Carnivores

Tous gardés en vie à l'issue et réutilisés, 34 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une boiterie leur est provoquée par huit points d'injection de kaolin sous la peau de la face plantaire d'un membre postérieur, sous une heure d'anesthésie générale, et dure environ cinq jours pendant lesquels ils sont hébergés seuls. Ils reçoivent jusqu'à trois administrations du produit testé espacées de trois semaines, des prélèvements sanguins à la jugulaire, et marchent en laisse sur une plateforme de mesure de force pour évaluer l'appui du membre rendu douloureux. Deux animaux ont été ajoutés au projet pour valider l'induction de la boiterie elle-même, et le porteur affirme qu'"aucune méthode alternative" ne permet d'évaluer un anti-inflammatoire vétérinaire sur ce modèle.

Objectifs

MODIFICATION : AJOUT D'UNE PROCEDURE DE VALIDATION DE METHODE DU CHALLENGE KAOLIN SUR DEUX NOUVEAUX ANIMAUX. L'objectif de ce projet est d'évaluer puis de comparer l'efficacité d'un élément d'essai administré à deux doses différentes. L'objectif est de pouvoir démontrer les propriétés anti-inflammatoire et analgésique du produit testé sur un modèle inflammatoire chez le chat. Ce produit test sera mis en comparaison avec un contrôle positif (la référence) et un contrôle négatif (le véhicule du produit test à administrer ou du sérum physiologique). Modification au projet: Ajout de deux animaux pour valider l'injection de kaolin et valider l'inflammation. Ce modèle permet de créer une boiterie en induisant réponse inflammatoire au niveau du membre induit. Grâce au modèle boiterie, les propriétées anti-inflammatoire et analgésique des produits testés pourront être évalués.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer l'efficacité du produit testé en le comparant aux contrôles positif et négatif. De démontrer les propriétés anti inflammatoires et analgésiques du produit test . Ce projet est nécessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires destinés à la médecine féline.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations sous-cutanées quelques soit le groupe, pour le produit test, le contrôle négatif et le contrôle positif. Durée, par administration, inférieure à la minute. Au total un maximum de 3 administrations par produit espacées de 3 semaines de récupération entre les administrations pourront être réalisées. La réalisation de la boiterie sera induite par administration d'une solution de kaolin en 8 points d'injections par voie sous-cutanée en face plantaire d'un membre postérieur sous anesthésie générale. La durée d'administration est inférieure à 5 minutes. La durée de l'anesthésie générale est d'environ 1h. Durée de la boiterie induite : environ 5 jours, il s'agit d'un modèle totalement réversible. Les prélèvements sanguins seront réalisés avant chaque administration du produit test, contrôle négatif ou positif puis toutes les 3 semaines jusqu'à la fin de l'étude. Tout prélèvement de sang sera fait selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. Enfin les animaux seront tenus en laisse et harnais et passeront à la marche sur un système de balance (force plate). Les animaux auront eu un entrainement au préalable de l'étude. Cela a pour but d'évaluer la force du membre présentant la boiterie pour pouvoir évaluer l'efficacité du médicament testé. Durée d'un passage : inférieur à 1 minute. Plusieurs passages ( maximum 5) sont réalisés par temps afin d'obtenir une moyenne fiable d'interprétation. MODIFICATION: INDUCTION D'UNE BOITERIE SUR DEUX ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES POUR LA MISE AU POINT TECHNIQUE.La réalisation de la boiterie sera induite par administration d'une solution de kaolin en 8 points d'injections par voie sous-cutanée en face plantaire d'un membre postérieur sous anesthésie générale. La durée d'administration est inférieure à 5 minutes. La durée de l'anesthésie générale est d'environ 1h. Durée de la boiterie induite : environ 5 jours, il s'agit d'un modèle totalement réversible.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont ceux liés à l'induction d'une boiterie et d'une inflammation du membre postérieur administré avec la solution de kaolin, à la contention lors des prélèvements sanguins, le risque d'hématome lors des prélèvements au niveau des veines jugulaires et au risque anesthésique de toute intervention sous anesthésie générale. Des réactions inflammatoires (gonflement, rougeurs par exemple) peuvent également être observées au niveau des sites d'injections des éléments tests.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux, il est indispensable de recourir à l’animal. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité d'un produit test sur le modèle boiterie chez le chat. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés.

