Procédures sévères

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une première chirurgie abdominale avec réveil de quarante minutes, six heures d'hypoxie reproduisant les conditions d'un vol long-courrier, puis une seconde chirurgie sans réveil pour prélever le caillot et le sang, certains groupes recevant en plus un gavage quotidien ou des injections répétées. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des douleurs après le réveil, une perte temporaire de mobilité et un stress accru, les souris génétiquement modifiées présentant un risque de saignement plus important. Il affirme que l'étude in vitro des plaquettes et des cellules endothéliales ne reproduit pas l'intégralité du vaisseau sanguin, ce qui fait à ses yeux de la souris un "modèle de choix" pour la thrombose veineuse.

Objectifs

Nous cherchons à comprendre comment se forment les caillots dans les veines, en comparant des conditions qui ressemblent à un voyage en train et à un vol long-courrier. Nos premiers résultats montrent que l’avion favorise la formation de thromboses, notamment par l’activation des plaquettes grâce à leur production d’énergie. Nous avons aussi observé que certains globules blancs ne participent pas au tout début, mais seulement après deux jours. Avec ce projet, nous voulons suivre plus finement l’évolution du caillot et la réaction de la paroi des veines. L’objectif est de mieux cibler les traitements pour prévenir les thromboses tout en limitant les risques de saignement.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de caractériser les étapes de formation et de lyse du thrombus en présence de l’endothélium. Cela permettra à long terme de prescrire aux patients une drogue pertinente en fonction des cellules intervenant en premier sur le site a de faibles doses pour éviter la comorbidité la plus commune le saignement.

Procédures

Les animaux sont dans un premier temps soumis à une chirurgie abdominale avec réveil de 40 minutes. Puis en fonction des lots; (à 6h, 24h, 48h,72h ou 96H) à une deuxième chirurgie ( 15 minutes) qui cette fois est sans réveil permettant le prélèvement du thrombus et du sang. Les deux chirurgies ainsi que les prélèvements ne sont réalisés qu'une seule fois par animal. Les differents lots sont exposés entre les deux chirurgies à 6 heures d'hypoxie ou de normoxie. Un groupe d’animaux pourra etre soumis à du gavage sur 3 jours à raison d’une fois par jour, ou a une injection en intraveineux ( 2 fois au total) ou en intra peritonéal (Une fois par jour durant 5 jours maximum).

Impact sur les animaux

Cette procédure est une procédure avec réveil et nécessite une chirurgie abdominale qui peut engendrer des douleurs post-opératoires les heures suivants le réveil des animaux. Les animaux du groupe test exposés aux conditions d'hypoxie hypobare après la chirurgie peuvent perdre temporairement un peu de mobilité et avoir une augmentation du stress. Enfin, les animaux génetiquement modifiés ainsi que ceux traités avec la molécule x présenteront des risques de saignements plus importants pendant la chirurgie que les souris wild type.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure après prélèvement sanguin et prélèvement de caillot sanguin.

Remplacement

A ce jour l’étude in vitro des neutrophiles, des plaquettes et des cellules endothéliales ne permet pas à elle seule de reproduire l’intégralité du vaisseau sanguin. De plus, l'induction de l'hypoxie à l'échelle cellulaire ne reproduit pas la complexité des pathologies thrombotiques veineuses auxquelles sont exposés les passagers d’un avion.

Réduction

Le nombre d’animaux annoncé a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats significatifs avec un risque de premier espèce égale à 5%. Dans le cas où une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant l’utilisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d’expérimentations supplémentaires. L’analyse du thrombus et des composés sanguins sera réalisée dans les mêmes animaux afin de respecter la règle des 3R (Reduction). Nous réitèrerons pas les groupes dont nous avons déjà réalisés l’étude du thrombus (40 souris en moins sur la totalité de l’etude).

