Mammifères "de rente"

Apporter la preuve qu'une prothèse biologique peut concurrencer les bandelettes synthétiques retirées de la clinique en Angleterre, au Canada et en Nouvelle-Zélande : 48 brebis sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est opérée par voie vaginale sous péridurale pendant une à deux heures pour recevoir une bandelette sous-urétrale, à raison d'une brebis par demi-journée sur six jours, puis suivie deux à six mois. Les complications attendues comprennent des saignements abondants, une dysurie, des infections et des douleurs, et chaque lot de seize compte une brebis de remplacement prévue en cas de décès après l'opération. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les organes du bassin, sauf les remplaçantes non implantées, et le porteur retient des brebis de six ans et plus ayant mis bas au moins trois fois, pour mimer le relâchement des tissus vieillissants.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’apporter des preuves expérimentales qu’un greffon entièrement biologique a le potentiel de devenir une solution chirurgicale alternative pertinente au traitement de l’incontinence urinaire d’effort. Une comparaison avec les traitements chirurgicaux standards actuels (prothèse synthétique ou chirurgie autologue) est donc essentielle. Nous proposons un nouveau paradigme qui repose sur l’utilisation d’un matériau complètement biologique qui n’est ni chimiquement ni autrement dénaturé tel que son ultrastructure, similaire à un tissu natif, soit préservée pour favoriser son intégration dans les tissus de l’hôte.

Bénéfices attendus

L’incontinence urinaire d’effort est un problème médical important pour les femmes affectant 1 femme sur 5. Il s’agit de la fuite involontaire d’urine au cours de l’effort (sport, éternuements, toux, etc.). Plusieurs solutions chirurgicales existent. Bien que des chirurgies autologues existent, c’est-à-dire qui utilisent les tissus de la patiente (bandelettes de fascia lata ou rectus fascia) pour soutenir l’urètre, elles ont été moins favorisées en raison de la disponibilité et de la commodité des prothèses synthétiques. De plus, ces prothèses synthétiques, qui sont robustes et rigides, permettent d’apporter un soutien mécanique plus durable que les chirurgies autologues. En revanche, du fait de leur nature synthétique, elles sont reconnues comme un corps étranger et provoquent une « réaction à corps étranger » qui conduit à des complications parfois graves comme des douleurs chroniques et intenses, infections, expositions voire des perforations des organes par la bandelette synthétique. D’ailleurs, des rapports inquiétants de taux de complications élevés après l'implantation de prothèses synthétiques urogénitales pour le traitement de l’incontinence urinaire d’effort ont poussé les autorités réglementaires à renforcer leur surveillance et augmenter leur classification de niveau de risque au niveau maximal (IIb à III). Cela a conduit plusieurs pays comme l’Angleterre, le Canada et la Nouvelle-Zélande à ne plus utiliser les bandelettes sous-urétrales synthétiques en clinique. De plus, depuis 2019, les prothèses synthétiques implantables par voie vaginale pour traiter la « descente d’organes », qui est une pathologie souvent concomitante à l’incontinence urinaire d’effort, ont également été retirées du marché dans de nombreux pays comme la France, les États- Unis, l’Angleterre et la Nouvelle-Zélande. Il existe donc un besoin médical et sociétal important pour des innovations. Cette étude permettra de sélectionner les procédés de fabrication de nouvelles bandelettes complètement biologiques les plus adaptés pour produire une prothèse aux caractéristiques pertinentes pour l’utilisation clinique. Les gains attendus grâce à cette nouvelle technologie à long terme sont les suivants : (1) Pour les patientes : une grande amélioration de leur qualité de vie en limitant les risques de complications et de récidives. (2) Pour la société : une réduction des coûts en limitant les complications et les réopérations.

Procédures

Une intervention chirurgicale sous anesthésie loco-régionale, péridurale, sera réalisée sur les animaux. Les brebis seront implantées d’une bandelette sous-urétrale par voie vaginale pour traiter l’incontinence urinaire d’effort. Nous prévoyons un temps d’intervention d’environ 1 à 2h sur chaque animal. Les brebis seront donc opérées 1 par 1 sur chaque demi-journée pendant 6 jours (non consécutifs). Après l’opération, les animaux seront suivis pendant 2 et 6 mois. Dans le cas où des brebis venaient à décéder suite à l’intervention, nous prévoyons 1 animal supplémentaire en remplacement en cas de décès. Aucun prélèvement n'est prévu.

Impact sur les animaux

Le transport et la chirurgie peuvent générer de l'angoisse. Des risques de complications au cours de la chirurgie ou en post-opératoire peuvent être attendus comme : des saignements (abondants), dysurie (difficultés à la miction), infections, douleurs, souffrance et angoisse. La durée de ces nuisances ou effets indésirables sera réduite au maximum pour n’être que passagère en portant une attention particulière aux brebis tout au long du projet.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort (sauf les animaux supplémentaires prévus en cas de décès d’un animal à la suite de l’opération et qui n’auraient donc pas été implantés) à l'issue de l’expérimentation puisque les organes du bassin seront prélevés à des fins d'analyses histologiques.

Remplacement

Il est possible d’étudier très largement in vitro ce matériau complètement biologique produit par culture de cellules de peau humaine. En revanche, son étude in vivo à long terme chez l’animal reste limitée. À ce jour, aucun système de modélisation ne peut suppléer à l'utilisation d'un modèle animal étant donné la complexité du système immunitaire. Des modèles animaux immunosupprimés, notamment souris ou rats, ne peuvent pas mimer l’anatomie ni la physiologie humaine car ils sont trop petits. D’ailleurs, ces modèles ne permettent pas d’évaluer la prothèse dans une région anatomique pertinente (région abdominale uniquement). Ainsi, le recours au modèle de gros animal permettra d’évaluer, à long terme, la réponse immunitaire innée de l’hôte combinée à la réponse immunitaire adaptative (indisponible chez les animaux immunosupprimés) dans un contexte de greffe pertinent (prothèse biologique produite par des cellules de brebis et implantée dans une brebis) et une région anatomique pertinente (urogénitale) simulant les conditions cliniques.

Réduction

Au total, 48 brebis sont nécessaires (3 lots de 16 brebis : 15 implantées et 1 de remplacement dans chaque lot). Nos premiers objectifs sont de démontrer l'implantabilité et l’intégration tissulaire supérieure des prothèses biologiques en comparaison avec une prothèse synthétique sur la base d'une observation directe (exposition et rétraction de la prothèse) et d’une évaluation histologique de la réponse immunitaire (innée et adaptative) dans un modèle de gros animal mimant le contexte clinique. Nous souhaitons également étudier la réponse immunitaire aux différents traitements des prothèses biologiques qui pourraient être source d’immunogénicité ce qui entraînerait une dégradation rapide du matériau in vivo. Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux (3 brebis par groupe) permettant l’obtention de résultats fiables pour répondre aux objectifs fixés. D’après la littérature, nous estimons la probabilité d’exposition prothétique avec une prothèse synthétique standard à environ 33%, avec rétraction et marqueurs de la réaction à corps étranger localisés autour des fibres synthétiques. Nous attendons des résultats similaires. En revanche, nous n’attendons pas d’exposition avec la prothèse biologique, ni de marqueurs de la réaction à corps étranger et, moins voire pas de rétraction du greffon biologique, ce qui démontrerait la supériorité de ce matériau. Selon la variabilité observée avec les premiers animaux, nous pourrons répéter l’expérience pour, par exemple, ajouter des animaux à l’étude ou confirmer certains résultats ou tester des conditions de production des greffons biologiques supplémentaires ou ajouter une condition expérimentale (Ex : chirurgie autologue).

