Mammifères "de rente"

Six mini-porcs vont être utilisés, gardés en vie à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit douze à treize prélèvements sanguins sur neuf jours après administration intraveineuse ou sous-cutanée de deux formulations, avec suivi de la température et des sites d'injection. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal entier pour évaluer les paramètres pharmacocinétiques. Les retombées annoncées, de nouveaux médicaments contre l'insuffisance cardiaque, sont renvoyées au long terme.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'évaluer les paramètres pharmacocinétiques de deux formulations test . La classe thérapeutique de ces formulations est: Cardiologie.

Bénéfices attendus

Il est necessaire de conduire ce projet pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques de ces deux formulations test qui pourront être utiles pour de futurs projets. A long terme ce projet aura pour objectif de trouver de nouveaux médicaments candidats pour les personnes souffrant d'insuffisance cardiaque.

Procédures

Dans ce projet, des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront réalisés. Douze et treize prélèvements de sang prévus sur 9 jours aprés l'administration intraveineuse ou souscutannée ( 1 mL de sang par prélèvement Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute) Des prélèvements sanguins seront effectués aprés l'administartion intraveineuse aux temps suivants: pre-dose, 0.25h, 0.5h, 2h, 6h, 10h, 24h, 48h, 72h, 120h, 168h et 216h. Des prélèvements sanguins seront effectués aprés l'administartion sous cutannée aux temps suivants: pre-dose, 1h, 3h, 8h, 12h, 24h, 30h, 48h, 72h, 96h, 120h, 168h et 216h. Un suivi de la température corporelle sera effectuée sur 24h ( pre dose, 2h, 8h et 24h post administration). Durée d'une mesure de température: de l'ordre de la minute. Suite aux administrations souscutannées, un suivi des sites d'injections sera également fait sur 48h post administration (pre dose, 1h, 3h, 8h, 24h, 30h et 48h). L'observation macroscopique des sites d'injections est de l'ordre de la minute.

Impact sur les animaux

Des prélèvements sanguins sont prévus dans ce projet. Les prélèvements seront réalisés sur animal vigile par un personnel expérimenté, conformément aux bonnes pratiques vétérinaire. Les prélèvements seront fait au niveau des veines jugulaires. Le sites de prélèvement seront alternés, droite et gauche, autant que possible. De même, les sites d'administration pour la voie sous cutannée seront observés pendant 48 h pour le suivi de la tolérance post administration. Toutes manipulations sur les animaux seront faites avec un personnel expérimenté, cela minimisera le stress des animaux lors des diverses manipulations.

Devenir

A la fin de ce projet, comprenant qu'une seule procédure, tous les animaux seront gardés en vie.

Remplacement

Il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble pour évaluer les paramètres pharmacocinétiques de ces deux formulations test.

Réduction

Deux groupes de 3 animaux sont prévus dans ce projet. C'est le nombre d'animaux minimal par groupe pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Dans ce projet, les points limites sont: - Douleurs importantes au niveau des sites de prélèvements (zones des veines jugulaires) - Réactions locales sévères ( exemple: induration, chaleur, douleur, érythème) au niveau du site d'administration ( administration sous cutanée au niveau de la zone lombaire) - Modification du comportement général des animaux suite aux administrations. Il est possible d'observer une hypotonicité des animaux pendant les premières 24h. Cette hypotonicité peut devenir un point limite si elle se prolonge. - L'élément test administré est un peptide biologique (classe thérapeutique: cardiologie). Il est possible d'observer une réponse immunitaire. L'intensité de la réponse sera reflétée par le suivi de la température corporelle. Si cette température est supérieure à 42°C cela pourra être considéré comme étant une point limite. Si un des points limites est atteint, l'animal sera exclu du projet.

Choix des espèces

Espèce de choix pour ce type d'étude Jeune adulte . A ce stade les animaux sont plus faciles à manipuler.

28 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, six tuées à l'issue pour analyses et vingt-deux réutilisées dans d'autres projets. Chaque animal reçoit l'implantation chirurgicale d'un boîtier de stimulation cardiaque, d'une télémétrie et d'une chambre de perfusion lors d'une opération de quatre heures, puis des injections d'une molécule antiarythmique après induction d'une fibrillation auriculaire. Le porteur affirme qu'aucune stratégie de remplacement n'est reconnue et que la démonstration passe par l'animal. Il décrit une molécule qui se positionnerait sur le marché des antiarythmiques comme alternative aux traitements existants.

Objectifs

L'objectif du projet est de valider les effets bénéfiques d'une molècule sur la fibrillation auriculaire. La fibrillation auriculaire est le trouble du rythme cardiaque le plus fréquent et dont les conséquences peuvent être très préjudiciables pour les patients. L’effet visé par l’administration de la molécule étudiée, appelée AM001, est la restauration du rythme normal et ce serait donc une alternative aux anti-arythmiques aujourd’hui utilisés en clinique. La pharmacologie existante est très limitée et ancienne. Les anti-arythmiques utilisés de nos jours comme l’amiodarone (cordarone®) sont toxiques et peuvent induire des complications thyroïdiennes et des cardiopathies sous-jacentes aux personnes sous traitement. De plus, les antiarythmiques peuvent entraîner des effets pro- arythmiques (torsades de pointes, fibrillation ventriculaire, troubles conductifs sévères,…). La molécule étudiée se positionnerait sur le marché des anti-arythmiques et permettrait de traiter la cause et non plus la conséquence de la pathologie cardiaque. Le composé serait utilisable avec une cardiopathie sous-jacente et ce, sans les effets secondaires mentionnés ci-dessus et sans déprimer la contraction cardiaque. Le traitement présenterait donc l’avantage d’avoir un effet anti-arythmique puissant, sans les effets secondaires et les contre-indications (pathologies cardiaques sous-jacentes notamment) des anti-arythmiques actuellement utilisés.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet revêt une importance particulière dans la mesure où l’obtention de résultats positifs pourrait réellement avoir des répercussions sur le développement d’un nouveau traitement de la fibrillation auriculaire chez l’homme. L’activité anti-arythmique de la molécule AM001 a été bien caractérisée chez la souris aussi bien au niveau moléculaire que fonctionnelle. Des études ont montré que l’AM001 provoque une totale inhibition de l’induction de la fibrillation auriculaire (par stimulation électrique) in vivo chez la souris et ex vivo dans l’oreillette gauche isolée de brebis. De manière importante, la molécule AM001 restaure le rythme sinusal in vivo chez la brebis anesthésiées et analgésiées en fibrillation auriculaire persistante après 15 minutes de perfusion. La validation d’un effet d’AM001 chez la brebis vigile en fibrilation auriculaire permettrait de proposer une nouvelle voie de traitement de la fibrilation auriculaire chez l’homme.

