Mammifères "de rente"

Infectées par le virus de la grippe directement dans la mamelle ou par une seconde voie d'administration, 12 brebis en lactation développent une inflammation mammaire et une montée de température. Elles portent un capteur télémétrique implanté par une petite chirurgie et sont traites deux fois par jour pour rester en lactation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées en fin de projet, du fait de l'infection expérimentale. Le porteur justifie six animaux, trois par lot pour deux souches ou deux voies d'inoculation, et prévoit de recommencer l'infection en l'absence de signes, sans expliquer d'où viennent les six autres brebis déclarées.

Objectifs

Contexte et objectif : Jusqu'à récemment, les ruminants n'étaient pas considérés comme des hôtes sensibles aux virus de la grippe aviaire. Cette vision a toutefois changé à la suite d’études récentes faisant état d'infections par le virus de la grippe aviaire hautement pathogène chez des vaches laitières aux États-Unis. Ces infections se caractérisent par une réplication virale massive dans la glande mammaire, entraînant une propagation du virus au sein des troupeaux et entre ceux-ci, ainsi qu'une transmission de la vache à l'homme par le lait infecté. Un cas d'infection par le virus chez une chèvre a également été documenté aux États-Unis début 2024. Des enquêtes sérologiques démontrant la présence d'anticorps chez les caprins, les ovins et les bovins suggèrent que les espèces ruminantes sont des hôtes sensibles et peuvent agir comme des réservoirs facilitant l'émergence de nouveaux virus grippaux aviaires présentant un potentiel zoonotique (voire pandémique) accru. Cependant, le tropisme viral pour la glande mammaire, ainsi que les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire des mamelles des ruminants aux infections par le virus grippal aviaire, sont mal compris. Pour répondre à ces questions, cette proposition rassemble l'expertise de cinq équipes dans le but de : 1/ Évaluer la capacité de souches du virus Influenza A faiblement pathogène à infecter de manière productive les cellules épithéliales mammaires primaires ovines; 2/Mettre en place un modèle d'infection in vivo chez l'ovin afin d'étudier les intéractions entre le virus de la grippe et son hôte, ainsi que les défenses antivirales dans la glande mammaire des ruminants. La demande d’autorisation de projet formulée ici concerne donc le point 2.

Bénéfices attendus

Le consortium bénéficiera du partage des connaissances, des outils et des ressources afin d'anticiper le développement de solutions pour un problème émergent en matière de santé animale. Ce projet représente également une opportunité pour les équipes disposant de compétences complémentaires de nouer des collaborations et de produire des travaux préliminaires qui pourraient ouvrir la voie à des projet scientifiques plus ambitieux. Il sera tiré parti de ce projet pour mettre en œuvre et valider des modèles d'infection par Influenza chez les petits ruminants qui pourront être mis à disposition des scientifiques et d’autres parties prennantes du secteur de la santé animale. La mise en œuvre de ce projet représente ainsi une précieuse opportunité de formation pour le personnel. Enfin, le programme scientifique proposé de tester de nouveaux outils de surveillance clinique chez les moutons (capteurs de température et caméra thermique infrarouge) et de mettre en place un modèle animal original (et plus abordable) pour reproduire les infections par le virus chez les bovins ou d'autres ruminants, qui pourrait être exploité pour le dépistage de vaccins/traitements.

Procédures

Pose des capteurs télémétriques : 20 minutes par animal 2 voies d'infection : 5 minutes par animal Prises de sang : 5 minutes par animal Ecouvillons nasaux : 1 à 2 minutes par animal

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles seront soumis soit à une administration de deux souches de virus, dans un des deux quartiers sous contention, soit à deux voies d'administration d’une souche de virus, sous contention. Il est attendu que les animaux soient atteints par la maladie. Les symptômes attendus sont une inflamation localisée de la mamelle accompagnée d’une montée en températue localisée ou systémique. Il peut y avoir un stress supplémentaire lié aux des différentes interventions (traite ou contention pour observation clinique).

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet, étant donné qu’ils seront soumis à une infection expérimentale.

Remplacement

Travail in vitro : depuis plus de 20 ans, des études ont été réalisées in vitro pour mieux comprendre les mécanismes de défense de la mammelle des ruminants. Au vu de la complexité des mécanismes de la réponse immunitaire, pas reproductibles en laboratoire, la mise au point du modèle doit être réalisée chez l’espèce cible(la brebis, dans ce cas particulier). Concenant la pertinance des modèles murins comme modèle, des différences majeures entre les cycles de lactation chez les rongeurs et chez les ruminants sont amplement décrites dans la littérature. Ces différences limitent l’utilisation de la souris pour aborder des questions précises, comme la réponse innée de la mamelle contre les infections. Outre les principales différences entre la souris et la brebis, il est pertinant de souligner que chez la souris, au retrait des souriceaux, la glande mammaire entre en tarissement/involution. Ainsi, la souris doit continuer d’allaiter afin de maintenir ses glandes mammaires en lactation. Lors des infections expérimentales, la présence de souriceaux genererait leur infection par l’ingestion du lait contaminé et rendrait l’étude inviable.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, un criblage in vitro de souches sera réalisé afin de tester leurs capacités à se répliquer de manière productive dans des cellules épithéliales mammaires primaires ovines. Les résultats de ces travaux permettront ainsi de réduire le choix à 1 ou 2 souches qui seront utilisées dans les infections in vivo. Le projet visant à mettre en place un modèle d'infection in vivo chez l'ovin, nous estimons qu’il faut à minima 3 animaux par lot pour tester soit 2 souches virales, soit 2 voies d’inoculation, donc 6 animaux au total. Etant dans une démarche de preuve de concept, nous prévoyons de pouvoir reconduire l’infection au bout de quelques jours si nous ne constatons pas de signes d’infection lors de la première série d’inoculations. Ce projet constitue une étude pilote visant à évaluer pour la première fois la faisabilité du modèle expérimental proposé. Compte tenu de la taille limitée des effectifs, aucune analyse statistique n’est envisagée. Des analyses comparatives des paramètres avant et après infection seront effectuées pour chaque animal et les données individuelles seront présentées sous forme de graphiques de dispersion, afin de visualiser la variabilité interindividuelle et d’évaluer la cohérence des réponses observées. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer la mise en œuvre pratique du modèle, sa tolérance par les animaux et la pertinence des procédures expérimentales, afin d’ajuster si nécessaire le protocole avant toute étude ultérieure de plus grande ampleur

