Mammifères "de rente"
Evaluation multimodale des greffons cardiaques en transplantation
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
60 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque animal subit une chirurgie du thorax d'une quarantaine de minutes puis est tué pour prélever le cœur, afin de comparer des dispositifs de préservation de greffon et une évaluation par imagerie. Le porteur écrit que la "souffrance myocardique" provoquée est "nécessaire à l'étude" tout en la présentant comme sans douleur supplémentaire pour l'animal sous anesthésie. Sur le remplacement, il affirme que l'évaluation d'un organe ne peut se réduire à celle d'une cellule et que la simulation informatique reste insuffisante.
Objectifs
Le but de ce projet est d’être le premier pas vers l’amélioration de la préservation et donc de la qualité des greffons cardiaques en limitant les conséquences de l’ischémie (arrêt de l’apport sanguin vers un organe), celle-ci ayant pour conséquence l’altération puis l’arrêt de la fonction de l’organe. Cette étape fait partie du processus de transplantation cardiaque. Pour protéger le cœur de cette ischémie et lui permettre de repartir, il est mis en sorte d’hibernation profonde, arrêtant sa fonction de pompe le temps du transport de l’organe vers le receveur. Le cœur ne se contracte plus et donc ne consomme quasiment pas d’oxygène. Il est ainsi protégé pour une durée de 4 à 6h. Passé ce délai, les altérations sur le cœur, secondaire à l’ischémie ne permettront pas au cœur de repartir. Le délai entre l’arrêt du cœur et son nouveau départ est court. Pour nous permettre d’augmenter le nombre de greffon (actuellement 1 greffon pour 2 patients) et améliorer sa protection, nous avons établis un protocole qui compare les dispositifs de transport du greffon. Améliorer sa protection est une obsession permanente. En effet, 42 % des patients transplanté cardiaque vont présenter dans les 24h premières heures une dysfonction précoce du greffon, c’est-à-dire une altération de sa fonction contractile qui conduit souvent au décès du patient. En effet, la pompe cardiaque est alors dans l’incapacité d’apporter le débit sanguin nécessaire à tout l’organisme et qui entraine la souffrance de l’ensemble des organes. Cette dysfonction peut être liée à un rejet. Cette réaction immunitaire forte est dirigée contre le cœur qui est reconnu comme étranger à l’organisme, comme si c’était un virus. La durée d’ischémie est responsable à elle seule de cette dysfonction. Améliorer la protection cardiaque pourrait diminuer les dysfonction précoces ainsi que les complications pour les patients : pose d’assistance cardiaque, dysfonction d’organes comme le foie ou le rein, etc..
Bénéfices attendus
Utiliser des dispositifs plus fiables que ceux utilisés actuellement permettra d’améliorer le taux de succès des transplantations réalisées, en limitant notamment les dysfonctions précoces des greffons. Par ailleurs, se donner les moyens d’évaluer la qualité d’un greffon cardiaque, via l’IRM (imagerie fiable, reproductible, non opérateur dépendant) constituera un véritable outil de recherche translationnelle. L’objectif étant de le transposer en pratique clinique pour avoir à disposition un moyen fiable et rapide d’évaluation avant la transplantation cardiaque, moyen inexistant à ce jour. Cela permettra par la suite d’exploiter à leur maximum le potentiel des trois nouveaux dispositifs qui sont ou seront prochainement mis sur le marché. Chacun repose sur une technologie spécifique avec une efficacité et un cout propre. Mieux les connaitre permettra d’adapter le dispositif de préservation aux durées d’ischémies prévues/anticipées afin d'en limiter les conséquences et de rationaliser le bilan cout/efficacité. Enfin, ces dispositifs de conservation des greffons cardiaques, dont certains promettent jusqu’à 24h de protection pourraient modifier l’organisation de la transplantation cardiaque chez l’Homme.
Procédures
tous les animaux seront soumis à une unique chirurgie du thorax de courte durée sous aesthésie générale et analgésie profonde (environ 40 min au total).
Impact sur les animaux
L'animal subira une période de stress lors de son acheminement jusqu’à son lieu d'hébergement et au stress de l'induction d'une anesthésie générale de courte durée.
Devenir
Les animaux sont mis à mort afin que les organes soient prélevés.
Remplacement
L’évaluation d’un organe ne peut pas se réduire à l’évaluation d’une cellule. Un organe est composé de différents tissus, eux-mêmes composés de cellules. La fonction d’un organe résulte d’une interaction de ces tissus. L’évaluation de sa fonction ne peut pas être « réduite » à l’évaluation cellulaire ou tissulaire. Par ailleurs, les progrès de la simulation informatique ne permettent pas encore non plus de modéliser l’organe de façon adapté à notre besoin. Ce projet pourrait être l’occasion de créer un modèle d'évaluation des greffons cardiaques. Le choix du cochon comme modèle animal est lié au fait qu’il est l’un des plus directement transposable chez l’homme.
Réduction
Les analyses statistiques réalisées dans le cadre d'une étude préliminaire portent à 9 le minimum d'animaux nécéssaire pour la partie omique et à 10 pour la partie IRM. Les équipes avec lesquelles nous allons collaborer pour utiliser le maximum d'organes pour chaque animal sacrifié sont désormais bien identifiées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par petits groupes, dans des box individuels permettant le contact physique, olfactif et visuel entre congénères. Ils sont hébergés sur litière de copeaux, ce qui leur permet d’exprimer leur comportement de fouissage (une partie des granulés est cachée dans la litière) et des balles de plastique au sol ou attachées au mur sont mises à disposition. Les hébergements sont sur un cycle jour/nuit de 12h/12h avec une température de 20-21°C, mais les animaux seront réceptionnés la veille de la procédure sans réveil. Le protocole sera le même que celui réalisé chez l’homme lorsque le cœur bat encore mais que le cerveau ne fonctionne plus, et de façon irréversible. Ce protocole est conçu pour assurer l’absence de douleur (sous anesthésie générale et analgésie profonde). Celle ci sera surveillée par la fréquence cardiaque et l'électrocardiogramme. Ainsi, en cas de tachycardie (augmentation franche de la fréquence cardiaque) a plus de 150 battements par minute, les sédations seront augmentées pour garantir l'analgésie. La « souffrance » myocardique provoquée est nécessaire à l'étude mais n’entraine aucune douleur supplémentaire pour l’animal.
Choix des espèces
Le porc est l’animal dont la physiopathologie se rapproche le plus de l’Homme. Ces résultats pourront donner suite à des études cliniques chez l’Homme. Nous utiliserons des porcs juvéniles de 55 kg. Ce choix nous permet de nous rapprocher au plus de la morphologie chez l’Homme. Cette taille nous permettra également de mutualiser les organes avec les chirurgiens thoraciques. Des porcs plus petits rendent difficile voire impossible les prélèvements conjoints du cœur et des poumons.
MPODP-1 : Etude pharmaco-cinétique et tolérance locale d’un système de délivrance intra-utérin à libération prolongée de médicament 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
56 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque brebis subit une chirurgie de pose d'implant utérin sous anesthésie, sept à neuf prélèvements sanguins et plusieurs transports entre deux sites, pour évaluer un dispositif destiné à traiter les fibromes chez la femme. Le porteur indique que, le jour de la mise à mort, les brebis encore anesthésiées seront utilisées pour la formation chirurgicale d'internes dans le cadre d'un autre projet, avant l'euthanasie. Il précise avoir écarté le primate, habituellement utilisé pour ce type d'étude, au profit de l'ovin.
Objectifs
L’objectif principal est la tolérance d'un implant utérin (type stérilet) qui permettrait de traiter localement les fibromes chez la femme. Le devenir dans l'organisme du principe actif contenu dans les implants intra-utérins à libération longue durée sera évalué. Les critères d’évaluation sont: - La teneur en principe actif dans les tissus utérins à différents temps (1 mois, 2 mois ou 3 mois) - La teneur en principe actif dans le plasma sanguin par prise de sang à différent temps et au stade terminal. Les objectifs secondaires et critères d’évaluation sont les suivants: - Evaluation de la tolérance locale du principe actif par une évaluation macroscopique et histologique des organes en terminal (utérus, ovaires, vagin, foie, rein) - Évaluation de l’état du système de délivrance du principe actif à l'issue de l'expérience par prélèvement de l’implant. L’évaluation de la dégradation est macroscopique et des caractérisations physico-chimiques seront réalisées. Le projet se déroule sur 2 sites : un site où les interventions et suivi post opératoire auront lieu (site n°1) et un site où le soin de suite sera réalisé (site n°2).
Bénéfices attendus
Ce projet d’expérimentation animale permettra d’évaluer les prototypes d’implants en termes de profil pharmacocinétique, notamment la durée et le niveau de concentrations circulantes. Ce projet permettra d’évaluer la performance et la sécurité des prototypes de dispositifs intra-utérin à libération prolongée d’un principe actif avant de passer en phase clinique. Le projet est nécessaire pour démontrer le profil pharmacocinétique du principe actif, l’exposition locale utérine, l’exposition systémique ainsi que la tolérance locale du principe actif et du système de libération vis à vis des organes.
Procédures
Les animaux auront tous une procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée estimée à 2h). Puis de 7 à 9 prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigile (estimé à 10 min chacun). Le jour de la fin de procédure et donc de mise à mort, les animaux sous anesthésie générale pourront être utilisés à des fins de formation des internes de chirurgie via la réalisation d'une procédure chirurgicale, encadrée par un médecin sénior (durée inférieure à 4h avant sacrifice, toujours sous anesthésie générale). Le projet se déroule sur 2 sites, les brebis seront donc déplacées pour 3 trajets (30 minutes). Sur le premier site (appelé animalerie n°1) auront lieu la chirurgie, le suivi post-opératoire immédiat (jusqu'au jour 4 environ, ou plus selon l'état de santé de l'animal) puis la mise à mort. Le second site (appelé animalerie n°2) est le fournisseur des animaux. Après avoir été opérées et surveillées en post-opératoire au sein de l’animalerie n°1, les brebis retourneront vers l'animalerie n°2 pour tout le temps du suivi (soit de 3 semaines à environ 3 mois selon les lots). Elles seront réacheminées sur l'animalerie n°1 pour la mise à mort.
Impact sur les animaux
En termes d’effets indésirable, le principe actif est approuvé aux Etats-Unis pour une utilisation chronique dans le syndrome de Cushing afin de contrôler l'hyperglycémie chez les patients. Le système de délivrance du médicament testé chez les animaux contiendra une dose beaucoup plus faible que celle usuellement pratiquée par voie orale. Avec une libération prolongée sur 3 mois, le risque d’entraîner des effets indésirables chez l’animal est extrêmement faible. Un stress peut également être engendré lors de chaque manipulation : tonte avant l'intervention, avant les anesthésies, lors des 4 prises de sang en post opératoire et lors des transports et changements de lieu. Du fait de l'intervention chirurgicale, des douleurs post opératoires sont possibles. Une légère douleur au point de prélèvement des prises de sang est également envisagée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort le dernier jour de suivi. Néanmoins, avant l'euthanasie, l'animal toujours sous analgésie et anesthésie générale, pourra être utilisé à des fins de formation des internes de chirurgie dans le cadre d'un autre projet autorisé (pour une durée inférieure à 4 heures). L'animal est ensuite euthanasié.
Remplacement
Le projet consiste à démontrer l’efficacité d'un système de délivrance d’un principe actif qui a d’ores et déjà été étudié et vérifié via des études in vitro. Avant de passer en phase d'étude clinique, l'étape in vivo est requise et ne peut être remplacée pour valider l’efficacité du système de délivrance. L’efficacité du système de délivrance repose notamment sur des processus biologiques d’absorption, d’accumulation et d’élimination, qui ne peuvent être simulés en intégralité par des modèles non vivants ou par des modèles in-silico. Par ailleurs, nous avons considéré de remplacer les primates utilisés habituellement pour des études de ce genre par des ovins.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au strict minimum (6 animaux par lot : 2 par durée de suivi). Il a été préféré de limiter ce nombre à son minimum et de permettre de renouveler chaque lot une fois en cas de besoin. Dans l'objectif de réduction du nombre d'animaux, et sur les recommandations du conseil scientifique du site porteur, les animaux lorsqu'ils seront sous anesthésie générale pour les prélèvements de fin de procédure (au bout d’un mois, de deux mois ou de trois mois de suivi selon le groupe), les animaux ne seront pas directement mis à mort mais utilisés à des fins de formations des internes de chirurgie pour une à deux procédures expérimentales supplémentaires, toujours sous anesthésie générale, avant euthanasie (projet ayant une autorisation APAFiS distincte).