Procédures

Les animaux auront deux prises de sang (une lors de l’inclusion et une à la fin du projet) 10 minutes sont nécessaire pour faire la prise de sang et également deux prélèvements urinaires, 10 minutes également. 6 animaux auront une cartographie endocavitaire par cathéter, les procédures seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Les animaux auront une implantation chirurgicale d’un boitier de stimulation cardiaque, d’un boitier de télémétrie et d’une chambre de perfusion, cette procédure dure environ 4 heures. Suite à la récupération post-chirurgicale, les brebis pourront recevoir plusieurs injections d’AM001 (maximum 3, perfusion durant environ 50 min via la chambre dédiée). Les animaux contrôles reçoivent une injection avec le véhicule (cyclodextrine) utilisée pour solubiliser l’AM001. Les effets du traitement seront évalués à distance grâce à la surveillance télémétrique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes phases du projet notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie), ces effets disparaissent rapidement car les moyens nécessaires pour faciliter le réveil des animaux (lampe chauffante par exemple) sont mis en place. Les examens électrophysiologiques sont indolores pour les animaux. Des effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des équipements électroniques localisés en sous-musculaire dans la zone du cou pour induire et enregistrer la progression de la fibrillation auriculaire mais ils sont maîtrisés et correspondent à des phases de cicatrisation prolongées. Le modèle de brebis est très bien maîtrisé au laboratoire et aucune brebis n’est décédée des suites d’une infection ou d’un problème lié à la cicatrisation. L’induction de la fibrilation auriculaire chez la brebis peut provoquer une fréquence ventriculaire cardiaque irrégulière mais il est à noter que celle-ci est asymptomatique chez la brebis. Lors des tests des effets de la molécule sur la progression de la maladie, les injections de cette molécule se feront à travers une chambre de perfusion, identique à celle utilisée chez les patients, localisée dans la zone du cou et implantée en sous-cutanée. Concernant les effets éventuels de la molécule, les données préliminaires laissent penser que l’injection de la molécule d’intérêt n’aura pas d’effets toxiques à la dose utilisée. Les effets indésirables peuvent être à ce stade : altération de la cicatrice du site d’implantation, infection dans la zone d’implantation ou rejet des équipements implantés. Pour minimiser l’inconfort de la brebis, les chambres à cathéter implantable par accès veineux sont de petite taille (poids 4.7g, dimensions 30x22x11 mm). La réalisation des injections nécessite l’isolement des brebis pour une durée de 50 à 60 min, ce qui peut induire un stress. Une récompense alimentaire sera donnée par les animaliers expérimentés à chaque injection afin de limiter l’angoisse liée à l’isolement mais également dans le but d’entrainer l’animal afin de faciliter la procédure et de diminuer le stress de la brebis.

Devenir

Six animaux seront utilisés en fin de projet pour réaliser des analyses en labotoire sur des prélèvements. Les autres animaux du projet (vingt deux) seront inclus dans d'autres projets étudiant la fibrilation auriculaire, dans l'objectif de diminuer l'utilisation d'animaux au sein de l'établissement.

Remplacement

Bien que les résultats collectés in vitro soient en faveur d’un effet inhibiteur dela molécule AM001 sur la progression de la fibrilation auriculaire, la démonstration de l’effet thérapeutique passe nécessairement par l’utilisation de l’animal. Aucune stratégie de remplacement n'est reconnue à ce jour permettant de répondre à la question scientifique posée dans ce projet.

Réduction

La stratégie de réduction repose principalement sur l’utilisation d’une quantité limitée d’animaux pour répondre aux questions scientifiques posées avec une puissance statistique suffisante. Pour favoriser la réduction du nombre d'animaux dans ce projet, chaque brebis est son propre contrôle au moins pour les paramètres de fonction cardiaque et le profil électrophysiologique, cette approche permet de limiter le nombre d’animaux utilisé en s’affranchissant de la variabilité interindividuelle. La stratégie de réduction repose également sur la redistribution des animaux étudiés dans ce projet vers les autres projets du laboratoire. Cette mutualisation permettra de réduire significativement le nombre de brebis utilisées au sein de l'établissement tout en répondant aux demandes des différentes équipes de l'établissement. Par exemple, le modèle de brebis est utilisé dans le développement de cathéters de diagnostic pour leur application chez l'Homme.

Raffinement

L’utilisation de la télémétrie pour surveiller la température, l’activité et le rythme cardiaque des brebis 24 heures sur 24 est une mesure de raffinement. En effet, cette approche nous permet de réagir très rapidement pour la réalisation de soins. Par exemple, lors du réveil de l’animal nous pouvons agir si nous observons que le retour de la température corporelle est trop lent. Cette surveillance renforcée permet également de mieux gérer les traitements antibiotiques et/ou analgésiques suite à une augmentation de température significative sans modification du comportement de l’animal ce qui est souvent le cas chez la brebis. Ainsi, cette méthode nous permet de récolter des données sans induire de stress chez la brebis et nous communiquons également les données à l’équipe de l’animalerie pour encore accroître la réactivité en cas de problèmes suite à la réalisation d’une chirurgie par exemple. Plus spécifiquement dans le cadre de ce projet nous entrainerons les animaux à rentrer dans le box d’isolement pour la réalisation de l’injection de l’AM001. L’utilisation d’une récompense alimentaire sous forme de granulés fonctionne très bien chez la brebis. Cet entrainement sera réalisé par les animaliers expérimentés qui s’occupent quotidiennement des animaux de façon à optimiser le processus d’apprentissage. Il est important de noter que la présence des animaliers lors de l’ensemble des procédures est indispensable dans le but de limiter le stress des brebis mais également de faciliter la réalisation des différentes étapes du projet. L’entrainement des brebis permettra de réduire l’angoisse et le stress lors des phases d’injections. Nous utilisons déjà cette méthode lorsque nous devons, 5 à 7 jours après la chirurgie, peser la brebis et allumer le boitier de stimulation, mais également lors des visites régulières à l’animalerie ou dans l’annexe de l’animalerie. Nous savons que des brebis entraînées ont un rythme cardiaque moins élevé lors de l’arrivée dans le box d’isolement que des brebis qui découvrent cet exercice pour la première fois. L’animal est placé dans les conditions d’hébergement initial avec les méthodes de raffinement adéquat à son espèce : groupe social, pierre à sel à disposition, foin et paille. Les animaux sont suivis quotidiennement par le personnel de l’animalerie.

Choix des espèces

Le cœur de la brebis a une anatomie, une électrophysiologie et une géométrie proche de celles du cœur humain. Ainsi, les méthodes cliniques d’imagerie et d’électrophysiologie peuvent être directement appliquées dans cette espèce. Les brebis utilisées seront adultes car les dimensions du coeur permettent l’utilisation d'outils cliniques notamment les cathéters permettant de faire la cartographie électrique in vivo. Lapathologie cardiaque de fibrilation auriculaire étant une pathologie majoritairement représentée chez les personnes âgées nous utiliserons des brebis âgées de 8 à 11 ans minimum.