Raffinement

Tout au long de la procédure expérimentale, une attention particulière visant à réduire douleurs, souffrance et angoisse chez les brebis sera apportée. Le transport et la chirurgie peuvent générer de l’angoisse. La durée du trajet est limitée (45 min maximum), dans un véhicule adapté, en lot de 2 brebis (minimum), pour limiter l’isolement social. La douleur, la souffrance et l’angoisse seront réduites par une prémédication et gérées par une anesthésie loco- régionale avec un suivi des paramètres vitaux durant la procédure chirurgicale. Un protocole d’analgésie post- opératoire prédéfini est réalisé pour chaque animal. En dehors de cette période, les animaux seront transportés et gérés au sein de l’établissement utilisateur assurant l’hébergement en conditions d’hébergement avec des méthodes de raffinement et d’enrichissement du milieu adéquat à son espèce : groupe social, pierre à sel et brosses dans les parcs à disposition, foin et paille, paillage régulier, jeux de mâchage... Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel dédié et expérimenté. La chirurgie est réalisée sous péridurale avec analgésie pré, per et post-opératoire par admission d’antalgiques. Des points limites ont été identifiés et se situent principalement au niveau de l’hébergement (grille d’évaluation pour la surveillance des points limites). De plus, si les premiers animaux présentent une défaillance des fonctions vitales dans les heures ou premiers jours qui suivent l’intervention, le protocole sera interrompu. Si l’état de santé d’un animal est concerné par l’un des points limites identifiés ainsi que par toute autre observation jugée anormale, un examen vétérinaire approfondi est réalisé et le responsable du projet est contacté par l’établissement utilisateur assurant l’hébergement pour définir la conduite à tenir (prescription d’un traitement médical adapté, examens complémentaires, etc.). Si l’état de santé de l’animal ne s’améliore pas, le vétérinaire de l’établissement utilisateur assurant l’hébergement et le responsable du projet décideront de l’euthanasie.

Choix des espèces

Le modèle ovin montre de grandes similitudes anatomiques avec l’humain au niveau de sa région pelvienne. De plus, il s’agit d’un modèle de « descente d’organes » bien établi dans la littérature, qui est une pathologie très souvent concomitante à l’incontinence urinaire d’effort. Par ailleurs, d’après nos études précédentes menées au laboratoire, les cellules ovines sont les seules cellules qui ont permis d’obtenir un matériau similaire à celui produit par les cellules humaines, en comparaison avec d’autres modèles animaux comme le chien et le cochon. Ces cellules ont été extraites, purifiées et amplifiées à partir de biopsies de peau récupérées sur des brebis post-mortem. L’espèce a donc été sélectionnée pour permettre l’étude de la réponse immunitaire complète ainsi que le remodelage des prothèses biologiques par les cellules de l’hôte. Nous souhaitons réaliser une implantation de bandelette sous-urétrales dans des brebis âgées (≥ 6 ans) et grandes multipares (≥ 3 mises bas) pour mimer le relâchement des tissus vieillissants (manque de tonus musculaire).

Une biopsie de l'endomètre et du placenta réalisée sur animal vigile, sans sédation ni anesthésie, en profitant de l'ouverture du col juste après la mise bas : vingt des soixante brebis gestantes du projet subissent ce prélèvement. 120 ovins au total, brebis et agneaux, sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec trois prises de sang pour les mères et cinq pour les descendants. Les brebis sont placées en conditions de vague de chaleur durant le dernier mois de gestation, ce qui peut provoquer une hyperthermie, des difficultés de thermorégulation et un risque d'avortement ou de mise bas précoce, l'enjeu déclaré étant de mesurer l'effet du dérèglement climatique sur la fertilité des descendants. 90 animaux, les mères et leurs filles, rejoindront le troupeau pour le renouvellement des générations, et les 30 descendants mâles seront abattus pour prélever leurs testicules et leur prostate, leur "reproduction" étant déclarée "compromise".

Objectifs

Le déreglement climatique et plus particulièrement l’intensification des vagues de chaleurs imposent une adaptation pour toutes les filières animales. Chez les ruminants, déjà peu adaptés à la chaleur du fait des fermentations du rumen, l’aptitude à produire est corrélée négativement à la résistance à la chaleur. Des effets délétères d’un index combinant la température et le taux d’humidité (THI), ont ainsi été démontrés sur la santé, la production ou la fertilité des individus touchés. Si l'effet de la température et de l'humidité peut être direct sur les animaux en croissance ou adultes, il pourrait également s'appliquer durant le développement fœtal, perturbant l’organogenèse et la fonction placentaire. Le stress thermique, réduit en effet la croissance d'organes spécifiques chez les veaux mâles et femelles et en particulier la taille des ovaires. Mais à l'heure actuelle, l'impact sur la construction du phénotype de fertilité des descendants et sur leurs performances de reproducteur à l’âge adulte reste inexploré. De tels impacts, s’ils étaient avérés, pourraient fortement limiter la diffusion du progres génétique des troupeaux et réduire les performances globales de l’élevage. Des perturbations épigénétiques pourraient être le socle soutenant toutes les modifications phénotypiques observées après un stress thermique. Le projet vise à étudier les effets d’un stress thermique en environnement contrôlé, appliqué durant le dernier mois de gestation chez la brebis, sur la construction du phénotype chez les descandants et leur performance à l’âge adulte.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier les effets du déreglement climatique (et plus particulièrement l’intensification des phases de pics de chaleurs) sur la construction du phénotype de la descendance et sur leurs performances de reproduction à l’âge adulte. Les bénéfices attendus à court termes porteront sur la caractérisation des effets physiologiques et moléculaires d’un choc thermique subi in utero sur le devenir des animaux afin d’améliorer nos connaissances scientifiques sur les mécanismes épigénétiques qui soutendent la construction des phénotypes. A long terme, ce projet devrait fournir des bases de compréhension sur les mécanismes d’adaptation des animaux aux changements environnementaux, ce qui permettrait de développer des leviers positifs attenuant les effets déletères d’un stress thermique.

