Poules

1 728 poulets de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 1 512 sont infestés par des coccidies, ce qui provoque des signes intestinaux, puis suivis et pesés jusqu'à l'âge d'abattage de 84 jours pour tester cinq extraits de plantes comme alternative aux anticoccidiens. Le porteur indique que les poulets infestés, non commercialisables, sont tués, tandis que les 216 témoins sont réintégrés dans la chaîne commerciale. Il présente ces alternatives "naturelles" comme une "nécessité" pour la filière avicole française.

Objectifs

La société actuelle est demandeuse d'une médication vétérinaire réduite (arrêt des antibiotiques, coccidiostatiques…), naturelle et respectueuse de l'environnement. De ce fait, la réduction de l’usage des traitements médicamenteux est aujourd’hui un enjeu majeur pour l’agriculture française. Parmi ces produits, les additifs coccidiostatiques (ou anticoccidiens) sont très utilisés en France et en Europe car ils sont le principal moyen de lutte contre la coccidiose. La coccidiose est une maladie parasitaire qui touche les volailles. Les symptômes peuvent être variés, mais la coccidiose se traduit souvent par une frilosité des volailles, une baisse de leur appétit, un retard de croissance, une apathie ou encore des diarrhées. Les animaux peuvent parfois se tenir en boule, avec leurs plumes ébouriffées, tous ces symptômes étant la résultante de dommages intestinaux qui induisent des pertes économiques significatives pour l’éleveur. Les éleveurs peuvent utiliser des substances à titre préventif, appelées coccidiostatiques (ou anticoccidiens). Elles sont considérées comme des additifs par la législation et sont généralement administrés via l’aliment. Cependant, cette utilisation présente quelques limites puisque des phénomènes de résistances aux anticoccidiens ont été développés et leur utilisation continue et routinière a entraîné l’émergence de populations résistantes, qui nécessitent des rotations régulières quant au type d’anticoccidien utilisé. Par ailleurs, des résidus anticoccidiens sont parfois retrouvés dans les produits avicoles. Les limites des coccidiostatiques ont entraîné le développement des vaccins. Ils représentent cependant un coût non négligeable pour l’éleveur et ont tendance à entrainer des baisses de performances zootechniques (croissance, consommation alimentaire), voire le développement de pathologies opportunistes. L’alerte sur les risques d’utilisation des substances médicamenteuses sur la santé et les limites de la vaccination motive aujourd’hui l’émergence de nouvelles offres de produits. Ainsi, au regard des préoccupations sanitaires grandissantes et d’une probable évolution réglementaire les interdisant, il est important de trouver aujourd’hui une alternative aux anticoccidiens. Dans le cadre de ce projet, notre objectif sera de tester des solutions alternatives et naturelles aux coccidiostatiques.

Bénéfices attendus

La coccidiose est une des maladies les plus fréquentes chez les volailles. Si les éleveurs peuvent utiliser des substances à titre préventif, tels que les coccidiostatiques (ou anticoccidiens) ou des vaccins, la mise en place et le développement de solutions alternatives et naturelles à visée anticoccidienne apparaissent comme une nécessité pour la filière avicole française. Dans ce contexte, le plus gros bénéfice de notre projet est le développement de nouvelles solutions naturelles à visée anticoccidienne, en remplacement des anticoccidiens et des vaccins. Cette étude aura de ce fait également des bénéfices pour le consommateur et la santé humaine : naturalité, qualité sanitaire (absence de résidus dans les produits avicole), qualités nutritionnelles…

Procédures

1512 animaux sont soumis à une infestation coccidienne expérimentale unique. L’inoculation se fera, sur animaux vigiles, à 15 jours d’âge car il s’agit de la réalité sur le terrain où les coccidioses cliniques apparaissent entre 12 et 15 jours d’âge. Chaque inoculation durera moins de 20 secondes. Les animaux seront suivis jusqu’à 84 jours d’âge, âge d’abattage classique pour cette souche de poulets. Tous les poulets seront pesés individuellement à 8 reprises afin de connaitre et comparer leur performance de croissance. La durée moyenne d’une pesée d’un parquet de 36 animaux est estimée à 10 min maximum.

Impact sur les animaux

Les effets négatifs sur les animaux sont principalement liés à l’infestation coccidienne expérimentale. Elle est néanmoins nécessaire pour évaluer l’effet anticoccidien des solutions que nous testons. La principale nuisance pour les animaux sera la présence de signes subcliniques transitoires, sur 24h (48h maximum), au moment du pic d’excrétion des coccidies, soit environ 4 à 7 jours d’après l’infestation. La pesée individuelle des animaux peut également représenter un stress pour ces derniers, mais reste nécessaire pour le suivi de la croissance des animaux.