Raffinement

Les animaux seront utilisés 4 jours après leur arrivée dans l'animalerie pour leur laisser le temps de s'acclimater. Afin de limiter le stress, les animaux seront transférés 24h avant la chirurgie dans la cage qui les hébergera tout le long de la procédure. Nous disposerons dans cette cage de l’enrichissement de type « Nestlets » qui correspond à des nids végétaux à base de fibres de coton. Ceci aura pour but de les habituer à leur nouvel habitat et de les acclimater à la prise d'eau gélifiée. Au cours de la chirurgie, les animaux suivants attendront dans une pièce d’hébergement afin de ne pas être perturbé par la chirurgie en cours. Les animaux seront opérés sur un tapis chauffant (39°C) afin de maintenir leur température pendant la chirurgie. Pour améliorer les conditions de réveil, les animaux seront placés sur une bouillotte dans la cage pour les maintenir au chaud. Une surveillance accrue sera réalisée après la chirurgie toute la durée de l’expérimentation (6H à 96h) ainsi que pendant l'exposition à l'hypoxie hypobare pour le groupe concerné pour évaluer le bien-être des animaux et détecter rapidement tout signe de souffrance. Une première dose de d’analgésique sera administrée aux animaux 30 minutes avant la chirurgie et une deuxième dès la fin de la chirurgie. Une troisième dose est injectée à la fin de la journée afin de limiter les douleurs durant la nuit. Nous disposerons en plus dans la boîte d’hébergement de l’eau gélifiée contenant un analgésique pour que les animaux y est accès tout au long de la nuit. Le lendemain matin, une dernière injection est réalisée avant de placer les souris en normoxie normobare ou en hypoxie hypobare (sauf pour le groupe de 6h qui aura déjà été euthanasiés). En cas de signes de douleurs chez un animal une nouvelle injection de lui sera administré. Si une souris montre des signes de douleur ou de difficultés à se déplacer, des soins supplémentaires sont administrés. En l’absence d’amélioration rapide, l’animal est euthanasié pour éviter toute souffrance prolongée. De même, si une souris ne réagit plus aux stimulations, elle est immédiatement euthanasiée.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix de thrombose veineuse et reproduit au mieux les mécanismes de thrombose présents chez l'humain. Les animaux sont utilisés entre 5 et 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire et vasculaire fonctionnel et mature.

Les rats Wistar mâles sont retenus parce qu'ils réagissent plus fortement que d'autres lignées aux chocs électriques inévitables et émettent des vocalisations de détresse à 22 kHz plus régulières. 220 d'entre eux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun reçoit une série de chocs de 1 mA d'une demi-seconde destinés à installer un état de stress post-traumatique, une ou deux injections de composés psychotropes, puis passe le test du champ ouvert, un test de reconnaissance d'objet et un enregistrement de ses vocalisations ultrasonores. Tous sont tués à la fin, le porteur expliquant que les substances administrées créent des adaptations dans le cerveau qui interdisent de les réutiliser.

Objectifs

Le trouble de stress post-traumatique est une réponse anormale à un traumatisme, qui touche une part importante de la population. Dans de nombreux cas, ce trouble est associé à d'autres pathologies psychiatriques, comme la dépression, ce qui complique sa prise en charge. Il est souvent décrit comme un dysfonctionnement de la mémoire, où le souvenir du traumatisme reste envahissant au lieu de s’atténuer naturellement. Les traitements actuels, notamment les antidépresseurs classiques, restent souvent peu efficaces, en particulier chez les patients souffrant de comorbidité. Face à ces limites, de nouvelles approches thérapeutiques sont explorées. Certaines substances agissant sur la plasticité cérébrale ont montré des effets prometteurs sur les symptômes du trouble de stress post-traumatique et de la dépression associée, notamment lorsqu’elles sont utilisées à faibles doses et en complément d’un accompagnement psychothérapeutique. Dans ce contexte, notre projet vise à étudier deux composés innovants susceptibles de favoriser la récupération après un traumatisme psychologique, sans provoquer d'effets indésirables majeurs. Nous utiliserons un modèle animal de trouble de stress post-traumatique afin de mieux comprendre les mécanismes en jeu et d’évaluer l’efficacité de ces composés.