Procédures

3 prises de sang seront effectuées sur l’ensemble des 60 mères gestantes (à 110 jours, 125 et ~147 jours de gestation). Pour un sous groupe de 20 brebis une biopsie de l’endomètre et du placenta sur animal vigile sera réalisée. Nous profiterons juste apres la mise-bas de l’ouverture du col pour réaliser ce prélèvement. A ce stade physiologique, les voies femelles étant dilatées afin de permettre le passage du nouveau-né, le prélèvement pourra se faire sur animal vigile sans sédation ou anesthésie locomotrice. Concernant les descandants, 5 prises de sang seront effectuées (naissance, 1, 3, 6 et 9 mois). Tous ces actes ont une durée limitée à de quelques secondes (prise de sang) à quelques minutes (biopsie).

Impact sur les animaux

Une hyperthermie sur les brebis mis en condition de vague de chaleur pourrait survenir, avec des difficultés de régulation de température corporel et respiratoire dues également au dernier stade de gestation. Un risque d’avortement ou de mise-bas précoce pourrait survenir. Un petit hématome pourrait apparaitre à la jugulaire, lié aux quelques prises de sang effectuées. Les femelles biopsée pourraient ressentir une douleur liée au prélèvement. Enfin, le stress generé par l’ensemble des manipulations pourrait également apporter une nuissance supplémentaire.

Devenir

Les mères ainsi que leurs filles pourront rejoindre leur troupeau d’origine afin de contribuer au renouvellement des générations. Seuls les déscandants mâles seront abatus à la fin de l’expériementation afin de collecter les organes necessaires à l’étude fonctionnelle de l’impact du déreglement climatique. L’etude portant sur divers organes, dont les testicules et la prostate, une approche par biopsie n’est pas compatible. Leur retour au sein du troupeau n’est également plus possible (reproduction compromise).

Remplacement

Il n’y a pas de remplacement possible puisque l’objectif du projet est d’étudier les impacts d’un stress thermique subit in utero sur le développement embryonnaire, la construction du phénotype et les performances de reproduction à l’âge adulte. Aucune étude ne permet d’ores et déjà de prendre en compte l’impact du stress thermique subi in utero sur la fonction placentaire et le développement testiculaire des descendants. Nous n’avons donc pas de données fiables pour remplacer tout ou partie des animaux necessaires. De plus les développements récents d’organoïdes ou de cultures cellulaires 2D ne permettent pas de prendre en compte toute la compléxité d’un organisme biologique [placenta – fœtus – organes spécifiques] ayant subit un stress thermique.

Réduction

Aucune étude ne permet de prendre en compte l’impact du stress thermique subi in utero sur la fonction placentaire et le développement testiculaire des descendants. En revanche, concernant le contenu spermatique en petits ARN non codants, des études chez le bovin soulignent une variabilité individuelle sans condition de stress appliquée. C’est pourquoi le nombre d’individus souhaités par groupe de stress permettant de tenir compte de la variabilité individuelle et de visualiser un effet potentiel du stress envisagé est compris entre 12 et 15 pour les deux sexes. Afin de les obtenir, 60 brebis gestantes seront utilisées dans le projet (30 pour le groupe « contrôle » et 30 pour le groupe « stress thermique »). Ces Brebis, porteuses de singleton, donneront naissance au mieux à 60 descendants en sexe-ratio équilibré, soit 15 males et 15 femelles par groupe. Ce nombre permettra de tenir compte de certains aléas de mortalité et d’entrainement à la récolte de semence. Nous choisirons les méthodes d'analyse statistique adaptés pour obtenir des résultats fiables et interprétables.

Raffinement

Les brebis étant des animaux grégaires, elles seront toujours manipulées par lot. Elles seront hébergées sur aire paillée et la contention des brebis pour le prélèvement sanguin se fera dans un espace réduit entre des claies. Un enrichissement adapté sera proposé dans chaque cellule (pour tous les lots) : des miroirs, cônes et un filet de foin suspendu. Les prélèvements de sang par ponction à la veine jugulaire, seront réalisées par du personnel qualifié et expérimenté. Lors de la prise de sang, les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée n’entrainant pas de trouble de l’état général (pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité) ; il ne sera pas fait d’anesthésie locale qui s'avèrerait plus douloureuse que la prise de sang, et augmenterait le risque d’hématome. Les prises de sang pourraient être alternativement faites à la veine jugulaire droite et gauche pour limiter le risque de phlébite. Un baume décongestionnant pourrait être appliqué en cas de lésions ou de thrombose. La présence récurrente des expérimentateurs en interaction positive en dehors de la procédure (alimentation, soins aux animaux) est associée à une diminution du stress face à la contention. Après chaque prélèvement les animaux recevront une récompense sous forme de granulés. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera assurée. En cas d’apparition de symptômes, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire référent.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisi en raison de leur reproduction saisonnée, soumise au stress thermique soit en fin de gestation, soit en début de gestation (selon les pratiques des éleveurs). De plus les avantages biologiques apportés par cette espèce (temps de gestation court et proportion des animaux) permettent aux ovins de servir de modèle pour d’autres espèces et notamment les gros ruminants. Les premiers animaux utilisés seront les brebis Ile-de-France gestantes. Le second lot d’animaux sera constitué des agneaux (mâles et femelles) obtenus après la mise-bas. Ces animaux permettront d'évaluer l'effet d’un stress thermique appliqué en fin de gestation (dernier mois) en environnement contrôlé sur la construction du phénotype de la descendance.

Sondées en permanence pendant onze jours et logées dans des cases où elles ne peuvent pas se retourner, 10 truies vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur cycle ovarien est bloqué par injection d'un analogue hormonal, présenté comme une alternative à l'ablation chirurgicale des ovaires, pour éviter que des variations d'appétit ne faussent la mesure de digestibilité. Le projet se réclame du mal-être des truies gestantes, que le rationnement sévère pousse aux comportements stéréotypés, et il commence par onze jours d'immobilisation et une sonde urinaire à chaque période. Aucune des truies n'est tuée, toutes réintègrent le troupeau expérimental à la fin, disponibles pour l'essai suivant.

Objectifs

L'un des objectifs majeurs de la conduite alimentaire en gestation est d'adapter les apports alimentaires en fonction de l'état de la truie souhaité en maternité. Le défi consiste à obtenir, en fin de gestation, un niveau de réserves corporelles suffisant tout en évitant une prise de poids trop importante, ce qui peut entraîner des problèmes de locomotion ainsi que des syndromes de dysgalacties post-partum, des répercussions négatives sur le taux de survie des porcelets et la longévité du troupeau. La maîtrise de l’état corporel de la truie passe par un rationnement alimentaire sévère qui peut se traduire par l’apparition de comportements stéréotypés. En favorisant le rassasiement des truies, les rations riches en matières premières fibreuses permettent de réduire l’apparition de ces problèmes comportementaux. L'utilisation d'enzymes externes dans l'alimentation des monogastriques est une pratique courante pour améliorer l'efficacité digestive et optimiser la valeur nutritionnelle des aliments. Cette pratique permet d’utiliser des ingrédients alternatifs ou des coproduits de manière plus efficace, qui, sans enzymes, seraient peu digestibles pour l’animal. Parmi ces enzymes, les xylanases sont des enzymes dégradant les polymères de xylose, qui sont des composants importants des fibres des plantes. L’action des xylanases sur l’amélioration de la digestibilité des nutriments est liée à une réduction de la viscosité des digesta, avec des effets positifs sur le transit, mais également à une modulation du microbiote intestinal, une augmentation de la production d’acides gras à chaîne courte, le tout conduisant à des effets positifs sur la santé du tube digestif. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’intérêt nutritionnel du remplacement d’une partie des céréales (blé, orge, maïs) par de l’ensilage de maïs, combiné avec l’utilisation d’une xylanase. Cette évaluation sera réalisée sur la base d’une mesure de la digestibilité fécale des aliments. Cette étude est une première étape pour valider une ration qui sera utilisée dans une étude de plus grande ampleur pour évaluer les effets à long terme sur les performances de la truie et ses porcelets