Raffinement
La procédure d’implantation du dispositif se déroulera intégralement sous anesthésie générale avec apport d'analgésique préopératoire et un ajustement des doses en cas d'apparition de signes de douleur ou de réveil (modification de la fréquence respiratoire). Une analgésie post-opératoire sera également mise en place. Les animaux seront re-transférés sur leur lieu d'approvisionnement (site n°2 agréé à l'expérimentation animale) qui est plus adapté pour les périodes prolongées. Les temps de trajet des animaux sont de courte durée (inférieurs à 30 min). Ces déplacements sont assurés par le site n°2, via un véhicule agréé au transport des ovins. Une grille de score est établie avec suivi des points limites (grille de scores). La même grille de score sera applicable quel que soit le lieu d'hébergement.
Choix des espèces
Le système de délivrance du médicament est destiné à être implanté dans la cavité utérine des femmes adultes dans l’objectif de diminuer la taille des fibromes utérins. Par conséquent, l’espèce a été choisie en fonction de l’anatomie utérine, de telle sorte que celle-ci soit la plus similaire possible à celle de l’anatomie de la femme. L’utérus de la femme est un utérus simplex, caractéristique des humains et des primates. Le primate n’a pas été sélectionné pour l’étude pour des raisons éthiques et de disponibilités de l’espèce. Les autres espèces possèdent soit un utérus duplex (rat, lapin, cochon d’inde, etc), bipartite (jument) ou bicorne (chienne, truie, vache, brebis). Les espèces pouvant être utilisés pour l’expérimentation animale possèdent donc une anatomie différente de celle de la femme. Afin de sélectionner l’espèce la plus pertinente pour l’étude, la taille de l’utérus a donc été le second critère de choix.L’utérus de l’espèce doit pouvoir recevoir l’implant dans son intégralité pour pouvoir transposer les résultats obtenus vers l’application clinique. La taille des cornes utérines de la brebis et de la truie permettent l’implantation de l’implant dans sa totalité. La brebis représente un meilleur modèle que la truie en raison de sa taille, de l'anatomie pelvienne et de la taille des vaisseaux utérins. La brebis adulte a donc été sélectionnée comme l’espèce la plus pertinente.
Étude de la réponse immune et du remodelage de fils biologiques de matrice extracellulaire issu d’un substitut vasculaire dans un modèle d’implants sous cutanés allogéniques chez l’ovin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
27 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque brebis subit une opération de trois à quatre heures sous anesthésie pour recevoir des implants sous-cutanés, suivie de deux semaines à six mois avant d'être tuée et sa peau prélevée, afin de tester la réaction immunitaire à un substitut vasculaire biologique. Le porteur présente comme une mesure de réduction le fait que le cœur des brebis pourra ensuite être utilisé pour des projets de cardiologie du même institut. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle ne peut suppléer l'animal vu la complexité du système immunitaire et retient la brebis comme seule espèce dont les cellules conviennent.
Objectifs
Contexte : Pour créer un abord vasculaire pour permettre l’hémodialyse, ou pour créer un pontage en remplacement de petits vaisseaux sanguins périphériques ou coronariens obstrués le chirurgien utilise des vaisseaux sanguins du patient lui-même. Malheureusement, ces vaisseaux viennent souvent à manquer lors d’interventions répétées suite à la progression d'une maladie par exemple. Dans cette situation, des prothèses vasculaires synthétiques sont utilisées mais avec de mauvais résultats. Ainsi, de nombreux groupes de recherche ont émis l’hypothèse qu’une prothèse vasculaire entièrement biologique apporterait de meilleurs résultats qu’une prothèse synthétique, c’est pourquoi l’objectif de ce projet est de développer un substitut vasculaire entièrement biologique par ingénierie tissulaire, issu d’une approche par substitut cellulaire. Cette approche repose sur la production de feuillets composés de matrice extracellulaire synthétisée par des cellules maintenues en culture cellulaire. A partir de ces feuillets de substitut cellulaire, des fils sont produits et utilisés afin d’assembler un substitut vasculaire par tissage. C'est à dire que ce procédé a pour objectif final de créer des vaisseaux à partir de cellules qui pourront être implantés. Notre étude a montré que le modèle ovin semblait plus adapté pour produire des feuillets de substitut cellulaire. L’expérimentation envisagée consiste à étudier la réponse immunitaire de l’hôte suite à l’implantation sous-cutanée des fils produits à partir de feuillets ovins.
Bénéfices attendus
Le développement d’un modèle animal va permettre d’appréhender la réaction immunitaire de l’hôte à l’implantation du substitut vasculaire dans un contexte de greffe allogénique (conditions proches des conditions cliniques). Les bénéfices de ce projet permettront de s’assurer de la biocompatibilité du tissu produit avant d’envisager le tissage du substitut vasculaire et son implantation. De plus, la réponse des cellules de l’hôte qui peuvent soit détruire, soit remodeler l’implant ne peuvent être évaluées autrement. L’expérimentation envisagée consiste à étudier la réponse immunitaire de l’hôte suite à l’implantation sous-cutanée des fils produits à partir de feuillets ovins. Cette expérimentation permettra d’évaluer la réponse inflammatoire ainsi que le remodelage des fils à différents temps de suivi (2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois) par des analyses histologiques et l’analyse des propriétés mécaniques des fils (avant et après l’implantation). Ces données nous permettront de sélectionner le procédé de création et de conditionnement des fils les plus adaptés pour tisser le substitut vasculaire.
Procédures
Chaque animal sera opéré une seule fois et l’intervention chirurgicale sera effectuée au bloc opératoire sous anesthésie générale par le personnel formés et habilités (environ 3 à 4 heures d’opérations).. Les fils expérimentaux et contrôles seront implantés en sous-cutanées à l’aide d’aiguille stérile. Suite à la procédure, le suivi, le réveil, les soins per-opératoires et post-opératoires seront effectués par le personnel de l’animalerie. Après leur réveil, les animaux sont remis en stabulation collective dans un objectif de raffinement. Ils sont maintenus sous surveillance pendant 6 à 10 jours où ils reçoivent les soins post- opératoires. Après cette période de surveillance, les animaux sont hébergés soit à l’établissement utilisateur, soit transportés et hébergés dans des conditions de ferme dans les hébergements annexes. Ils seront visités et suivis quotidiennement par le personnel présent et formé et reviendront minimum 72h avant le jour de prélèvement, défini en fonction de leur temps de suivi (2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois). Les explantations seront effectués après l’euthanasie de l’animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels se situent principalement lors de la réalisation de la procédure chirurgicale sous- anesthésie. Les effets indésirables lors de l'opération peuvent être: troubles du rythme cardiaque et hypothermie. Des effets indésirables post-opératoire peuvent être : infection du site d’implantation sous-cutanées, mauvaise cicatrisation et démangeaisons. Au niveau de la phase longitudinale, lors de l’hébergement les potentiels effets indésirables peuvent être un stress ou de l’angoisse du au trajet entre l’EU et l’hébergement annexe.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort aux différents temps précédemment décrits (2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois). La peau des animaux sera ensuite prélevée après le sacrifice des animaux. Les différents fils expérimentaux seront explantés pour être analysés
Remplacement
Il est nécessaire de s’assurer de la biocompatibilité du tissu produit (les fils de substitut cellulaire) avant d’envisager le tissage du substitut vasculaire et son implantation. De plus, la réponse des cellules de l’hôte qui peuvent soit détruire, soit remodeler l’implant ne peuvent être évaluées autrement. A ce jour, aucun système de modélisation ne peut suppléer à l'utilisation d'un modèle animal étant donné la complexité du système immunitaire. L’étape d’expérimentation animale est également légalement obligatoire avant l’utilisation de ce type de produit chez l’humain. Nous avons choisi un modèle ovin pour les raisons suivantes. Les modèles animaux immunodéficients ou immunosupprimés notamment souris ou rats, ne peuvent pas mimer la physiologie humaine car ils sont trop petits. Ces modèles animaux ne permettent pas d’étudier le système immunitaire innée et adaptif et représente des conditions d’implantations xénogéniques éloignés des conditions cliniques futures allogéniques.C’est pourquoi ce projet vise le développement d’un modèle de gros animal qui permettra d’évaluer, à long terme, la réponse immunitaire innée de l’hôte combinée à la réponse immunitaire adaptative dans un contexte de greffe allogénique (indisponible chez les animaux immunodéficients ou immunosupprimés) simulant les conditions cliniques. D’après nos études menées au laboratoire, le modèle ovin est le seul dont les cellules permettent la production de feuillets de substitut cellulaire qui ressemblent à ceux produits avec des cellules humaines et permettront d’étudier la réponse immunitaire dans un contexte allogénique. Le but de ce projet est le développement d’un modèle ovin qui va permettre d’appréhender la réaction immunitaire innée et adaptative de l’hôte à l’implantation des fils de substitut cellulaire dans un contexte de greffe allogénique.
Réduction
Ces expérimentations sont conçues pour avoir recours à un nombre minimal d’animaux permettant l’obtention de résultats exploitables avec des tests statistiques de comparaison multiple pour comparer les différentes conditions et les différents temps d’implantation. Nous souhaitons implanter 2 brebis pour chaque temps expérimental classiquement décrits dans la littérature (2 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois) pour l’étude de la réponse immune innée et adaptative (précoces et tardives). Pour chaque condition expérimentale testée, nous implanterons 8 fils de chaque condition sur chaque animal. Ainsi chaque animal sera son propre contrôle car toutes les conditions expérimentales seront implantées dans chaque individu, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux impliqués dans l’expérimentation à 2 par temps de suivi. Le renouvellement de ces expérimentations permettra d’effectuer des modifications et/ou optimisations des conditions expérimentales avec un criblage plus fin pour sélectionner le conditionnement de préparation du fil de substitut cellulaire le plus adapté à la production du substitut vasculaire. Dans un objectif de réduction globale d’utilisation d’animaux vivants à des fins expérimentales, les animaux utilisés dans ce projet pourront être sacrifiés selon les méthodes décrites de prélèvement cardiaque de l’établissement utilisateur afin que leur cœur puisse être utilisé dans les projets de recherche de cardiologie mené au sein de cet institut.
Raffinement
Les animaux seront suivis dans des locaux agréés avec du personnels qualifiés et les périodes d’isolement limités au strict minimum nécessaire afin de réduire l’angoisse. Lors des interventions, angoisse, douleur et souffrance seront réduites par une prémédication. Durant l’anesthésie qui sera maintenue par voie gazeuse. l’électrocardiogramme, la pression artérielle, et la saturation en oxygène seront suivis. Des molécules de réanimation et un défibrillateur seront utilisés en cas de besoin selon les signes cliniques et du monitoring des signes vitaux. Le réveil de l’animal est réalisé sous analgésique et oxygène jusqu’à obtention d’une respiration spontanée. Le réveil sera surveillé par le personnel de l’animalerie qui vérifie la température et la posture debout de l’animal et administre des soins si nécessaire. Après leur réveil, les animaux sont remis en stabulation collective (raffinement adéquat à son espèce groupe social, pierre à sel à disposition, foin et paille…) Pour l’hébergement des animaux; Ils sont maintenus sous surveillance à l’établissement utilisateur pendant 6 à 10 jours où ils reçoivent les soins post-opératoires, pour surveiller leur état de santé et soigner les plaies chirurgicales. Les animaux sont ensuite hébergés soit à l’établissement utilisateur, soit transportés vers l’hébergement annexe. Ça offrira à l’animal des conditions quotidiennes maximales d’hébergement durant les périodes intermédiaires entre les différentes étapes du projet. Ils seront visités et suivis quotidiennement par le personnel présent, et reviendront sur le site de l’établissement utilisateur minimum 72h avant le jour de prélèvement, défini en fonction de leur temps de suivi. Des points limites ont été définis. Si les premiers animaux présentent une défaillance des fonctions vitales dans les heures ou premiers jours qui suivent l’intervention, le protocole sera interrompu. L’observation de l’état des animaux est réalisée quotidiennement au sein de l’établissement où ils seront hébergés. Si l’état de santé d’un animal est concerné par l’un des points limites ainsi que par toute autre observation jugée anormale, un examen vétérinaire approfondi est réalisé et le responsable du projet est contacté par l’établissement utilisateur pour définir la conduite à tenir (prescription traitement médical adapté, examens complémentaires). Si l’état de santé est préoccupant, le vétérinaire et le responsable du projet décideront de l’euthanasie.