Bénéfices attendus

Le trouble de stress post-traumatique est une réponse pathologique à un traumatisme, qui touche une part importante de la population. Dans la majorité des cas, il est associé à d’autres troubles psychiatriques, notamment la dépression, ce qui aggrave le pronostic et rend la prise en charge plus difficile. Ce trouble est souvent lié à un dysfonctionnement de la mémoire : le souvenir du traumatisme reste intense et persistant, au lieu de s’atténuer avec le temps. Les traitements actuels, principalement les antidépresseurs, ne sont pas toujours efficaces, en particulier chez les patients présentant une dépression comorbide. Cela souligne l’importance de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Certaines substances capables de stimuler la plasticité cérébrale ont montré des effets encourageants sur les symptômes résistants du trouble de stress post-traumatique et de la dépression associée, notamment lorsqu’elles sont utilisées à faibles doses et en complément d’une prise en charge psychothérapeutique. Notre projet vise à évaluer deux composés innovants susceptibles de favoriser la récupération après un traumatisme, en agissant sur les mécanismes de plasticité neuronale, sans provoquer d’effets secondaires majeurs. Nous utiliserons pour cela un modèle animal de trouble de stress post-traumatique, afin d’étudier leur efficacité et de mieux comprendre leur mode d’action. Les résultats seront également comparés à ceux obtenus avec un traitement de référence.

Procédures

Les rats seront tout d’abord exposés, ou non selon le groupe expérimental, à une session de stimuli inévitables, de faible intensité, destinés à induire un stress dans le cadre d’un modèle validé de trouble de stress post-traumatique. Cette session constitue l’étape de conditionnement au stress. Par la suite, les animaux recevront des injections de substances actives par voie intra-péritonéale et/ou sous-cutanée. Ces administrations seront réalisées sur des animaux vigiles (non anesthésiés), dans des conditions de contention manuelle douce. Chaque injection impliquera une contention brève, d’une durée estimée entre 10 et 20 secondes. Selon le groupe, les animaux recevront une à deux injections, à des temps définis (par exemple : immédiatement après le stress, ou après un délai de 24 à 48 h dans le cadre de l’évaluation d’un effet différé). Enfin, les animaux effectueront des tests comportementaux : a) le test du champ ouvert avec une durée de session de 5 minutes, b) le test de la reconnaissance d’objet avec une durée de session de 5 minutes, 3) le test de vocalisations ultrasonores avec une durée de session de 7 minutes. L’ensemble de ces interventions est conçu pour limiter le stress additionnel et garantir des conditions d’expérimentation reproductibles, tout en respectant le bien-être animal. Un suivi quotidien sera effectué afin de surveiller l’état de santé des animaux après chaque manipulation.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions selon les groupes expérimentaux, chacune étant associée à un niveau de nuisance spécifique : Stimuli inévitables : Tous les rats recevront une série de stimuli électriques brefs (1 mA, 0,5 sec) dans le cadre du protocole de stress. Cette procédure entraîne un stress modéré à intense, de courte durée, sans séquelle physique. Injections intra-péritonéales et/ou sous-cutanées : Tous les animaux recevront une à deux injections, nécessitant une contention manuelle douce d’environ 10 à 20 secondes. Ces injections induisent une douleur légère et transitoire liée à la piqûre. Administration de substances psychotropes : Certains rats recevront des composés ayant un effet sur le système nerveux central. Cela peut entraîner un inconfort passager, observé par des comportements typiques comme les head twitches, sans conséquence durable. Tests comportementaux (champ ouvert, reconnaissance d’objet, vocalisations ultrasonores) : Ces épreuves consistent à placer les animaux dans des environnements nouveaux. Elles induisent une légère anxiété transitoire, sans manipulation douloureuse ni contrainte physique. Toutes ces interventions seront réalisées dans le respect du bien-être animal, avec une surveillance quotidienne et des critères d’arrêt prédéfinis si une souffrance est détectée.