2 miniporcs vont être utilisés, tous deux tués à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Ils reçoivent une molécule par voie orale pendant cinq jours, subissent cinq prises de sang, un prélèvement de liquide céphalo-rachidien sous anesthésie et un séjour isolé en cage à métabolisme, avant d'être tués pour prélever leurs organes, afin de mesurer la diffusion d'une nouvelle molécule. Le porteur justifie l'étude par des données de pharmacocinétique jugées utiles pour de futurs projets. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal entier, et présente le porc comme "espèce de choix" sans autre argument.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de la formulation test, de déterminer le passage de la barrière hémato encéphalique de l'élément test et enfin de faire des analyses macroscopiques et dosage de l'élément test aux niveau de certains tissus et organes comme le cerveau, le foie, les reins, le muscle, les poumons , le coeur et la rate.

Bénéfices attendus

Il est necessaire de conduire ce projet pour déterminer les paramètres PK et avoir également des données sur la distribution de cette nouvelle molécule test qui sera bénéfique pour de futur projets.

Procédures

Administration topique orale: Dépôt de la formulation directement sur les muqueuses de la gueule de l'animal, sur animal vigile, volume inférieur à 1 mL durée de l'ordre de la minute. Administrations répétées sur 5 jours 1 fois par jour. Recueil d'urine et de fécès: miction directe. Animal en cage à métabolisme sur 24h maximum. Contact visuel et auditif entre les animaux. Pas de geste particulier fait à l'animal. Prélèvement sanguins: 5 prélèvements maximum sur 5 jours (Pre-dose, 2h, 4h, 26h, 120h ), volume maximal 2 mL, sur animal vigile. Durée par prélèvement: inférieur à la minute Prélèvement de LCR (liquide céphalo rachidien): un seul prélèvement à 5 jours aprés la première administration. Animal anesthésié. Volume prélevé environ 1 mL. Durée du prélèvement: de l'ordre de la minute Euthanasie de l'animal pour prélèvement de tissus: sur animal anesthésié, temps inférieur à la minute. Toutes interventions sur l'animal sera faite avec un personnel expérimenté et conformément aux bonnes pratiques vétérinaire et à la réglementation en vigueur.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, il est prévu : - Des administrations topiques par voie orales. Une attention particulière sera portée à la manipulation de l'animal plus particulièrement à la contention. Un entrainement par rapport à la manipulation de l'animal est prévu pendant la période d'acclimatation pour éviter au maximum le stress de l'animal. - Des prélèvements sanguins seront réalisés. 5 prélèvements de sang au maximum sur 120h ( pre-dose, 2h, 4h, 26h, 120h ) d'environ 2 mL. Une attention particulière sera portée au niveau des sites de prélèvements. Attention à ce qu'il n'y ait pas de douleur, gonflement au niveau des sites de prélèvement. Pour éviter cela, de la glace et un point de compression suffisament long sera fait aprés chaque prélèvement. - un recueil d'urine et de fécès sur 24h est également prévu. Pour cela les animaux seront placés en cage à métabolisme. Ils seront donc durant cet intervalle de temps (maximum 24h) dans des conditions individuelles et dans un espace restreint. Les animaux auront cependant un contact visuel et auditif entre eux. Toutes manipulations sur les animaux seront faites avec un personnel expérimenté, cela minimisera le stress des animaux lors des diverses manipulations.

Devenir

Dans cette procédure le prélèvement de tissus est nécessaire. Cela sera fait sur tous les animaux post mortem selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation.

Remplacement

Il est indispensable de recourir à l'animal dans son ensemble pour évaluer les paramètres pharmacocinétiques et les paramètres de distribution de l'élément test.

Réduction

Deux animaux sont prévus dans ce projet. Un seul animal par formulation ( 1 contrôle et 1 formulation test). C'est le nombre minimal possible pour avoir un résultat.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 2 et une attention particulière sera portée à l'enrichissement du milieu (apport de jouet: balles, cordes). Les animaux seront également hébergés en cage à métabolisme pour des recueils d'urine et de fécès sur une durée maximale de 24h. Les animaux auront un contact visuel et auditif entre eux. Les animaux seront observés à minima une fois par jour, voir plusieurs fois par jour si besoin.

Choix des espèces

Espèce de choix pour ce type d'étude Jeune adulte . A ce stade les animaux sont plus facile à manipuler.

74 animaux non-humains, 64 cochons et 10 chiens, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Ils subissent sous anesthésie l'implantation d'un dispositif dans l'estomac puis jusqu'à cinq prises de sang sur trois mois, avant d'être tués pour prélever leurs organes, afin de mettre au point une alternative à la chirurgie de l'obésité développée par une entreprise. Le porteur indique que la chirurgie provoque douleur et perte d'appétit et que le dispositif peut entraîner une inflammation digestive ou une obstruction. Il affirme que la complexité du système digestif rend l'usage d'un "organisme complet et vivant" "indispensable" pour valider le produit avant sa pose chez l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer une solution innovante afin de traiter l’obésité de manière aussi efficace que la chirurgie de réduction de volume de l'estomac, tout en évitant les complications associées. Notre dispositif est aussi une alternative aux ballons intra-gastriques qui sont actuellement utilisés. Plusieurs essais sur des cadavres humains et animaux ont déjà été menés pour mettre au point le dispositif ainsi que son déploiement et son ancrage dans le tube digestif. Désormais, nous devons passer à une phase animale pour démontrer l'inocuité sur le moyen terme de notre dispositif, et pour prouver qu'il reste en place, malgré les conditions chimiques et le péristaltisme digestif. Nos études sont menées en parrallèle entre le laboratoire in vivo et les ateliers de mise au point et d'ingenierie médicale. Suite à chaque essai in vivo, les améliorations sont apportées au prototype. Dès que le prototype sera considéré satisfaisant, il sera mis en place chez l'humain pour des essais cliniques.

Bénéfices attendus

L’obésité est définie comme une présence anormale ou excessive de graisse représentant un risque pour la santé. Ce problème est devenu épidémique avec près de 4 millions de personnes dans le monde, décédant de comorbidités liées au surpoids et à l’obésité chaque année. D’après la World Health Organization, près de 39% des adultes dans le monde, représentant près de 1.9 milliards de personnes, étaient en surpoids en 2016. On estime aujourd’hui que plus de 700 millions de personnes souffrent d’obésité. Bien que l’efficacité de la chirurgie bariatrique, qui réduit le volume de l'estomac, ne soit plus à démontrer, seul 1% des patients éligibles décident de se faire opérer à cause du risque de complications sévères et des modifications anatomiques irréversibles. Et pour les solutions moins invasives, comme les ballons gastriques, elles sont aujourd’hui associées à une perte de poids limitée et temporaire. Ce projet est nécessaire pour le développement d’une solution qui sera posée, chez l'humain, par voie endoscopique afin de traiter l’obésité de manière aussi efficace que la chirurgie tout en minimisant les complications associées. En effet, il permettra de vérifier la sécurité et potentiellement l'éfficacité des dispositifs développés par l’entreprise.