Bénéfices attendus

L'évaluation de la valeur nutritionnelle de régime intégrant de l'ensilage de maïs et supllémenté ou pas avec de la xylanase est un prérequit pour mettre au point des stratégies nutritionnelles pour réduire le mal être des truies tout en assurant une bonne valarisation de l'aliment.

Procédures

Les collectes de fèces et d'urines sont obtenues par défécation et miction naturelles ; aucun autre prélèvement n'est prévu. Les animaux seront équipés d'une sonde urinaire pour faciliter la collecte des urines et éviter la contamination des fèces par de l'urine. Pour chaque période de 30 jours, la sonde urinaire sera maintenue pendant 11 jours lors de la période de collecte. La mesure de la digestibilité est très sensible à toute variation de la prise alimentaire. Pour éviter les effets d'une chute de l'appétit sur la qualité de la collecte, le cycle ovarien de la truie sera bloqué immunologiquement pendant la durée de l'essai.

Impact sur les animaux

Conditions de logement : Dans le cadre de la mesure de la digestibilité, les truies doivent être logées dans des cases individuelles, ce qui leur permet de ne pas se retourner et de dissocier correctement les fèces et les urines. Toutefois, la réduction de la possibilité de mouvement peut entraîner des risques pour leur bien-être. Collecte des urines : Les particularités anatomiques des femelles rendent difficile la collecte séparée des urines et des fèces. Pour contourner ce problème, les truies seront équipées de sondes urinaires de la veille du début de la période de collecte à la fin de cette période (soit une durée de 11 jours). Bien que la sonde soit posée et entretenue dans des conditions d'hygiène rigoureuses, en respectant les protocoles de soins vétérinaires, on ne peut pas totalement exclure un risque d'infections urinaires. Blocage du cycle ovarien de la truie : Les fluctuations hormonales liées au cycle reproductif peuvent influencer les mesures de digestibilité, notamment en agissant sur l'appétit des truies. Pendant la durée de l’essai, la fonction ovarienne sera temporairement bloquée chimiquement. Ce traitement constitue une alternative à l’ovariectomie chirurgicale. Les injections de ce traitement peuvent entraîner possiblement des gonflements ou inflammations au point d'injection.

Devenir

L'ensemble des animaux réintègre le troupeau de truies expérimentales à la fin de la procédure

Remplacement

Le porc est l'espèce cible de ce projet. Compte tenu des spécificités inhérentes au stade physiologique (truie reproductrice), à sa conduite alimentaire et aux conséquences sur l'utilisation digestive des aliments, il n'est pas possible de travailler sur des animaux d'un autre stade physiologique. L'utilisation d'animaux vivants est nécessaire pour rendre compte de processus digestifs extrêmement complexes et soumis à une large variabilité entre individus. Le remplacement n'est, pour l'instant, pas possible, car l'utilisation d'animaux est inhérente au type d'étude.

Réduction

L'utilisation d'un plan expérimental en carré latin 4*4 complet permet de contrôler notre principale source de variation (effet animal), tout en testant plusieurs traitements alimentaires. Chaque traitement est testé exactement une fois par ligne et par colonne, ce qui signifie que chaque animal et chaque période reçoivent une seule fois chaque traitement. Cela permet de : 1/ maximiser la précision des résultats en neutralisant les effets liés à l'animal ; 2/ réduire le nombre d’animaux nécessaires, car chaque animal sert de contrôle pour lui-même à travers plusieurs périodes ; et 3/ limiter la variabilité interindividuelle, ce qui est crucial dans ce type d'essai pour la mesure de la digestibilité. L’utilisation des truies pour la phase de formation sera limitée au strict nécessaire. Une fois le geste maîtrisé par l’équipe technique, le nombre d’animaux sollicités n’excédera pas 4.

Raffinement

Conditions de logement : Pour limiter les risques sur le bien-être des truies, la durée de mise en case individuelle est strictement limitée à 11 jours pour chaque période expérimentale, incluant 1 jour d'adaptation et 10 jours de collecte. Les cages sont équipées de barreaux et placées dans la même pièce, par groupe de 4, afin de permettre aux animaux de maintenir un contact visuel, tactile, olfactif et auditif. Le reste du temps, les truies sont placées en case collective (16 m²), avec des systèmes permettant une distribution individuelle de la ration et un enrichissement adapté (jouets et toile de jute). Pose de sonde urinaire et risque de cystites : Pendant la période de collecte, la présence éventuelle d’infection urinaire sera contrôlée au moment de la miction à l'aide de bandelettes urinaires. En cas d'infection avérée, l'animal sera soigné avec un traitement adapté. Risques d'infection localisée au site d'injection d'un analogue de synthèse du GnRF : Bien que les réactions soient généralement temporaires, des gonflements ou inflammations au point d'injection peuvent survenir. Le cas échéant, l’animal sera traité avec le traitement préconisé par le vétérinaire en charge du suivi des animaux..

Choix des espèces

- Le porc (truie) ne peut pas être remplacé par une espèce modèle compte tenu de la spécificité anatomique de son tube digestif et de sa conduite alimentaire Nous avons choisi de travailler sur la truie reproductrice non-gravide car ce stade est spécifiquement visé par la stratégie alimentaire que nous voulons tester. Nous travaillerons sur des truies en 3ème ou 4ème portées ce qui correspond à la parité moyenne des truies en élevage commercial.

Issues du cheptel de l'établissement, 40 brebis sont saillies pour en retenir 25 gestantes, dont les agneaux entreront eux aussi dans le protocole. 160 moutons au total vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, 141 tués et 19 renvoyés à l'élevage. Les brebis gestantes reçoivent huit injections intramusculaires sur dix-huit semaines pour reproduire un syndrome des ovaires polykystiques, leurs descendants subissent quatorze prises de sang de la naissance à vingt-quatre semaines, et les femelles pubères jusqu'à 36 prélèvements par cathéter jugulaire, immobilisées douze heures en cage individuelle sans pouvoir se retourner. Le porteur écrit en majuscules que le nombre de brebis a été doublé "suite à un problème sanitaire, résolu depuis", sans dire combien d'animaux la première version prévoyait.