Raffinement

A partir de la période d'acclimatation, les brebis seront équipées d’un dispositif télémétrique afin de suivre la température corporelle, dispositif couramment utilisée dans nos installations. Une petite chirurgie sera necessaire pour l’implantation du capteur sur la brebis. Les données de température seront transmises à une base positionnée à proximité des animaux. Cette base est équipée d’un écran pour permettre de relever les températures enregistrées. Elle pourra également être connectée ultérieurement à un système informatique pour récupérer l’ensemble des données de températures acquises tout au long du projet. Ces données permettront de visualiser très précisement les changements de température liés à l’infection. La technologie de thermographie infrarouge (caméra thermique) sera testée pour assurer le suivi de l’inflammation et de la température au niveau de la glande mammaire. Cette approche serait une alternative moins invasive et moins contraignante pour les animaux. En effet, lors d’une mammite, une augmentation de la température au niveau local est attendue et pour l’analyser, nous devons utiliser des approches complémentaires comme la thermographie infrarouge. Cette analyse nous permettra ainsi d’évaluer la faisabilité de cette approche dans le cadre d’une inflammation contrôlée et les données générées pourrons nous aider à raffiner nos futurs modèles de mammite. Il est prévu également d’effectuer un travail de conditionnement et de renforcement positif pour les interventions prévues lors de la traite. Les animaux étant déjà présents dans notre élevage, ce travail sera mis en place et initiée sur ces animaux pour les préparer notamment aux interventions lors de la traite. Plusieurs agents de l’unité se sont formés à cette méthode. Enrichissement social : Les animaux seront hébergés en groupes. Une visite régulière des animaliers sera assurée. Une récompense alimentaire sera fournie aux animaux après les interventions.

Choix des espèces

Des enquêtes sérologiques démontrant la présence d'anticorps chez les caprins, les ovins et les bovins suggèrent que les espèces ruminantes sont des hôtes sensibles et peuvent agir comme des réservoirs facilitant l'émergence de nouveaux virus grippaux présentant un potentiel zoonotique (voire pandémique) accru. La mise en place d’un modèle infectieux sur petits ruminants est le plus pertinent et plus adapté à notre capacité actuelle de travail et d’hébergement en confinement biologique. Pour ce projet, nous avons decidé de travailler sur l’espèce ovine en tant que modèle plus abordable que l’espèce bovine pour sa facilité d’hébergement sous confinement biologique et d’approvisionnement. Cela nous permettra également d’effectuer un travail d’acclimatation et de conditionnement renforcé des animaux avant le démarrage de la procédure expérimentale. Le projet portant sur la mise en place d’un modèle d'infection in vivo chez la brebis afin d'étudier les mécanismes de défense antivirale dans la glande mammaire, les animaux utilisés seront des brebis en lactation. Les brebis seront soumises à une traite biquotidienne pour être maintenues en lactation.

112 porcs charcutiers vont être utilisés, tous tués à 110 jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un transpondeur sous la peau, une à deux injections vaccinales intramusculaires et trois prises de sang de 10 ml, avec fièvre, baisse d'appétit et lésions musculaires possibles au point d'injection. La mise à mort sert à examiner l'encolure pour mesurer les dégâts locaux laissés par les adjuvants testés. Le porteur présente ces essais comme une recherche de meilleure tolérance pour la santé et le bien-être des animaux non-humains, et détaille aussitôt les gains attendus en croissance, en productivité et en homogénéité des lots.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer l’innocuité et l’efficacité de différentes formulations adjuvantes chez le porc charcutier. L’antigène utilisé (APP) présente un profil d’innocuité déjà bien établi. En revanche, l’association de cet antigène avec certains adjuvants peut induire des lésions locales, superficielles et/ou musculaires, susceptibles d’entraîner une réforme de l’animal. Le test de nouveaux adjuvants vise à diminuer ces effets. En termes d’efficacité, il est établi que les quantités d’anticorps spécifiques de l’APP sont directement associés à l’efficacité vaccinale. Le suivi de ces paramètres constitue donc des indicateurs pertinents pour l’évaluation de l’efficacité des nouveaux candidats adjuvants dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

Une meilleure tolérance et efficacité sont sans cesse recherchées pour améliorer la santé et le bien-être animal. L’optimisation des adjuvants vise avant tout à renforcer la réponse immunitaire, en stimulant plus efficacement les défenses naturelles de l’animal et en favorisant une production d’anticorps durable et protectrice. En parallèle, une meilleure immunité contribue à diminuer l’incidence des maladies cliniques et subcliniques, améliorant la croissance, la productivité et l’homogénéité des lots. Enfin, des animaux mieux protégés nécessitent moins de traitements antibiotiques, participant ainsi à la réduction de l’usage des antimicrobiens et à la lutte contre l’antibiorésistance

Procédures

Tous les actes se feront sur animal vigile : Pose de transpondeurs sous-cutanés (1 fois par animal, durée de l'acte moins de 2minutes), Injection d'un vaccin une à deux fois en fonction des groupes à J0 et J28 ( durée de l'acte moins de 2 minute par animal), prélèvements sangins à J0, J27 et J80 : 10ml (Durée de l'acte mois de 5 minutes par animal, contention comprise)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent principalement le stress induit par la manipulation et la contention des animaux, la douleur ainsi que les éventuels hématomes associés aux prélèvements sanguins, et la douleur liée aux injections intramusculaires. Des effets indésirables transitoires (fièvre, baisse de l’appétit) peuvent également survenir à la suite des injections. Par ailleurs, une gêne ou une douleur passagère peuvent être observées lors de l’implantation du transpondeur.

Devenir

Les animaux sont maintenus sous surveillance dans leur zone d'hébergement durant toute la procédure, jusqu'à leur mise à mort à J110. Un examen macroscopique des sites d'injection est alors réalisé au niveau de l'encolure. Le prélèvement de cette zone étant terminal, il ne permet pas le maintien en vie des individus.