Procédures

Les animaux subiront, principalement, une chirurgie, sous anesthésie générale, pour la mise en place du dispositif directement dans l'estomac. Puis, après leur réveil, ils recevront les soins post-opératoires pour une reprise d'alimentation normale. Des prises de sang sont prévues avant la chirurgie, pour évaluer les paramètres basaux des animaux, puis après la chirurgie, pour suivre l'évolution de ces paramètres et vérifier si le dispositif engendre des dérèglements. Un maximum de 5 prises de sang de 10 ml est prévu pendant les 3 mois du protocole. Elles ont lieu sous anesthésie pour les porcs et sur animal vigile pour les chiens. D'autre part, dans la période post-opératoire, les porcs et chiens devront être hébergés seuls pour une durée de 3 jours, mais dans des boxes confortables, et permettant à chaque porc et chien de voir, sentir et toucher ses confrères voisins quand ils le souhaitent.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables les plus prévisibles sont ceux que la chirurgie va provoquer : douleur, perte d'appétit, inconfort, suite à la chirurgie abdominale. D'autres effets indésirables pourraient intervenir si le dispositif n'est pas bien toléré. Il peut s'agir d'inflammations du tube digestif, ou d'autres phénomènes vasculaires localisés au niveau du site d'implantation. Si le dispositif ne reste pas en place, il peut aussi provoquer une obstruction digestive. Nous attendons très peu d'effets indésirables des prélèvements sanguins, dont le volume est réduit au regard du poids des porcs et des chiens.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement d'organes pour des analyses macroscopiques et histologiques.

Remplacement

Ce projet vise à confirmer l’adéquation du dispositif en cours de développement avec le système digestif. Avant d’initier ce projet, des essais sur sujets anatomiques humains et animaux ont été effectués afin de confirmer les dimensions des prototypes en cours de développement. De plus, des essais in vitro ont été réalisés en laboratoire afin de simuler le déploiement du dispositif ainsi que son comportement lors de contraintes mécaniques simulant le péristaltisme. Néanmoins, la complexité et l’adaptabilité du système digestif limitent notre capacité à simuler l’environnement exact. Le dispositif étant à visée clinique, il est nécessaire d’obtenir des données dans ses conditions réelles d’utilisation, ainsi l'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable notamment pour le suivi post implantation. Notre stratégie prévoit d’utiliser un maximum de 64 porcs et 10 chiens pour la totalité du projet comprenant une étude pilote, une preuve de concept et enfin une étude de validation de l’innocuité du dispositif. Nous fonctionnons pas à pas, et le projet sera arrêté si chaque phase ne permet pas d’obtenir les résultats escomptés.

Réduction

Avant d’effectuer les études de preuve de concept, une première phase avec une étude pilote sera effectuée en utilisant un nombre réduit d’animal afin de valider que le dispositif s'ancre et se déploie correctement. Pour tester le dispositif candidat. Le nombre d'animaux utilisés a été réduit au minimum et a été calculé pour obtenir une puissance statistique suffisante. Mais surtout, notre approche est progressive : nous réalisons des études successives, en améliorant le dispositif à chaque fois. Dès que nous estimons qu'il est au point, l'étude de preuve de concept s'arrête et nous réalisons une seule étude de tolérance. Le nombre d'animaux présenté ici est donc un nombre maximum d'animaux, qui peut être réduit si nous développons un dispositif satisfaisant rapidement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec enrichissements propres à l’espèce. : ils disposent de vastes boxes, d'une taille supérieure à celle requise par la législation. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier formés aux soins et à la manipulation de ces espèces. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés. En cas de perte de poids importante se rapprochant des 20%, les rations pourront être enrichies avec une solution de nutrition entérale hyperénergétique.

Choix des espèces

Nous prévoyons d’utiliser les modèles porcin et canin car tous deux possèdent une anatomie et une physiologie du système gastro-intestinal très proches de celle de l’homme. Les deux modèles seront utilisés de manière complémentaire, le modèle chien principalement pour des dispositifs transpyloriques grâce à l’absence de torus pylorique et le modèle porc principalement pour des dispositifs avec « chaussette » de 60cm car nettement moins sujet aux intussucepions. Ainsi en fonction du dispositif testé, le modèle animal qui sera choisi sera celui qui, par son anatomie et sa physiologie, sera le plus approprié pour obtenir les données les plus robustes. Pour les porcs le critère de sélection principal sera le poids (environ 50-100kg) afin d’avoir des correspondances anatomiques similaires à celles observées en clinique. Cela correspondra à des animaux adolescents/adultes. Pour les chiens, nous prendront des chiens adultes qui ont auront terminé leur croissance.

100 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée pour analyser un organe et la plupart réutilisés pour d'autres tests ou la formation. Chaque animal reçoit une administration unique d'un candidat médicament, par voie intraveineuse, orale, sous-cutanée ou sur la peau, suivie de prélèvements de sang répétés. Le porteur indique que le même animal peut être réutilisé après sept jours pour tester une autre molécule ou une autre voie, et évoque un possible placement en association comme le GRAAL. Il affirme qu'un "organisme vivant entier" est nécessaire et qu'aucune méthode in vitro validée n'existe, la peau du porc ressemblant à celle de l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer le devenir de molécules candidats médicaments après administration unique par différentes voies d’administration, afin de déterminer comment elles sont absorbées, distribuées, métabolisées et éliminées de l’organisme. Les informations apportées permettent de modéliser le comportement de la molécule dans l’organisme et de prévoir les doses et posologies pour son utilisation future. Elles contribuent au choix de la voie d’administration pour les futures études réglementaires de toxicologie dans l’espèce non-rongeur, qui seront soumises aux autorités de santé pour l’enregistrement de nouveaux médicaments.

Bénéfices attendus

Les données obtenues permettront de mieux caractériser des molécules candidats médicaments en vue d’une future administration chez l’homme. Elles contribueront au choix de la voie d’administration pour les études réglementaires de toxicologie nécessaires à l’enregistrement du médicament, et au choix des doses thérapeutiques chez l’homme.

Procédures

Chaque animal recevra une administration unique de la molécule candidat médicament, qui pourra être effectuée par voie intraveineuse (1 minute ou 10 min dans le cas d'une injection lente), orale (environ 2 minutes), sous cutanée (30 secondes) ou topique (5 minutes) selon le mode d’administration prévu dans les études de toxicologie réglementaire et en clinique. Des prélèvements sanguins seront ensuite effectués à différents temps après l’administration pour doser la molécule dans le sang. Ces prélèvements pourront s’effectuer sur animal vigile (5 minutes pour la contention et le prélèvement) ou sur animal anesthésié (temps d’anesthésie approximativement 5 min, prélèvement 1 minute, réveil 1 à 2 minutes). Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire à ce type d’étude, le même animal pourra recevoir une nouvelle administration de la molécule par une autre voie d’administration, ou dans une autre formulation, après une période minimum de 7 jours permettant à l’animal de récupérer et à la molécule d’être éliminée.