Choix des espèces
Ces expérimentations chez le gros animal sont nécessaires pour évaluer la faisabilité et la durabilité de greffons vasculaires de diamètres qui correspondent à ceux utilisés en clinique. Le modèle ovin a été choisi car il fait partie des modèles animaux couramment utilisés dans le domaine vasculaire. En revanche, d’après nos études menées au laboratoire, ce modèle est le seul dont les cellules permettent la production de feuillets de substitut cellulaire qui ressemblent à ceux produits avec des cellules humaines. Grâce à la collaboration mise en place avec, nous avons déjà extrait, purifié et amplifié des cellules issues de biopsies de peau récupérées post-mortem sur des brebis. Nous avons donc sélectionné l’espèce qui nous permettrait d’étudier la réaction immunitaire et le remodelage des fils par les cellules de l’hôte, implantés en tant qu’allogreffes. Les animaux seront implantés à partir de 13 mois d’âge afin d’avoir des brebis adultes. Les brebis possèderont un système immunitaire et un système vasculaire mature. Cet âge est aussi compatible avec le suivi des implantations à des temps tardifs (6 mois).
OPTIMISATION DE LA SURVIE DU GREFFON CARDIAQUE AVANT TRANSPLANTATION – ÉTUDE CHEZ LE PORC
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
72 porcs vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chaque animal subit une ouverture du thorax puis un arrêt cardiaque provoqué, le cœur étant prélevé pour tester un dispositif de transport de greffon et une solution de préservation mis au point au laboratoire, protégés par deux brevets. Le porteur décrit une mise à mort sous anesthésie sans réveil et situe le seul stress possible à l'induction de l'anesthésie. Sur le remplacement, il affirme que les essais sur cellules restent "très insuffisants" pour représenter les phénomènes en jeu dans le greffon et retient le porc pour la proximité de son cœur avec celui de l'humain.
Objectifs
CONTEXTE La transplantation cardiaque est face à un problème majeur : la pénurie de greffons. Pour pallier à ce problème, les équipes cliniques envisagent d’utiliser de nouvelles sources de greffons dits à « critères élargis » (provenant de donneurs âgés, pathologiques, en arrêt cardiaque ou encore lointains géographiquement). Afin d'assurer une protection optimale de ces greffons fragiles, nous avons mis au point un nouveau procédé de transport par perfusion hypothermique qui permettrait d’optimiser la protection du cœur. Ce dispositif a fait l’objet de 2 brevets et a été récompensé par le prix de l’innovation. OBJECTIF GÉNÉRAL DU PROJET Notre objectif est d'optimiser la survie du greffon cardiaque grâce à un nouveau dispositif de transport des greffons, associé à une nouvelle solution innovante de préservation du greffon. Le dispositif de transport ainsi que la solution de préservation ont été mis au point dans notre laboratoire. Les études précliniques expérimentales proposées seront menées chez le porc. Ces travaux doivent permettre un passage du procédé en clinique humaine dans les prochaines années. RECHERCHE DE TYPE PRÉCLINIQUE Il s’agit d’une recherche translationnelle avec 3 objectifs opérationnels: 1- Prolonger le temps de préservation du greffon cardiaque. 2- Optimiser les conditions de survie des cœurs prélevés arrêtés. 3-Développer une méthode originale et non invasive d’évaluation de la viabilité du greffon par des analyses en imagerie (IRM et ultrasonore)
Bénéfices attendus
Le projet permettra une meilleure connaissance scientifique des phénomènes de survie des greffons avant transplantation. Les résultats obtenus faciliteront nous l’espérons : (i)les partenariats industriels (en cours), (ii)le transfert des données expérimentales vers la clinique humaine. Concernant les bénéfices cliniques, le nouveau procédé de préservation des greffons permettra d’augmenter le pool de donneurs (près d’1/3 de donneurs supplémentaires), par l’utilisation de greffons géographiquement éloignés et de greffons provenant de patients à critères élargis. Ces nouvelles sources de greffons permettront de pallier, au moins en partie, à la pénurie des greffons, problème crucial de la transplantation cardiaque aujourd’hui.
Procédures
Dans un premier objectif, les animaux sont placés sous anesthésie générale et couverture analgésique adéquates (phase de préparartion de 30 min environ) puis seront soumis à une procédure chirurgicale (ouverture du thorax et cardioplégie) d’une durée de 30 minutes environ. L’animal est mis à mort pendant l’anesthésie générale. Durée totale de la procédure sous anesthésie générale : 60 minutes environ. Dans un premier objectif, les animaux sont placés sous anesthésie générale et couverture analgésique adéquates (phase de préparartion de 30 min environ) puis une injection intraveineuse de molécules anticoagulante, anesthésiante et curarisante induit un arrêt cardiorespiratoire puis la mort de l’animal. 30 min après la mort de l'animal le cœur est prélevé. Durée totale de la procédure sous anesthésie générale : 70 minutes environ.
Impact sur les animaux
Tous les travaux se dérouleront sur des animaux sous anesthésie générale, complétée par des antalgiques. La mise à mort aura lieu durant la phase d'anesthésie (induction d'un arrêt cardiaque in situ) et donc sans réveil de l'animal. Le seul moment où l'animal est susceptible de ressentir un stress est l'induction de l'anesthésie à l’initiation de l’expérimentation. Les protocoles utilisés ont été mis en œuvre pour éviter toute douleur ou souffrance de l'animal. Il s’agit de procédures sans réveil.
Devenir
Le projet consiste à réliser à un prélèvement cardiaque en vue d’éudier le comportement du cœur isolé dans les conditions opératoire pré-transplantation. Tous les animaux utilés sont sont mis à mort (sous anesthésie et sans souffrance) du fait du prélèvement du cœur.
Remplacement
En amont du projet, de nombreux essais ont été réalisés sur modèles cellulaires ce qui a permis d’obtenir nos premiers résultats. Les cellules ont été placées dans différentes solutions (7 solutions testées) et à différentes températures (7 températures évaluées entre 5 et 35°C). Notons toutefois, les protocoles de conservation sur cellules restent très insuffisants pour représenter la complexité des phénomènes physiopathologiques survenant au niveau du greffon cardiaque. Ce projet a pour objet de tester un nouveau dispositif médical et une nouvelle procédure spécifique de perfusion du greffon lesquels nécessitent l’utilisation d’un modèle animal pertinent. Ainsi, pour nous rapprocher au mieux des conditions cliniques, nous mènerons nos travaux chez l’animal, ce qui nous permet de mimer les situations rencontrées en clinique.
Réduction
Concernant la réduction du nombre d'animaux utilisés (8 par groupe), nous nous sommes basés sur une évaluation statistique permettant d’évaluer avec précision le nombre minimal d’animaux nécessaires pour valider nos hypothèses scientifiques. Par ailleurs, en plus de notre fournisseurs agréé, éleveur de porcs fermiers, nous pourrions bénéficier de quelques animaux destinés à être mis à mort dans le cadre d’une autre étude, ce qui permettrait une réduction globale du nombre d’animaux.
Raffinement
Nous sommes en contact avec d’autres équipes (laboratoires), disposées à récupérer du matériel biologique issu de ces animaux (rein, foie, pancréas, cerveau, peau, oreilles, sang ...), en post-mortem. Par ailleurs, de nombreuses petites actions de raffinement seront mise en place comme : le passage régulier de l’animalier dans l’enclos, le fait que celui-ci habitue le porc à sa présence, le caresse au niveau du cou, l’utilisation d'une crème de type Lidocaïne appliquée au niveau de la zone d’injection (cou et cuisse) avant l'anesthésie, et l'utilisation d'une seringue munie d’un prolongateur, permettant l'induction de l'anesthésie à distance de l'animal (ce qui réduit considérablement le stress lié à l’induction de l’anesthésie). De manière générale, le programme antidouleur envisagé est bien adapté. Un autre point concerne l’isolement préopératoire des animaux sur plusieurs jours lors de l’hébergement. Nous tenterons de pallier à cette situation en hébergeant (autant que possible) 2 animaux simultanément. Ce qui impliquera pour nous d’utiliser ces 2 animaux sur la même demi-journée d’expérimentation. Enfin, plusieurs points limites dans nos procédures sont à mentionner, excluant les animaux de l’étude : (i) mauvais état général de l’animal en préopératoire durant l’hébergement (fièvre, blessures, diarrhées…), (ii) mauvaise tolérance aux anesthésiques, pouvant provoquer chez lui un arrêt cardio-respiratoire imprévu, (iii) accident de chirurgie (hémorragie suite à une blessure irréversible sur l’aorte ou sur l’artère pulmonaire, fibrillation irréversible du cœur), (iv) infection du cœur (péricardite découverte lors de l’ouverture du thorax). .
Choix des espèces
Pour nous rapprocher au mieux des conditions cliniques, et dans une optique de transfert clinique, nous mènerons nos travaux chez le porc. Nous avons choisi cette espèce animale, du fait de la proximité anatomique et physiologique entre le cœur de porc et le cœur humain. Par ailleurs, le dispositif médical de perfusion des greffon cardiaque que nous avons conçu est destiné aux cœurs humains. Il est donc indispensable de le tester et l’évaluer expérimentalement avec des greffons de taille similaire. Le cœur de porc se prête parfaitement à cette évaluation. Nous utiliserons de jeunes porcs d’environ trois mois ayant un poids compris entre 35 et 40 kg. Nous avons historiquement une bonne expérience de l’utilisation de ces animaux, à cet âge. En effet, les résultats obtenus ont fait l’objet de nombreuses publications. En outre, pour des raisons pratiques, les animaux de plus de 45-50 kg sont non adaptés à nos installations et à notre matériel, et de ce fait, augmenteraient les difficultés d’expérimentations, tant du point de vue de la manipulation de l’animal que de la gestion de l’anesthésie (perturbations susceptibles de survenir par phénomène de relargage de l’anesthésie du fait de la masse graisseuse importante chez les animaux dépassant les 50 kg). Les animaux utilisés seront donc de jeunes adultes, permettant une transposition par rapport aux patients donneurs jeunes (issus par exemple et tragiquement d’un accident de voiture). La taille et la physiologie des cœurs de ces animaux est proche de celles des cœurs humains. Des animaux plus jeunes ou plus âgés nous éloigneraient de ces critères cliniques.
Angiographie par résonance magnétique avec injection de produits de contraste chez le porc
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
7 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sains, ils reçoivent sous anesthésie générale deux injections de produits de contraste espacées de 48 heures, pour comparer un agent de routine à un nouveau candidat en imagerie par résonance magnétique. Le porteur juge la toxicité attendue très faible, et justifie la mise à mort par l'impossibilité d'un retour à l'élevage pour "raisons sanitaires". Sur le remplacement, il affirme que des tests in vivo sont "indispensables" et retient le porc pour sa proximité anatomique avec l'humain.