Devenir

La totalité des animaux seront mis à mort car l'administration des médicaments créant des neuro-adaptations, les animaux ne peuvent pas être réutilisés.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de développer de nouveaux médicaments contre le trouble de stress post-traumatique destinés à un usage chez l’humain. L’étude préclinique doit donc inclure une administration chez l’animal entier, d’autant plus que les effets comportementaux de ces composés ne peuvent être évalués que chez un animal vigile. Des approches in vitro sont déjà mises en œuvre au laboratoire (évaluation de la neurogenèse, de la synaptogenèse, et électrophysiologie in vitro). Toutefois, le recours à des modèles complexes, c’est-à-dire à des animaux vivants, demeure indispensable pour analyser les réponses antidépressives induites par de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été défini avec rigueur, dans une démarche éthique visant à concilier la robustesse scientifique et la réduction du nombre d’animaux. Les groupes expérimentaux sont constitués de 10 rats chacun. Cet effectif a été déterminé par une approche statistique et sur la base de nos travaux antérieurs et des données disponibles dans la littérature pour ce type de modèle. Il permet d’obtenir des résultats fiables et reproductibles, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux impliqués. Cette estimation prend en compte la variabilité attendue des réponses physiologiques et comportementales mesurées, afin de garantir la validité des conclusions sans sureffectif inutile. Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum nécessaire pour assurer la validité statistique des résultats, déterminé sur la base de publications antérieures et selon les recommandations du test de puissance de Dupont & Plummer, avec une puissance statistique de 0,90 et un risque alpha de 0,05. Cette méthodologie garantit la fiabilité des résultats tout en respectant les principes éthiques de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. Conformément aux exigences réglementaires, chaque cage sera équipée d’un enrichissement standard comprenant trois éléments : un nid végétal à base de fibres de coton, un abri teinté de type igloo, et un bâtonnet en bois à ronger. En cas de difficulté alimentaire, notamment à la suite de procédures stressantes ou de traitements susceptibles d’entraîner une baisse transitoire de l’appétit, une solution de substitution sera proposée sous forme de blédine, accessible dans une coupelle placée directement dans la cage. Les animaux seront observés quotidiennement, avec une attention particulière portée à leur apparence physique externe ainsi qu’à d’éventuels changements comportementaux. Des points limites seront définis à l’avance pour anticiper toute souffrance inutile. En cas de douleur, le vétérinaire référent examine l’animal et instaure en première intention un traitement par Metacam®, et si celui-ci s’avère insuffisant ou que l’état clinique l’exige, un antalgique plus puissant comme le Buprécare® peut être prescrit avec un suivi rapproché. La méthode utilisée associera une anesthésie générale profonde (kétamine + xylazine) à une injection d’Euthasol®.

Choix des espèces

Le choix du rat Wistar comme espèce modèle repose sur sa large utilisation en neurosciences et en biologie psychiatrique. Ce modèle est bien caractérisé, robuste, et permet une transposition pertinente des mécanismes étudiés à l’humain. Les rats Wistar sont spécifiquement privilégiés pour les expériences impliquant l’épreuve de peur conditionnée (chocs inévitables) et l’émission des vocalisations ultrasonores à 22 kHz, car ils présentent un profil de réponse émotionnelle plus marqué que d’autres lignées. Tous les animaux utilisés seront des mâles adultes, âgés d’environ 8 semaines au début des procédures. Le choix de ce stade de développement est justifié par une meilleure stabilité comportementale et hormonale, ainsi que par une correspondance avec les populations adultes humaines, principalement concernées par les traitements psychotropes. L’utilisation de mâles uniquement vise à limiter la variabilité induite par le cycle ovarien et présentent des schémas vocaux plus robustes et constants, ce qui les rend mieux adaptés aux tests standardisés en neuroscience sociale et affective.

Construire une souris porteuse de lymphome, puis y observer l'effet de cellules CAR-T sur les microbiotes pulmonaire et intestinal: 96 souris mâles de six semaines sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées au vingt-huitième jour. Irradiées aux rayons X la veille de l'injection des cellules tumorales, elles subissent trois prélèvements sanguins, des prélèvements de selles tous les deux jours et trois séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur prévoit une fatigue, une perte d'appétit, une perte de poids, puis dans les cas avancés une faiblesse ou une paralysie. Il présente ce travail comme le moyen d'être "les pionniers" de ce type de modèle et d'initier un programme de plus grande envergure déposable dans des appels à projets nationaux.

