réponses et de cibler un maximum de la population pédiatrique atteinte du cancer du foie et ainsi de réduire la mortalité et morbidité de ce cancer. Nous prévoyons de faire un maximum de 2 études de nouveaux candidats par an, soit 10 nouveaux candidats médicaments sur 5 ans.
Procédures
Les souris subiront 1 seule injection de plasmides (qui véhiculent nos gènes d’intérêt) dans la veine de la queue pour une durée inférieure à 5 secondes. Certaines de ces souris seront traitées avec des drogues anti-cancéreuses, administrées en état vigile, selon les recommandations fournies pour chaque drogue. Après administration, la souris est placée en observation dans sa cage. La fréquence des injections dépend du type de traitement (variant de 1/jour à 1/semaine) pour une durée approximative d’entre 15 et 30 jours. Les analyses par imagerie non-invasive seront effectuées 1 fois par semaine sous anesthésie gazeuse. Chaque séance d'imagerie durera environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Cette technique d’injection est couramment utilisée dans plusieurs laboratoires situés dans le monde entier. Les nuisances attendues sont : 1) Nuisance globale de l'expérience d'injection qui n'est que temporaire (inférieure à 30 minutes). Au-delà de cette période, les souris ne montrent plus aucun signe de souffrance. A ce stade initial du développement de la tumeur, aucun signe de souffrance n'est détecté chez les animaux ; 2) l’administration d’agents médicamenteux pourrait entraîner une douleur légère pendant quelques secondes au moment de l’injection. ; 3) Formation et évolution des tumeurs pourrait entrainer des malaises pour la souris, d’où l’importance d’un suivi quotidien avec une grille de score qui tient compte des différents signes de souffrance pour y remédier; 4) Injection du réactif pour imagerie, peut induire une doleur légère temporaire au cours de l’administration ; 5) Anesthésie volatile pour les techniques d'imagerie. Un petit groupe de souris sera concerné para les nuisances liées à la biopsie pour le génotypage : douleur temporelle de quelques secondes pendant le prélèvement sous anesthésie gazeuse.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées afin d'analyser les tumeurs d'un point de vue moléculaire et histologique.
Remplacement
Concernant les objectifs de ce projet, nous testerons certains gènes dans des modèles in vitro (culture d'hépatocytes immortalisés établis au laboratoire, lignées cellulaires, organoïdes de cellules de foie). Ces systèmes in vitro nous permettront de limiter nos études in vivo, en se focalisant sur les gènes candidats les plus pertinents, notamment ceux rapportés comme étant altérés chez les patients. Cette étape de validation in vivo, chez la souris, est indispensable pour valider dans un contexte physiologique l'implication des gènes candidats dans les processus de tumorigenèse et notamment dans des cas cliniques où leur altération a été décrite. En outre, l'analyse dans ce contexte in vivo est une étape obligatoire pour comprendre comment ces gènes influencent également l'environnement tumoral, notamment les cellules immunitaires.
Réduction
Dans cette étude, quand possible nous utiliserons l’imagerie in vivo (échographe) similaires aux appareils utilisés chez les patients, mais adaptés à la taille de notre modèle rongeurs. Ces imageries nous permettent de suivre l’évolution des animaux, en particulier la croissance tumorale, sur plusieurs semaines et de réaliser plusieurs types de mesures, ce qui nous permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire pour avoir des résultats utilisables. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé au maximum tout assurant des résultats statistiquement exploitables, nous avons calculé qu'un effectif maximum de 10 animaux par groupe serait suffisant pour les expérimentations d’efficacité et 6 animaux par groupe pour les expériences de toxicité. Le nombre d’animaux utilisés est déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Cet outil d’analyse statistique nous permet d’estimer le nombre d’animaux nécessaires, selon la variabilité des réponses obtenues. De plus, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses post-mortem sur les tissus récupérés (foie, tumeurs, poumons, rate, sang, moelle osseuse). En outre, nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues sur chaque animal en réalisant des analyses biologiques, biochimiques et histologiques sur le même animal. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux et du statut sanitaire des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats obtenus et de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Nous envisageons de mutualiser des groupes contrôles pour les différents tests, lorsque ce sera possible. Par exemple : 1) le groupe "plasmide contrôle" dans le cas où le même vecteur est injecté, 2) dans le cas d'injection
Raffinement
L'état de santé des souris sera quotidiennement surveillé ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour les prendre en charge. Des stratégies d’optimisation seront mises en place au cours du projet afin de garantir le bien-être chez l’animal. La formation et l'évolution des tumeurs sera suivie au cours du temps par imagerie non invasive. En cas de souffrance de l’animal, des analgésiques seront administrés. Tout signe et/ou comportement anormal sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent l’animal sera sorti du protocole. Les conditions d’hébergement classiques seront enrichies en alternance par afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypie.