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la cause la plus fréquente d'infertilité féminine (8 à 13 % des femmes en âge de procréer dans le monde). Les critères du diagnostic du SOPK sont basés sur au moins deux des trois caractéristiques suivantes : 1/ irrégularité ou absence des règles, 2/ un taux élevé d’hormones masculines dans le sang, et 3/ ovaires renfermant de nombreux kystes folliculaires de 2 à 6 mm. La plupart des patientes atteintes de SOPK présentent également des taux d'hormone AMH (anti-müllérienne) et LH (hormone lutéinisante) élevés. De plus, ce trouble est généralement associé à une résistance à l'insuline, de l’obésité, des taux de cholestérol élevés et une hypertension artérielle. Il est important de noter que la plupart des caractéristiques du SOPK sont transmises aux filles des femmes atteintes de ce syndrome, puisque 60 à 70 % de leurs filles développent ce syndrome. Malgré le nombre de femmes touchées par ce trouble, les causes du SOPK restent incomprises. Parmi les facteurs impliqués dans le SOPK, les androgènes, et l'AMH ont été reconnus comme jouant un rôle central. L'hypothèse actuelle est que l’excès d'androgènes ou d'hormones sexuelles masculines durant la grossesse pourrait entraîner des modifications au niveau de l’activité ovarienne et la sécrétion de certaines, ce qui entraînerait le développement du SOPK à l'âge adulte. Notre projet qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) a pour objectif de tester si un anticorps dirigé contre l’AMH peut supprimer les défauts d'ovulation observés dans un modèle de brebis ayant reçu un excès d'androgènes mimant le SOPK chez la femme. En effet, la brebis est une espèce proche de la femme en terme de développement ovarien. Nous étudierons également chez la mère et chez ses descendants mâles les conséquences d’un taux élevé d’hormones masculines au niveau des tissus périphériques et reproducteurs.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de constituer un corpus de données visant à évaluer si un anticorps anti-AMH est un bon candidat pour des essais ultérieurs chez l'humain, en l'occurence chez la femme développant un syndrome des ovaires polykystiques. Elle permettra aussi de mieux comprendre les effets moléculaires de la testostérone chez la femme et les conséquences chez la descendance mâle.

Procédures

Pour les 40 brebis adultes : 1 prise de sang (PS) intra-veineuse (IV) (jugulaire) sera réalisé à 18 jours après la saillie. Pour les 25 brebis gestantes sélectionnées : 8 Injections intra musculaire (IM) sur 18 semaines. 4 PS IV (jugulaire) pendant la gestation. Pour tous les descendants mâles (n=20) : 14 Prises de sang par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Pour tous les descendants femelles (n=20) : 14 PS par IV (jugulaire) de la naissance jusqu'à 24 semaines. Autour de la puberté, 6 PS par IV (jugulaire) sur 3 semaines. 1 anesthésie générale pour 1 passage à l’IRM à la puberté. Pose de cathéter à la puberté sous anesthésie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Pour les femelles pubères issues des mères androgénisées (n=16) : 18 Prises de sang sur 9 semaines. 4 injections intra veineuse (jugulaire). 1 anesthesie genérale pour un passage à l’IRM après l’injection de l’anticorps. 1 pose de cathéter après le passage à l’IRM sous anesthesie local. 36 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 2 Injections par cathéter jugulaire. 12 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. 16 prélèvements de sang par cathéter jugulaire. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Dans l'EU1 seront effectuées toutes les expérimentations sauf l'anesthésie générale et le passage à l'IRM qui seront réalisés dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les differentes injections peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose des cathéters jugulaires peut entraîner des douleurs au point d'injection. Pour les animaux traités, il existe un risque d’apparition de kystes et d’anomalies de la vessie (observés par IRM). Il peut arriver mais trés rarement des signes extérieurs associés à une douleur comme une dérivation urinaire entre les cuisses qui peut entrainer des brûlures. Les nuisances en lien avec l’anesthésie de l’IRM sont une irritation des voies respiratoires lors de l’intubation et l’extubation, un possible hématome lors l’intraveineuse et un potentiel stress lors des manipulations.

Devenir

Sur les 40 brebis saillies, 25 seront utilisées, les 15 brebis non selectionnées retourneront à l'élevage. Les 25 brebis sont nécessaires afin d'obtenir suffisamment de descendants femelles pour tester l'effet de l'injection d'anticorps . Une fois l'agnelage effectué, les 20 brebis androgénisées et les 5 témoins seront euthanisées afin de récupérer les tissus périphériques et reproducteurs pour une analyse moléculaire. Sur les 40 descendants, 4 descendants femelles issues des mères témoin pourront retourner sur l'élevage. Ainsi, seront euthanasiés 12 descendants mâles issus des mères androgénisées et 4 descendants mâles issus des mères témoin mais aussi 16 descendants femelles injectés soit avec l'anticorps (n=8) ou avec une solution témoin (n=8) afin de pouvoir mener une étude moléculaire sur les tissus périphériques et reproducteurs.

Remplacement

Nous ne pouvons tester les anticorps que sur un organisme entier. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. D'autre part, il a été démontré dans la littérature que la brebis androgénisée est un bon modèle syndrome d'ovaires polykystiques chez la femme.

Réduction

Nous allons utiliser 25 brebis gestantes, 20 (16+4) agneaux mâles et 20 (16+4) agneaux femelles jusqu’à la puberté. Ce nombre a été estimé en utilisant un test de comparaison de deux moyennes (nombre de follicules antraux) dans chaque groupe. Avec des lots de 8 descendants femelles issues de mères androgénisées cela donne une puissance tout à fait satisfaisante. Afin d’avoir 16 brebis issues de mères androgènisées, il faut partir d’au moins 20 brebis au départ. Afin de vérifier que le traitement de testostérone fonctionne, nous suivrons également 5 brebis qui seront non traitées, et leurs descendants.