Devenir

Les animaux ayant subi l’infestation coccidienne ne sont pas commercialisables ; ils seront mis à mort. Les animaux n’ayant pas subi l’infestation (lot témoin = 216 animaux), pourront, après vérification qu’ils ne soient pas contaminés par les coccidies, être replacés dans la chaîne commerciale.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet qui vise à évaluer l’efficacité de solutions alternatives aux anticoccidiens, le remplacement n'est pas possible car il n'existe, à ce jour, aucune technique in vitro pour étudier les réponses physiologiques des individus face aux stimuli auxquels ils sont exposés. Cependant, en amont de ce projet, des tests ont été effectués en remplacement de l’utilisation des animaux : d’une part en laboratoire pour contrôler et quantifier l’efficacité des molécules vis-à-vis des parasites et l’absence de toxicité vis-à-vis des cellules de l’hôte (in vitro) et d’autre par simulation informatique (in silico).

Réduction

De nombreux tests en amont ont été effectués in vitro et in silico afin de réduire le nombre d’animaux total nécessaires au projet. Cependant, pour tester l’efficacité des 5 solutions alternatives aux anticoccidiens, nous avons besoin d’utiliser les animaux. L’effectif de 1728 animaux a été déterminé statistiquement pour obtenir des résultats robustes tout en réduisant au maximum le nombre d'animaux nécessaire pour pouvoir évaluer 8 modalités expérimentales et en tirer des conclusions significatives.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des parquets, au sol sur des copeaux et en groupe afin de créer des relations sociales. Des ficelles seront installées dans chaque parquet en tant que matériel d’enrichissement. Ils seront hébergés dans des parquets de 2.68m² selon les normes règlementaires définies par l’arrêté du 28 juin 2010 établissant les normes minimales relatives à la protection des poulets destinés à la production de viande et dans des conditions optimales d’alimentation et de soins. Des points limites précis et suffisamment précoces sont déterminés et une grille d’évaluation du bien-être des poulets sera complétée quotidiennement par le personnel animalier pour permettre de détecter précocement toute altération de leur état de santé ou de leur comportement. Pour chaque paramètre d’atteinte au bien-être, nous avons défini plusieurs niveaux d’action. De plus, la surveillance des animaux portera particulièrement sur les éléments suivants : l'alimentation, l'état des déjections, le comportement et les blessures. En cas d'atteinte au bien être sur un des ces 4 paramêtres, l'animal est immédiatement prise en charge. Dans le cas où les symptômes persistent au-delà de 3 jours, l'animal est déclaré «hors expérimentation ». Selon son état, il est remis au sol, en groupe. Si son état ne le permet pas, il sera mis à mort selon une méthode conforme à la règlementation.

Choix des espèces

S'agissant d'un objectif finalisé sur la santé des volailles, le choix du poulet (gallus gallus) a été fait car il s’agit l'espèce majeure sur le terrain et un modèle reconnu par la filière. Les poussins arriveront à 1 jours d’âge, mais l’infestation coccidienne n’aura lieu qu’à 15 jours, âge à partir duquel les infestations aux coccidies apparaissent en élevage. Nous étudierons ensuite les animaux infestés sur toute la durée d’élevage, c’est-à-dire jusqu’à 84 jours qui correspond à l’âge classique d’abattage pour cette souche à croissance lente. Cela nous permettra par la suite de transposer les résultats à un élevage commercial classique.

1 140 poules pondeuses vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis données à des familles pour poursuivre leur vie en basse-cour. L'expérimentation consiste à les peser, à peser leurs aliments et à récupérer leurs fientes pour mesurer la digestibilité des rations, le porteur jugeant "peu probable" tout effet indésirable au-delà d'une moindre consommation ou d'une baisse de ponte. L'objectif affiché sert la filière de production d'œufs, cadré autour des "performances technico-économiques". Le porteur indique tester d'abord les aliments par simulation informatique et in vitro, ne retenant in vivo que les formulations jugées intéressantes.