Choix des espèces
Nos études nécessitent l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement puisque la thématique principale de notre laboratoire est de comprendre les mécanismes impliqués dans des étapes d'initiation et d'évolution du cancer. Les modèles animaux que nous utiliserons représentent des alternatives prometteuses pour obtenir des résultats plus pertinents en ce qui concerne la compréhension du cancer chez l'Homme. En particulier, les approches utilisées dans notre équipe, combinant des études in vitro avec des analyses in vivo réalisées chez la souris, permettent d'identifier de nouveaux gènes, leur implication dans le développement de tumeurs hépatiques, et de mettre en évidence des nouveaux mécanismes de coopération entre gènes, comme nous l'avons déjà démontré. Les souris seront utilisées au stade jeune (moins de 2 mois). Cet âge permet d'évaluer l'initiation et l'évolution tumorale dans des individus pédiatriques, pour récapituler le contexte de l’hépatoblastome.
Impact du cycle circadien sur les lésions et la fonction vasculaire post-accident vasculaire cérébral
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
48 souris vont être utilisées, chacune subissant deux chirurgies puis deux séances d'imagerie sous anesthésie en moins de vingt-quatre heures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les expérimentateurs leur provoquent un accident vasculaire cérébral par thrombus, avec pour suites annoncées une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels et un affaiblissement de la patte avant gauche. Le porteur revendique par ailleurs que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement et ne présentent aucun signe de douleur. Le bénéfice attendu tient en une phrase, acquérir des données fondamentales sur la physiopathologie de l'accident vasculaire cérébral, face à quarante-huit AVC provoqués et quarante-huit mises à mort.
Objectifs
Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, différents compartiments vont être séquentiellement touchés : le compartiment vasculaire sera immédiatement affecté, suite à la formation d’un thrombus qui induit in situ une diminution du débit sanguin cérébral (DSC). S’ensuit une perte de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et l’apparition de dommages parenchymateux. Plusieurs observations cliniques ou précliniques suggèrent que plusieurs rythmes biologiques, en particulier le cycle circadien influence la physiologie de la BHE et du parenchyme cérébral. De fait, cette sensibilité variable au cours de la journée pourrait impacter le devenir post-AVC. Ainsi, dans ce projet, nous allons caractériser l’influence du cycle circadien sur les altérations précoces du débit sanguin cérébral et la lésion cérébrale dans un modèle d’AVC thrombo-embolique. Ce projet s’inscrit dans une étude multicentrique, dans laquelle chaque laboratoire étudie l’impact du cycle circadien, sur le devenir histologique/fonctionnel chez la souris.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie de l’AVC et plus particulièrement sur l’impact du cycle circadien.
Procédures
Les animaux seront soumis à : 2 chirurgies : approche pré-opératoire et induction d’un AVC ischémique (sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 40 à 45 minutes) et 2 protocoles d’imagerie : imagerie ultrasonore en phase précoce post-AVC (sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 30 à 40 minutes) et IRM à 24h (sous anesthésie générale d'une durée de 20 à 25 minutes)
Impact sur les animaux
L’hébergement des animaux s’effectuera au moins 3 semaines avant le début des procédures pour leur habituation et la gestion de leur stress. Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient pour l’ensemble des procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels, un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer leurs tissus pour des analyses cytologiques et histologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale pour apporter un niveau de preuve suffisant. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié. Cette surveillance quotidienne permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun signe de douleur. Des points limites ont été définis et seront appliqués au cours du projet. Les animaux bénéficieront de toutes les bonnes pratiques vétérinaires.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les AVC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, des animaux adultes âgés de 8-9 semaines seront nécessaires.
Étude du rôle des cellules immunitaires innées dans la progression de la drépanocytose chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Jusqu'à quatre-vingt-dix gavages quotidiens, quinze injections, deux séjours de huit à vingt-quatre heures en cage métabolique et jusqu'à vingt-quatre heures dans une atmosphère appauvrie en oxygène : 1 825 souris vont subir ce protocole, toutes tuées à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur reconnaît que les crises vaso-occlusives provoquées chez ces souris entraînent des douleurs intenses et prolongées, comparables aux épisodes que vivent les personnes drépanocytaires. L'objet du projet est d'identifier des cellules immunitaires comme cibles thérapeutiques dans les complications rénales et cardiaques de la maladie. Le choix de souris de quatre semaines à six mois est justifié par l'absence de fibrose liée à l'âge, qui assurerait "une variabilité minimale des résultats expérimentaux".