Raffinement

NOUS MAINTIENDRONS LES AGNEAUX SOUS LEUR MÈRE, CONTRAIREMENT À CE QUI ÉTAIT PRÉVU INITIALEMENT. CETTE STRATÉGIE PRÉSENTE UN DOUBLE AVANTAGE : D’UNE PART, LA PROTECTION VACCINALE DES MÈRES SERA TRANSMISE AUX AGNEAUX VIA LE COLOSTRUM, RENFORÇANT AINSI LEUR IMMUNITÉ PASSIVE ; D’AUTRE PART, LA PRÉSENCE MATERNELLE FAVORISERA UNE TRANSITION ALIMENTAIRE PLUS PRÉCOCE VERS LE FOURRAGE, APPORTANT UNE PROTECTION DIGESTIVE SUPPLÉMENTAIRE. Les animaux seront gardés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. LA PÉRIODE D’ACCOUPLEMENT SERA AVANCÉE DE 15 JOURS PAR RAPPORT AU RESTE DU CHEPTEL POUR PERMETTRE UNE SURVEILLANCE RENFORCÉE DES NOUVEAUX NÉS PAR LE PERSONNEL ZOOTECHNIQUE. Pour limiter les stress liés à la manipulation, ils seront visités tous les jours avec contact direct ou non, permettant l'habituation de l'animal à l'expérimentateur et un suivi du bien-être des animaux. Nous récompenserons les animaux après chaque session de prises de sang en distribuant du concentré à l’auge excepté lorsqu’un suivi métabolique sera prévu sur ces prélèvements. Lors de la pose des cathéters, le comportement et l'apparence des brebis (notamment au niveau de l’implantation du cathéter) seront suivis avec attention. Les animaux seront maintenus en cage individuelle (107 cm de long sur 67 cm de large) le temps des prélèvements (12 heures), ils ne pourront pas se retourner mais auront tout de même un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Avant toute injection intramusculaire ou intraveineuse, une application de gel antalgique (type Vétobiol) sera réalisée. Les deux veines jugulaires seront utilisées en alternance pour limiter le risque d’hématome. Les animaux seront mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie pour le passage à l’IRM, afin de limiter tout risque de régurgitation. Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Le transport des animaux avant l'opération et leur retour sera réalisé par un technicien formé et expérimenté dans une bétaillère agréée pour le transport d'animaux vivants. Le trajet est de moins de 5 minutes et la bétaillère sera abondamment remplie de paille.

Choix des espèces

SUITE À UN PROBLÈME SANITAIRE, RÉSOLU DEPUIS, LE NOMBRE DE BREBIS A ÉTÉ DOUBLÉ. Afin de pouvoir mimer le SOPK chez la femme nous souhaitons utiliser des brebis gestantes pour plusieurs raisons : 1. contrairement aux rongeurs, la brebis présente l'avantage d'avoir un développement ovarien similaire à la femme. 2. De plus, ce modèle a déjà été validé dans nos unités. - 40 brebis saillies seront utilisées pour la détection de 25 brebis gestantes qui rentreront dans la procédure. Cet effectif doit permettre d'assurer la production de descendants assez conséquente pour poursuivre nos travaux. - 20 descendants mâles seront étudiés de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 20 descendants femelles seront étudiées de la naissance (J0) à la puberté (J168). - 16 femelles pubertes sur les 20 entreront dans la 2ème phase de l’expérimentation (de J168 jusqu’à J235).

Gardées vivantes à l'issue de l'essai pour le renouvellement du troupeau et réutilisables dans d'autres essais, 6 vaches laitières Prim'Holstein vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Elles passent douze semaines à l'attache, la mobilité restreinte pour permettre la collecte totale de l'urine et des fèces cinq jours d'affilée par période, avec trois prélèvements de sang à la veine de la queue. Le porteur écrit pourtant que les régimes testés ne sont pas de nature à entraîner une douleur ou une souffrance. L'objet est zootechnique, mesurer la digestibilité de mélanges d'ensilage de luzerne et de maïs, et il affirme qu'aucune autre approche ne peut remplacer la vache pour étudier ces flux de matière et d'azote.

Objectifs

L’élevage laitier se trouve de plus en plus confronté à la problématique du changement climatique, sous contraintes environnementales, avec le souci de réduire l’utilisation d’intrants et d’accroître l’efficience d’utilisation des ressources. Dans ce contexte en mutation, il est reconnu que la luzerne a une place de choix, comme fixatrice d’azote atmosphérique, et pour sa capacité à apporter des protéines produites de façon durable dans l’alimentation des ruminants. Une meilleure utilisation de la luzerne sous forme d’ensilage pourrait être une réponse adaptée au contexte changeant actuel, si les conditions de son utilisation sont mieux définies, notamment en termes de valorisation par l’animal. En effet, les conséquences d’associer l’ensilage de luzerne et celui de maïs sur les performances animales, la possibilité de réduire les intrants, la valorisation des fourrages et l’efficience d’utilisation de l’azote doivent être approfondies. Cet essai aura pour but d’évaluer la valorisation énergétique (digestibilité) et protéique (déjections) à l’échelle de la vache laitière lorsque celle-ci est nourrie avec des mélanges d’ensilage de luzerne et de maïs selon des proportions variables. Trois traitements expérimentaux seront comparés : 2 traitements diffèrent en termes de proportions des fourrages étudiées : 25%, ou 50% d’ensilage de luzerne pour respectivement 75% ou 50% d’ensilage de maïs et un troisième traitement avec 25% d’ensilage de luzerne et 75% d’ensilage de maïs, avec 200 g d’urée pour apporter plus d’azote dégradable pour les bactéries dans le rumen.

Bénéfices attendus

L’influence des régimes sur l’ingestion et la digestibilité des rations sera évaluée afin d’estimer l’efficience alimentaire, la valorisation de l’énergie et de l’azote ingérées, et les pertes d’azote vers l’environnement. Cela nous aidera à mieux valoriser ces fourrages pour nourrir les vaches laitières de façon plus durable en augmentant la diversité fourragère et l’autonomie protéique des élevages laitiers, et en réduisant les intrants de type tourteau de soja.

Procédures

Cet essai concerne des animaux vigiles qui seront hébergés en stabulation entravée, durant 12 semaines (3 semaines de mesures de référence, puis 3 périodes de 3 semaines chacune). Les vaches seront nourries à volonté et traites 2 fois par jour. Lors des mesures de bilan ingestion-excrétion d’azote, un prélèvement sanguin sera réalisé à la veine caudale, à raison de 1 par période et par vache (soit 3 au total), chaque prélèvement de sang durant 5 minutes maximum (nettoyage de la peau et prélèvement de sang). Des collectes totales d’urine et de fèces seront aussi réalisés pendant 5 jours consécutifs par période, en continu.

Impact sur les animaux

Le dispositif de collecte de l’urine et des fèces nécessite de restreindre la mobilité des animaux, ce qui contraint de les garder à l’attache le temps de l’expérimentation. Les vaches seront attachées par leur licol avec une longueur de chaîne suffisante pour qu’elles puissent tourner la tête librement en position debout ou couchée, comme cela est pratiqué dans certains élevages. Lors des mesures de bilan ingestion-excrétion d’azote, un prélèvement sanguin sera réalisé à la veine caudale, à raison de 1 par période et par vache (soit 3 au total), chaque prélèvement de sang durant 5 minutes maximum (nettoyage de la peau et prélèvement de sang).

Devenir

Les animaux n’ayant subi aucune intervention invasive, ni traitement susceptible d’avoir des effets importants sur leur santé et/ou survie, seront conservés afin de participer au renouvellement ultérieur du troupeau et pourront être réutilisés dans de nouveaux essais. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable des installations expérimentales. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci soit possible.

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux par une autre approche pour cet essai car le but est d’étudier les flux de matières, d’énergie et d'azote à l'échelle de la vache, incluant des mécanismes in vivo de recyclage/mobilisation/interactions digestives notamment au sein du rumen.