Objectifs

Les immunothérapies à base de cellules génétiquement modifiées pour reconnaitre spécifiquement la tumeur a récemment révolutionné la prise en charge de certains cancers hématologiques. Néanmoins, les effets secondaires comme des infections pulmonaires sont nombreux chez les patients traités par ces celluels et conditionne l’efficacité du traitement et le pronostic vital du patient. A ce jour, aucune étude expérimentale n’a été réalisée et les mécanismes physiopathologiques sous-jacents restent méconnus. L’ambition de ce projet est de développer un modèle murin de lymphome afin d’étudier l'efficacité des cellules thérapeutiques et leurs interactions avec les microbiotes pulmonaire et intestinal. Pour cela, des souris seront ayant développées un lymphome seront traitées par ces cellules. Les objectifs sont i) de valider l'efficacité d'un traitement par ces cellules et 2) d’étudier l’impact de ce traitement sur la composition des microbiotes pulmonaire et intestinal et l'emergence de bactéries nocives . Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet a deux effets levier majeurs. Le premier est expérimental puisque le projet a pour objectif de développer un modèle murin pour évaluaer l'efficacité d'un nouveau traitement d'immunothérapie à base de cellules génétiqument modifiées pour reconnaitre directement la tumeur et nous permettra ainsi d’être les pionniers dans la conception de ce type de modèle expérimental. Le deuxième levier majeur est clinique puisque le projet visant à étudier les interactions entre les ces cellules génétiquement modifiées et les bactéries du microbiote a pour but générer des nouvelles pistes thérapeutiques et améliorer la prise en charge des patients traités par ce type d'approche. Ainsi, les données acquises lors de ce projet permettront d’initier un programme de plus grande envergure qui pourra faire l’objet d’un dépôt dans le cadre d’appels à projets nationaux

Procédures

Les interventions suivront un calendrier précis sur une période de 28 jours. Jour -1 :Les animaux recevront une courte exposition aux rayons X dans le but de préparer le modèle expérimental (Laboratoire de Physique de Clermont rattaché à EU1). Cette étape dure quelques minutes et ne provoque qu’une gêne transitoire. Jour 0 : Une injection sera réalisée afin d’induire le développement de la tumeur (EU1). L’intervention est rapide et effectuée sur des animaux vigiles, avec manipulation douce et réchauffement préalable pour limiter le stress. Jour 2 : Une seconde injection sera réalisée pour administrer les cellules thérapeutiques ou de contrôle (EU1). Suivi du jour 0 au jour 28 : Des prélèvements de sang seront réalisés trois fois (EU1) au cours de l’étude pour suivre la réponse biologique. Des prélèvements de selles seront effectués tous les deux jours pour l’analyse du microbiote (EU1). Une surveillance clinique quotidienne (poids, aspect du pelage, activité, comportement) permettra de détecter précocement tout signe de souffrance (EU1). Des séances d’imagerie non invasives auront lieu à trois reprises (jours 7, 14 et 21)(EU2). Ces examens nécessitent une anesthésie courte (EU2) . Après chaque séance, les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil complet puis replacés dans leur hébergement habituel (EU1). Jour 28 : Les animaux seront euthanasiés (EU1) selon les méthodes réglementaires, afin de permettre la collecte des organes nécessaires aux analyses prévues.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient ressentir un léger stress ou une gêne passagère liés aux manipulations, aux anesthésies courtes ou aux déplacements nécessaires aux observations. Ces effets sont temporaires et limités grâce à l’utilisation de cages adaptées, au suivi attentif du personnel et à des conditions d’hébergement confortables. La maladie induite par la tumeur peut provoquer une fatigue, une baisse de l’appétit, une perte de poids ou une diminution de l’activité. Dans les cas plus avancés, une faiblesse ou une paralysie peuvent apparaître. Les animaux seront observés chaque jour afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de détresse. Si nécessaire, un traitement adapté sera administré ou l’animal sera retiré de l’étude pour éviter toute souffrance prolongée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélements d'organes (poumons, intestins, foie, rate), du sang et du liquide broncho-alvéolaire et permettre des analyses immunologiques afin d'étudier l'efficacité des cellules thérapeutiques. Des analyses microbiologiques seront également effectuées par l'analyse de la composition des microbiotes dans le poumons et l'intestin.

Remplacement

Notre approche expérimentale a inclus une première analyse in vitro avec des co-cultures entre les cellules de lymphomes, les cellules genetiquement modifiées pour reconnaitre directement la tumeur mais elle reste largement insuffisante pour analyser l’efficacité du traitement par ce type d'immunothérapie, car elle n’englobe que très partiellement la complexité de l’in vivo. Le modèle murin utilisé permettra de reproduire fidèlement dans un organisme complexe le protocole d’immunothérapie par cellules modifiées qui est proposé aux patients atteints de lymphome et ainsi comprendre l’impact sur les microbiotes pulmonaire et intestinal dans ce modèle en caractérisant les effets directes (perte d’efficacité du traitement, resistance au traitement,…) mais également les effets indirectes (modification des microbiotes pulmonaire et intestinal, émergence de pathobiontes, inflammation…)