Objectifs
L’angiographie par résonance magnétique (MRA) avec injection d’un agent de contraste est une technique qui permet de détecter des lésions vasculaires chez des patients atteints de pathologies artérielles, en utilisant l’Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM). L’objectif de ce projet est de comparer 2 produits de contraste, un utilisé en routine et un nouveau candidat, potentiellement plus efficace à demi dose. Il s’agit ici de confirmer l’efficience de cette demi dose, afin de garantir son innocuité et sa sécurité d’emploi en clinique humaine, ainsi que son efficacité sur des lésions vasculaires. Dans cette étude le recours à l’animal (porc sain) a été choisi car l’imagerie peut s’effectuer avec des protocoles d’angiographie transposables directement à l’Homme.
Bénéfices attendus
Sur le court terme, ce projet va permettre de documenter l’efficacité d’un nouvel agent de contraste lors d’une angiographie par résonance magnétique et de déterminer ses performances et ses limites dans cette application médicale. Sur le plus long terme, ce projet s’inscrit dans l’intérêt clinique des patients, en effet le praticien hospitalier pourra déterminer la meilleure posologie à attribuer aux patients tout en préservant les mêmes performances que les agents de contraste actuellement sur le marché.
Procédures
Les animaux subiront 2 injections par la veine auriculaire, sous anesthésie générale, à 48 heures d'intervalle. La procédure totale dure environ 2h, répétée 2 fois.
Impact sur les animaux
Les complications d’une anesthésie sont rares. En cas d’irritation de l’appareil respiratoire supérieur (liée à l’intubation), un anti inflammatoire non stéroïdien sera administré. Des complications infectieuses pourraient également survenir : un antibiotique serait alors administré. L’injection des produits de contraste à la veine auriculaire ainsi que les médicaments par voie intraveineuse peuvent entrainer un hématome. Les produits qui seront injectés aux sujets sont des agents de contraste destinés à l’usage chez l’homme. Ils ont globalement un excellent profil de tolérance, avec une élimination rapide. Concernant les effets potentiels chez l’animal, ils sont considérés comme très faibles. Par conséquent, il n’est pas attendu de toxicité particulière dans cette étude chez le porc.
Devenir
Une fois la procédure d’imagerie effectuée, les animaux seront euthanasiés. En effet aucun replacement ni adoption n’est possible après des injections d’agents de contraste, et le retour à l'élevage d'origine est impossible pour des raisons sanitaires.
Remplacement
Pour s'assurer de l'efficacité réelle des agents de contraste, des tests in vivo sont indispensables. En effet, le recours aux animaux permet d’avoir des modèles ayant de fortes homologies avec l’Homme, soulignant ainsi le transfert possible des résultats vers l'Homme. Cela permet également de prendre en considération le comportement des agents de contraste au sein des différents organes. Le projet sera conduit sur des porcs ayant un poids d’environ 40 kg. Le modèle porcin est déjà validé pour les études cardiovasculaires. Le choix de cette espèce nous permettra de comparer nos résultats aux données de la littérature et d’avoir des résultats proches de ceux attendus chez l’Homme. Nous avons décidé d’utiliser des porcs sains de 40 kg car ils présentent des homologies avec l’Homme, notamment un rapport poids du cœur sur poids du corps équivalent. En effet, la majorité des études sur le système cardiovasculaire sont effectués chez des porcs compris dans cette fourchette de poids. De plus, l’étude en imagerie in vivo s’effectuera avec des protocoles d’angiographie par résonance magnétique directement transposables chez l’Homme.
Réduction
Un groupe de 6 animaux a été prévu. Le calcul du nombre d’animaux a été déterminé selon l’expertise du laboratoire d’accueil et de notre laboratoire. En effet, un groupe de 6 animaux est suffisant pour mettre en avant des différences significatives lors de l’évaluation d’un agent de contraste. Afin de limiter le nombre d’animaux, tous les animaux recevront deux injections de produits de contraste différents par voie intraveineuse. Ce protocole expérimental permettra de faire des comparaisons intra-individuelles. L’injection des deux agents de contraste (une référence et le nouvel agent) sera espacée dans le temps de 48H. Le volume d’injection de chaque composé sera ajusté pour être identique afin de ne pas apporter un biais à l’étude. Une telle étude permet de standardiser un protocole pour comparer dans les meilleures conditions possibles différents agents de contraste au sein des mêmes individus. En effet, ce projet évaluera l’efficacité de différents produits de contraste injectés chez le même animal.
Raffinement
La procédure sera réalisée par du personnel expérimenté, ayant une expertise de l'anesthésie et de l’euthanasie chez des modèles porcins. Nous avons fait le choix de passer par la veine auriculaire, et non la veine jugulaire, pour l’injection des produits de contraste afin de limiter au maximum la douleur pouvant être infligée à l’animal. En outre, les deux examens en imagerie réalisés sur chaque animal seront espacés de 48H pour éviter des anesthésies trop rapprochées. Les séquences en angiographie par résonance magnétique dès l’injection du produit de contraste sont très courtes (20-30 sec), ce qui permet de répéter les mesures tout en limitant la durée totale de l’anesthésie. Des mesures seront prises dès la prise en charge de l’animal jusqu’à la réalisation de la procédure en imagerie in vivo : Pré-examen imagerie/Anesthésie: les animaux arriveront la veille, et seront mis à jeun 24h avant l’intervention, avec abreuvement à volonté. - Anesthésie (induction par voie intraveineuse), puis intubation, ventilation et maintien de l'anesthésie par voie gazeuse - Per-imagerie - Anesthésie par voie gazeuse. Post imagerie - Les animaux sont logés en cases par groupes de 3 animaux et l’enrichissement du milieu sera réalisé à l’aide d’une quantité de paille suffisante pour qu’ils puissent jouer avec. Ils seront surveillés quotidiennement.
Choix des espèces
Nous avons décidé d’utiliser des porcs sains d’environ 40 à 50 kg car ils présentent des homologies avec l’Homme, notamment un rapport poids du cœur sur poids du corps équivalent. En effet, la majorité des études sur le système cardiovasculaire sont effectués chez des porcs compris dans cette fourchette de poids. Dans notre étude nous allons nous intéresser à l’arbre artériel, notamment l’aorte, ce qui rend ce modèle d’étude pertinent. De plus, l’étude chez le porc peut être effectuée avec des protocoles IRM directement utilisables chez l’Homme. Des porcs compris entre 40-50 kg seront utilisés dans l’étude. A ce stade de développement, le porc présente plus de caractéristiques communes avec l’Homme que le porc adulte pesant entre 80-100 kg.
Nouvelles approches pour l’évaluation et le traitement des douleurs arthritiques chez les ovins. Partie 01
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
68 brebis vont être utilisées, 34 tuées à l'issue et 34 renvoyées dans leur élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du léger au sévère. Une arthrite est déclenchée par une injection dans l'articulation sous anesthésie, suivie d'une IRM, de prélèvements sanguins, d'injections et de quinze administrations intranasales d'ocytocine, avec quatre tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur décrit une boiterie et un œdème articulaire pendant quatorze jours et prévoit une mise à mort si le score de douleur reste élevé plusieurs jours. Il affirme que le remplacement du mouton est impossible car l'espèce est "l'objet de l'étude", ce projet étant la partie 01 d'un travail mené dans deux établissements.
Objectifs
Chez les animaux d’élevage, la douleur reste un concept délicat à aborder. En effet, l'évaluation de la douleur chez ces animaux repose sur l'évaluation subjective de quelques critères zootechniques, cliniques et comportementaux (productivité, postures, etc.) dont les conclusions vont significativement varier en fonction de l'expérience et de la sensibilité des professionnels et qui ne permettent pas d’évaluer la douleur dans toutes ces dimensions (cognitive/émotionnelle/sensorielle). L'absence de biomarqueurs spécifiques permettant de réaliser un diagnostic précis de l'état douloureux d'un animal et/ou de quantifier l'intensité douloureuse conduit à un déficit d'évaluation. Ce déficit d'évaluation limite la prise en charge précoce des douleurs favorisant le développement de douleurs chroniques avec pour conséquence une augmentation de l'anxiété et du stress de l'animal douloureux mais également de ses congénères via des mécanismes de contagion émotionnelle, encore largement incompris. Par ailleurs, ce déficit d'évaluation ne permet pas de valider de manière précise l'efficacité des traitements antalgiques conventionnels chez les animaux d'élevages or, l'utilisation de ces traitements est limitée 1/ par leurs effets secondaires notamment sur la reproduction (ex : AINS), 2/ par la réglementation qui limite la présence de résidus médicamenteux dans les produits animaux de consommation et 3/ par le coût de ses traitements qui restent à la charge des professionnels. Ensemble, ces contraintes font que la prise en charge de la douleur des animaux élevages est limitée. Il existe donc un besoin impérieux d'innovation pour améliorer d'une part, l'évaluation de la douleur avec pour objectif de tester l'efficacité réelle des antalgiques sur ces animaux et d'autre part, pour stimuler le développement de nouvelles molécules plus efficaces, dépourvues d'effets secondaires et qui satisfassent les contraintes spécifiques de l’élevage. Dans ce contexte, ce projet propose de combiner des approches d’imagerie médicale, d’éthologie et de pharmacologie afin de 1/ mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs spécifiques de l’état douloureux dans un modèle d’arthrite inflammatoire chez le mouton et 2/ démontrer l’efficacité antalgique de l’ocytocine, un composé déjà présenté comme antalgique sur les douleurs inflammatoires chez les rongeurs et dont l’utilisation pourrait satisfaire aux contraintes de l’élevage. Ce projet sera réalisé dans deux unités expérimentales.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet auront plusieurs bénéfices aussi bien d'un point de vue scientifique que du point de vue de la médecine vétérinaire. D'un point de vue scientifique ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes de contagion émotionnelle de la douleur et de son impact sur l’expression des comportements sociaux chez les animaux. D’un point de vue de la médecine vétérinaire, si les résultats de ce projet démontrent l’efficacité antalgique d’un traitement intranasal d’ocytocine, alors nous aurons alors fourni les premiers arguments pour un repositionnement de l’ocytocine comme analgésique pour le traitement des douleurs inflammatoires chez les ovins.
Procédures
Au sein de l'EU1 les interventions suivantes seront réalisées: Huit prélévements sanguins (veine jugulaire) durant quelques secondes / Deux injections sous cutanées durant quelques secondes / Quinze administrations intra nasales durant quelques secondes / Quatre tests comportementaux qui seront réalisés 8 fois. Un test ne sera effectué qu’une seule fois et durera 5min ; les 3 autres seront effectués 8 fois et ils dureront 3min, 10min et 30min. Au sein de l'EU2 les interventions suivantes seront réalisées: Une injection intraarticulaire réalisée au sein de l'EU2 sous anesthésie générale et sous analgèsie (45 min) pour l'induction d'un modèle d'arthrite / Une procédure d'imagerie médicale IRM réalisée sous anesthésie générale (1h45) dans lEU2
Impact sur les animaux
L’induction du modèle d'arthrite induit l'apparition d'une boiterie, un œdème articulaire et des signes de douleur à la flexion modérée pendant 14 jours. Les différents actes expérimentaux peuvent engendrer du stress pour l’animal. L'administration intra nasale peut être un acte désagréable pour l’animal mais l’ocytocine ne présente pas d'effet secondaire. Les prises de sang réalisées à la veine jugulaire peuvent entrainer une légère douleur ainsi que l’apparition d’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement. Les injections sous cutanées réalisées de part et d’autre des flancs de l’animal ainsi que l’injection intra-articulaire (tibiotarsiennes) pour induire le modèle d'arthrite peuvent également engendrer une douleur légère au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger. Le transport des brebis d’un établissement utilisateur à l’autre peut générer du stress pour l’animal.