Réduction

Le schéma expérimental en carré latin ainsi que l'analyse statistique des données permettront de répondre aux objectifs scientifiques tout en limitant le nombre de vaches à 6 dans ce projet. L’utilisation d’un carré latin permet que chaque animal soit son propre témoin, pour ainsi réduire le plus possible le nombre de vaches tout en gardant une puissance statistique suffisante pour montrer les effets des traitements expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront élevés et suivis conformément aux règles d’élevage et de bonnes pratiques en place dans l’élevage. Un suivi régulier du comportement des animaux sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou de douleur. Les animaliers chargés du suivi ont tous une solide formation en élevage laitier et sont sensibilisés à la douleur animale. Le suivi régulier par le vétérinaire sanitaire assure également la bonne santé des animaux. En cas de problèmes détectés, les animaux seront soignés selon les prescriptions du vétérinaire. Les régimes testés, classiques, ne sont pas de nature à entraîner une douleur ou une souffrance.

Choix des espèces

La problématique de l’étude, spécifique aux vaches laitières, nécessite de travailler avec cette espèce. Les vaches seront de race Prim’Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue en France et dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches seront en milieu de lactation afin de déterminer les effets des traitements sur les performances zootechniques et la composition du lait.

Une prothèse en dérivé plastique est implantée dans le diaphragme d'agneaux nouveau-nés, sous anesthésie générale, avec une prise de sang pendant l'opération puis deux autres à J2 et J10. 30 agneaux sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le protocole mobilise des brebis gestantes qui ne figurent pas dans le décompte. Le RNT annonce une évaluation à dix jours et à trois mois, décrit une IRM réalisée à trois mois après la mise à mort, puis situe cette mise à mort dix jours après l'opération. Tous sont tués pour prélever la prothèse et les tissus qui l'entourent, afin de juger de son intégration avant un éventuel essai chez l'enfant.

Objectifs

1/Evaluation de la réaction de l’hote à la prothèse in situ chez le gros animal (agneau) à 10 jours et 3 mois. Une équipe de recherche a mis au point une prothèse diaphragmatique adaptée aux populations pédiatriques atteinte de hernie diaphragmatiques : une membrane en dérivé de plastique très résistante. Celle-ci a déjà réalisé les tests biologiques in vitro pour l'évaluation de la toxicité, de la réponse inflammatoire et de colonisation cellulaire. Notre objectif est l’évaluation in vivo de l’implantation de la prothèse diaphragmatique sur des agneaux sains. Des analyses microscopiques des explants seront réalisées pour décrire l'intégration de la prothèse dans l'hôte. Cette expérience nous permettra d’analyser la tolérance clinique, la sécurité de l’implantation, l’inflammation de la prothèse lors de l’implantation. A notre connaissance, c’est actuellement la seule étude en cours pour étudier l’implantation de cette nouvelle prothèse en dérivé de plastique très résistante.

Bénéfices attendus

Développement d’une prothèse en dérivé de plastique très résistante actuellement non existante sur le marché potentiellement plus adaptée à la croissance de l’enfant. Amélioration de la prise en charge de la hernie diaphragmatique de forme grave.

Procédures

Chaque agneau sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale pour la pose de la prothèse avec une prise de sang. Puis chaque agneau aura deux prises de sang (J2 et J10) après l'opération. Le bilan sera réalisé sous contention avec pose d’un patch anesthésique, une échographie sera réalisée sur le même temps. Tous les animaux à 3 mois, après une technique de mise à mort, auront une IRM.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu sera la douleur modérée pendant et suite à la chirurgie de l'agneau, dont la prise en charge de la douleur est optimisée par un protocole anti douleur

Devenir

Tous les agneaux seront gardés en vie à la suite de la procédure 1 qui est une opération sous anesthésie générale afin de poser la prothèse, puis tous les agneaux seont mis à mort en fin de procédure 2 (soit 10 jours après l'opération) afin de faire des prélèvements pour analyser l'impact de la prothèse.

Remplacement

L’implantation de cette nouvelle prothèse nécessite une étape préclinique dans le modèle expérimental chez le gros animal le plus utilisé dans cette pathologie rare, à savoir l’agneau, avant la mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’homme, il n’y a donc pas de mesures de remplacement possible dans le cadre de ce projet de recherche.

Réduction

Les agneaux seront leur propre témoin ce qui limitera le nombre d’animaux nécessaires pour le protocole. Les jumeaux seront utilisés comme groupe témoin en comparant la prothèse en dérivé de plastique très résistante à la prothèse de référence/sans mise en place de plaque.

Raffinement

Chaque brebis arrive une semaine avant son terme afin de s'acclimater à son nouvel environnement. Les brebis sont livrées au minimum par 2 afin de réduire le stress du transport. Les brebis sont hébergées à plusieurs en permanence dans les box et aucune brebis ne sera seule hébergée afin de réduire le stress lié à la solitude. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale avec une sédation avant et pendant l'opération afin d'avoir une prise en charge optimale de l'animal. Les animaux bénéficieront également de protocoles antalgiques adaptés tout au long de leur prise en charge opératoire.

Choix des espèces

Le modèle animal doit avoir des caractéristiques morphologiques et physiologiques proches du modèle humain. C’est le cas de la brebis, qui est un mammifère avec une gestation de singleton ; jumeaux ou triplet. Le poids de l’agneau sont proches de ceux du fœtus humain. Sa taille est suffisante pour permettre la pose de cathéters vasculaires, une chirurgie en période néonatale. Des études sur plusieurs jours sont possibles chez l’agneau chroniquement instrumenté, ce qui permet de limiter le nombre d’animaux par projet. Enfin, plusieurs modèles d’agneau instrumenté ont déjà été décrits dans la littérature et nous permettent de justifier la pertinence de notre choix. Notre protocole de recherche porte sur la réparation de la hernie diaphragmatique en période néonatale donc nos animaux utilisés est l’agneau nouveau-né. Il est donc nécessaire d’utiliser des brebis gestantes. Notre expérimentation aura au terme soit vers J 145. Cet âge est nécessaire pour que le nouveau-né soit suffisamment gros pour la chirurgie, pour la pose de cathéters vasculaires (3000-3500 g) et pour limiter les risques de perte per opératoire.

Brûlés en quatre endroits sous anesthésie générale à J0, opérés trois heures à J2 pour un prélèvement de peau et une autogreffe sur les zones brûlées, 16 cochons de deux mois enchaînent ensuite les changements de pansement tous les deux ou trois jours jusqu'à J28. Chaque séance se fait sous anesthésie, avec des biopsies au punch à J11, J14 et J18 et sept prélèvements sanguins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés séparément après la brûlure, pour qu'ils ne s'arrachent pas les pansements entre eux. Au vingt-huitième jour ils sont tués, les greffons et les plaies excisés pour l'histologie, les organes et le sang prélevés pour la toxicologie.