Impact sur les animaux

- Les administrations et prélèvement peuvent induire un certain niveau de stress, et potentiellement de douleur, qui seront limités par la maitrise des gestes techniques. - A priori, aucun effet toxique des molécules testées n’est attendu après administration unique en raison des doses utilisées dans les études de pharmacocinétique choisies pour n’entrainer aucune toxicité. Toutefois, l’animal sera observé après l’administration afin de repérer toute réaction cutanée liée à l’application topique, ou tout signe de mal être pouvant être lié au traitement et mettre en place un suivi adapté en accord avec les points limites préétablis. - A priori, aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux après les prélèvements sanguins répétés du fait de l’alternance des sites de prélèvement. Un point de compression d’environ 30 secondes sera effectué après chaque prélèvement pour s’assurer de l’arrêt du saignement. Par ailleurs, une attention particulière sera apportée au niveau des sites de prélèvements afin de repérer tout signe inattendu d’inflammation qui pourrait entrainer une douleur chez l’animal. Des fiches d’observation sont mises en place et permettent de suivre les points limites préalablement établis.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux pourront : - soit être euthanasiés si le protocole nécessite le dosage de la molécule dans un organe cible, ou en cas d’effet indésirable sévère inattendu qui n’aurait pas pu être traité après intervention du vétérinaire - soit être réutilisés dans une autre procédure expérimentale pour tester une autre molécule, ou à des fins de formation et de maintien des compétences aux gestes techniques. Cette réutilisation se fera conformément aux dispositions réglementaires en vigueur et après avis du vétérinaire. - soit être replacés dans des organismes pouvant les accueillir et les réhabiliter (type association GRAAL)

Remplacement

Un organisme vivant entier est nécessaire pour caractériser la distribution d’une molécule candidat médicament jusqu’à son élimination de l’organisme. Il n’existe aucune méthode alternative in vitro validée scientifiquement offrant une alternative fiable à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Les molécules évaluées auront auparavant été testées dans des tests in vitro afin de n’évaluer que des molécules présentant un potentiel thérapeutique élevé et ainsi réduire le nombre de mini porcs utilisés dans ce projet. Des groupes de 8 animaux au maximum seront utilisés pour évaluer chaque molécule (4 males et 4 femelles) dans le cas où le sexe de l’animal pourrait avoir un impact sur la distribution de la molécule, par exemple en raison de son mode d’action. Cependant, 4 animaux seront préférentiellement utilisés pour évaluer chaque molécule, ce qui permet d’obtenir des analyses statistiques robustes et une interprétation scientifique des données. Si les études préliminaires générées dans d’autres modèles ont montré une faible variabilité des paramètres influençant la distribution de la molécule, le nombre d’animaux pourra être limité à 3 par groupe. Afin de réduire le nombre d’animaux, un effort sera porté sur l’utilisation d'un même animal pour tester une autre voie d’administration, une autre formulation, ou un autre candidat médicament après accord du vétérinaire. Dans ce cas, un délai minimum de 7 jours sera appliqué pour que l’animal puisse récupérer, et pour garantir l’élimination de la molécule de l’organisme.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et de soins sont conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages que pourraient ressentir les animaux, en conformité avec les législations françaises et européennes. Par défaut, les animaux sont hébergés en box collectifs sur copeaux de bois. Dans le cas d’administration par voie topique, les animaux sont hébergés en box individuels afin d’éviter le transfert du produit d’un animal à l’autre par contact. Dans ce cas, les box individuels permettent de garder un contact visuel et olfactif avec leurs congénères afin de diminuer le stress. Si cela ne nuit pas à l’expérimentation, un fruit pourra également être donné, comme récompense, et le milieu environnemental pourra être enrichi par l’apport de jouets adaptés au mini porc. De la musique peut également être présente dans les salles d’hébergement. Dès l’arrivée des animaux, une période d’acclimatation d’au moins 15 jours sera appliquée avant toute procédure expérimentale afin qu’ils s’habituent à l’environnement, aux conditions d’hébergement, à la présence humaine et aux interactions avec le personnel. La première semaine, les interactions seront limitées à la présence humaine, y compris dans les box avec possibilité de contact physique avec les animaux (palpation des oreilles, cou, dos, pattes…) et habituation à la pesée. A partir de la deuxième semaine, l’habituation aux différentes situations auxquelles les animaux pourront être soumis dans l’étude pourra commencer. Afin de limiter le stress des animaux au moment de l’étude, les animaux seront habitués à être pris dans les bras, placés dans le hamac qui servira aux prélèvements sanguins… Aucun geste invasif ne sera pratiqué pendant cette période. Afin de s’assurer du bien-être animal, les animaux seront observés quotidiennement et les observations notées dans des grilles d’observation afin de tracer tout signe inattendu. En cas d’altération de l’état d’un animal, la surveillance sera augmentée au minimum à 2 fois par jour. En cas de signes de douleur, il sera soigné en appliquant des protocoles analgésiques pré établis adaptés au mini porc. Des points limites adaptés sont pré établis avec un arbre décisionnel permettant de traiter toute souffrance de l’animal en accord avec le vétérinaire

Choix des espèces

Dans le cadre du développement d’un nouveau médicament, la distribution de l’actif dans l’organisme doit être étudiée dans au moins deux espèces animales mammifères dont une espèce non-rongeur, en vue des études de toxicité réglementaires nécessaires à l’enregistrement. Le mini porc est une des espèces non-rongeur fréquemment utilisée en particulier pour les produits en dermatologie administrés par voie topique, en raison des nombreuses similitudes entre la peau de porc et la peau humaine. La quantité de produit dosée dans le sang chez le mini porc servira au choix des doses testées dans les études de toxicologie réglementaires et/ou les études cliniques chez l’homme. L’espèce mini porc est également sélectionnée pour ce type d'étude, parce qu’elle permet de prélever plusieurs millilitres de sang de manière répétée sur le même animal après administration du produit. Les mini porcs utilisés sont âgés au minimum de 6 semaines à réception (animaux sevrés) et au maximum de 12 mois. D’une manière générale, le poids est un facteur déterminant pour la quantité de médicament administré à l’animal (souvent en faible quantité à ce stade de développement) mais également en termes de manipulation de l’animal. Aussi l’âge maximal est fixé à 12 mois pour limiter les difficultés de contention qui peuvent être préjudiciables au bien-être animal. Pour les produits administrés par voie topique, les animaux seront préférentiellement utilisés à partir de 9 semaines. En effet, c’est à cet âge que l’épaisseur de l’épiderme et du derme approche celle de l’homme adulte. Cette similarité est essentielle pour mimer la pénétration cutanée des produits administrés par voie topique.