Devenir
34 brebis seront replacées dans leur élevage et 34 autres brebis seront euthanasiées afin de récolter les tissus d’intérêt (articulation, moelle épinière, cerveau) pour des études ultérieures.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer nos animaux avec une autre espèce ou un substitut non-vivant. L’utilisation du mouton est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage et la médecine vétérinaire de cette espèce. De plus, nous souhaitons étudier l'impact d'une douleur modérée sur l'expression des comportements sociaux dans cette espèce et cette question ne peut pas être abordée par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour une étude basée sur un approche IRM, notre effectif est plutôt important (N=4x8 animaux). Ainsi, nous optimisons nos chances d’obtenir un contraste suffisant entre les groupes expérimentaux. Les conditions de vie sont en adéquation avec les besoins de l’espèce (i.e. herbivore social). Les conditions de vie du groupe « arthrite-serum physiologique » (i.e. traitement avec l’impact le plus négatif) correspondent à la réalité observée naturellement, voire moins douloureux puisque nos animaux ne développeront pas d'atteinte sur d'autres articulations ou encore des atteintes pulmonaires comme observées lors des infections à agalacticae sur les exploitations. La taille de nos effectifs (8 individus par groupe) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests paramétriques. Si ces conditions ne sont pas remplies, nous utiliserons des tests non-paramétriques tels que les tests de permutation pour comparer les lots expérimentaux. Des matrices de corrélation pourront être utilisées pour tester les éventuels liens entre paramètres comportementaux et neurobiologiques, si la variabilité intra-groupe le permet.
Raffinement
Les conditions de vie des animaux seront en adéquation avec les besoins de l’espèce. Ils seront hébergés dans le bâtiment conditionnés de l'EU1 et auront accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. L'enclos des animaux sera enrichi avec un promontoire permettant à l'animal de monter et descendre afin qu'il puisse changer son point d'observation et faire de l'exercice. Lors du transport des animaux entre les deux unités expérimentales, les animaux recevront une injectionde neuroleptique afin de limiter le stress. Lors de l'induction du modèle les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de limiter l'induction de douleurs inutiles liés à l'injection intrarticulaire de BCII. Tous les animaux seront visités quotidiennement et une surveillance accrue sera réalisée post induction du modèle. Deux expérimentateurs indépendants utiliseront deux échelles d'évaluation publiées et validées pour évaluer la douleur chez les animaux Expérimentateurs. Ainsi, si un animal Expérimentateurs présente pendant plus de trois jours un score supérieur à 5 sur l'une de ces deux grilles l'animal recevra une injection d'antalgique et sera euthanasié par un employé qualifié de l'EU1. L'animal Observateur sera replacé au sein du cheptel de l'EU1 et sortira de l'expérimentation. Lors des prélèvements, des tests comportementaux, et des injections intranasales, les animaux recevront une récompense sous forme d'aliments juste après les procédures afin de réduire le stress engendré par la procédure.
Choix des espèces
Le mouton est utilisé dans cette étude à cause de la forte incidence (jusqu'à 40% des jeunes animaux dans certaines fermes) des pathologies l'arthritiques observées dans cette espèce. Ces arthrites sont causées par plusieurs bactéries et cette situtation sanitaire présente une sérieuse atteinte au bien-être des animaux. Ainsi l'utilisation du mouton est nécessaire car cette espèce est l'objet de l'étude. Les animaux utilisés seront des femelles de race Ile de France agées entre 9-10 mois. Ce projet sera réalisé chez des jeunes animaux car la prévalence des arthrites infectieuses est plus importante chez les jeunes ovins.
Nouvelles approches pour l’évaluation et le traitement des douleurs arthritiques chez les ovins. Partie 02
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
68 brebis vont être utilisées, 34 tuées à l'issue et 34 renvoyées dans leur élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du léger au sévère. Une arthrite est déclenchée par une injection dans l'articulation sous anesthésie, suivie d'une IRM, de prélèvements sanguins, d'injections et de quinze administrations intranasales d'ocytocine, avec quatre tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur décrit une boiterie et un œdème articulaire pendant quatorze jours et prévoit une mise à mort si le score de douleur reste élevé plusieurs jours. Il affirme que le remplacement du mouton est impossible car l'espèce est "l'objet de l'étude", ce projet étant la partie 02 d'un travail mené dans deux établissements.
Objectifs
Chez les animaux d’élevage, la douleur reste un concept délicat à aborder. En effet, l'évaluation de la douleur chez ces animaux repose sur l'évaluation subjective de quelques critères zootechniques, cliniques et comportementaux (productivité, postures, etc.) dont les conclusions vont significativement varier en fonction de l'expérience et de la sensibilité des professionnels et qui ne permettent pas d’évaluer la douleur dans toutes ces dimensions (cognitive/émotionnelle/sensorielle). L'absence de biomarqueurs spécifiques permettant de réaliser un diagnostic précis de l'état douloureux d'un animal et/ou de quantifier l'intensité douloureuse conduit à un déficit d'évaluation. Ce déficit d'évaluation limite la prise en charge précoce des douleurs favorisant le développement de douleurs chroniques avec pour conséquence une augmentation de l'anxiété et du stress de l'animal douloureux mais également de ses congénères via des mécanismes de contagion émotionnelle, encore largement incompris. Par ailleurs, ce déficit d'évaluation ne permet pas de valider de manière précise l'efficacité des traitements antalgiques conventionnels chez les animaux d'élevages or, l'utilisation de ces traitements est limitée 1/ par leurs effets secondaires notamment sur la reproduction (ex : AINS), 2/ par la réglementation qui limite la présence de résidus médicamenteux dans les produits animaux de consommation et 3/ par le coût de ses traitements qui restent à la charge des professionnels. Ensemble, ces contraintes font que la prise en charge de la douleur des animaux élevages est limitée. Il existe donc un besoin impérieux d'innovation pour améliorer d'une part, l'évaluation de la douleur avec pour objectif de tester l'efficacité réelle des antalgiques sur ces animaux et d'autre part, pour stimuler le développement de nouvelles molécules plus efficaces, dépourvues d'effets secondaires et qui satisfassent les contraintes spécifiques de l’élevage. Dans ce contexte, ce projet propose de combiner des approches d’imagerie médicale, d’éthologie et de pharmacologie afin de 1/ mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs spécifiques de l’état douloureux dans un modèle d’arthrite inflammatoire chez le mouton et 2/ démontrer l’efficacité antalgique de l’ocytocine, un composé déjà présenté comme antalgique sur les douleurs inflammatoires chez les rongeurs et dont l’utilisation pourrait satisfaire aux contraintes de l’élevage. Ce projet sera réalisé dans deux unités expérimentales.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet auront plusieurs bénéfices aussi bien d'un point de vue scientifique que du point de vue de la médecine vétérinaire. D'un point de vue scientifique ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes de contagion émotionnelle de la douleur et de son impact sur l’expression des comportements sociaux chez les animaux. D’un point de vue de la médecine vétérinaire, si les résultats de ce projet démontrent l’efficacité antalgique d’un traitement intranasal d’ocytocine, alors nous aurons alors fourni les premiers arguments pour un repositionnement de l’ocytocine comme analgésique pour le traitement des douleurs inflammatoires chez les ovins.
Procédures
Au sein de l'EU1 les interventions suivantes seront réalisées: Huit prélévements sanguins (veine jugulaire) durant quelques secondes / Deux injections sous cutanées durant quelques secondes / Quinze administrations intra nasales durant quelques secondes / Quatre tests comportementaux qui seront réalisés 8 fois. Un test ne sera effectué qu’une seule fois et durera 5min ; les 3 autres seront effectués 8 fois et ils dureront 3min, 10min et 30min. Au sein de l'EU2 les interventions suivantes seront réalisées: Une injection intraarticulaire réalisée au sein de l'EU2 sous anesthésie générale et sous analgèsie (45 min) pour l'induction d'un modèle d'arthrite / Une procédure d'imagerie médicale IRM réalisée sous anesthésie générale (1h45) dans lEU2
Impact sur les animaux
L’induction du modèle d'arthrite induit l'apparition d'une boiterie, un œdème articulaire et des signes de douleur à la flexion modérée pendant 14 jours. Les différents actes expérimentaux peuvent engendrer du stress pour l’animal. L'administration intra nasale peut être un acte désagréable pour l’animal mais l’ocytocine ne présente pas d'effet secondaire. Les prises de sang réalisées à la veine jugulaire peuvent entrainer une légère douleur ainsi que l’apparition d’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement. Les injections sous cutanées réalisées de part et d’autre des flancs de l’animal ainsi que l’injection intra-articulaire (tibiotarsiennes) pour induire le modèle d'arthrite peuvent également engendrer une douleur légère au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger. Le transport des brebis d’un établissement utilisateur à l’autre peut générer du stress pour l’animal.
Devenir
34 brebis seront replacées dans leur élevage et 34 autres brebis seront euthanasiées afin de récolter les tissus d’intérêt (articulation, moelle épinière, cerveau) pour des études ultérieures.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer nos animaux avec une autre espèce ou un substitut non-vivant. L’utilisation du mouton est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage et la médecine vétérinaire de cette espèce. De plus, nous souhaitons étudier l'impact d'une douleur modérée sur l'expression des comportements sociaux dans cette espèce et cette question ne peut pas être abordée par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour une étude basée sur un approche IRM, notre effectif est plutôt important (N=4x8 animaux). Ainsi, nous optimisons nos chances d’obtenir un contraste suffisant entre les groupes expérimentaux. Les conditions de vie sont en adéquation avec les besoins de l’espèce (i.e. herbivore social). Les conditions de vie du groupe « arthrite-serum physiologique » (i.e. traitement avec l’impact le plus négatif) correspondent à la réalité observée naturellement, voire moins douloureux puisque nos animaux ne développeront pas d'atteinte sur d'autres articulations ou encore des atteintes pulmonaires comme observées lors des infections à agalacticae sur les exploitations. La taille de nos effectifs (8 individus par groupe) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests paramétriques. Si ces conditions ne sont pas remplies, nous utiliserons des tests non-paramétriques tels que les tests de permutation pour comparer les lots expérimentaux. Des matrices de corrélation pourront être utilisées pour tester les éventuels liens entre paramètres comportementaux et neurobiologiques, si la variabilité intra-groupe le permet.
Raffinement
Les conditions de vie des animaux seront en adéquation avec les besoins de l’espèce. Ils seront hébergés dans le bâtiment conditionnés de l'EU1 et auront accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. L'enclos des animaux sera enrichi avec un promontoire permettant à l'animal de monter et descendre afin qu'il puisse changer son point d'observation et faire de l'exercice. Lors du transport des animaux entre les deux unités expérimentales, les animaux recevront une injectionde neuroleptique afin de limiter le stress. Lors de l'induction du modèle les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de limiter l'induction de douleurs inutiles liés à l'injection intrarticulaire de BCII. Tous les animaux seront visités quotidiennement et une surveillance accrue sera réalisée post induction du modèle. Deux expérimentateurs indépendants utiliseront deux échelles d'évaluation publiées et validées pour évaluer la douleur chez les animaux Expérimentateurs. Ainsi, si un animal Expérimentateurs présente pendant plus de trois jours un score supérieur à 5 sur l'une de ces deux grilles l'animal recevra une injection d'antalgique et sera euthanasié par un employé qualifié de l'EU1. L'animal Observateur sera replacé au sein du cheptel de l'EU1 et sortira de l'expérimentation. Lors des prélèvements, des tests comportementaux, et des injections intranasales, les animaux recevront une récompense sous forme d'aliments juste après les procédures afin de réduire le stress engendré par la procédure.
Choix des espèces
Le mouton est utilisé dans cette étude à cause de la forte incidence (jusqu'à 40% des jeunes animaux dans certaines fermes) des pathologies l'arthritiques observées dans cette espèce. Ces arthrites sont causées par plusieurs bactéries et cette situtation sanitaire présente une sérieuse atteinte au bien-être des animaux. Ainsi l'utilisation du mouton est nécessaire car cette espèce est l'objet de l'étude. Les animaux utilisés seront des femelles de race Ile de France agées entre 9-10 mois. Ce projet sera réalisé chez des jeunes animaux car la prévalence des arthrites infectieuses est plus importante chez les jeunes ovins.