Remplacement

Les modèles in vitro et ex vivo permettent aujourd’hui d’obtenir des informations précieuses sur les mécanismes immunologiques de base, mais ils ne peuvent pas reproduire l’ensemble de la complexité de la réponse immunitaire d’un organisme vivant. Les adjuvants agissent à plusieurs niveaux : activation de l’immunité innée, recrutement cellulaire au site d’injection, présentation de l’antigène, induction de la mémoire immunitaire… Ces processus impliquent une interaction dynamique entre cellules, tissus et médiateurs circulants, qu’aucun modèle in vitro ne peut entièrement reproduire. Les réactions locales (inflammation, nécrose, granulome) et systémiques (fièvre, baisse d’appétit, altération du comportement) ne peuvent être observées que chez l’animal entier. Ces effets sont essentiels à mesurer pour garantir le bien-être animal et la sécurité du vaccin avant toute application en élevage.

Réduction

Des études antérieures ont établi qu'un effectif minimal de sept animaux par groupe est nécessaire pour garantir la fiabilité statistique des résultats.

Raffinement

Le raffinement proposé repose sur plusieurs points essentiels destinés à optimiser le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation : 1. Conditions d’hébergement : Les animaux seront hébergés en loges sur caillebotis, équipées de chaînes et de balles servant de jouets d’enrichissement. Ils auront un accès permanent à l’eau (ad libitum) et seront nourris deux fois par jour (matin et soir). Chaque loge comprendra une zone de repos propre, distincte de la zone d’alimentation, afin de favoriser le confort et le comportement naturel des animaux. 2. Interventions et habituation Toutes les interventions seront réalisées dans le calme, avec récompense alimentaire à la clé pour limiter le stress. Une habituation progressive au jus de pomme sera mise en place dès la semaine précédant le début de l’expérimentation, afin de faciliter notamment la troisième prise de sang, identifiée comme la plus sensible. 3. Suivi sanitaire et critères de vigilance Les animaux feront l’objet d’une surveillance biquotidienne. Les paramètres suivants seront systématiquement suivis et consignés dans les données expérimentales : température, réactions au site d’injection et signes allergiques. Pour chaque critère, ainsi que pour le comportement général de l’animal, une grille de référence définit des points limites gradés et les actions de soins associées

Choix des espèces

L'objectif du projet est de tester des adjuvants pour la mise au point de vaccins porcins donc nous testons ces adjuvants sur l'espèce porcine. Les porcs seront utilisés de l'âge de 42 jours (jeune porc en croissance) à 152 jours pour coller à ce qui se fait en élevage. La primo injection du vaccin se fait souvent assez jeune (ici à 42 jours) avec un rappel 28 jours plus tard. Nous conservons les animaux jusqu'à 152 jours pour avoir un suivi de 110 jours après la primo-injection et ainsi vérifier l'innocuité du produit testés.

Trois anesthésies générales de deux à deux heures trente en quatre à six jours, une injection de manganèse dans l'abdomen sous endoscopie et trois injections intraveineuses à la jugulaire attendent chaque brebis. 24 brebis au maximum vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le porteur prévoit un effectif majoré "pour pallier les pertes éventuelles liées aux longues anesthésies successives", tout en indiquant n'avoir observé aucun effet néfaste du manganèse lors de l'expérience pilote, après avoir rappelé sa neurotoxicité à forte dose chez l'être humain. Les brebis sont tuées sous anesthésie parce que la durée de persistance du manganèse dans leur organisme reste inconnue, ce qui interdit toute réutilisation.

Objectifs

L’objectif est de mettre en place la technique d’Imagerie par Résonnane Magnétique du manganèse in vivo à l'échelle du cerveau entier chez l’ovin. Les propriétés paramagnétiques du manganèse (Mn2+) permettent son utilisation comme agent de contraste pour l'IRM (MEMRI : IRM du ManganEse). C’est un composé qui pénètre et s'accumule dans les neurones actifs, donc sa concentration intracellulaire est le reflet direct de l'activité neuronale. Cette technique permet de visualiser les changements du cerveau en réponse à des stimulis. La dynamique du Mn2+ (biodisponibilité, pharmacocinétique) dépend de l'espèce, il est donc nécessaire de réaliser des mises au point sur le cerveau d’ovin. Une première expérience pilote a été réalisée sur 5 animaux ; cette expérience nous a permis de déterminer la dose minimale de Mn2+ à utiliser. Nous avons également observé les zones de diffusion du Mn2+ 24h post administration. Il est nécessaire de compléter et d’affiner ces résultats, notamment en analysant des points de cinétique qui manquent à notre analyse : les temps 48, 72 et 96 heures post-administration de manganèse. Dans le cadre de cet avenant, nous souhaitons réaliser l’acquisition d’images IRM supplémentaires pour 6 animaux à 1 temps long, à 22 jours post administration de manganèse. Pour cela, six brebis seront donc anesthésiées 1 fois de plus, à distance de leur dernière anesthésie. MODIFICATION : NOUS DEMANDONS L'AJOUT DE 4 ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES POUR APPORTER DES PREUVES SOLIDES SUR LA FAISABILITE ET LA RESOLUTION DE LA TECHNIQUE DEVELOPPEE, EN UTILISANT UNE STIMULATION COMPORTEMENTALE POSITIVE.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir la fenêtre temporelle optimale pour l’acquisition du meilleur contraste en IRM MEMRI. Après injection, la concentration du manganèse augmente graduellement dans les tissus du cerveau, puis sa détection atteint un plateau, persiste pendant plusieurs heures et ensuite décroit. C’est la fenêtre correspondant au plateau qu’il s’agit de déterminer chez l’ovin. Une fois cette fenêtre temporelle définie, nous pourrons réaliser les expériences d’IRM fonctionnelle. Les mises au point des conditions de dose et temps dans cette expérimentation préliminaire bénéficieront à des appels à projet ultérieurs. Ce projet est une étape clé dans la mise en œuvre des études d’IRM fonctionnelle chez les ovins en utilisant une approche MEMRI par réhaussement de manganèse.

Procédures

Entre 12 animaux et 20 animaux subiront les gestes techniques, 20 est un nombre maximal prévu pour pallier les pertes éventuelles liées aux longues anesthésies successives. Les animaux subiront 3 anesthésies sur une durée de 4 jours pour 6 à 10 animaux maximum, et 5 jours pour 6 à 10 animaux maximum, pour passage à l'IRM. La 1ère anesthésie durera 2h30, les 2 autres 2h. Ils recevront également une injection intra-péritonéale sous anesthésie générale. Ils subiront 3 injections par voie intraveineuse à la jugulaire pour induire les anesthésies (durée totale contention comprise d'une minute). LES 4 ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES SUBIRONT 3 ANESTHESIES SUR UNE DUREE DE 6 JOURS. LA 1ERE ANESTHESIE DURERA 30 MINUTES, LES 2 AUTRES 2H. ILS RECEVRONT EGALEMENT UNE INJECTION INTRA-PERITONEALE SOUS ANESTHESIE GENERALE. ILS SUBIRONT 3 INJECTIONS PAR VOIE INTRAVEINEUSE A LA JUGULAIRE POUR INDUIRE LES ANESTHESIES (DUREE TOTALE CONTENTION COMPRISE D'UNE MINUTE).