Réduction

32 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront répartis en 4 groupes de 8 animaux. 2 groupes auront les éléments contrôle positif et contrôle négatif puis deux groupes auront l' élément test à deux doses différentes. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats représentatifs et interprétables et en tenant compte de la variabilité inter individuelle. Une justification du nombre d'animaux est demandée au donneur d'ordre. Des phases préliminaires, comme des études pilotes, ont été réalisées dans le but de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour cette étude. Ces études ont mis en avant qu'il était necessaire d'avoir des groupes de 6 à 8 animaux. Des groupes de 6 à 8 animaux ont été également indiqué dans des textes de références (J. vet. Pharmacol. Therap., 2005, 28, 275-285, J Vet Pharmacol Ther. 2009 Feb; 32(1):18-30 par exemple) . Pas de test statistique réalisé en amont. Pas d'approche statistique prévue pour ce projet. MODIFICATION : AJOUT D'UNE PROCEDURE DE VALIDATION DE METHODE DU CHALLENGE KAOLIN SUR DEUX NOUVEAUX ANIMAUX SOIT UN TOTAL DE 34 ANIMAUX INCLUS DANS CE PROJET. DEUX ANIMAUX DE PLUS RAJOUTES POUR VALIDER LA METHODE EST LE NOMBRE MINIMAL POUR EFFECTUER CE PROJET.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation, les animaux continueront une phase d'entraînement à la marche en ligne dans le corridor de Force Plate. Cette phase sert à familiariser les animaux avec le dispositif experimental. Les animaux seront hébergés par groupe de 2 à 4. Puis ils seront hébergés en condition individuelle tout au long de la présence de la boiterie. Cet hébergement en individuel est nécessaire pour mettre l'animal dans de bonnes conditions pour la phase de réveil et pour faciliter l'observation des animaux ainsi que de garantir leur tranquilité tout au long de la phase active du modèle boiterie. En effet, pour les chats, le calme et le repos est plus apprécié lors d'évènements pouvant occasionner une gêne ou une diminution de la capacité motrice que les nombreuses intéractions sociales avec des congénères. Ils garderont un contact visuel, auditif et olfactif pendant la période d'hébergement individuel. De l'enrichissement (exemple: plateformes à différentes hauteurs, tunnels, balle, corde et griffoirs) sera présent autant que possible dans les boxes. Les tablettes dans les hébergements seront remontées aussi longtemps que la présence de boiterie pour l'animal au niveau du membre induit. En cas de détection d'une souffrance ou de douleur , le vétérinaire sera immédiatement prévenu et procèdera à un examen clinique de l'animal concerné afin d'établir un diagnostic et mettre en place un traitement adapté en accord avec le Donneur d'Ordre. Des anesthésiques ou analgésiques pourront être utilisés si necessaire. Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible pour ce projet. Chats adultes entre 1 à 9 ans. Ce stade de développement permettra de viser la majorité du stade cible de ce médicament.

Caractériser la pharmacocinétique de produits en vue d'une autorisation de mise sur le marché : 72 furets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour quantifier ces produits dans leurs organes. Chaque animal reçoit jusqu'à trois administrations, par voie intraveineuse, intratrachéale, intranasale ou orale, puis subit jusqu'à vingt prélèvements sanguins sous anesthésie sur cinq mois et jusqu'à cinq lavages broncho-alvéolaires de vingt minutes. Les furets sont mis à jeun deux à cinq heures avant chaque anesthésie pour limiter les vomissements. Le porteur justifie l'espèce par sa proximité pulmonaire avec l'humain et par la recommandation de tester sur un rongeur et un non-rongeur, et résume les bénéfices attendus en une phrase, contribuer au développement et "éventuellement" à la mise sur le marché de nouveaux produits.