Objectifs

Cette nouvelle version constitue une demande d’amendement-1 au projet pour poursuite de l’étude. Ce projet a pour objectif de développer un nouveau protocole thérapeutique pour la cicatrisation du site donneur de greffe et la prise de greffe en associant un hémostatique cicatrisant issu des algues et une biothérapie à base des sécrétions des cellules souches.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de développer et de démontrer l'efficacité d’un pansement innovant in vivo, préalable à une étude clinique chez l'Homme.

Procédures

L’utilisation d’un nouveau pansement nécessite la modification du projet initial avec ajout de 6 animaux. Notre projet prévoit l’utilisation de 16 porcs sur une unique procédure expérimentale de 28 jours reproduisant la prise en charge classique des grands brûlés : 1. J0 : sous anesthésie générale quatre brûlures et pose de pansement seront réalisées (45min) 2. J2 : sous nouvelle anesthésie générale, intervention chirurgicale au niveau de la brulure, prélèvement de peau et autogreffe de peau sur les zones brûlées, pose pansement (3h). 3. Sous anesthésie changement de 8 pansements : 4 brûlures + autogreffe et 4 sites donneur tous les 2/3 jours de J2 à J28 (1h). 4. Sous anesthésie et au moment du changement de pansements : biopsies punch sur sites brulés + autogreffe à J11, J14, J18 et prélèvements sanguins à J0, J2, J4, J7, J14, J21, J28 (1h 30). 5- Au 28ème jour l’euthanasie des porcs sous procédure complète d’anesthésie générale (1h).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux pourraient inclure : •Douleur au site de brûlure •Possibles douleurs, inconfort ou gêne au niveau des sites d’auto-greffe et des sites donneurs de peau après la chirurgie. •Risques de complications chirurgicales telles que l'infection des plaies ou les saignements. •Effets secondaires systémiques liés à l'anesthésie générale et ou aux médicaments administrés pendant les procédures chirurgicales et pour la gestion de la douleur post-opératoire. •Hébergement isolé des animaux au sein d’une même pièce, après la brûlure pour éviter les risques d’arrachement/ grignotage des pansements entre congénères.

Devenir

Au 28ème jour les porcs seront euthanasiés sous procédure complète d’anesthésie générale pour prélèvement des greffons cutanés traités avec les pansements. Les plaies seront excisées/collectées en post-mortem pour des analyses histologiques et les principaux organes ainsi que le sang seront prélevés pour des analyses toxicologiques.

Remplacement

Les effets des produits de sécrétion et du pansement ont été préalablement étudiés sur des modèles cellulaires in vitro. De plus, la cicatrisation cutanée a été évaluée sur un modèle d’exérèse de peau chez la souris et les analyses histologiques montrent un tissu de granulation plus épais à jour 8 des plaies traitées avec la nouvelle compresse par rapport aux souris contrôles. Cependant ce modèle murin présente des limites notamment le processus de cicatrisation qui se réalise par contraction et non par ré-épithélialisation comme chez l’Homme. De plus, s’agissant de plaies chirurgicales, il ne récapitule pas les conditions inflammatoires pathologiques de la brûlure. Ainsi ce projet se propose de passer sur un modèle grand mammifère plus proche de l’Homme afin de mettre en évidence les bénéfices du traitement sur les blessures par brûlure ayant subi une greffe de peau. Le remplacement par d’autres modèles biologiques n’est pas possible ici car seuls les modèles animaux rendent compte de l’ensemble des mécanismes mis en jeu au niveau cutané et systémique pour la cicatrisation.

Réduction

Après une analyse statistique tenant compte de divers facteurs tels que la puissance statistique, la variabilité attendue des résultats et les objectifs spécifiques de l'étude, nous avons déterminé qu'un groupe de 8 porcs serait suffisant pour obtenir des résultats significatifs et fiables tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés, conformément aux principes de la Stratégie de Remplacement, de Réduction et de Raffinement (3R). En plus des 8 porcs, nous avons prévu 2 animaux (10 porcs au total) pour une première partie procédure servant d’étude pilote. Elle aura pour objectif d’évaluer la faisabilité de l’expérience, d’entrainer les chirurgiens aux gestes techniques et de préciser les temps de suivi et d’analyse pour apprécier les capacités de prise de greffe et de cicatrisation après traitement. Si ce groupe pilote montre des résultats satisfaisants, la totalité des 10 animaux ne sera pas utilisée, mais seuls 8 animaux seront utilisés. Suite à ce 1er groupe, un second groupe de n=6 animaux, pourra être ajouté de façon à poursuivre l’étude en tester des améliorations techniques au niveau du pansement. Si les résultats sont satisfaisants, la totalité des 6 animaux ne sera pas utilisée. Dans tous les cas, le nombre d'animaux a été réduit au maximum en considérant que chaque animal est son propre contrôle.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au raffinement dans l’hébergement et dans la prise en compte des souffrances de l’animal. La température de la pièce sera maintenue à la même température que chez l’éleveur et l’alimentation sera poursuivie telle que chez l’éleveur de façon établir une continuité et diminue le stress thermique et alimentaire. Une alimentation humidifiée sera apportée aux animaux douloureux pour faciliter la prise alimentaire. De plus une attention particulière sera apportée au confort digestif des animaux par apport d’argile blanche et de pansement gastrique. La procédure se déroulera sous anesthésie générale et des antalgiques seront utilisés pour diminuer la douleur et apaiser les animaux et ils seront installés sur des tapis chauffants. Les pansements effectués tous les 2 jours se feront également sous sédation, et une évaluation de la douleur sera réalisée chaque jour afin d’optimiser l’analgésie si nécessaire. Il est important de souligner que toutes les nuisances et effets indésirables seront surveillés de près et traités de manière appropriée pour assurer le bien-être et le confort des animaux participant à l'étude. Enrichissement du milieu : Enrichissement diversifié et en rotation (jouets, luzerne compactée pour fouissage…) seront à disposition pendant toute la phase d’expérimentation, conformément aux moyens disponibles dans l’animalerie. Les animaux seront hébergés collectivement pendant la phase d’adaptation. Après début de la phase expérimentale à proprement parler, les animaux seront séparés pour permettre le déroulement des expérimentations dans de bonnes conditions. Un hébergement collectif n’est pas possible durant cette phase à cause des risques d’arrachement des pansements avec des comportements de grignotage des pansements entre congénères. Les porcs seront cependant hébergés au sein d’une même pièce, dans des boxes accolés avec contact olfactif, visuel et auditif.

Choix des espèces

Nous utiliserons des porcs mâles âgés d'environ 2 mois, car à cet âge, leur peau a une épaisseur similaire à celle des humains, ce qui facilite la comparaison des résultats. De plus, leur poids autour de 40 kg, rend la réalisation des expériences plus pratique. Ce modèle porcin partage de nombreuses similitudes anatomiques et physiologiques avec les humains. Par exemple, la peau des porcs a une épaisseur et une distribution des vaisseaux sanguins similaires à celle des humains. Ces caractéristiques font du porc un choix idéal pour étudier l'efficacité de notre nouveau pansement sur la cicatrisation après des brûlures, car il se rapproche davantage de la situation clinique chez l'homme.