Impact sur les animaux

Bien qu’il soit un élément nécessaire au bon fonctionnement de l’organisme, le manganèse est cependant neurotoxique à forte dose. Chez l’homme, il provoque maux de tête, insomnies, pertes de mémoire, instabilité émotionnelle, dystonie, tremblements, troubles du langage et des troubles de la marche. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse.

Devenir

A la suite des acquisitions, tous les animaux seront mis à mort toujours sous anesthésie générale. En effet, ils ne pourront pas être réutilisés car nous ne savons pas combien de temps le manganèse reste dans l'organisme des animaux. POUR LES 4 ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES DEMANDES LES CERVEAUX SERONT PRELEVES A L'ISSUE DU PROJET.

Remplacement

Cette étude d‘imagerie cérébrale permettant de déterminer la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste IRM, ET DE PROUVER L'EFFICACITE DE LA TECHNIQUE SUITE A UNE STIMULATION COMPORTEMENTALE, ne peut être réalisée qu’in vivo. Il est en effet impossible d’étudier ou de reproduire ces expériences in vitro et encore moins in silico. Ce projet est un prérequis pour développer l’approche d’imagerie MEMRI qui permettra, ultérieurement, de mettre en place des projets longitudinaux, avec des nombres restreints d’animaux expérimentaux.

Réduction

Ce projet, qui concerne 12 animaux expérimentaux (24 animaux maximum) est nécessaire car il complétera et affinera les résultats obtenus lors d’une précédente expérience. L’évolution temporelle de la concentration de Mn2+ dans le cerveau d’ovins a été déterminée 24h, 72h et 120h après son administration. Les points 48h et 96h n’ont pas été étudiés et sont indispensables pour déterminer la fenêtre d’acquisition optimum pour obtenir le meilleur contraste. Nous avons planifié l’expérience de manière à acquérir des images IRM à deux temps post-administration de Mn2+ pour chaque animal, ce qui réduit considérablement le nombre d’animaux. Nous pensons qu’avec 4 temps d’analyse post-administration de Mn2+ et 6 animaux (10 animaux maximum) par temps (6 animaux imagés aux temps 24h et 72h et 6 animaux imagés aux temps 48h et 96h post-administration de Mn2+), la disponibilité du manganèse dans le cerveau des ovins au cours du temps pourra être modélisée par un ingénieur expert en pharmacologie. La taille de nos effectifs (6 individus par traitement expérimental) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances (tests paramétriques ou non paramétriques). LA MODIFICATION CONCERNE 4 ANIMAUX EXPERIMENTAUX. ELLE PERMETTRA D’APPORTER UNE REPONSE CLAIRE (OUI/NON) SUR LA FAISABILITE DE LA TECHNIQUE TESTEE, SUITE A UNE STIMULATION POSITIVE FORTE. AU COURS DE CE PROTOCOLE, 3 ANESTHESIES SUCCESSIVES SONT PREVUES. LE NOMBRE DE 4 ANIMAUX NOUS PERMETTRA DE NE PAS RE-ENDORMIR UNE BREBIS SI SON REVEIL PRECEDENT A ETE TROP COMPLIQUE.

Raffinement

Pour limiter les stress liés à la manipulation des brebis, les 12 brebis (20 maximum) seront regroupées pour rester ensemble toute la durée de l’expérience et former ainsi un groupe social stable. Deux semaines avant les expériences, les manipulateurs iront quotidiennement approcher les brebis, les toucher et évoluer parmi elles pour établir un contact et lors de chaque visite, nous leur donnerons à chacune une poignée de granulés comme renforcement positif, ce qui participera à leur habituation. Nous n’avons pas observé d’effet néfaste de l’administration intra péritonéale de manganèse à la dose utilisée lors de l’expérience pilote, néanmoins, les brebis feront cette fois aussi, l’objet d’une surveillance accrue dans la période qui suivra l’administration de Mn2+, et ce jusqu’à l’anesthésie pour l’imagerie suivante. Au cours de cette période, l’apparition de tremblements, les difficultés de déplacement, la prise alimentaire seront particulièrement surveillés. Nous serons attentifs à la survenue de signes de mal être (position des oreilles, port de la tête, prostration). Dans le cas où de tels signes apparaitraient, un traitement analgésique sera administré. Nous avons opté pour une administration sous endoscopie du manganèse qui permet de nous assurer de la qualité de l’injection en intrapéritonéale ainsi que de la progressivité de l’injection : sous anesthésie générale, nous pouvons adopter une vitesse d’injection réduite susceptible de limiter l’apparition d’effets indésirables. Les animaux expérimentaux seront maintenus dans des conditions adaptées aux herbivores, litière de paille et foin ad libitum. Ils seront manipulés dans le calme par des agents expérimentés. Les animaux arriveront sur la plateforme 3 jours avant le début de l’expérimentation, pour s’habituer à l’environnement. Avant l’anesthésie, et pour réduire la météorisation et assurer quand même leur confort, ils auront accès à du foin de bonne qualité en quantité limité avec abreuvement adlibitum. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé.

Choix des espèces

L’espèce ovine sera utilisée dans ce protocole car cette approche d’imagerie MEMRI sera utilisée pour étudier les circuits cérébraux impliqués dans les interactions sociales et sexuelles dans cette espèce. Un lot homogène de brebis de 18 mois sera utilisé, car nous souhaitons que cette approche soit validée dans les conditions où les animaux ont terminé leur développement. Dans un premier temps, cette approche sera développée chez les brebis car ce sont elles qui sont présentes majoritairement en élevage. Elle sera ensuite transférable (dose de MnCl2+ et temps de diffusion de manganèse jusqu’à la phase plateau) chez les béliers. Un essai avec quelques individus sera réalisé plus tard pour la validation chez les mâles. Aucune différence dans la distribution cérébrale du manganèse dans le cerveau entre les mâles et les femelles n’est cependant attendue.