Objectifs

L’autorisation de mise sur le marché (AMM) d’un produit (médicament, agent de contraste…) nécessite au préalable de caractériser notamment sa pharmacocinétique (PK) et sa pharmacodynamique (PD). La pharmacocinétique consiste à évaluer l’absorption, la diffusion, la métabolisation et l’excrétion du produit par l’organisme. Elle permet notamment d’améliorer les dosages et la posologie du produit par l’étude de sa concentration sanguine au cours du temps. Elle permet également de déterminer les voies d’administrations optimales selon la métabolisation du produit dans l’organisme. La pharmacodynamique consiste quant à elle à évaluer les effets du produit sur l’organisme. Ce projet a pour objectif de caractériser la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de produits après administration chez le furet.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera au développement et éventuellement à la mise sur le marché de nouveaux produits.

Procédures

Les animaux recevront une injection de produit en dose unique ou répétée (maximum 3 administrations) par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire, intrapéritonéale, intratrachéale, intranasale ou pers os. Ces administrations seront réalisées en moins de 1 minute sur animaux vigiles ou en environ 10 minutes sur animaux anesthésiés. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 8 fois pour des études courtes (moins de 2 semaines) et au maximum 20 fois pour des étude longues (5 mois). Un prélèvement s’effectue en moyenne en 1 à 2 minutes soit 10 minutes au total en comprenant le temps d’anesthésie volatile. Des lavages broncho-alvéolaires pourront être réalisés sur animaux anesthésiés au maximum 5 fois. Ces lavages s’effectuent en moyenne en 20 minutes avec le temps d’anesthésie. L’ensemble des prélèvements seront réalisés autant que possible lors d’une même anesthésie. Pour limiter le risque de vomissements, les animaux seront mis à jeun entre 2 et 5h avant chaque anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront manipulés régulièrement pour différents actes avec ou sans anesthésie susceptibles d’induire un stress : pesées, suivi clinique, mise à jeun, administration des produits, prélèvements de sang et lavages broncho-alvéolaire. Les animaux pourront présenter des réactions différentes selon les produits testés et selon les voies d’administration, pouvant entrainer l’apparition de signes cliniques (risque de pertes de poids liées aux éventuelles anesthésies répétées, inflammation locale des sites d’injection).

Devenir

L’ensemble des animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements d’organes dans le but de réaliser la quantification ex-vivo des produits par différentes analyses.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire afin de pouvoir caractériser la pharmacocinétique et notamment la biodistribution d’un produit dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable la biodistribution d’un produit dans un organisme vivant.

Réduction

Cette étude a fait l’objet d’une réflexion étayée par des connaissances statistiques et des données de la littérature scientifique afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Toutefois, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’évaluer la biodistribution du traitement testé, des groupes de minimum 6 animaux seront utilisés. Si nécessaire, lors de phases amont, des études pilotes pourront être réalisées sur un nombre limité d’animaux (3 par groupe minimum). Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé lors de ce projet, les analyses seront réalisées également en amont de l’administration des produits afin que chaque animal soit son propre contrôle.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines minimum sera respectée durant laquelle une période d’habituation pourra être mise en place si nécessaire. Cette phase consiste à caresser, porter et faire rentrer les animaux dans la boîte d’induction d’anesthésie qui sera ensuite utilisée lors des anesthésies pour les actes techniques. Les 3 premiers jours, les animaux ne seront pas stimulés pour s’habituer aux locaux et au personnel. Avant le démarrage de l’étude, le vétérinaire assurera une visite de contrôle clinique. Les animaux seront hébergés en groupes avec des enrichissements et appropriés à leurs besoins (distinction stricte entre les aires de repos avec des panières et linges permettant la nidation et des zones où ils pourront faire leurs besoins). Des hamacs comme aires de repos en hauteur et des jeux comme des balles avec des clochettes à l’intérieur, des hochets avec des objets à l’intérieur émettant du bruit à la manipulation, des tubes PVC organisés en un réseau à sorties multiples et servant également de cachettes pour les furets seront ajoutés au parc ou cages d’hébergement. Une alternance des jouets pour stimuler l’intérêt des animaux sera respectée afin d’éviter l’ennui. Un temps de jeux quotidiens (hors weekend et jours fériés) de 15 à 30 minutes avec les animaliers, en particulier ceux réalisant les soins quotidiens des animaux, sera également respecté pour habituer progressivement les animaux au contact humain et diminuer le stress lors des manipulations. Les animaux seront observés quotidiennement et ce depuis leur arrivée jusqu’à leur euthanasie. De plus, durant l’étude, le poids des animaux sera mesuré régulièrement (a minima une fois par semaine), accompagné d’un suivi clinique plus précis basée sur une grille de scoring (comportement général, écoulements nasaux et oculaires, aspect du pelage, difficultés respiratoires, aspect des muqueuses). En cas d’apparition de signes cliniques anormaux, des examens cliniques approfondis pourront également être réalisés par un vétérinaire responsable du suivi. Les signes cliniques observés seront pris en charge (injection de fluides, analgésiques, antibiotiques, etc…) dans la mesure où les actions n’interfèrent pas avec les produits injectés. Enfin, le personnel réalisant les actes sera habilité, formé et expérimenté.