100 chèvres vont être utilisées, réutilisées ensuite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un implant sous-cutané et une injection de lipopolysaccharide dans la jugulaire pour déclencher une inflammation qui imite une mammite, avec une fièvre attendue d'environ deux degrés, suivie de onze prises de sang. Le porteur relie ces travaux à la "capacité d'adaptation" dégradée par la sélection sur la production et vise à terme des animaux "plus résilients, productifs et en bonne santé". Il affirme que la réponse inflammatoire du ruminant ne peut être étudiée qu'in vivo.

Objectifs

L’objectif principal du projet est d’évaluer les capacités d’adaptation des chèvres à une épreuve inflammatoire, en lien avec leur génotype. Dans le cadre du projet nous produisons et utilisons des chèvres laitières de race Alpine, issues d’une sélection divergente sur le caractère de longévité fonctionnelle (chèvres de génotype Longévité élevée (LGV+) et chèvres de génotype Longévité faible (LGV-). L'ensemble des chèvres est génotypé et caractérisé sur des caractères de croissance, de métabolisme énergétique, de production de lait, de santé et de réponse à des épreuves nutritionnelles afin de mieux comprendre les déterminants de la capacité d'adaptation des chèvres à une épreuve transitoire nutritionnelle. Dans cet avenant, nous proposons de réaliser une épreuve inflammatoire transitoire sur un sous ensemble de 2 groupes chèvres LGV+ et LGV- de ce dispositif afin d’élargir le concept d’adaptation à la réponse anti-infectieuse en relation avec le génotype. En effet, la santé des animaux d’élevage fait partie intégrante de leur capacité d’adaptation et de leur bien-être. Les mammites, en particulier, représentent la maladie infectieuse majeure chez les ruminants laitiers. Pour ce faire, nous proposons une épreuve inflammatoire par voie générale à base de Lipopolysaccharide (LPS), un composé non infectieux d’origine bactérienne permettant de mimer une inflammation de type mammite afin de doser les cytokines circulantes et caractériser la cinétique de réponse suite à cette stimulation.

Bénéfices attendus

La capacité d'adaptation est une caractéristique qui a été dégradée, chez les animaux de rente, par la sélection pour des niveaux de production élevés. Ce qui a eu des conséquences négatives sur la santé, la reproduction, et la longévité de ces animaux et par conséquent a impacté l'efficacité de production. Les causes du déclin de la capacité d'adaptation sont majoritairement inconnues. La capacité d'adaptation d'un animal est due à des mécanismes adaptatifs opérant à différents niveaux d'organisation physiologique. Ils sont en partie sous le contrôle des conditions d’élevage et de nutrition, du statut physiologique de l’animal, mais aussi de son patrimoine génétique. Nous savons, en particulier, que la longévité fonctionnelle, qui traduit des mécanismes d’adaptation des adultes, est partiellement contrôlé par la génétique. Ce projet doit permettre de mieux comprendre le rôle de la génétique sur les capacités d'adaptation des chèvres adultes. A court terme (durée du projet), il doit permettre de valider l’utilisation d’un ensemble de cytokines sanguines pour caractériser la résilience de la chèvre, dans le cadre d’une épreuve in vivo par du LPS (mimant une mammite). Si cette étape est concluante, cela permettra de tester une procédure équivalente, in vitro, à partir de simples prélèvements sanguins (sans épreuve LPS). A plus long terme, ce phénotypage pourra être utilisé, le cas échéant, pour sélèctionner des animaux plus résilients, productifs et en bonne santé, afin de garantir la durabilité de l’élevage caprin.

Procédures

Les animaux seront soumis à la pose d’un implant sous cutané après contention pour la mesure de la température interne de l’animal. Réalisée une seule fois sur chacune des 100 chèvres du projet. Utilisation d’une seringue à usage unique qui contient l’implant à injecter (de la grosseur d’un grain de riz). Ensuite les chèvres se verront injecter des lipopolysaccharide (LPS : Escherichia coli ultrapur) réalisée au niveau du cou dans la veine jugulaire. Réalisée une seule fois sur chacune des 100 chèvres du projet. Enfin des prélèvements de sang seront effectués à l’aide d’une aiguille montée sur un prolongateur à partir de ponctions à la veine jugulaire. Pour la collecte de 11 tubes (volumes de 4ml) maximum pour chacune des 100 chèvres du projet : 1 prélèvement de 4 ml toutes les deux heures avant l’épreuve (J-1), puis toutes les deux heures entre l’injection de LPS et jusqu’à 12h, et ensuite une fois par jour jusqu’à 72heures. Soit un volume total inférieur à 50mL correspondant à moins de 1% du volume sanguin total de l’animal.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous réalisons des prises de sang et la pose d’un implant sous cutané pour le suivi de la température. Les chèvres peuvent éprouver un stress léger lors des contentions nécessaires pour les prises de sang et la pose de l’implant. Une douleur et une inflammation transitoires peuvent apparaitre lors de la pose des implants sous cutanés. Une eventuelle nuisance serait l'apparition d'hematome suite aux prises de sang. Par ailleurs, nous proposons dans ce projet une épreuve inflammatoire par voie générale à base de Lipopolysaccharide (LPS), un composé non infectieux d’origine bactérienne permettant de mimer une inflammation de type mammite, s. Dans une expérience préalable réalisée sur un petit effectif, l’injection par voie générale (0,5 µg/kg poids vif), de LPS a permis de déclencher une réaction inflammatoire des chèvres qui s'est accompagnée d’une élévation de température réctale moyenne de +1,9°C entre +3 et +6 heures après l'épreuve. Le retour à l’état normal (température et fréquence respiratoire) s’observe entre 12 et 48 heures après l’injection. Ainsi il est attendu que les chèvres impliquées dans cette procédure auront recouvré leur état antérieur de santé à la fin de l’essai. Les nuisances eventuellles en lien avec l'injection de LPS pourraient être une fièvre >40°C, un décubitus prolongé, une perte de poids et efin impliquer une prostration, une cachexie ou alopecie.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie Aucune mise à mort n’est prévue, car les chèvres auront recouvré leur état antérieur de santé à la fin de l’essai. Dans le cas, peu probable, d’atteinte des points limites, la mise à mort sera opérée par le vétérinaire sanitaire soit en urgence par un opérateur expérimenté et habilité de la structure, à l’aide d’un matador et suivi d’une saignée. Les animaux pourront être réutilisés selon l’avis du vétérinaire sanitaire.

Remplacement

La réponse anti inflammatoire du ruminant laitier implique des modifications biologiques complexes, qui incluent également leur impact sur la production de lait et le métabolisme énergétique qui nous intéressent ici et qui donc ne peuvent être étudiés qu’in vivo.