Pour tester la tenue à six mois d'électrodes cérébrales souples destinées aux troubles de la conscience, 58 miniporcs se font implanter ces électrodes en profondeur dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal enchaîne des séances d'imagerie d'une à deux heures sous anesthésie, deux enregistrements de l'activité cérébrale par semaine le premier mois puis un toutes les deux semaines pendant cinq mois, et des anesthésies générales de quatre heures destinées à simuler une altération de la conscience. Le porteur annonce des douleurs, une hypothermie, une déshydratation, des troubles neurologiques, un risque d'infection et un risque de rejet de l'implant. Tous les miniporcs sont tués pour l'examen histologique des tissus, sans qu'aucun élément n'indique comment l'effectif de 58 a été arrêté.

Objectifs

Jusqu’à 6 % de la population mondiale souffrirait de troubles de la conscience (DoC) caractérisés par une altération aigue et globale des fonctions mentales et une incapacité à répondre à des stimuli. Les DoC comprennent le coma, l’état végétatif (absence de conscience en dépit d’une vigilance préservée) et l’état de conscience minimale (mais incapacité à communiquer). Ils sont dus à une perte de l’intégrité de réseaux neuronaux (comprenant des millions de neurones interconnectés) et de leurs neurotransmetteurs qui régulent l’état d’éveil et de conscience. Les causes des DoC sont diverses : traumatisme crânien, hémorragie, ischémie, infection… induisant de multiples mécanismes d’un patient à l’autre qu’il est indispensable d’explorer afin d’élaborer une thérapie personnalisée. A ce jour, aucun traitement n’est reconnu. Des études utilisant des agents pharmacologiques ou une neurostimulation ont montrées des améliorations chez certains patients. Mais les bénéfices sont hétérogènes et la neurostimulation, lourde et peu accessible pour les patients, nécessite un gros développement pour la mise en place de paramètres personnalisés. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les DoC et de permettre la mise en place d’une thérapie personnalisée. Pour cela, nous utiliserons un implant innovant biocompatible miniature mimant les propriétés mécaniques du tissu cérébral et minimisant la réponse immunitaire. Ce dispositif unique offre aussi la possibilité d’effectuer des enregistrements de l’activité cérébrale et de la neurostimulation des zones cérébrales périphériques au plus profondes. Les électrodes seront implantées dans des régions cérébrales impliquées dans les DoC, sur 6 mois chez le miniporc, afin d’évaluer ses performances d’enregistrements et de neurostimulations à long terme. Le miniporc est un modèle adapté de par une anatomie cérébrale et des contraintes chirurgicales similaires à l’Homme. Les DoC seront simulés grâce à des niveaux d’anesthésie plus ou moins profonds. Les principaux agents pharmacologiques utilisés chez l’Homme seront aussi administrés afin d’évaluer leur action sur l’activité cérébrale.

Bénéfices attendus

Cette étude pourrait, à court terme, permettre de valider et de mettre en place chez le miniporc une nouvelle approche d’anesthésie déjà bien développée chez l’Homme et qui présente de nombreux avantages en comparaison aux méthodes « conventionnelles » : réveil et récupération plus rapide, dosage plus précis, profondeur d’anesthésie plus stable et contrôlable (modérée ou profonde) et moins d’effets secondaires. Elle permettra aussi d’enrichir les connaissances sur le cerveau du miniporc grâce aux imageries réalisées ce qui nous permettra d’améliorer la précision de futures chirurgies. Les autres bénéfices attendus du projet sont d’évaluer à long terme un nouveau type d’électrodes miniatures et souples, mimant les propriétés mécaniques du tissu cérébral ce qui minimise la réponse immunitaire. Ces électrodes, qui permettent un enregistrement tout au long de leur axe, offriraient une possibilité de recueillir des signaux cérébraux sur une importante profondeur et permettraient d’enregistrer de multiples zones cérébrales avec un seul dispositif. Ici nous les utiliserons dans le cadre des DoC afin de mieux évaluer les mécanismes impliqués dans cette pathologie et d’analyser les effets thérapeutiques d’une neurostimulation. La double fonction des électrodes, enregistrements et neurostimulation, leur confèrerait également un potentiel de traitement dans certains troubles neurologiques. La souplesse des électrodes, tout comme leur capacité d’enregistrements, pourraient aussi grandement participer à développer le domaine des interfaces cerveau-machine qui prend de plus en plus d’ampleur.

Procédures

Avant la chirurgie, des séances d’imagerie (de 1 à 2h00) seront réalisées sous anesthésie afin de déterminer la meilleure trajectoire d’implantation des électrodes. Pour le transport entre la zone d’hébergement (stabulation) et le service d’imagerie, les animaux seront anesthésiés par injection afin d’éviter tout stress. La chirurgie d’implantation sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront aussi exposés, sous anesthésie générale, après la chirurgie, à une séance d’imagerie (de 1 à 2h) mensuelle au maximum pour vérifier la position des électrodes. Après la chirurgie et une période de récupération d’une semaine au minimum, les animaux seront exposés éveillés (1h environ) et sous anesthésie générale pour simuler les DoC (qui se limitera à 4h pour ne pas trop les fatiguer) à des sessions d’enregistrement de l’activité cérébrale : signaux EEG (électroencéphalogramme). Le 1er mois 2 enregistrements par semaine sont prévus (espacés de 72h au minimum) et les 5 mois suivants un enregistrement toutes les 2 semaines. Après obtention d’une ligne de base de l’activité cérébrale, les enregistrements seront effectués, bimensuellement au maximum, sous microstimulation cérébrale ou sous agents pharmacologiques utilisés chez l’Homme pour traiter les DoC. Chaque animal pourra être soumis, sous anesthésie générale, à une prise de sang si son état requière une analyse. L’euthanasie sera effectuée sous anesthésie générale et analgésie.

Impact sur les animaux

Tout acte chirurgical visant à poser un implant cérébral en profondeur peut engendrer chez les animaux : douleur, pertes de poids, hypothermie, déshydratation, troubles neurologiques, risque d’infection au niveau du site d’incision ou d’implantation. Le réveil après une anesthésie générale peut induire une désorientation et un stress de courte durée. Une anesthésie générale peut engendrer un état de fatigue transitoire. La pose d’un dispositif implantable peut induire une irritation, une réaction inflammatoire, une infection ou encore un rejet.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés selon un protocole approprié, afin d’obtenir les prélèvements requis pour les analyses histologiques pour compléter scientifiquement l’étude. L’étude des tissus est indispensable pour valider la bonne tolérance de l’implant à long terme.