Choix des espèces

Le modèle furet a été choisi car il constitue un modèle plus proche de l’homme que la souris à la fois sur le plan anatomique et au niveau physiologique et particulièrement pulmonaire. Cela en fait une espèce particulièrement pertinente pour l’étude de composés à visée thérapeutique ciblant les maladies respiratoires, permettant une meilleure transposition des résultats précliniques vers l’homme. De plus, il est souvent utilisé comme modèle préclinique intermédiaire permettant de conforter des résultats préliminaires obtenus en modèle souris qui est souvent un prérequis des agences réglementaires pour mieux prédire la biodistribution humaine et évitant ainsi le recours aux primates non-humains. Il est également fortement recommandé de réaliser les études de PK/PD sur deux espèces : rongeur et non-rongeur. Par ailleurs, ce modèle a l’avantage d’être plus grand qu’une souris permettant ainsi de réaliser des prélèvements tels que les prélèvements sanguins de façon plus fréquentes et en plus grandes quantités. Les animaux sélectionnés pour ce projet seront âgés au minimum de 3 mois correspondant au début du stade adulte.

Réutilisés dans un autre projet plutôt que tués, 12 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont castrés sous anesthésie, l'intervention étant plafonnée à une heure, puis évalués sur la douleur post-opératoire que le porteur qualifie de modérée et transitoire. La molécule analgésique testée peut par ailleurs entraîner une sédation, des troubles gastro-intestinaux et une modification du comportement. L'intervention retenue pour produire cette douleur est une chirurgie que le porteur nomme lui-même "de convenance", et l'étude vise un usage à la fois humain et vétérinaire.

Objectifs

L’analgésie représente un pilier fondamental de toute intervention chirurgicale, tant en médecine humaine qu’animale. Une gestion optimale de la douleur contribue non seulement à améliorer le confort du patient, mais aussi à favoriser une récupération post-opératoire plus rapide, plus sûre et avec moins de complications. Elle participe également à une meilleure qualité globale de la prise en charge. Dans ce contexte, cette étude vise à évaluer l’efficacité analgésique d’une molécule innovante, en vue de son potentiel usage en médecine humaine et vétérinaire. L’objectif est d’apprécier ses effets sur la douleur post-opératoire, sa tolérance et son intérêt en tant qu’alternative aux traitements antalgiques conventionnels.

Bénéfices attendus

Amélioration de la prise en charge de la douleur post-opératoire : en évaluant une nouvelle molécule analgésique, ce projet vise à proposer des alternatives efficaces et potentiellement mieux tolérées que les traitements classiques. Réduction de la consommation d’antalgiques conventionnels : si la molécule testée montre une bonne efficacité, elle pourrait permettre de diminuer l’utilisation de médicaments opioïdes ou AINS, souvent associés à des effets secondaires.

Procédures

Les animaux sont soumis à une procédures chirurgicales : sous anesthésie, donc la durée sera plafonnée à 1h, afin d'assurer une récupération optimale aux animaux;

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue : - Douleur post-opératoire : bien que des protocoles analgésiques soient mis en place, une douleur modérée transitoire peut survenir après la castration. - Effets secondaires liés aux molécules analgésiques : selon le traitement administré, des effets indésirables légers sont possibles (sédation, troubles gastro-intestinaux, modification du comportement, etc). - Stress de l’anesthésie, hypothermie lors de l’anesthésie.

Devenir

Le projet étant peu invasif et ne nécéssitant pas d'euthanasie, les chiens pouront être réutilisés pour un autre projet.