Objectifs
La drépanocytose est une maladie génétique récessive causée par une mutation d’un gène, qui provoque une déformation des globules rouges. Cette pathologie entraine des complications rénales et cardiaques. Malgré les traitements actuels, les complications multiorganiques persistent. Des recherches récentes soulignent le rôle clé de certaines cellules immunitaires dans l’amplification des réponses inflammatoires, aggravant les lésions tissulaires et les dysfonctionnements des organes. Ce projet vise à explorer l’implication de ces cellules dans les complications liées à la drépanocytose et à évaluer leur potentiel en tant que cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes inflammatoires impliqués dans les complications aiguës et chroniques rénales et cardiaques de la drépanocytose. En se concentrant sur la contribution des cellules immunitaires, l’objectif est d’identifier des marqueurs pronostiques validés ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques capables de dépasser les limites des traitements actuels, en s’attaquant directement aux causes sous-jacentes des atteintes organiques associées à la drépanocytose. À terme, cette recherche pourrait contribuer à améliorer de manière significative les résultats cliniques et le bien-être global des patients atteints de cette maladie.
Procédures
- Biopsie de la queue : une seule biopsie de moins de 2 mm (10 secondes) réalisée sur une souris. - Prélèvement sanguin : un prélèvement sur souris vigile (durée environ 30 secondes) et deux prélèvements sur souris anesthésiées (durée environ 1 minute). - Mesure de la pression artérielle : deux mesures non invasives de 20 minutes sur souris vigiles pendant deux jours consécutifs. - Injections : 15 injections (une par jour) sur souris vigiles (environ 20 secondes par jour). - Administration orale : entre 15 et 90 administrations orales (une par jour) sur souris (environ 20 secondes par jour). - Administration par mini-pompes osmotiques : implantation sous-cutanée de pompes pour la délivrance continue du traitement (durée de la chirurgie : environ 5 minutes). - Séjour individuel dans des dispositifs métaboliques d’une durée de 8 à 24 heures, réalisé une à deux fois selon le protocole. - Exposition à une atmosphère hypoxique contrôlée : une à deux expositions d’une durée de 3 à 24 heures dans un environnement à faible teneur en oxygène.
Impact sur les animaux
Les souris ressentiront des douleurs légères et de courte durée à la suite de la biopsie de la queue et de la mesure de la pression artérielle. - Elles subiront également le stress d’un confinement individuel dans des cages métaboliques pendant une durée de 8 à 24 heures. - L’administration par voie orale, le prélèvement sanguin et les injections leur causeront une douleur légère et de courte durée ou un inconfort minime au site d’injection. -Douleurs modérées et de courte durée après chirurgie pour la pose de la pompe osmotique. - Les crises vaso-occlusives, qui reproduisent les complications aiguës observées dans le contexte de la drépanocytose, provoquent des douleurs intenses et prolongées, comparables aux épisodes douloureux sévères ressentis chez les patients drépanocytaires. - L’administration par voie orale quotidien entraînera un certain inconfort chez les souris, mais cette technique sera réalisée à l’aide de sondes d’alimentation en plastique polypropylène, afin de minimiser les risques de lésions œsophagiennes.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et d’analyser les reins, le cœur et le foie.
Remplacement
Le modèle animal permet d’étudier la physiopathologie rénale, cardiaque et hépatique en tenant compte de l’ensemble des paramètres physiologiques présents chez un organisme vivant. Les approches in vitro ou in silico ne peuvent pas reproduire cette complexité, notamment les interactions entre les vaisseaux sanguins et le système immunitaire, ce qui les rend peu pertinentes pour comprendre ces mécanismes.
Réduction
Le nombre minimum d'animaux requis est calculé sur la base d'un plan expérimental permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire pour obtenir des conclusions biologiquement pertinentes. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque animal, un maximum d’organes et d’échantillons biologiques sera prélevé afin d’éviter la répétition des expériences sur de nouveaux animaux. Ces tests statistiques sont adaptés à la taille de nos échantillons. Les accouplements sont optimisés pour obtenir les animaux d’intérêt avec le meilleur rendement possible.