Objectifs

La production mondiale œuf dans le monde est en constante augmentation. La France en est le 1er pays producteur d’œufs, avec 15,7 milliards (Md) d’œufs produits en 2020, soit +4,9% par rapport à 2019. Ainsi, la filière est toujours à la recherche d’une amélioration des performances technico-économiques en élevage de production. Ceci va principalement passer par l’alimentation des poules. En effet, pour leur métabolisme, les cellules de l’organisme utilisent des nutriments apportés par l’alimentation et des métabolites issus de la mobilisation des réserves corporelles. La digestion des aliments et l’absorption des produits de la digestion sont indispensables pour transformer les aliments ingérés en nutriments assimilables par les volailles. Dans ce contexte, il est indispensable de connaitre de façon précise la digestibilité de chaque aliment apporté à la poule. Celle-ci se caractérise par la formule suivante : (Quantité ingérée – Quantité excrétée dans les fécès) / Quantité ingérée. Elle permet de calculer le coefficient d’utilisation digestive (exprimé en pourcentage de la digestibilité apparente). Pour obtenir ses valeurs il faut donc 1) peser les quantités mangées par l’animal et 2) récupérer les fientes des animaux. Le but de ce projet est de mesurer à une échelle imitant les conditions et la durée d’élevage la digestibilité des aliments donnés aux poules afin d’optimiser les recommandations alimentaires, de chercher de nouvelles matières premières et vérifier l’impact de ces aliments sur la qualité physique et organoleptique de l’œuf. En pratique 1 140 poules de race Dekalb White seront utilisées pour ce projet (1 essai par an pendant les 5 années du projet).

Bénéfices attendus

A l’issue de ce projet, nous souhaitons mettre à jour les valeurs nutritionnelles des aliments pour poules pondeuses (en terme de valeurs énergétiques, protéiques, lipidiques, cellulosiques, vitaminiques et minérales principalement) pour améliorer leur bien-être (digestif notamment), et leurs performances.

Procédures

Les mesures prévues sont les suivantes : 1/ Pesée des animaux par case (n=19 animaux) le jour de leur arrivée, puis tous les 15 jours, jusqu’à la fin de l'essai. 2/ Pesée des aliments consommés chaque semaine par case (n=12). 3/ Ces données permettront d’établir pour chaque case le poids moyen des poules, le gain moyen quotidien et l’indice de consommation. Les éventuelles mortes seront ramassées chaque jour et pesées individuellement. Elles seront prises en compte dans le calcul des indices. 4/ Les fécès seront récupérés chaque semaine par parc (plaque sous les grillages) et analysés en laboratoire pour composition chimique.

Impact sur les animaux

Compte-tenu des aliments testés (le but étant d’optimiser les performances et maximiser le bien-être), il est peu probable que des nuisances ou effets indésirables soient observés. Les seuls critères imaginés pourraient être une moindre consommation d’aliment, une moindre prise de poids et un moindre taux de ponte. Il faut souligner que la surveillance des animaux se déroulera de manière très rapprochée puisque des prélèvements sont prévus toutes les semaines et une surveillance quotidienne sera faite par l’animalier.

Devenir

Tous les animaux seront adoptés par des familles pour continuer leur vie de poule pondeuse de basse cour à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Avant de tester un aliment sur poule, des simulations informatiques seront testées afin de mettre en place seulement celles intéressantes nutritivement. De plus, avant de mettre en place des études sur poules nous travaillons avec des modèles in vitro (analyses en laboratoire) permettant de vérifier l’efficacité de nouvelles plantes, additifs ou matières premières. Seuls ceux efficaces après ces premiers tests seront testés in vivo, afin d’observer leur appétence et leur effet sur les performances et l’immunité des animaux.

Réduction

Nous utilisons au total 1140 poules pour ce projet (1 essai par an pendant les 5 années du projet). L'utilisation d'animaux homogènes sur les plans biologiques et sanitaire, nous permet de réduire la variabilité d'un individu à l'autre et donc d’obtenir un nombre minimum d’individus par lot. Le nombre d’animaux a été validé par un test de puissance statistique (réalisé sur le logiciel R) et permettra une interprétation statistique des résultats.

Raffinement

Chaque parc dispose d’enrichissements pour les poules (perchoirs, jouets, miroirs) afin de répondre à leurs besoins naturels et de les stimuler. De plus, les poules ne sont pas isolées dans les parcs et sont plusieurs par parc afin de combler leur instinct grégaire.

Choix des espèces

La poule pondeuse (Gallus gallus) est l’espèce utilisée pour produire des œufs de consommation alimentaire. Les poules utilisées auront de 18 à 70 semaines d’âge, soit la durée classique d’élevage d’une poule pondeuse standard.