Remplacement

Même si les techniques d’aujourd’hui comme la construction d’organoïdes permettent de limiter l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro ou in silico permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques. Les mécanismes des DoC étant très mal connus, ces derniers ne peuvent être reproduits qu’in vivo pour le moment. Nous devons aussi évaluer et valider à long terme l’intégrité et la fonctionnalité du dispositif implantable composé d’électrodes souples, ce qui ne peut être réalisé que sur des organismes entiers, complets avec leur physiologie et leur complexité sur le plan biologique. En amont, des premiers tests de cytotoxicité et de biocompatibilité, pour sécuriser au maximum l’implantation des dispositifs, ont été réalisés et validés, notamment chez le rongeur.

Réduction

Même si les techniques d’aujourd’hui comme la construction d’organoïdes permettent de limiter l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, il n’existe pas à ce jour de modèle in vitro ou in silico permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques. Les mécanismes des DoC étant très mal connus, ces derniers ne peuvent être reproduits qu’in vivo pour le moment. Nous devons aussi évaluer et valider à long terme l’intégrité et la fonctionnalité du dispositif implantable composé d’électrodes souples, ce qui ne peut être réalisé que sur des organismes entiers, complets avec leur physiologie et leur complexité sur le plan biologique. En amont, des premiers tests in vitro pour sécuriser au maximum l’implantation des dispositifs, ont été réalisés et validés, notamment chez le rongeur.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation par des personnes expérimentées, afin d’assurer leur bien-être pendant les changes, les pesées, les protocoles, les anesthésies, les prises de sang ou tous soins nécessaires post chirurgie. Ils seront également entraînés par renforcement positif à rester dans un hamac avant le début des sessions d’enregistrements. Pour chaque chirurgie, l’animal sera sous anesthésie générale et analgésie, ses fonctions cardiaques et respiratoires seront monitorées tout comme la quantité d’oxygène dans le sang, sa température corporelle qui sera maintenue à 37 °. Un gel ophtalmique sera également appliqué pour éviter son inconfort. Des soins post opératoires adéquates seront adaptés pour chaque animal et des antalgiques seront utilisés le temps nécessaire. Toutes les imageries ou les prises de sang en cas de besoin seront réalisées sous anesthésie générale. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement tout au long de l’expérience, avec une surveillance accrue en sortie de chirurgie et d’anesthésie générale et tout sera mis en œuvre pour que les animaux aient un niveau d’inconfort aussi limité que possible. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués et en cas d’effets inattendus des traitements appropriés seront immédiatement mis en œuvre et/ou il pourra être décidé d’interrompre l’expérimentation. En parallèle, le vétérinaire sera alerté.

Choix des espèces

Compte tenu des objectifs de l’étude, le modèle porcin est plus pertinent que le modèle rongeur notamment du fait de la taille de l’implant à tester (semblable à celui destiné à l’Homme), de la durée sur laquelle le dispositif doit rester implanté et du déroulé des sessions d’enregistrement et de neurostimulation. Le miniporc offre aussi la possibilité de simuler les conditions d’une future implantation humaine du dispositif. Enfin, les mouvements du cerveau produits chez le miniporc génèrent une instabilité des signaux similaire à celle rencontrée chez l’Homme. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes du fait de la durée d’implantation (6 mois) et de la taille des implants. Des animaux juvéniles âgés de 6 semaines (permettant une meilleure habituation à la manipulation et une meilleure constitution des groupes sociaux du fait de leur jeune âge) seront réceptionnés et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Les chirurgies seront réalisées sur les animaux jeunes adultes d’environ 8 semaines. Les animaux seront utilisés dans la procédure à l’âge adulte, entre 2 et 8 mois.

Une injection de staphylocoques directement dans la rotule, sous contrôle radiologique, provoque chez 84 porcs une infection osseuse chronique. Âgés de deux à trois mois, ils sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous mis à mort en fin de protocole pour le prélèvement de leurs rotules. Deux angiographies sous anesthésie générale suivent, à une semaine pour administrer des bactériophages et à deux semaines pour vérifier le résultat, l'objet déclaré étant de traiter localement les infections sur prothèse résistantes aux antibiotiques. Le porteur énumère la boiterie, la fièvre, la perte de poids, la fatigue et l'œdème du genou parmi les effets attendus, et conclut qu'il n'y aura pas de nuisance supplémentaire en dehors du stress de la prémédication.

Objectifs

L'ostéomyélite chronique (infection de l'os), peut durer très longtemps, parfois des années, et provoquer des douleurs récurrentes. Son traitement est compliqué, car il repose souvent sur des cures longues d’antibiotiques. Ces traitements peuvent avoir des effets secondaires et, avec le temps, les bactéries deviennent parfois résistantes, en particulier les staphylocoques. Une alternative prometteuse est l'utilisation de bactériophages, des virus ciblant spécifiquement certaines bactéries. Cette méthode suscite un intérêt croissant en France, particulièrement pour traiter les infections osseuses liées aux prothèses (comme les prothèses de genou ou de hanche). Cependant, l'administration intraveineuse actuelle des bactériophages conduit à une concentration insuffisante au sein des os infectés. Une administration locale pourrait pallier ce problème, mais sans garantie d'une diffusion adéquate en profondeur. Dans ce contexte, notre projet vise à intégrer les techniques de radiologie interventionnelle (imagerie vasculaire) utilisées pour boucher des vaisseaux dans différentes régions anatomiques, avec le développement d'un nouveau dispositif médical associant des bactériophages. L'objectif est donc de créer un modèle porcin d'ostéomyélite infectieuse du genou pour mieux comprendre cette pathologie et tester l'efficacité de dispositifs médicaux innovants permettant une administration ciblée et efficace de bactériophages dans la zone infectée.