Impact du cytosorb EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
15 cochons vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal subit la pose d'une circulation extracorporelle et une chirurgie de deux heures, avec un risque de choc hémorragique lors de l'installation du dispositif, pour tester une membrane de filtration du sang dans le choc cardiogénique. Le porteur renvoie les retombées cliniques à une meilleure récupération cardiaque attendue, tandis que les cochons sont tués en fin d'intervention pour prélèvement histologique. Il affirme que le modèle d'ischémie-reperfusion ne peut être mené que sur un "organisme dans son entier" et qualifie le recours au gros animal de choix qui "s'impose".
Objectifs
Le choc cardiogénique est une pathologie encore très fréquente en réanimation, avec une augmentation de l’incidence sur les dernières années. Il est défini par l'incapacité du coeur à générer un débit sanguin suffisant permettant aux organes périphériques de subvenir à leurs besoins. On observe initialement une augmentation des résistances vasculaires pour maintenir une pression de perfusion (constriction des vaisseaux périphériques). Par la suite, le système ne parviendra plus à compenser suffisamment, causant alors une dilatation des vaisseaux puis une baisse de l’oxygénation, provoquant une dysfonction d’organes. Il arrive parfois que le choc cardiogénique, lorsqu’il est réfractaire à toute thérapeutique médicamenteuse, nous amène à un traitement plus invasif par une pose d'une circulation extra-corporelle. L'objectif de cette étude est de prouver l'efficacité d'une membrane d’épuration sanguine (cytosorb) visant à filtrer les molécules inflammatoires sans pour autant impacter la réponse immunitaire physiologique. Cette membrane va donc faire baisser le taux de molécules inflammatoires diminuant la réaction immunitaire excessive et améliorant la récupération du coeur et des organes périphériques.
Bénéfices attendus
Les dernières études sur le cytosorb tendent à montrer plutôt une innocuité de cette membrane sans pour autant prouver son efficacité clinique. Aucune ne s’est focalisée sur la circulation extracorporelle dans le contexte de choc cardiogénique. L’objectif de notre étude est de montrer l’implication du cytosorb dans la diminution du phénomène inflammatoire (diminution de l’utilisation de solutions de remplissage et des médicaments).
Procédures
Les animaux auront tout d'abord une injection d'un calmant afin de réduire le stress dû à la manipulation (durée 2 minutes) dans l'établissement utilisateur n°1 puis une perfusion intraveineuse sera posée afin de permettre une anesthésie générale (2minutes). A partir de ce moment, les animaux seront sous anesthésie profonde et subiront une intervention chirurgicale qui durera 2h (opérations dans l'établissement n°2).
Impact sur les animaux
- stress (diminué par une période de quarantaine dans un environnement adapté et par une prémédication) - douleur (limitée par une surveillance accrue et scopée, et une anesthésie adaptée aux signaux de douleurs, tels la tachycardie ou l’hypertension, un morphinique (sufentanil) est utilisé en pousse-seringue continu). - Effets secondaires à la chirurgie : perte de sang avec choc hémorragique lors de la pose de l’ECMO (circulation extra-corporelle).
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement en vue de l'étude histologique qui suivra.
Remplacement
La place de cette approche thérapeutique n'a jamais été évaluée. Une vraie étude comparative est nécessaire. Il n'y a pas de modèle existant d'ischémie-reperfusion cellulaires. Le modèle d’ischémie-reperfusion ne peut donc être effectué que sur un organisme dans son entier avec un impact sur les différentes fonctions.
Réduction
Modèle déjà en place dans notre structure permettant de réduire le nombre d’animaux à étudier, personnel formé à l’étude et la manipulation du modèle porcin. Le nombre d'animaux a été déterminé comme le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'obtenir des données statistiquement exploitables. La mise en place des appareillage (canules...) sera réalisée par des chirurgiens cardiaques expérimentés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes (au minimum 2 animaux) afin de limiter l’angoisse et le stress des animaux. Le milieu est enrichi avec des jouets adaptés (balles...). Une période de quarantaine d’au moins huit jours avant l’entrée des animaux dans le protocole est respectée permettant leur stabilisation physiologique et comportementale en réduisant le stress. Les animaux sont mis à jeun le jour de l’expérimentation et les cochons seront prémédiqués par l’injection intra-musculaire d’un produit anesthésique aux propriétés calmantes avec un produit psychotrope aux propriétés antidouleur. Les cochons seront ensuite sous anesthésie profonde pendant tout le protocole d'étude et avec un antidouleur en perfusion continue. Le cochon sera scopé en permanence, permettant de surveiller en continu la fréquence cardiaque, la fréquence respiratoire et la pression artérielle. Toute modification de ces paramètres entrainera une adaptation immédiate des médicaments afin d’assurer le confort de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle animal de cochon (animal d’un poids entre 50 et 60 kgs, de morphologie cardiaque mature et avec un poids suffisant pour une circulation extra-corporelle est utilisé pour sa similitude avérée, en terme d’anatomie cardiaque et d’hémodynamique, avec les processus physiologiques rencontrés en clinique. Le choix d’un modèle sur gros animal s’impose pour pouvoir implanter la circulation extra-corporelle, nécessaire à notre projet. De plus, ce modèle est déjà connu de nos équipes.
Accompagner les éleveurs pour une meilleure prise en charge des douleurs animales : le cas de la caudectomie des ovins (MOUDOC)
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
240 agneaux vont être utilisés, gardés vivants et engraissés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. On leur coupe la queue à la pince hémostatique ou à l'élastique, cette dernière pouvant provoquer une douleur chronique jusqu'à quinze jours, puis on réalise jusqu'à douze prises de sang pour doser le cortisol et l'haptoglobine. Le projet mesure la douleur d'une pratique d'élevage courante et teste des analgésies utilisables par les éleveurs, en vue d'une fiche de "bonnes pratiques". Le porteur affirme qu'on "ne peut pas remplacer l'espèce ovine" pour étudier la douleur liée à cette pratique.
Objectifs
Des travaux ont été réalisés au niveau international pour objectiver la douleur au cours de la caudectomie chez les ovins (chirurgicale, au fer chaud ou au couteau) mais généralement en la réalisant conjointement à la castration. Aucune étude n’a été réalisée à ce jour en France sur la caudectomie des ovins (par pince hémostatique et élastique) et la prise en charge de la douleur lors de cette procédure. Or, la filière ovine a besoin de disposer d’éléments sur ce sujet pour identifier les leviers d’action qui permettront de faire progresser les éleveurs sur les pratiques mises en œuvre et la prise en charge de la douleur. Concernant la prise en charge de la douleur au cours de cette intervention, si la douleur aigüe provoquée par la caudectomie à la pince hémostatique semble possible à prendre en charge, la douleur chronique provoquée par la caudectomie à l’élastique semble plus complexe à gérer, cette douleur pouvant durer jusqu’à 15 jours post-intervention. Des méthodes de prise en charge de la douleur ont été testées dans différents pays mais sont couplées à la castration réalisée en même temps et leur faisabilité sur le terrain par les éleveurs du territoire reste à tester. Compte-tenu que ces procédures d’élevage vont être de plus en plus réglementées et que la prise en charge de la douleur au cours de ces interventions pourra être imposée dans un futur plus ou moins proche, acquérir des références sur la gestion de la douleur adaptée aux pratiques d’élevage en France semble indispensable. L’élaboration d’une fiche technique co- construite avec un groupe d’acteurs et visant à diffuser les bonnes pratiques de caudectomie des ovins et de prise en charge de la douleur permettra d’améliorer les pratiques mais également de communiquer sur ces bonnes pratiques de prise en charge de la douleur au cours de la caudectomie en France. L’objectif du projet est donc d’objectiver la douleur lors de la caudectomie des ovins par les méthodes les plus utilisées en France : la pince hémostatique et l’élastique. Le projet permettra aussi d’évaluer la prise en charge de la douleur et l’efficacité des analgésies possibles utilisables par les éleveurs.
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés pour l’homme sont l’élaboration de bonnes pratiques de caudectomie des ovins et de prise en charge de la douleur qui seront diffusées via une fiche technique co- construite avec un groupe d’acteurs. Ces recommandations permettront d’améliorer les pratiques mais également de communiquer sur ces bonnes pratiques de prise en charge de la douleur au cours de la caudectomie en France. Cela contribuera aussi à améliorer le Bien-être des animaux en diffusant de meilleures pratiques.
Procédures
Les prises de sang pour le cortisol seront réalisées à -2min, 30 min, 45 min, 60 min, 90 min, 138 min après intervention, soit 6 prélèvements de 2 ml. Les prises de sang pour l’haptoglobine auront lieu une fois tous les 3 jours pendant les 15 jours de procédure soit 6 prélèvements de 1 ml par animal. Les prises de sangs seront sur 32 agneaux pour la première année et 88 agneaux pour la deuxième année. La caudectomie sera réalisée sur 12 lots de 16 animaux, soit 192 animaux.Un traitement analgésique est effectué 20 minutes avant la caudectomie et postérieurement à la première prise de sang le cas échéant. Il comprend : • Une anesthésie locale sur site de caudectomie : Procamidor® (20 mg/mL – principe actif : procaïne) par injection sous-cutanée en anneaux autour de la queue (environ 0.5 à 1 mL) à environ 0.5 à 1 cm en amont de l’endroit de pose de l’élastique. • Un traitement AINS : Metacam® (5 mg/mL – principe actif : méloxicam), injection intramusculaire à 1 mg/kg. Le poids pris en compte est celui de la pesée de mise en lot à J-1.
Impact sur les animaux
Les dommages de l’expérimentation sur l’animal ont été réduits au maximum grâce aux 3R : Remplacement : La caudectomie étant une pratique d’élevage, on ne peut pas remplacer l’espèce ovine pour la réalisation de celle-ci et l’étude de la douleur associée. Réduction : la taille des effectifs (avec 16 sujets par groupe expérimental) a été déterminée par un calcul d’effectifs et est optimisée pour garantir un nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour obtenir une bonne puissance statistique. Raffinement : Les conditions d’élevage des animaux seront optimales : les recommandations en matière de logement sont respectées : les parcs sont composés de 8 mères et de 16 agneaux. Ceux-ci auront le lait maternel durant la période expérimentale (qui a lieu avant le sevrage). Les agneaux seront en groupes sociaux et manipulés calmement. Il y a un abreuvoir et un râtelier pour 8 brebis.
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux ne quittent pas leurs groupes et sont élevés afin d'être engraissés
Remplacement
La caudectomie étant une pratique d’élevage, on ne peut pas remplacer l’espèce ovine pour la réalisation de celle-ci et l’étude de la douleur associée.
Réduction
La taille des effectifs (avec 16 sujets par groupe expérimental) a été déterminée par un calcul d’effectifs et est optimisée pour garantir un nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour obtenir une bonne puissance statistique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales : les recommandations en matière de logement sont respectées : les parcs sont composés de 8 mères et de 16 agneaux. Ceux-ci auront le lait maternel durant la période expérimentale (qui a lieu avant le sevrage). Les agneaux seront en groupes sociaux et manipulés calmement. Il y a un abreuvoir et un râtelier pour 8 brebis.
Choix des espèces
Le projet nécessite d’utiliser des animaux vivants afin de comparer les réactions (tant physiologiques que zootechniques et comportementales) des animaux après une caudectomie à l’élastique ou à la pince hémostatique et avec différentes méthodes de prise en charge de la douleur
Recherche du dopage génétique, administration de transgènes dans le cadre du contrôle antidopage des chevaux
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
6 chevaux vont être utilisés, gardés vivants et réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils reçoivent une injection sous-cutanée ou intramusculaire de plasmides porteurs de transgènes "de la performance", puis subissent des prélèvements de sang à la jugulaire jusqu'à trente fois par mois et des prélèvements d'urine, pour vérifier qu'une méthode de détection du dopage génétique fonctionne. Le porteur indique que les chevaux sont gardés jusqu'à quinze ans sauf retraite anticipée décidée par le vétérinaire. Il affirme que l'étude ne peut se faire que sur l'espèce cible, le cheval, et qu'il n'existe "pas d'alternatives non animales" pour ce contrôle antidopage.