150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

96 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Inoculées avec le virus de la maladie de Marek, elles subissent huit prélèvements de sang et trois prélèvements de plumes, et le porteur indique s'attendre à ce que la majorité développe la maladie, avec fièvre, paralysie, lymphome, perte de plumes ou mort subite. Les oiseaux sont hébergés en isolateurs qui restreignent leurs mouvements, et ceux présentant des symptômes graves sont euthanasiés après confirmation du diagnostic. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'étudier la latence virale et qu'aucun autre modèle animal ne convient, ce virus n'infectant que les gallinacés.

Objectifs

Le virus de la maladie de Marek est un herpès virus aviaire hautement contagieux et entrainant des lymphomes mortels pour les animaux dans un délai de quelques semaines. Ce virus est actuellement sous contrôle grâce à des protocoles de vaccination très stricts, bien que ceux-ci ont montré des failles dans les dernières années. Ce virus est également un outil en recherche biomédicale de par son côté modèle d’oncogenèse viro-induite. L’objectif de ce projet est d’approfondir les connaissances sur l’oncogenèse induite par ce virus. Alors que celle-ci a été longtemps réduite au résultat de l’expression d’un facteur de transcription viral dérégulant la biologie cellulaire des cellules infectées de manière latente, les découvertes successives d’acides ribonucléiques (ARN) non-codants impactant le cycle viral et l’oncogenèse viro-induite ont remis en cause ce modèle. Dans le cadre de ce projet, nous proposons qu’un ARN non-codant nouvellement découvert et encodé à partir du même gène permettant l’expression de l’oncogène majeur du virus puisse avoir un impact sur l’apparition de la lymphomagenèse. Pour répondre à cette question deux virus OGM ont été produits en laboratoire et testés in vitro avant cette approche in vivo. L’approche in vitro a montré ses limites car l’effet est suspecté de se produire durant la latence du virus, qui n’est pas observable dans les modèles cellulaires. Ce projet nécessitera au maximum l’utilisation de 96 poules.

Bénéfices attendus

L’étude de l’impact de l’ARN circulaire étudié sur l’oncogenèse requiert un volet in vivo pour répondre à la question de recherche. Actuellement, et depuis leur première description en 2018, aucun ARN circulaire viral n’a été décrit pour ses rôles promouvant l’oncogenèse viro-induite in vivo. Le virus de la maladie de Marek est un modèle adéquat pour investiguer ce pan inexploré de l’oncogenèse viro-induite. Au travers de ce projet, nous espérons comprendre le rôle de l’ARN circulaire associé au locus de l’oncogène majeur du virus de la maladie de Marek. Les bénéfices sont donc à répartir sur plusieurs niveaux : 1- Maladie de Marek : Meilleure compréhension du cycle viral et de la tumorigenèse viro-induite 2- Biologie moléculaire : Descriptions de nouvelles fonctions des ARN circulaires, notamment viraux 3- Virologie : Description d’un pan très récent de la virologie.

Procédures

une inoculation de virus sur animaux vigiles + 8 prélèvements de sang sur animaux vigiles + 3 prélèvements de plumes sur animaux vigiles. Durée de chaque acte : moins d’une minute.

Impact sur les animaux

1/ L’hébergement des animaux en isolateurs est nécessaire dans le cadre des recherches portant sur le virus de la maladie de Marek. Cependant, l’hébergement en isolateurs peut induire une compétition sur les ressources alimentaires en fonction de la fréquence des nourrissages. Ce type d’hébergement réduit également la liberté de mouvement des animaux. 2/ La maladie de Marek est une maladie virale hautement contagieuse et fatale pour la majorité des animaux infectés. Il est attendu que la majorité des animaux de l’étude soient atteints de la maladie durant le temps de l’étude. Parmi les symptômes possibles : fièvre, paralysie, mort subite, lymphome, perte de poids, perte de plumes, difficultés respiratoires, ailes pendantes, boiterie. 3/ Les prises de sang et prélèvements de plumes entraineront un stress récurrent chez les animaux concernés. Ces manipulations entraineront également des douleurs ponctuelles : un animal dont la contention serait mal assurée pourrait se faire mal ou se blesser ; l’injection intramusculaire peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection et les prises de sang peuvent être sources d’hématomes au site de prélèvement. Les prélèvements de plumes entrainent une douleur ponctuelle pour l’animal.

Devenir

En fin d’expérience, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser différents prélèvements d'organes et de plumes.