Bénéfices attendus

Ce projet se positionne à l'avant-garde de la recherche en infectiologie et orthopédie. Il a l'ambition de développer un modèle expérimental chez le cochon pour étudier les infections osseuses. Ce modèle se distingue par son choix judicieux du cochon, un organisme dont la proximité immunologique et physiologique avec l'humain fournit des connaissances précieuses. Un aspect particulièrement innovant de ce projet réside dans le choix de la rotule comme site d'étude, un os facilement accessible et doté d'une vascularisation simplifiée. Cette approche ouvre des perspectives enrichissantes pour l'étude de nouveaux vaisseaux apparaissant au cours de l'infection et pour l'évaluation de nouvelles stratégies de traitement injectés localement. L'objectif est double : approfondir notre compréhension des mécanismes de l'ostéomyélite et élaborer des traitements plus précis et efficaces, surtout face au problème grandissant des bactéries résistantes aux antibiotiques. Ainsi, ce projet ne vise pas seulement à enrichir les connaissances actuelles, mais également à ouvrir des voies prometteuses pour des interventions cliniques améliorées et plus ciblées.

Procédures

Le 1er jour, les animaux seront anesthésiés sur une courte durée pour l'induction d'une infection au niveau du genou, par injection d'une bactérie directement dans la rotule sous rayons X (30 min maximum). Après une semaine environ, réalisation d'une angiographie (examen d'imagerie d'environ 1 heure) afin de valider la présence de l'infection, l'apparition de nouveaux petits vaisseaux sanguins (marqueurs d'une inflammation locale), et traitement avec des bactériophages (virus s'attaquant aux bactéries responsables de l'infection). Après deux semaines, réalisation d'une angiographie pour vérifier la réussite du traitement. L'angiographie est une méthode mini-invasive non chirurgicale, qui permet de cibler un lieu d'injection en passant par les vaisseaux sanguins. Elle se réalise sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

D'un point de vu clinique, le projet visant à provoquer une infection au niveau du genou, l'apparition d'une gêne ou d'une douleur peut être envisagée, associée à un changement de comportement de l'animal qui se préservera de déplacements inutiles (apparition de boiterie par exemple). De même, des signes généraux directement liés à l'infection pourraient être observés : fièvre, perte de poids, fatigue, œdème du genou, rougeurs. Lors des sessions d'imagerie interventionnelle, les animaux seront anesthésiés et préservés de la douleur par l'administration de traitements adéquates. Il n'y aura donc pas de nuisances supplémentaire en dehors du stress qui pourrait être ressenti lors de la prémédication.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour permettre le prélèvement des rotules qui seront ensuite analysées.

Remplacement

Il s’agit d’une étude ayant pour objectif de vérifier l'efficacité et la précision d'une technique interventionnelle, permettant de cibler précisément une zone à traiter. Il n’existe pas de méthode alternative permettant d’atteindre cet objectif dans des conditions le plus proches possibles des cas cliniques chez l'humain. Les expériences faites en laboratoire sur des cellules, bien qu'utiles pour certaines études préliminaires, ne parviennent pas à reproduire de manière adéquate les interactions dynamiques entre les organismes entiers et les bactéries, ni la complexité des vaisseaux sanguins dans l'os. De même les simulations informatiques, bien qu'avancées, ne peuvent pas encore imiter de façon exhaustive les réponses complexes de l'organisme vivant.

Réduction

Pour ce projet, le nombre d'animaux a été évalué au minimum tout en gardant un nombre suffisant pour que les résultats restent fiables. Après calcul, nous avons estimé qu’il fallait au moins 12 genoux par groupe pour pouvoir réaliser des analyses solides grâce aux tests statistiques utilisés. Cette taille d’échantillon permet repérer une différence réelle entre les groupes si elle existe, ou de valider un groupe pilote testant un nouveau traitement. L'analyse des résultats sera basée sur l'étude et la comparaison des données qualitatives et des données quantitatives (mesures faites avant et après traitement sur le même genou).

Raffinement

Nous attacherons une importance majeure au raffinement des conditions d’hébergement et d'enrichissement pendant la période d'acclimatation d'une semaine minimum et tout au long de la procédure. Afin de limiter leur stress, les animaux seront hébergés en groupe. L'enrichissement est réalisé en créant une zone de repos couverte de litière, leur permettant de s'allonger tous ensemble et de répondre à leur comportement de fouissement. Ils disposent également de jouets suspendus à mordiller. Pour la phase d'injection dans le genou, une anesthésie courte sera réalisée. Une fois infectés, les animaux seront surveillés pour détecter tout changement de comportement. Le suivi quotidien de la température de l’animal sera un critère de vigilance. En cas de fièvre, un prélèvement sanguin sera réalisé pour vérifier certains marqueurs biologiques, et mettre en place des actions adaptées (points limites). Les gestes interventionnels (angiographie) seront toujours réalisés sous anesthésie générale afin de prévenir la souffrance et l’angoisse de l’animal, de même que la mise à mort. Lors des quelques gestes possiblement douloureux pendant la réalisation de l'angiographie, un antidouleur morphinique sera utilisé.

Choix des espèces

Le porc est un modèle souvent utilisé en recherche sur les maladies infectieuses parce qu'il présente un système immunitaire proche de l'être humain, offrant ainsi un aperçu plus réaliste des réactions aux infections. De plus, le porc est un bon modèle d'étude des vaisseaux sanguins. Ces deux critères réunis, associés à notre expertise sur cette espèce notamment en imagerie interventionnelle, il est un modèle de choix pour réaliser cette étude. Les animaux sont choisis au terme du post-sevrage à l'âge de 2-3 mois, pour des raisons techniques (poids entre 25 et 35 kg) car sa taille permet de réaliser des gestes et d'utiliser du matériel identique à ceux de la médecine humaine.

Soumises trois fois à la pose d'une éponge intravaginale, à une injection intramusculaire d'hormone puis à quinze jours de prélèvements sanguins quotidiens à la jugulaire, 75 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste une hormone recombinante censée remplacer celle qui est aujourd'hui purifiée à partir du sang de juments gestantes, prélèvements suivis d'avortements provoqués que le porteur décrit comme plus rentables pour la production. Il présente le bénéfice principal comme une réponse aux "attentes sociétales" sur le bien-être des animaux non-humains, et affirme que le "besoin" d'une molécule de ce type est "réel et pressant" pour les entreprises et les éleveurs. Les 25 brebis traitées avec l'hormone naturelle retournent à l'élevage, les 50 autres, traitées avec la recombinante faute d'autorisation de mise sur le marché, sont tuées et envoyées à l'équarrissage.