Remplacement

La réponse à l’objectif de l’étude nécessite une évaluation directe de la réponse à la douleur, ce qui ne peut être réalisé que sur l’animal vivant. En effet, il n’est pas envisageable de tester une molécule innovante directement chez l’homme ou en clinique vétérinaire, en raison des risques encore inconnus liés à son utilisation.

Réduction

Au total, 12 animaux seront utilisés (6 + 6). Un nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables sur l’évaluation de l’efficacité d’une nouvelle molécule.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec des enrichissements propres à l’espèce. De plus, la température de la salle d’hébergement sera augmentée après la chirurgie. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier habilité et habitué à travailler avec des chiens. En cas de troubles liés au dispositif, des traitements pourront être mis en place, similaires à ceux pratiqués en médecine humaine. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés : AINS et/ou morphiniques. Au cours des études, les animaux feront l'objet d'un suivi clinique, afin de détecter tout signe de mal-être ou toute anomalie physique.

Choix des espèces

Le modèle de chien a été choisie en raison de la pertinence directe du modèle animal avec l’application clinique visée. En effet, la molécule testée présente un potentiel d’utilisation non seulement en médecine humaine, mais également en médecine vétérinaire, notamment dans la gestion de la douleur post-opératoire. Le chien étant une des principales espèces concernées par ce type d’indication (chirurgie de convenance, douleur aiguë), il constitue un modèle approprié, à la fois pour l’évaluation de l’efficacité analgésique et pour l’extrapolation clinique future. De plus, les protocoles d’évaluation de la douleur sont bien validés chez cette espèce, ce qui garantit la fiabilité des données recueillies. Des chiens adultes seront utilisés dans ce projet, car ils représentent la catégorie d’animaux la plus fréquemment concernée par les interventions chirurgicales en pratique clinique. Leur utilisation permet ainsi de reproduire des conditions proches de la réalité vétérinaire.

Infectés par le virus de la grippe au moyen d'une instillation dans le nez, 52 furets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes et mesurer les charges virales. Ils développent fièvre, éternuements, écoulement nasal et apathie, et subissent jusqu'à six prélèvements sanguins et lavages bronchoalvéolaires, plus des lavages nasaux et des écouvillonnages de la gorge quotidiens. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne permet de modéliser l'efficacité d'un antiviral dans un "organisme entier" vivant, et retient le furet comme seul modèle développant des signes cliniques proches de ceux de l'humain. La sélection in vitro des candidats les plus prometteurs est laissée au "donneur d'ordre", ce qui situe le projet dans une prestation d'évaluation pour un commanditaire.

Objectifs

Chaque année, malgré l’existence de vaccins et traitements antigrippaux déjà disponibles, environ un milliard de personnes contractent le virus de la grippe et entre 3 à 5 millions d’entre eux développeront une forme sévère conduisant entre 290 000 et 650 000 décès liés à des troubles respiratoires. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements antiviraux indiqué dans le cas d’une infection au virus de la grippe. Ce projet inclura deux études lors desquelles, des furets (mustela putorius furo), connus comme modèle de choix dans le développement d’une maladie symptomatique post-infection au virus de la grippe, seront utilisés. es animaux seront infectés avec une suspension virale du virus de la grippe. Des traitements (composé(s) à tester et traitement(s) de référence d’efficacité antivirale connue) seront injectés en préventif ou en curatif.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera au développement et éventuellement à la mise sur le marché de nouveaux traitements anti-grippaux offrant des thérapies plus efficaces contre les infections grippales.