Réduction

Des tests in vitro préalables (co-cultures lymphome/cellules génétiquement modifiées pour reconnaitre la tumeur) ont permis de limiter le recours aux animaux. Le nombre d’animaux in vivo a été calculé à partir d’analyses statistiques afin d’obtenir des résultats significatifs avec des lots de taille minimale (8 souris/lot, 3 répétitions). Chaque animal sera exploité au maximum (prélèvements multiples d’organes et fluides) afin d’optimiser l’information obtenue et réduire le nombre total nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies avec un enrichissement de milieu varié (rouleaux en carton, coton pour nidification, matériaux à ronger) permettant l’expression des comportements naturels et la réduction du stress.En fonction de l’état clinique des animaux et de la progression tumorale, l’enrichissement sera adapté individuellement : raccourcissement ou retrait partiel des tubes en carton pour faciliter les déplacements en cas de mobilité réduite ;déplacement de la nourriture et de l’eau vers la zone la plus accessible ;utilisation de nourriture humidifiée ou émiettée et de gels hydratants pour maintenir la prise alimentaire et limiter la déshydratation ;ajout de matériaux de confort (nids de coton compactés) pour réduire la fatigue. Une surveillance quotidienne sera assurée (pesée, l’évaluation de l’activité, du comportement, de la posture, du pelage et de la respiration). Ces observations seront consignées dans une grille de scoring clinique spécifique au modèle de lymphome. Tout signe de souffrance ou de douleur déclenchera l’administration d’un traitement antalgique .En cas de non-amélioration, l’animal sera immédiatement euthanasié afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les transports entre EU1 et EU2 sont de très courte durée (5 minutes). Les animaux sont déplacés dans des cages dédiées, enrichies et placées dans des cartons opaques. Ces mesures minimisent les stimuli stressants. Les trajets sont limités au strict nécessaire, réalisés par du personnel formé, avec surveillance clinique avant et après déplacement et établissement d’un certificat de transport. Les animaux regagnent leur hébergement immédiatement après chaque procédure.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des souris mâles de 6 semaines, pesant environ 20 g. À cet âge, le système immunitaire est pleinement mature et fonctionnel, avec des populations lymphocytaires diversifiées et un microbiote intestinal stabilisé. Cette espèce est adaptée à l’étude des lymphomes car des lignées de cellules B tumorales y sont disponibles, et des protocoles établis permettent la modification génétique des lymphocytes T pour générer les cellules thérapeutiques in vitro. Le choix du sexe mâle est motivé par deux raisons principales : Comparabilité avec nos travaux antérieurs, déjà réalisés chez des mâles, ce qui garantit la cohérence et la continuité des données. Prépondérance masculine décrite dans les lymphomes, ce qui confère une pertinence scientifique et permet de limiter le nombre d’animaux en évitant la duplication des expériences sur les deux sexes (principe de réduction).

Une souris qui ne réagit plus à un stimulus, ou qui reste inactive dans sa cage plus de six heures, est mise à mort. 630 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Génétiquement modifiées pour le métabolisme des lipides et soumises à un régime riche en graisses prolongé, elles développent une dysfonction de la valve aortique, subissent une biopsie du cartilage de l'oreille au sevrage, trois jours d'injections et une anesthésie gazeuse à chaque échocardiographie. Le porteur écrit que le modèle qu'il cherche à mettre au point a déjà été décrit par d'autres équipes, et repousse le calcul de puissance statistique à l'après-mise au point, sans justifier l'effectif de départ.