Réduction

Le nombre d’individus a été défini afin de pouvoir évaluer la réponse à l’épreuve inflammatoire en interaction avec le génotype de la chèvre. Dans l'esprit des 3R, nous avions proposé initialement d’évaluer 80 chèvres primipares, car les données d’héritabilité (h²) des réponses immunitaires etaient élevées dans la littérature . Ces heritabilités sont en moyenne plus de 3 fois supérieures à celle de la longévité (h²=0.08 en race Alpine). Les analyses préliminaires (n = 96 chèvres des cohortes 1 et 2) du projet ont montré que le Beta Hydroxy Butyrate plasmatique du sang discrimine les génotypes longévité. Toutefois, une étude récente dans l’espèce bovine, utilisant le dosage de cytokines après stimulation par LPS montre des héritabilités plus faibles (0.07 à 0.15 dans de nombreux cas, et aucune h²>0.15). Ainsi, afin d’atteindre la puissance statistique espérée, nous proposons donc d’augmenter l’effectif total de 20 chèvres, soit 100 chèvres évaluées au total.

Raffinement

Les chèvres seront hébergées en groupe, sur litière paillée. L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité de l’inflammation et permet de mimer les premières étapes d’une vraie infection. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention manuelle minimale, les animaux étant habitués à être manipulés par les opérateurs de la structure. Les chèvres feront l’objet d’une surveillance accrue pendant toute la durée du protocole, selon une grille permettant d’évaluer la température, le poids, le comportement alimentaire, l’anorexie, la présence d’un décubitus latéral et l’apparition de comportements anormaux. Un score sera donné par animal et si il est superieur à 2 alors il est sorti de l'experimentation. La mise en place des implants sous cutané pour le suivi de la température sera réalisée par des opérateurs expérimentés et habilités (animaliers), qui côtoient ces animaux quotidiennement. Un baume décongestionnant, antiseptique et cicatrisant sera appliqué en massage sur la zone concernée après mise en place de l’implant. Ces implants permettent donc de relever automatiquement la température et de supprimer les prises de température par voie transrectale. Un traitement en cas d'hyperthermie prolongée est administré. En cas de non recouvrement de l'etat , une euthanasie sera realisée.

Choix des espèces

L’espèce caprine est l’espèce cible. La physiologie et la réponse immunitaire des ruminants sont particulières à ces espèces. Le choix est d'étudier des chèvres primipares non gestantes en lactation.

45 vaches laitières vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réintégrées au troupeau et susceptibles d'être réutilisées. Trente-six d'entre elles reçoivent une injection de lipopolysaccharide dans un quartier de la mamelle pour déclencher une inflammation, en plus de prises de sang répétées, afin de tester des compléments alimentaires censés prévenir les mammites. Le porteur indique que l'injection provoque une fièvre et une mamelle douloureuse de quatre à douze heures, et qu'aucun analgésique n'est administré car il interférerait avec l'inflammation étudiée. Il affirme que la réponse immunitaire doit être évaluée à l'échelle de "l'animal entier", ce qu'aucun système in vitro ne permettrait.

Objectifs

Les mammites sont parmi les maladies les plus fréquentes en élevage bovin laitier. Elles affectent les performances zootechniques et économiques et sont source de mal-être des animaux. La capacité des bovins laitiers à résister à l'établissement de mammites est liée, en partie, à l'efficacité de leur système immunitaire mais également au fonctionnement du tissu mammaire. Par ailleurs, les vaches laitières sont sujettes à un stress oxydant intense au démarrage de la lactation. Le stress oxydant interfère avec le système de défense immunitaire et peut également entrainer des dommages tissulaires au niveau mammaire. Alimenter les vaches laitières avec des extraits de plantes riches en antioxydant et en d’autres principes actifs susceptibles d’agir directement sur le système immunitaire pourrait permettre d’optimiser le statut immunitaire et antioxydant des vaches laitières et ainsi prévenir les mammites, cliniques ou sub-cliniques. Ainsi, les effets de ces extraits de plantes sur les mécanismes impliqués dans la réponse du système immunitaire et le fonctionnement mammaire méritent d’être objectivés pour permettre le développement de ces solutions sur le terrain. L’objectif de cette étude est de déterminer si des extraits de plantes ou un apport de vitamine E peut agir sur le statut immunitaire et antioxydant de la vache laitière en situation d’épreuve inflammatoire en réduisant le stress oxydant et l’inflammation et en améliorant l’intégrité de l’épithélium mammaire. La supplémentation en vitamine E correspond à une stratégie de prévention des mammites dont les effets ont été objectivés dans la littérature et constitue un témoin positif. Les supplémentations en vitamine E et en extrait de plantes seront comparées à un traitement témoin non supplémenté. Les extraits de plante testés ont vocation à être commercialisés en fermes laitières et à ce titre leur usage répond à toutes les réglementations en vigueur garantissant leur innocuité pour les animaux.

Bénéfices attendus

Les mammites sont le fait d’une pathologie courante en élevage laitier, notamment pendant les premières semaines de lactation. C’est aujourd’hui une des premières causes d’usage des antibiotiques dans ces élevages. L’adoption de stratégies alimentaires de prévention des mammites pourrait être un levier, à associer à d’autres, pour réduire le risque de mammites. Cependant, afin de définir les stratégies les plus efficaces possible, leurs effets méritent d’être objectivés. Le présent projet a pour objectif de mettre en évidence les mécanismes par lesquels ces stratégies peuvent favoriser un fonctionnement adéquate du système immunitaire face à une infection. Les bénéfices attendus sont une réponse inflammatoire améliorée avec les suppléments de vitamine E ou extraits de plantes. Cette réponse sera suivie par la mesure dans le lait des marqueurs de l’inflammation notamment la présence de cellules somatiques et le dosage de molécules de l’inflammation dans le sang et le lait. L’épreuve inflammatoire mise en œuvre dans ce projet peut être qualifiée de mécaniste par rapport à des approches épidémiologiques qui pourraient être une alternative. Elle se traduit par l’implication de peu d’individus dans l’objectif de mesurer l’effet des stratégies ciblées sur un mécanisme en amont de la déclaration des mammites (à savoir la réponse immunitaire) avec l’objectif de généraliser ces résultats. Ces travaux pourront permettre de donner de nouvelles recommandations pour une nutrition préventive des vaches laitières en début de lactation. La substitution des traitements antibiotiques par un ensemble de stratégie de prévention répond au concept de gestion intégrée de la santé aussi bien à destination des animaux, notamment en élevage, que des hommes.