Procédures

Les animaux recevront une administration intranasale de virus et recevront une/des injection(s) du traitement antiviral en dose unique ou répétées (maximum 3 administrations) en amont et/ou en avant l’infection. La procédure d’infection durera en moyenne 30 minutes, anesthésie comprise, comme l’administration des traitements. Des lavages nasaux, des lavages bronchoalvéolaires, des écouvillonnages oropharyngés et des prélèvements sanguins seront réalisés, 1 fois avant infection (baseline) puis au maximum, tous les 2 jours à partir du lendemain de l’infection et ce jusqu’à euthanasie des animaux (soit 6 fois au maximum durant l’ensemble de l’étude) pour les prélèvements de sang et les lavages bronchoalvéolaires ou tous les jours pour les lavages nasaux et les écouvillonnages oropharyngés. L’ensemble des prélèvements sera réalisés lors d’une même anesthésie et celle-ci durera en moyenne 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être infectés avec le virus de la Grippe entrainant l’apparition de signes cliniques reflétant la réalité clinique (principalement fièvre, éternuement, écoulement nasal et apathie). La sévérité et la durée de ces signes pourront varier entre les animaux traités et non traités. Les animaux seront également manipulés régulièrement pour différents actes (administration des traitements, pesées, observations cliniques, prélèvements, etc.) susceptible d’induire un stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la phase expérimentale afin de prélever les organes pertinents à la mesure d’efficacité des produits antiviraux en vues d’analyses des charges virales.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser de manière fiable l’efficacité de traitements antiviraux dans un organisme entier vivant (modélisation d’une situation clinique). En effet, cette réponse dépend d’un très grand nombre de facteurs impliquant notamment l’ensemble du système immunitaire. Une sélection in vitro des candidats les plus prometteurs pourra être réalisée en amont des études précliniques par le donneur d'ordre.

Réduction

Cette étude a fait l’objet d’une réflexion étayée par des connaissances statistiques et des données de la littérature scientifique afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Toutefois, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur une réelle efficacité du traitement testé, des groupes de minimum 6 animaux seront utilisés. Un groupe contrôlé infecté non traité ou traité avec le véhicule sera systématiquement inclus.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines minimum sera respectée durant laquelle une période d’habituation sera mise en place : les animaux bénéficieront quotidiennement de contacts avec le personnel pour limiter le stress. Cette phase consiste à caresser, porter et faire rentrer les animaux dans la boîte d’induction d’anesthésie qui sera ensuite utilisée lors des anesthésies pour les actes techniques). Les 3 premiers jours, les animaux ne seront pas trop stimulés pour s’habituer aux locaux et au personnel. Avant le démarrage de l’étude, le vétérinaire assurera une visite de contrôle clinique. Les animaux seront hébergés en groupes tout au long du projet avec des enrichissements appropriés à leurs besoins (distinction stricte entre les aires de repos avec des panières et linges permettant la nidation et des zones où ils pourront faire leurs besoins). Des hamacs comme aires de repos en hauteur et des jeux comme des balles avec des clochettes à l’intérieur, des sortes d’hochets avec des objets à l’intérieur émettant du bruit à la manipulation, des tubes PVC organisés en un réseau à sorties multiples et servant également de cachettes pour les furets seront ajoutés au parc ou cages d’hébergement. Une alternance des jouets pour stimuler l’intérêt des animaux sera respectée. Un temps de jeux quotidiens (hors weekend et jours fériés) de 15 à 30 minutes avec les animaliers, en particulier ceux réalisant les soins quotidiens des animaux, sera également respecté pour habituer les animaux au contact humain. Durant l’étude, le poids des animaux et la température seront mesurés quotidiennement. Ils seront complétés par un suivi clinique quotidien avec observations de signes cliniques spécifiques à la grippe (comportement général de l’animal pour déceler une éventuelle apathie, réponse à la stimulation, état de son pelage (soyeux ou en pilo-érection), présence d’éternuements (sporadiques ou fréquents), présence et fréquence d’écoulements nasaux et oculaires, identification d’éventuelles difficultés respiratoires et état des muqueuses avec d’éventuelles congestions). Ces observations serviront à établir un score total permettant d’évaluer avec le vétérinaire l’état clinique général des animaux. La décision d’euthanasie ou non sera évaluée au cas par cas par concertation entre vétérinaire et directeur d’étude.

Choix des espèces

Le furet a été choisi car il s’agit, à ce jour, du seul modèle naturellement susceptible à l’infection aux virus de la grippe adaptés à l'humain ainsi que du seul modèle animal présentant des signes cliniques typique de l’infection au virus de la grippe tel que de la fièvre, de la toux ou des éternuements. Les animaux sélectionnés pour ce projet seront âgés de 2 à 4 mois correspondant à un stade de jeune adulte doté d’un système immunitaire mature au moment de la vaccination.