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre au point un modèle murin de maladie valvulaire cardiaque appelée rétrécissement aortique calcifié. Cette pathologie se caractérise par un épaississement puis une calcification progressive de la valve aortique, limitant son ouverture et compromettant son étanchéité. Ce modèle permettra de mieux comprendre les mécanismes de développement de la maladie et d’évaluer l’efficacité de traitements pharmacologiques, actuellement inexistants.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra, dans un premier temps, de mettre au point chez la souris un modèle de rétrécissement aortique calcifié (RAC), déjà décrit par d’autres équipes, qui pourra ensuite être utilisé pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement du RAC, ainsi que pour évaluer le bénéfice potentiel de traitements pharmacologiques de cette pathologie in vivo. Dans un second temps, nous étudierons l’implication de l’activité de d'une enzyme dans différents types cellulaires (cellules endothéliales valvulaires, cellules inflammatoires, etc...), grâce à l’utilisation de modèles de souris génétiquement modifiées (OGM) au cours du développement du RAC. Nous espérons ainsi, si les résultats obtenus sont encourageants, proposer une nouvelle stratégie de ciblage pharmacologique de l’enzyme, spécifique aux cellules inflammatoires, pouvant constituer une approche innovante pour limiter la progression du RAC chez l’Homme.

Procédures

Biopsie du cartilage auriculaire externe de 2mm au moment du sevrage. Injections quotidiennes durant 3 jours. Anesthésie gazeuse lors de chaque échocardiographie.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons, si notre modèle s’avère fonctionnel, à observer des signes de dysfonction cardiaque — notamment une augmentation du gradient transvalvulaire — et plus particulièrement de la valve aortique pendant plusieurs jours, évalués par échocardiographie. Cette dysfonction pourrait entraîner chez l’animal un état de fatigue, notamment à l’effort pendant plusieurs minutes. L’injection de la molécule induisant la délétion pourrait également provoquer des rougeurs, des douleurs ou une inflammation abdominale pendant quelques minutes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de cette étude.

Remplacement

Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro, car l’objectif de cette étude est de mettre au point un modèle murin de rétrécissement aortique calcifié (RAC), inexistant à ce jour.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons de manière séquentielle des mesures non invasives de la fonction cardiaque (échocardiographie). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation et de mutualisation des prélèvements réalisés au moment de la mise à mort pour les analyses ex vivo. Ainsi, les tissus prélevés pour chaque animal seront congelés, broyés puis réduits à l’état de poudre, afin d’être répartis pour différentes analyses : lipidomiques, protéiques et moléculaires. De cette manière, un seul animal sera utilisé pour l’ensemble de ces analyses ex vivo, en lieu et place d’un animal dédié à chacune des méthodes. À l’issue de la phase de mise au point du modèle animal, nous ajusterons le nombre d’animaux nécessaires aux procédures suivantes à l’aide d'un calcul de puissance statistique, afin d’optimiser et réduire encore le nombre d’animaux requis. Enfin, des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos procédures, afin de s’affranchir d’un effet lié au sexe et de valoriser l’ensemble des animaux géntiquement modifiés produits dans notre animalerie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés conformément aux normes en vigueur, avec un enrichissement environnemental adapté. Des points limites précis ont été définis (absence de réaction à un stimulus, inactivité prolongée dans la cage pendant plus de six heures, manifestation de signes de détresse), ainsi qu’une stratégie d’anesthésie et d’analgésie appropriée associée à un suivi quotidien des signes cliniques et à un suivi du poids hebdomadaire. Par ailleurs, les expérimentateurs auront des contacts pluri-hebdomadaires avec les animaux afin de favoriser leur habituation à la manipulation. L’identification des souris génétiquement modifiées par puçage sous-cutané et la biopsie du cartilage auriculaire externe nécessaire au génotypage seront réalisées de manière concomitante, au cours d’une procédure unique, sous anesthésie gazeuse. Cette organisation vise à limiter le stress et à réduire le nombre d’anesthésies.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage indéniable de permettre l’utilisation d’outils de biologie moléculaire qui ne sont pas toujours accessibles chez le rat (modèle également développé au sein de notre laboratoire), tels que l’invalidation ciblée d’un gène dans différents types cellulaires, comme c’est le cas dans cette étude. Ces modèles sont particulièrement pertinents pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de la dysfonction valvulaire aortique responsable de la maladie cardiaque dont cette demande fait l'objet. Nous utiliserons un modèle de souris génétiquement modifiée pour le métabolisme des lipides qui, associé à un régime alimentaire riche en graisses prolongé induit une dysfonction valvulaire aortique similaire à celle observé chez des patients. Des animaux adultes, âgés de 8 à 12 semaines et pesant 20 à 24 g, seront utilisés pour cette étude. À cet âge, la taille des souris permet de faciliter le suivi échocardiographique de la maladie.