Objectifs

La maîtrise de la reproduction en élevage des ruminants (bovins, ovins, caprins) ainsi que des porcins fait appel depuis 70 ans à une hormone naturelle très active, purifiée à partir de sang de juments gestantes (PMSG : Pregnant Mare Serum Gonadotropin, aussi appelée eCG : equine Chorionic Gonadotropin). Les fortes oppositions d’ordre éthique liées au bien-être animal nous ont conduit à envisager la production de cette hormone par génie génétique et sa production in vitro en cultures cellulaires, donc sans prélèvement de sang sur des « animaux-usines ». L’objectif du projet est de réaliser une preuve de concept de la capacité des eCG recombinantes d’induire une ovulation fertile chez la brebis avec une efficacité similaire à celle de la eCG extraite du sang des juments gravides. L’objetif final est le dépôt d’une demande de brevet pour les eCG recombinantes afin de proteger la proprieté intellectuelle.

Bénéfices attendus

Le principale benefice de l’eCG recombinante est de répondre aux attentes sociétales concernant le bien-être animal. En effet, on évitera de prélever de grands volumes de sang chez des juments gestantes, puis souvent de réaliser les avortements car les concentrations baissent fortement dans la deuxième moitié de la gestation et qu’il est plus rentable pour la production de l’hormone de redémarrer une gestation. Redistribuer à des millions d’animaux d’élevage une eCG partiellement purifiée provenant de sérums de multiples juments, au statut sanitaire inconnu, constitue un risque. En 2017 l’Union Européenne a publié un rapport dans lequel elle se dit "vivement préoccupée par l'importation et l'utilisation de médicaments vétérinaires contenant de la eCG". Cette situation impacte très négativement l’image des industriels et des éleveurs, lesquels se trouveraient par ailleurs en grande difficulté en cas d’interdiction de la eCG naturelle. Par ailleurs, en l’état, la capacité de synchroniser les ovulations par des méthodes sans hormone (effet mâle et photopériode pour les brebis) est insuffisante pour la pratique efficace de l’insémination artificielle, véritable pilier de la diffusion du progrès génétique en élevage. Le besoin d’une molécule de type eCG est réel et pressant pour les entreprises et les éleveurs, avec un cahier des charges exigeant, respectueux du bien-être animal. Notre proposition est le développement d’une eCG recombinante largement similaire à la eCG mais n’impliquant pas, de fait, le prélèvement de volumes sanguins très conséquents chez des juments gestantes. Ceci permettrait donc d’éliminer l’utilisation des juments pour la production de l’eCG et par consequant une amélioration du bien être animal.

Procédures

Chaque brebis sera soumise à 3 séries d’expériences et chaque expérience est constituée de la pose d'une éponge intravaginale et d’une injection intramusculaire d’hormone suivie, en fonction des lots experimentaux, par quinze jours de prélèvements sanguins à raison d’un prélèvement par jour et par brebis ou d'un seul prélevement 8 jours après l'injection de l'hormone. Chaque prélèvement sanguin dure entre 3 et 5 seconds.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang à la jugulaire peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les injections en intramusculaire peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose d’une éponge intravaginale peut être désagréable pour la brebis.

Devenir

Comme l’eCG naturelle possède une AMM (autorisation de mise sur le marché) les 25 brebis traitées avec cette eCG seront réplacées et retourneront dans l’élevage. Par contre, comme l’eCG recombinante n’a pas d’AMM les brebis traitées avec cette molécule seront euthanasiées et envoyées à l’équarissage.

Remplacement

La physiologie est bien plus que la somme des multiples niveaux d’action – que nous sommes loin d’appréhender. Et cette somme ne peut pas être anticipée ; notre niveau de connaissance est très insuffisant. Chaque niveau interagit avec celui ou ceux qui a (ont) engendré son activité, et réagit aussi en fonction des niveaux d’intégration supérieurs afin de produire la réponse physiologique la mieux adaptée (le nombre de paramètres intégrés nous échappe largement mais reste la clé de l’adaptation des organismes à leur environnement – laquelle est en perpétuelle évolution). Tout cela ne peut se produire que dans un organisme entier ; aucune possibilité de reproduire cette somme d’interactions dans un modèle in vitro – on parle ici assurément de multiples (dizaines?) de types cellulaires et d’organes « indépendants » - ou dans un quelconque modèle in silico – qui restera toujours borné par les informations (partielles et incomplètes) dont nous pouvons le nourrir. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. Ceci justifie pleinement l’emploi d’animaux entiers ; seuls à même de rendre compte de ce que signifie la physiologie, et seule option valide pour espérer modifier les paramètres de celle-ci

Réduction

Nous allons réutiliser le même lot de brebis pour réaliser les trois experiences prévues dans le projet. Nous allons utiliser trois lots de 25 brebis. Ce nombre a été éstimé en utilisant un test de comparaison de deux proportions (proportion de brebis ayant ovulé et nombre d'ovulations fertiles dans chaque groupe).

Raffinement

Suite à l’injection et au prélèvement de sang nous donnerons des granulés à manger comme renforcement positif. Tout au long des experiences les animaux seront régulierement surveillés pour identifier des possibles signes de douleurs ou d’inconfort. Tout signe d’inconfort et/ou de douleur sera pris en charge par des antalgiques locaux. Les brebis étant des animaux sociaux resteront en groupe tout au long de l’expérience afin d’éviter un stress d’isolement social. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période des prélèvements pour évaluer l'état de bienêtre des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence seront suivi avec attention pour détecter d'éventuels signes de souffrance et de détresse. En cas de signe de détresse et de malêtre significatif, les animaux seront traités comme suit : Anti inflammatoire non stéroïdien en intramusculaire éventuellement renouvelé 48H après si signes douloureux. Dans le cas où ces traitements ne résulteraient pas en une amélioration significative de l’état des animaux, ou dans le cas où certains comportements témoignant une douleur seraient détectés les animaux seraient alors euthanasiés par surdosage de barbituriques intraveineux.

Choix des espèces

La brebis est une des espèces cibles pour l’utilisation d' eCGs recombinante dans la maitrise de la reproduction en élévage. En outre la brebis est un modèle largement utilisé pour l’étude de la reproduction chez les animaux d’élevage et nous pouvons nous baser sur une littérature très riche sur ce modèle. Pour pouvoir étudier l'effet sur l'ovulation et la fertilité nous utiliserons des brebis adultes.