20 chiennes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit trois IRM de deux heures sous anesthésie générale, un prélèvement de globules blancs de trois heures sous anesthésie générale, 27 prises de sang à l'état vigile, six échographies cardiaques et six enregistrements de l'électrocardiogramme portés de douze à soixante-douze heures. Le porteur annonce une perte d'appétit, une journée de fièvre avec abattement, un risque de saignement de la vessie et un risque rare de relargage cytokinique, et prévoit d'interrompre les sorties en extérieur pendant une quinzaine de jours. Ces chiennes portent l'anomalie génétique de la myopathie de Duchenne et développent toutes une fibrose du cœur entre trois et neuf ans, ce que le porteur présente comme le seul modèle animal caractérisé pour les femmes porteuses de cette maladie.

Objectifs

En cancérologie, l'une des approches thérapeutiques actuellement utilisée est basée sur l'utilisation de cellules CAR-T (lymphocytes T tueurs =sous-population de globule blanc) modifiées artificiellement pour cibler des marqueurs tumoraux spécifiques. Les globules blancs du patient sont isolés par une procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple, puis modifiés ex vivo pour cibler un marqueur spécifique de la tumeur à traiter. L'idée d'appliquer cette méthode à d'autres contextes pathologiques dans lesquels un marqueur spécifique d'une cible à détruire est exprimé, a émergé. En particulier, un marqueur spécifique de la fibrose a récemment été identifié et des cellules CAR-T pourraient être utilisées pour attaquer la fibrose qui est présente dans de nombreux contextes pathologiques, dont la fibrose myocardique qui accompagne de multiples maladies cardiaques. En particulier, les femmes qui peuvent transmettre la myopathie de Duchenne peuvent développer une fibrose myocardique. Il en est de même chez des chiennes qui portent une anomalie génétique dans le gène en cause dans la myopathie de Duchenne (dites "porteuses saines" car ne présentant pas d'anomalie clinique évidente) et il a été démontré que le marqueur de la fibrose est bien présent dans le coeur de ces animaux. L'objectif de ce projet est de déterminer si le ciblage de ce marqueur par des cellules CAR-T permet de réduire la fibrose du coeur chez des chiennes porteuses de myopathie de Duchenne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'obtenir une preuve de concept pré-clinique sur l'efficacité du ciblage d'un marqueur spécifique de la fibrose, pour réduire celle-ci dans un contexte de patiente porteuse de myopathie de Duchenne. Si cette stratégie s'avère efficace, cette étude ouvrira la voie à la possibilité d'utiliser ce marqueur comme une cible thérapeutique chez les patientes porteuses de myopathie de Duchenne, mais aussi chez des patients atteints de cardiomyopathies d'origines diverses dans lesquelles une fibrose cardiaque évolue et contribue à la dégradation de la fonction cardiaque.

Procédures

- Trois examens d'imagerie IRM sous anesthésie générale, durée approximative 2 heures/examen - Un prélèvement de globules blancs par une procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple, sous anesthésie générale, durée approximative 3 heures - 27 prélèvements sanguins vigile, temps estimé 5 minutes y compris préparation et compression pour éviter la formation d'un hématome. - Vigiles, les chiennes subiront également des examens cliniques, six échographies cardiaques (20 minutes) et six enregistrements de l'électrocardiogramme en "ambulatoire" (12 à 72 heures, équipement sans fil porté par le chien).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les chiennes au cours de ce projet sont de trois ordres : - Celles liées aux arythmies ventriculaires qui touchent ces animaux et qui pourraient conduire à une fibrillation ventriculaire et un arrêt cardiaque (événement rarissime) - Celles liées au protocole médicamenteux préparatoire qui a pour but de diminuer la quantité de globules blancs circulants pour permettre une meilleure efficacité des cellules CAR-T. Les principales nuisances induites sont une perte d'appétit transitoire en cours de traitement, qui répond à un traitement anti-vomitif et une journée de fièvre avec abattement associée à la baisse des globules blancs dans le sang, environ une semaine après le début du traitement. La formule sanguine et l’état général se normalisent ensuite en quelques jours. Par ailleurs, malgré les mesures préventives recommandées mises en œuvre, il ne peut être exclu qu’un épisode de cystite hémorragique (saignement de la vessie) puisse survenir, s’agissant d’une toxicité connue d’un des agents pharmacologiques utilisés - Celles liées à la survenue éventuelle mais rare d'un syndrome de relargage cytokinique (état inflammatoire aigu), complication connue chez l'Homme des traitements par cellules CAR-T. - Celles liées au stress des anesthésies générales, prélèvements sanguins et examens effectués.