Raffinement
Plusieurs mesures seront prises pour réduire le stress, l’anxiété et la souffrance des animaux : 1/ Des points limites clairs et stricts, spécifiques au projet, ainsi qu’un système de notation de la douleur ont été définis pour surveiller le bien-être des animaux et permettre une intervention si nécessaire. 2/ Pour limiter la douleurs, des prélèvements seront effectués sous anesthésie, des analgésies sont prévues pour traiter la douleur.
Choix des espèces
Le modèle souris est essentiel pour étudier les pathologies rénales, cardiaques et hépatiques, car il reflète la complexité de l’organisme vivant que les modèles in vitro ou in silico analyses ne peuvent pas reproduire. Les souris âgées de 4 semaines à 6 mois sont idéales, car elles ont dépassé le sevrage physiologique et ne sont pas encore à un âge où une fibrose des organes (rein, cœur, foie, etc.) pourrait se développer en raison de facteurs liés à l'âge pendant la drépanocytose, ce qui permet d’assurer une variabilité minimale des résultats expérimentaux.
Evaluation de l’effet protecteur d’émulsions lipidiques enrichies en acides gras polyinsaturés dans un modèle murin de péritonite
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une injection d'endotoxine bactérienne dans l'abdomen sur animal vigile, puis une ponction dans le cœur sous anesthésie gazeuse : les gestes infligés à chaque souris tiennent en trente-cinq secondes. 456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 336 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau sévère. À forte dose, le produit injecté provoque fièvre, hypothermie, hypotension et faiblesse musculaire, jusqu'à la mort, pour tester si une émulsion lipidique enrichie en acides gras polyinsaturés limite les effets d'une péritonite. Vingt souris par groupe sont prévues spécifiquement pour l'étude de l'atteinte des points limites, alors que le porteur ne retient de l'injection que "de faibles douleurs, de courte durée".
Objectifs
Les inflammations généralisées associées à une infection grave constituent 1/3 des décès à l’hôpital et sont causées, dans un grand nombre de cas, par des péritonites : infections originaires de la cavité abdominale. La plupart des péritonites sont dues à des bactéries libérant de puissants activateurs de l’inflammation : les lipopolysaccharides (LPS, endotoxines). Les LPS présents dans la cavité péritonéale passent rapidement dans la circulation, déclenchant une réaction inflammatoire incontrôlée. Les lipoprotéines, dont le rôle est de transporter les lipides (cholestérol, triglycérides) dans la circulation, ont la capacité de lier, neutraliser et détoxifier les LPS circulants. L’association entre LPS et lipoprotéines est favorisée par la protéine de transfert des phospholipides (PLTP). Notre groupe a pu démontrer dans des expériences préliminaires que l’inactivation des LPS par les lipoprotéines sous l’effet de la PLTP peut avoir lieu encore plus précocement : dans la cavité péritonéale, avant que les LPS n’aient pu rejoindre la circulation. De nombreux patients en soins intensifs sont placés sous nutrition parentérale, permettant l’apport de nutriments par voie intraveineuse. Les gouttelettes lipidiques présentes dans ces émulsions possèdent des propriétés similaires à celles des lipoprotéines. Dans un projet précédent, notre équipe a pu montrer que l’Intralipide, émulsion riche en acides gras poly-insaturés oméga 6, en présence de PLTP, réduit partiellement la mortalité chez les souris sans toutefois diminuer l’inflammation. Néanmoins, il existe plusieurs formulations d’émulsions lipidiques différant par leur composition en acides gras et notamment des versions enrichies en oméga-3. De manière importante, les oméga-3 et oméga-6 peuvent moduler la réponse inflammatoire. De plus, certains travaux ont montré que la PLTP a la capacité de moduler la distribution des acides gras dans la circulation. Ce projet vise donc à comparer l’impact des émulsions enrichies en oméga-3 ou oméga-6 sur les effets délétères des LPS dans un modèle de péritonite chez la souris. La réponse inflammatoire et le temps d’atteinte des points limite suite à l’injection de LPS dans la cavité péritonéale seront comparés chez des souris type sauvage (PLTP active) et des souris génétiquement modifiées dépourvues de PLTP active (souris PLTPKO), supplémentées ou non en émulsion.