Objectifs
Ce projet est justifié par la mise en œuvre de nouveaux contrôles réglementaires recommandés par l'International Federation of Horseracing Authorities pour répondre à la menace du dopage génétique. Le dopage génétique est défini comme « l’utilisation d’acides nucléiques, d’analogues d’acides nucléiques ou de toutes substances qui pourraient modifier les séquences génomiques et/ou altérer l’expression génique par tout mécanisme. Ceci inclut le transfert de gènes, mais également l’utilisation de cellules normales ou génétiquement modifiées » dont l’utilisation pourrait permettre l’amélioration des performances athlétiques des chevaux en ciblant des gènes dit « de la performance ». Au regard du code des courses ou des articles 6A ou 6B de la Fédération Internationale des Courses hippiques, la détection de l’administration des gènes de la performance est toujours une priorité absolue. L’amplification PCR est l’une des techniques de choix de détection appliquée à la détection de transgènes circulants potentiellement utilisés à des fins de dopage. L’objectif de ce projet est de vérifier que la méthode de détection développée par le laboratoire est satisfaisante pour détecter, dans les fluides biologiques, l’administration de vecteurs plasmidiques contenant des transgènes liés à la performance physique chez le cheval à la suite d’un protocole d’administration (voie parentérale : Intramusculaire ou sous-cutanée.
Bénéfices attendus
Ce projet doit contribuer à répondre à la menace du dopage génétique par la mise en place d’une technique de contrôle adapté.
Procédures
La procédure consiste en une administration unique par voie sous cutanée ou intra-musculaire et des prélèvements sanguins et urinaires avant et après l’administration. Nombre de prélèvements sanguins et urinairesde 30/mois au maximum pour le sang et de 15 /mois pour les urines. En ce qui concerne les prélèvements, le prélèvement sanguin se déroule en 3 étapes : - la désinfection de la zone de prélèvement par application d'une solution alcool modifiée à l'aide d'une compresse stérile imbibée pendant 10sec puis 2min d'attente. - introduction de l'aiguille 20G et prélèvement du sang 10 sec / tube - retrait de l'aiguille 20G et compression de la jugulaire 30 sec à l'aide d'une compresse. Le prélèvement urinaire se déroule en une seule étape, lorsque le cheval se met en position l'opérateur rentre dans le box, se place sur un des côtés et positionne un pot de récupération sous le jet d'urine. La durée du prélèvement d'urine dépend de la durée de la miction (d'environ 30 sec en moyenne). La durée d'administration dans le cas de ce projet (administration en sc ou en IM) est de quelques secondes après désinfection au niveau de l’encolure.
Impact sur les animaux
Les chevaux subissent des prises de sang par ponction de la veine jugulaire. Il est très rarement rencontré un risque d’infection au point de ponction.
Devenir
Tous les chevaux sont gardés généralement jusqu’à 15 ans en bonne santé sauf avis contraire du vétérinaire recommandant un départ en retraite anticipé. Décision prise par le vétérinaire
Remplacement
Cette étude ne peut être réalisée que chez l’animal vivant et sur l’espèce cible, le cheval pour obtenir des prélèvements comparables à des situations de dopage réelles. Il n’existe pas d’alternatives non animales utilisables pour ce projet. Il est nécessaire de disposer d’échantillons comparables à ceux prélevés dans le cadre du contrôle antidopage pour démontrer que la méthode développée correspond bien aux besoins et est applicable au contrôle antidopage et sera efficace.
Réduction
Le nombre d’animaux impliqués est réduit au minimum. Ces essais sont généralement conduits sur un cheval pour les études pilotes et trois chevaux pour les études destinées à suivre l’effet du transgène.
Raffinement
Les chevaux sont hébergés dans un établissement confortable. Ils sont quotidiennement surveillés et observés. Tout éventuel signe d’inconfort est noté et corrigé et est pris en compte afin d’optimiser les tests ultérieurs. Le bien-être de chaque cheval est une priorité quotidienne du personnel. Les chevaux subissent des prises de sang par ponction de la veine jugulaire. Les injections sont réalisées par un vétérinaire. Les prélèvements sont réalisés par un vétérinaire ou du personnel expérimenté soucieux d’éviter absolument tout risque d’infection lié aux injections et aux prélèvements.
Choix des espèces
Répondre aux exigences du contrôle anti-dopage des chevaux. Le cheval est l’unique espèce concernée. Les animaux utilisés sont des jeunes chevaux (à partir de 2 ou 3 ans) ou des chevaux adultes d’âges comparables à ceux des chevaux de compétitions.
Validation d’une nouvelle méthode de protection du myocarde lors de l’Infarctus du Myocarde à la phase aigüe, basée sur l’utilisation d’ondes de chocs thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
50 porcs vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque animal, profondément endormi et sous ventilation assistée pendant cinq à huit heures, subit un infarctus provoqué puis une reperfusion couplée à un traitement par ondes ultrasonores, avant le prélèvement de son cœur. L'objectif déclaré est de valider une protection du myocarde applicable ensuite à l'humain, étape que le porteur décrit comme "cruciale et préalable à toute étude clinique". Il affirme que le porc, à la physiologie cardiaque proche de l'humain, est "désormais pour des raisons éthiques le modèle recommandé".
Objectifs
L’importance de l’infarctus du myocarde et ses conséquences en termes d’insuffisance cardiaque et de mortalité cardio-vasculaire en font un problème de santé publique majeur dans les pays développés. La taille de l'infarctus est le facteur majeur du pronostic après infarctus du myocarde aigu. Les interventions visant à réduire la taille finale de la lésion ont donc un intérêt clinique majeur pour améliorer le pronostic des patients pris en charge pour infarctus du myocarde. La prise en charge actuelle de l’infarctus du myocarde vise à ré-alimenter le cœur en sang oxygéné (reperfuser) le plus rapidement possible. Cependant des études expérimentales et cliniques ont montré qu’une reperfusion brutale a trop souvent des effets secondaires sur le myocarde ischémique, induisant des lésions supplémentaires. Ces dommages survenant après reperfusion peuvent participer jusqu'à 40% de la taille finale de l’infarctus. L’objectif du projet de recherche lié à la demande d’autorisation était de valider deux nouvelles stratégies thérapeutiques de protection du myocarde, dites de sono-cardioprotection, sur un modèle d’infarctus réalisé chez le Porc, étape cruciale et préalable à toute étude clinique ultérieure. Deux modes d’applications des ultrasons comme stratégie thérapeutique non-invasive avait été envisagées : la mécano-transduction (Shock-Wave) et les ultrasons focalisés de basses intensités (LIPUS). Toutes deux ont été utilisées pour déposer de l'énergie ultra-sonore à différentes intensités dans des endroits focalisés des tissus, avec des utilisations en routine clinique dans le domaine de l'oncologie et en urologie. Trois étapes avaient été fixées pour réaliser cette étude. Les 2 premières étapes ont été accomplies dans le cadre d’une demande d’autorisation de projet précédente. Cette demande est donc destinée à couvrir la 3e et dernière étape du projet. L’évaluation de la méthode et sa validation comme précédemment combinera i) l’imagerie pour explorer le retentissement de l’infarctus du myocarde et des thérapies adjuvantes au niveau du cœur, notamment au niveau inflammatoire ii) des prélèvements sanguins et tissulaires pour des analyses histologiques, biologiques pour relier l’imagerie macroscopique et le niveau cellulaire.
Bénéfices attendus
Des études préliminaires sur des modèles cellulaires, et à thorax ouvert sur modèle porcin, ont permis de valider l’effet potentiellement protecteur des shock-wave (mécano-transduction). Toutefois, ces résultats, bien que très encourageants, sont très éloignés de la réalité clinique où les ondes de chocs doivent prouver leur efficacité en application directe sur le cœur vivant et battant. L’objectif étant une application humaine de cette technologie, seul un modèle sur gros animal, qui présente une physiologie coronaire et cardiaque très semblable à l’homme a permis d’avancer sur cette problématique. L’espèce animale choisie pour notre étude est le porc de taille réduite, dans lequel nous induisons un infarctus d’intensité similaire à celui retrouvé chez l’homme, nous effectuons la reperfusion couplée à nos deux propositions thérapeutiques innovantes, dont nous avons montré à thorax ouvert, (modèle permettant l’application des ondes de chocs directement sur le cœur) qu’elles permettent de réduire les effets délétères du traitement actuel. Si cette première étape expérimentale a été cruciale pour démontrer l’effet thérapeutique dans la configuration la plus favorable mais invasive, celui-ci doit maintenant être confirmé à thorax fermé avec la procédure non-invasive utilisée sur l’homme. Cette étape finale permettra de suivre chronologiquement la mise en place de la lésion ischémique, puis d’étudier l’efficacité de la thérapie proposée pour limiter les effets délétères de la reperfusion dans un scénario clinique qui pourra être utilisé ensuite directement sur l’Homme.
Procédures
Chaque animal, profondément endormi et placé sous ventilation assistée, sera extemporanément suivi sur le plan physiologique durant le déroulement du protocole. L’endormissement sera entretenu par une perfusion continue d’antalgiques et une anesthésie gazeuse, de sorte qu’à la moindre manifestation de signes de réveil de l’animal une augmentation de l’anesthésiant sera pratiquée et éventuellement suivie d’une augmentation de la vitesse de perfusion : l’objectif est d’éviter toute perception douloureuse à l’animal. L'expérimentation sera immédiatement arrêtée si un problème, lors de la chirurgie, survient : dissection coronaire, hémorragie, poumon atteint. Notre équipe est aussi préparée à une réanimation si une fibrillation ventriculaire arrive: massage cardiaque et défibrillation. L'expérimentation sera arrêtée après 30min de réanimation infructueuse et/ou impossibilité de stabiliser l'animal après réanimation (arythmies importantes, pression artérielle basse). A partir du moment où la chirurgie réalisée est satisfaisante, le protocole d'imagerie commence. La durée maximale de l'expérimentation est constante et évaluée de 5 à 8 heures.
Impact sur les animaux
Puisque le modèle consiste à induire une ischémie aigüe et transitoire sur le cœur de l’animal, il est attendu une anoxie du territoire en aval de l’artère occluse. Comme chez l’homme, cela entraine des anomalies de la fonction segmentaire, et des troubles rythmiques fréquents (extra-systoles (ES), tachycardie ventriculaire (TV)). Par ailleurs on note en général un œdème intra et extracellulaire comme chez l’être humain, et des complications cellulaires qui font justement l’objet de la recherche et des thérapies mises en œuvre. L’ensemble des conséquences induites par la procédure d’ischémie sont prévenues et/ou traitées par l’anesthésie/analgésie et les médicaments anti-arythmiques délivrés en fonction de la symptologie. L’infarctus étant réalisé sur animaux profondément endormis, sous anesthésie générale, la prise en charge de la douleur est prévue. La procédure par voie percutanée est celle utilisée chez l’homme, laquelle limite les conséquences hémorragiques.
Devenir
Pour permettre les prélèvements histologiques, ainsi que la mesure de l’aire à risque et de la zone de nécrose les prélèvements de cœur sous cardioprotection sont nécessaires. Immédiatement après la mort le cœur de l’animal doit ainsi être prélevé afin de permettre la découpe du cœur en tranche, digitaliser les clichés pour une analyse quantitative. Il est donc obligatoire de procéder à un protocole expérimental sans réveil, tous les animaux du protocole seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation.
Remplacement
REMPLACEMENT : Le projet vise à améliorer la thérapie de l’infarctus cardiaque pour l’homme avec des sondes ultrasonores de taille humaine et des caractéristiques physiques spécifiques. L’évaluation de la méthode et sa validation utilisera l’imagerie pour explorer le retentissement de l’infarctus du myocarde et des thérapies adjuvantes au niveau du cœur. Les sondes de thérapie, mais aussi les outils d’imagerie (IRM) utilisées doivent être les mêmes que ceux utilisés en clinique humaine, avec les mêmes contraintes physiologiques (taille, puissance des ultrasons délivrés. Nous devons aussi nous approcher le plus possible de la physiopathologie humaine le porc est désormais pour des raisons éthiques le modèle recommandé.