Devenir

Les animaux seront mis à mort du fait de la nécessité de réaliser des prélèvements larges de tissus incluant l'organe cible du traitement qui est le coeur

Remplacement

Ce projet vise à évaluer une stratégie de thérapie anti-fibrose, ayant recours à une injection systémique de cellules du système immunitaire modifiées pour se diriger contre un marqueur de la fibrose et aller détruire les cellules responsables de cette fibrose dans le coeur. Il apparaît donc incontournable de réaliser cette étude dans un organisme entier. Des tests réalisés in vitro ont confirmé que les globules blancs modifiés pour devenir des "CAR-T" se dirigent bien contre d'autres cellules si elles expriment le marqueur de fibrose. Ces tests de fonctionalité in vitro sont renouvelés à chaque production de cellules pour valider la qualité du produit de thérapie cellulaire administré aux animaux traités. Reste à déterminer si dans le contexte d'un organisme entier, les cellules parviennent bien à migrer dans le tissu cible, à atteindre les zones de fibrose et les détruire.

Réduction

Un effectif de 10 chiennes traitées par des cellules CAR-T et 10 chiennes recevant un placebo a été sélectionné car une modélisation statistique, effectuée dans le logiciel Statistica, sur la base de données déjà disponibles dans le modèle utilisé dans ce projet, a montré qu'il s'agit de l'effectif nécessaire et suffisant pour démontrer la normalisation, dans le groupe traité, d'un paramètre clé d'imagerie cardiaque reflétant la fibrose.

Raffinement

Les chiennes seront évaluées à l'aide de mesures non invasives développées, pour la plupart d'entre elles, à partir de méthodes utilisées chez les patients et adaptées aux chiens. Elles seront hébergées par groupes de deux, de tempéraments compatibles, avec accès à un lieu de couchage, des plateformes et des jeux variés. Elles seront sorties quotidiennement en groupes plus larges dans des espaces extérieurs. Cependant, durant une quinzaine de jours entourant le protocole de préparation et l'injection de cellules, les sorties devront être interrompues pour les protéger d'éventuelles infections opportunistes. Du temps supplémentaire sera passé avec les chiennes afin de remplacer cette activité habituelle par du jeu ou des caresses. Des moments d'intéractions avec l'homme seront ménagés quotidiennement (temps de jeux, caresses). Elles bénéficieront d'un suivi vétérinaire quotidien afin de suivre au plus près les éventuelles complications liées à leur pathologie cardiaque ou au projet. Des points limites précis, adaptés à ce contexte pathologique, et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis. Dans le cadre du projet, les gestes potentiellement stressants seront réalisés sous anesthésie générale, et une analgésie sera mise en place pour tout geste potentiellement douloureux. Par ailleurs, des points limites adaptés aux effets secondaires possibles et connus chez le chien du protocole médicamenteux préparatoire ont été déterminés, et permettront, suivant le cas considéré, de soulager la souffrance des animaux le plus précocement possible par des traitements adaptés, ou de les mettre à mort sans délai.

Choix des espèces

Cette étape préclinique de validation d'une approche thérapeutique anti-fibrose en développement est prévue chez le chien. En effet, il s'agit actuellement du seul modèle animal caractérisé pour les femmes porteuses de myopathies de Duchenne ou Becker, et qui reproduit fidèlement la maladie humaine notamment sur le plan de la fibrose, et de l'expression du marqueur de fibrose ciblé. Par ailleurs, l'espèce chien permet la mise en oeuvre des mêmes procédures que celles mise en oeuvre chez l'Homme pour le traitement par des cellules CAR-T (prélèvement des lymphocytes T par cytaphérèse et autogreffe en particulier). Les chiennes seront des adultes de 3 à 9 ans, tranche d'âge au cours de laquelle une fibrose myocardique est présente de manière systématique chez ces animaux.