Procédures

Durant ce projet, 45 vaches seront soumises à 2 prises de sang au niveau de la veine de la queue avant leur mise-bas. Parmi ces vaches, 36 seront soumises à l'injection d'un composé inflammatoire (lipopolysaccharide) dans un des quartiers de la mammelle en 5ième semaine de lactation et à 4 prises de sang au niveau de la veine jugulaire, une avant l'injection de LPS, les 3 autres, 4h, 28h et 76h après l'injection. En parallèle, des échantillons de lait seront également prélevés par traite partielle avant l’injection puis 0h, 4h, 7h, 10h, 28h, 52h et 76h après l’injection. L’injection de LPS dans un des quartiers de la mamelle des vaches déclenche une réaction inflammatoire aiguë, mais de courte durée, avec un retour en production des animaux dans la semaine qui suit le déclenchement de la réponse inflammatoire.

Impact sur les animaux

Entre quatre semaines avant la date prévue de vêlage et la fin de la 4ième semaine de lactation, les vaches seront conduites de la même façon que les autres vaches de la ferme, à la seule différente de la nature des stratégies de supplémentation destinées à prévenir les mammites. Le traitement ‘sans supplémentation’ se traduira par la non administration de suppléments alimentaires susceptibles d’aider les vaches à prévenir les maladies infectieuses, ce qui donnera lieu à un suivi rapproché afin de détecter précocement tout signe d’infection et de sortir rapidement les animaux de l’essai pour un traitement adapté. Les doses de vitamine E offertes seront toujours inférieures au maximum tolérable et l’extrait de plante utilisé a été évalué en amont de l’essai pour son absence de nocivité pour les vaches. Lors de cet essai, nous observons aussi les conséquences d’une injection d’un composé pro-inflammatoire dans un quartier de la mamelle. L’injection de lipopolysaccharide dans un des quartiers de la mamelle des vaches déclenche une réaction inflammatoire aiguë, mais de courte durée, avec un retour en production des animaux dans la semaine qui suit le déclenchement de la réponse inflammatoire. Compte-tenu des travaux antérieurs et des données de la littérature, l'injection du composé inflammatoire (LPS) induira une inflammation locale de courte durée (plus de signes locaux d'inflammation 12h après injection) accompagnée d’une fièvre de courte durée (pic de température rectale à 8h post-injection et retour à une température normale 12h post-injection). Le quartier injecté sera douloureux à la palpation entre 4h et 12h post-injection. L’état général, l’intensité de l’inflammation locale et la douleur sont évalués à l’aide d’une grille de notation. L’utilisation d’un médicament pour limiter la douleur (analgésique) n ‘est pas possible en raison de son impact sur le déroulement de l’inflammation. Les animaux seront par ailleurs suivis de près pour détecter dans les jours qui suivent tout cas de pathologie autre que cette injection pourrait masquer. Enfin, les animaux seront soumis à des prélèvements sur animaux vigils. Les prises de sang ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à la contention lors de la distribution des aliments. La douleur causée par l’aiguille ne nécessite pas d’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront réintégrés dans le troupeau des vaches laitières de la ferme expérimentale pour retrouver une vie de vache laitière similaire à celles que l’on peut trouver dans les troupeaux laitiers expérimentaux. Ces animaux sont donc susceptibles d’être réutilisés pour d’autres projets expérimentaux.

Remplacement

Même si des premières études sur cellules en culture ont permis de réaliser une première sélection des extraits de plantes susceptibles de moduler favorablement la réponse immunitaire et dont l’usage en ferme pourrait être envisagé, il n’est pas possible de remplacer entièrement l’utilisation d’animaux pour définir les modes d’actions des extraits de plantes. En particulier, l’amélioration de la réponse immunitaire et du statut antioxydant doit être évalués à l’échelle de l’animal entier afin de prendre en compte à la fois les régulations cellulaires mais aussi systémiques de ces réponses. La méthode proposée permet l'évaluation globale des premières étapes de la réponse au niveau de l’animal entier et permet de ré-introduire les animaux en élevage et donc de les garder en vie.

Réduction

L’objectif est de disposer de résultats sur 12 animaux par stratégie testée. Ce nombre a été évalué pour disposer d’une puissance statistique suffisante compte-tenu que chaque lot de vache ne recevra qu’un des trois traitements au cours de l’expérimentation. L’objectif est de disposer de suffisamment d’animaux pouvant détecter une différence entre les groupes en fonction des traitements et des réponses analysées. L’épreuve inflammatoire nécessitant de disposer d’animaux répondant à deux conditions qui sont difficiles à anticiper, des animaux de réserves (3 par stratégie) vont devoir être inclus. Les deux conditions sont de disposer au moment de l’épreuve de vaches à un même stade de lactation et ayant au moins un quartier de la mamelle avec un très bon niveau sanitaire constaté par une concentration faible de cellules somatiques dans le lait. Selon les dates effectives de vêlage et les résultats d’analyses de lait avant l’épreuve inflammatoire, certaines vaches pourront être remplacées par ces vaches de réserve pour l’épreuve inflammatoire. Des résultats expérimentaux passés permettent d'évaluer que 3 animaux de réserve par stratégie seront suffisants. Au final, le nombre d’animaux impliqués sera donc de 45, dont au maximum 36 seront soumis à l’épreuve. Les données seront analysées par analyse de variance en modèle mixte à l’aide du logiciel R. Nous étudierons l'effet des traitements en mesures répétées avec analyse de l’effet du temps et prise en compte de la vache en effet aléatoire.

Raffinement

La conduite d’élevage sera respectueuse du bien-être des animaux. Un suivi régulier du comportement et des paramètres indicateurs de la souffrance des animaux (fièvre supérieure à 40°C, animal couché faible, et les œdèmes de la mamelle qui engendre une sensibilité importante) sera mis en place pour détecter le plus rapidement possible tout signe de perturbations et traiter si besoin les animaux malades. Les parties du protocole pouvant entraîner de la souffrance chez les animaux sont clairement identifiées (prise de sang et épreuve inflammatoire). Le traitement visant à induire une inflammation dans un quartier de la mamelle est suivi d’une réponse inflammatoire de courte durée avec un retour en production des animaux dans la semaine qui suit le déclenchement de la réponse inflammatoire. L’utilisation d’un composé non infectieux pour le déclenchement de l’inflammation réduit l’intensité de cette inflammation. De plus, contrairement à une infection expérimentale, ce protocole permet de garder les animaux en vie tout en permettant de mimer les premières étapes d’une mammite. Les prises de sang réalisées ne nécessitent qu’une contention minimale, les animaux étant habitués à être contentionnés lors de la distribution des aliments. A la fin de l’essai tous les animaux réintègreront le troupeau de la ferme.

Choix des espèces

La problématique de l’étude, assez spécifique aux vaches laitières, nécessitera de travailler avec cette espèce. Les vaches seront de race Prim’ Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. L’incidence des mammites étant la plus forte et de façon nette en début de lactation, de même que le stress oxydatif, les vaches impliquées seront majoritairement en début de lactation.