Réduction
REDUCTION : Le nombre porcs demandé correspond à l’effectif permettant d’évaluer et de comparer les différents groupes avec la puissance statistique nécessaire pour valider cette étude, compte tenu d'une variabilité inter-individuelle attendue et similaire à l’homme, et de la précision des mesures IRM de zone à risque, taille oedème et taille d’infarctus. Le nombre minimum pour identifier les changements dans le temps est estimé à 15, au moyen de tests statistiques prenant en compte le risque et la puissance attendue pour assurer une bonne différence entre les groupes et les points dans le temps.
Raffinement
RAFFINEMENT : Les porcs sont hébergés dans les conditions adaptées à leur espèce, logés sur copeaux, en groupes sociaux, avec jeux à leur disposition. Un suivi quotidien leur est apporté. Un vétérinaire assure le suivi sanitaire. Pour le transport vers le site d’expérimentation, l’animal déjà isolé dans un box de l’animalerie (mise à jeun de 24h obligatoire avant anesthésie), est tranquillisé avec un sédatif. A son arrivée sur le site d’expérimentation avant l’acheminement au bloc opératoire, l’animal est prémédiqué avec douceur afin de limiter au maximum son stress avant installation sur la table d’opération au bloc opératoire. Une voie veineuse périphérique est posée sur une veine marginale de l’oreille droite ou gauche, et lui seront administrés, en bolus lent, l’anesthésique et l’analgésique. Par la suite en complément une perfusion lente est mise en place pour administration continue de l’anesthésique et de l’analgésique. Chaque animal, profondément endormi et placé sous ventilation assistée, sera extemporanément suivi sur le plan physiologique (fréquence cardiaque, pressions artérielles invasives, débit cardiaque, température corporelle) durant le déroulement du protocole. L’expérimentation sera arrêtée si un problème survenant lors de la procédure ne peut pas être résolu (ex : dissection vasculaire entrainant une hémorragie de l’animal). Notre équipe est également préparée à une réanimation si une fibrillation auriculo-ventriculaire survient : massages cardiaques et défibrillations. L’expérimentation sera arrêtée après 30 minutes de réanimation infructueuse et/ou impossibilité de stabiliser l’animal après réanimation (arythmies importantes, pressions artérielles basses). Enfin pour la mise à mort, l’animal est toujours placé sous anesthésie générale avant induction d’une surcharge de barbiturique.
Choix des espèces
Le projet vise à améliorer la thérapie de l’infarctus cardiaque pour l’homme avec des sondes ultrasonores de taille humaine et des caractéristiques physiques spécifiques. L’évaluation de la méthode et sa validation utilisera l’imagerie pour explorer le retentissement de l’infarctus du myocarde et des thérapies adjuvantes au niveau du cœur. Les sondes ultrasonores de thérapie, mais aussi les outils d’imagerie (IRM) utilisée doit être les même que ceux utilisés en clinique humaine, avec les mêmes contraintes physiologiques (taille, puissance des ultrasons délivrés...). Il n'est pas possible de remplacer le porc par un rongeur, dont l’imagerie comme la thérapie nécessiterait des systèmes dédiés qui ne sont pas équipés des techniques d’imageries développées pour une application humaine. Nous devons aussi nous approcher le plus possible de la physiopathologie humaine et le porc est désormais pour des raisons éthiques le modèle recommandé. Nous utilisons des porcs adultes de taille réduite d’âge supérieur à 1 an, de sexe mâle ou femelle, ayant un poids compris entre 50 et 70 kg. L’éleveur est le spécialiste de cette souche de porcs. Nous avons des données expérimentales importantes sur ce type d’expérimentation, nous permettant de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de nouveaux protocoles sans réveil de l’animal. Les résultats obtenus sur les animaux de cet âge sont convaincants et suffisants dans nos études. Ce modèle animal est proche de l'imagerie cardiaque chez l'homme et permettra de transposer les connaissances acquises vers une imagerie clinique.
Etude d’un autovaccin à streptocoque administré à des truies
- Recherche appliquée
- Maladies animales
4 truies et 27 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les truies sont infectées deux fois par un streptocoque puis vaccinées, les porcelets infectés à leur tour, avec des écouvillonnages amygdaliens et vaginaux et des ponctions sanguines répétés tout au long de la reproduction. Le porteur indique que l'infection reste quasi asymptomatique chez les truies mais peut rendre les porcelets malades, ceux qui atteignent les points limites étant alors mis à mort. Il justifie le projet par les pertes économiques en élevage porcin et le "potentiel zoonotique" de la bactérie, et affirme qu'aucun remplacement in vitro n'est possible.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un autovaccin visant un streptocoque administré à des truies en gestation. De précédentes investigations ont mis en évidence une excellente protection des porcelets issus de truies infectées par une bactérie de type streptocoque avant leur mise à la reproduction puis vaccinées contre cette bactérie en cours de gestation. Ces connaissances inédites doivent absolument être consolidées avant d’être diffusées auprès des professionnels de la filière porcine qui sont fréquemment confrontés à cette bactérie responsable de troubles méningés chez le porcelet. L’objet de cette saisine est donc d’apprécier l’efficacité, sur des porcelets, d’un autovaccin administré en gestation à leur mère préalablement infectées par ce streptocoque. Elle comporte une seule procédure expérimentale impliquant un total de 4 truies et de 27 porcelets.
Bénéfices attendus
Les bactéries de type streptoccoque étudiées ici, sont répandues dans les élevages porcins et transmissibles de l’animal à l’homme. Elles sont responsables de graves affections (méningite, septicémie et polysérites) pouvant entraîner des pertes économiques importantes (réduction des performances zootechniques des animaux affectés, détérioration de la qualité des carcasses, élévation du taux de pertes et de saisies à l’abattoir, etc.). Le contrôle de l’infection des animaux par cette bactérie est généralement difficile et les mesures de prévention aléatoires. En élevage, l’antibiothérapie constitue un des éléments de l’arsenal thérapeutique. Cependant, son utilisation doit être limitée en raison de résistances développées par les bactéries vis-à-vis de certains antibiotiques. Une des méthodes alternatives pour lutter contre ce streptocoque repose sur la vaccination et plus précisément, dans la mesure où aucun vaccin commercial n’est disponible, sur l’utilisation d’autovaccins. Ces derniers sont préparés à partir de germes pathogènes isolés d’un sujet malade dans un élevage donné et sont administrés aux animaux de ce même élevage. Les autovaccins sont utilisés pour prévenir les infections à ces streptocoques chez les truies ou les porcelets sans que leurs efficacités ne soient clairement démontrées. Acquérir des connaissances sur les autovaccins visant les infections à ce type de streptocoque apportera des éléments pour aider à mieux gérer ces maladies désastreuses en élevages et à potentiel zoonotique.
Procédures
Prélèvements sur truies vigiles : Des écouvillonnages amygdaliens seront réalisés chez les 4 truies avant le jour de l’infection soit 5 semaines avant les inséminations artificielles, puis 8 fois au cours du cycle de reproduction (soit 9 interventions). Des ponctions sanguines seront réalisées pour suivre la réponse immunitaire (soit 11 interventions). Des écouvillonnages vaginaux seront également réalisés avant le jour de l’infection puis 4 fois au cours du cycle de reproduction (soit 5 interventions). Les truies seront infectées deux fois par voie veineuse et seront vaccinées deux fois par voie musculaire. Prélèvements sur porcelets vigiles : Des écouvillonnages amygdaliens seront réalisés sur chacun des porcelets avant le jour de l’infection puis 1 fois par semaine pendant 3 semaines (soit 5 interventions). A chaque jour de prélèvement, un écouvillonnage amygdalien sera effectué sur les porcelets infectés, les porcelets contacts et les porcelets témoins (n=27 animaux). Des ponctions sanguines seront réalisées 24h après la naissance puis une fois par semaine à compter du sevrage jusqu’à la fin de l’expérimentation pour suivre des paramètres immunologiques et deux fois au cours de la première semaine suivant l’infection (suivi de la bactériémie), soit 9 interventions au total. Les porcelets seront infectés une fois par voie veineuse. Afin de limiter la contention des animaux, les écouvillonnages amygdaliens seront réalisés en même temps que les ponctions sanguines. Les durées des interventions sont estimées chez les truies à 30 secondes pour l’infection par voie veineuse, 20 secondes pour la vaccination par voie musculaire, 1 minute et 30 secondes pour l’ écouvillonnage amygdalien et la ponction sanguine et 10 secondes pour l’écouvillonnage vaginal (sans contention). Pour les porcelets, les durées des interventions sont estimées à 30 secondes pour l'infection par voie veineuse et entre 30 secondes et 1 minute pour l’ écouvillonnage amygdalien et la ponction sanguine.
Impact sur les animaux
L’infection expérimentale avec le streptocoque étudié est quasiment asymptomatique chez les truies et est généralement symptomatique chez les porcelets de 6 semaines. Cependant, la sévérité clinique peut être limitée lorsque la dose bactérienne injectée est ajustée à la dose minimale infectante. C’est la dose que nous utiliserons dans cette procédure expérimentale. Toutefois, une attention de tous les instants sera apportée au suivi clinique quotidien de chaque porcelet. Ils seront examinés a minima au cours de deux visites quotidiennes pendant les 10 premiers jours suivant l’infection. Des visites supplémentaires seront instaurées autant que de besoin en fonction des symptômes cliniques relevés. Au-delà de ces 10 jours, si l’état de santé des animaux le permet, ils seront examinés une fois par jour, y compris le week-end. Dans les cas où l’infection conduirait à une altération importante de l’état de santé, à une atteinte des points limites préalablement définis, les porcelets seront mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Cet acte est nécessaire afin d'obtenir des prélèvements de bonne qualité impactant directement les résultats des analyses.
Remplacement
L’expérimentation consistant à évaluer l’efficacité d’un vaccin et étudier les réponses immunologiques induites, il n’y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal par une étude in vitro ou in silico.
Réduction
Ce protocole expérimental est pensé de façon à minimiser le nombre de porcelets utilisés tout en menant une étude suffisamment puissante pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Nos études antérieures montrent qu’il est indispensable d’avoir au minimum trois porcelets infectés par truie et des groupes de 6 porcelets pour (i) considérer la variabilité inter-individuelle des animaux et (ii) obtenir une pression d’infection suffisante permettant de reproduire une colonisation des amygdales et/ou la maladie. Ce projet impliquera au total 4 truies et 27 porcelets.
Raffinement
Les truies et les porcelets seront élevés en groupe stable, bénéficieront d’un enrichissement social et auront à leur disposition des objets manipulables. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique rapproché. Les truies, abreuvées à volonté, seront examinées a minima une fois par jour pendant les deux semaines suivant l’infection. Les porcelets seront nourris et abreuvés à volonté. Ils seront examinés a minima au cours de deux visites quotidiennes pendant les 10 premiers jours suivant l’infection (y compris le week-end). Des visites supplémentaires seront instaurées autant que de besoin en fonction de l’évolution leur état de santé . Au-delà de ces 10 jours, si l’état de santé des animaux le permet, ils seront examinés une fois par jour, y compris les week-ends. En cas d’atteinte de points limites préalablement définis, les porcelets seront mis à mort afin qu’ils ne souffrent pas. Une récompense sous la forme de friandise sera proposée aux truies et aux porcelets une fois l’ensemble des prélèvements réalisés afin d’associer un moment positif aux manipulations opérées pour les besoins du projet.
Choix des espèces
Le porc est l’espèce cible de la bactérie de type streptococoque étudiée dans cette saisine. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de la procédure expérimentale. Les truies et les porcelets impliqués dans l’expérimentation auront, au moment de l’infection, respectivement ente 28 et 34 semaines de vie et entre 6 et 7 semaines de vie . Le modèle expérimental a été précédemment validé à ces âges ce qui permet de s’affranchir d’une étape de validation.