Bénéfices attendus
Environ 6 millions de personnes meurent d’une infection chaque année dans le monde, et le taux de mortalité dans le cas d’une infection liée à une péritonite est d’environ 50%. A ce jour, aucun traitement ne s’est avéré efficace pour résoudre l’inflammation sévère liée à l’endotoxémie (présence de LPS) et au sepsis. Le présent projet, basé sur de premiers résultats prometteurs avec une première émulsion, permettra de déterminer si l’utilisation en voie intrapéritonéale d’une émulsion lipidique optimisée pour sa composition en acides gras anti-inflammatoires pourrait constituer un moyen efficace de limiter les effets délétères de l’endotoxémie liée à une péritonite.
Procédures
Injection intrapéritonéale sur animaux vigiles : 1 (5 secondes) Prélèvement intracardiaque sans chirurgie, sous anesthésie gazeuse : 1 (30 secondes)
Impact sur les animaux
De faibles douleurs, de courte durée, peuvent être occasionnées lors de l’injection intrapéritonéale. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur souris vigiles sous contention manuelle, ce qui peut engendrer un stress transitoire le temps de la manipulation (moins d’une minute). L’injection intrapéritonéale de LPS peut entrainer les effets suivants : - A faible dose : état fébrile transitoire d’environ 4 heures (fatigue, tremblements) - A forte dose : syndrome d’inflammation systémique aiguë (fièvre, hypothermie, hypotension, faiblesse musculaire) pouvant déboucher sur la mort de l’animal dans les cas les plus sévères. Cette condition associée à une classe sévère fera l’objet d’une attention particulière pour les points limites.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Notre étude exclut l’utilisation de modèles in vitro ou d’animaux dont l’anatomie, le système circulatoire et immunitaire sont trop éloignés de celui des mammifères. En particulier, la présence d’un compartiment péritonéal est ici cruciale pour étudier l’influence de l’injection des émulsions, des lipoprotéines et de la protéine de transfert des phospholipides (PLTP) dans ce même compartiment afin de voir leur effet au niveau local, où s’accumulent les LPS au cours d’une péritonite. Nous utiliserons le plus petit modèle de mammifère, la souris, en tirant parti de l’existence d’un modèle génétiquement modifiées dépourvues de PLTP active (PLTPKO), disponible et déjà utilisé par notre équipe.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables, le projet requiert : - 7 animaux par groupe pour les études cinétiques sur 24h. Ces animaux seront mis à mort à l’issue de leur unique prélèvement sanguin par ponction intracardiaque sous anesthésie gazeuse, ceci afin de récupérer un volume maximum de sang. - 20 souris par groupe pour l’étude d’atteinte des points limite.
Raffinement
Le génotypage des souris sera effectué à partir de prélèvement de follicules pileux, cette méthode étant non douloureuse et non invasive pour les animaux en comparaison des méthodes classiques de prélèvement de tissus. Les deux injections intrapéritonéales (LPS et émulsion lipidique) seront réalisées sur animaux vigiles sous contention manuelle. Une crème antidouleur sera appliquée localement au site d’insertion de l’aiguille. Pour les animaux ayant reçu la dose élevée de LPS, des points limites spécifiques seront déterminés. Ces animaux seront en état de syndrome inflammatoire sévère et peuvent présenter des difficultés à boire et se nourrir. L’utilisation de nourriture hydratée placée directement dans les cages permettra un accès facilité à la nourriture et à l’eau. La prise en charge de la douleur chez ces animaux sera faite par ajout d’un antidouleur morphinique mélangé à l’eau de boisson ainsi qu'à la nourriture tout au long de la période d’étude. Le prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque (sans chirurgie) se fera sous anesthésie gazeuse. La souris sera maintenue à 37°C à l’aide d’un plateau chauffant le temps de la ponction. De la crème antidouleur sera appliquée localement sur le site d’insertion de l’aiguille. L’animal sera ensuite immédiatement mis à mort avant réveil.
Choix des espèces
Espèce (souris) : Les souris type-sauvage présentent une forte activité PLTP. Les souris déficientes en PLTP sont disponibles pour notre équipe de recherche. Elles constituent un bon modèle d’activité PLTP faible, comme observé dans de nombreux cas de sepsis chez l’Homme. L’espèce souris présente ainsi une bonne alternative à l'expérimentation sur d'autres espèces de mammifères dont la maintenance est plus laborieuse. Stade adulte (2 à 5 mois) : La réponse inflammatoire chez la souris est affectée par l’âge ce qui se traduit par une certaine tolérance aux endotoxines, l’installation d’une inflammation chronique et une diminution de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires d’où la nécessité d’utiliser des animaux plutôt jeunes et d’âge homogène.