Remplacement

Il est impossible de remplacer le modèle par des approches in vitro ou in silico car les méthodes actuelles n‘offrent qu‘une approche limitée de la maladie. Notamment, il n‘est pas possible d‘étudier in vitro la latence virale, responsable de la lymphomagenèse. L’utilisation d’un autre modèle animal, moins sensible, est également impossible car cet herpès virus n’infecte que les gallinacés.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque lot a été établi afin d’être en conformité avec le principe de réduction des règles de bien-être animal et de manipuler un nombre d’échantillons suffisants pour établir si les différences mesurées entre lots sont statistiquement significatives et donc non dus au hasard. Les meilleurs tests statistiques seront appliqués dans les comparaisons des différents groupes pour permettre un traitement optimal des données.

Raffinement

Une visite des animaux est effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié afin de détecter l’apparition de symptômes de la maladie ou tout autre signe anormal lié à la santé et au bien-être des animaux. Les animaux présentant des symptômes graves de la maladie de Marek seront euthanasiés après confirmation du diagnostic par le responsable du projet. Les animaux présentant des symptômes légers feront l’objet d’une surveillance accrue pour détecter l’apparition de nouveaux symptômes. L’ensemble des gestes techniques est assuré par du personnel formé et compétent, ce qui limitera le stress des animaux. La contention est effectuée en douceur et les prélèvements sont le plus rapide possible. Les prélèvements de plumes et de sang sont réalisés simultanément pour limiter le stress. Le nombre de prélèvements a été réduit au minimum et espacés au minimum de 7 jours pour limiter la manipulation et la souffrance liées aux prélèvements répétés. Dans le cas des prélèvements de plumes, de petites plumes seront prélevées, ce qui limite la douleur par rapport aux prélèvements de plus grosses plumes. Afin de limiter la douleur lors de l’inoculation du virus, nous utiliserons des seringues avec des aiguilles fines et courtes. Les injections seront réalisées sous PSM (poste sécurité microbiologique) avant l’entrée des animaux dans les isolateurs afin de faciliter la manipulation, notamment la contention des animaux et ainsi rendre l’injection plus simple et moins stressante pour les animaux. des vers de farine seront testés comme aliment de récompense après les prélèvements. Des points limites adaptés ont été définis.

Choix des espèces

Le virus de la maladie de Marek ne provoque des lymphomes que chez les gallinacés. L’utilisation de la race choisie permet d’obtenir des effets plus importants et donc, de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude. De plus, chaque année, malgré la vaccination, des élevages de poulets présentent des cas de maladie de Marek malgré la vaccination. Cela peut être dû à une mauvaise vaccination, à des souches hypervirulentes ou à des environnements très contaminés. Pour des raisons techniques, les poulets seront infectés à l’âge de 14 jours. Ils seront euthanasiés à maximum 75 jours d’âge. L’âge d’inoculation de 14 jours a été déterminé car il permet de commencer les prélèvements sanguins dès le début de l’expérience, tout en restant suffisamment sensible à la maladie pour obtenir des résultats robustes en un minimum de temps.

152 poulets de chair vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont vaccinés par voie intramusculaire ou orale puis infectés par la bactérie Campylobacter, avant mise à mort et prélèvement d'organes, pour optimiser un vaccin destiné à réduire la contamination humaine par la volaille. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable, décrivant Campylobacter comme une bactérie commensale asymptomatique du poulet, et présente ce dernier comme la "seule espèce adaptée" faute d'organoïdes reproduisant l'immunité aviaire. Les poussins sont élevés jusqu'à 42 jours, âge d'abattage des poulets de chair, puis tués pour l'étude.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le développement d’une stratégie de lutte vis-à-vis de la bactérie Campylobacter jejuni dans la filière avicole par la vaccination. Lors d’essais précédents, nous avions montré qu’un vaccin candidat basé sur la protéine appelée « YP437 » donnait des résultats prometteurs en terme d’induction d’anticorps sériques ou de protection vis-à-vis de l’infection bactérienne. Cependant, le protocole vaccinal doit maintenant être amélioré pour être plus efficace. Les objectifs visés par ce projet sont d’évaluer des pistes d’amélioration de la stratégie vaccinale : (1) Evaluer l’efficacité vaccinale du candidat vaccin sous sa forme protéique (vaccination et rappel vaccinal sous forme de protéines). En effet, cette combinaison n’avait pas été évaluée lors des essais précédents qui utilisait une primo-vaccination sous forme d’ADN et un rappel vaccinal sous forme protéique. Or, d’après notre expérience avec d’autres antigènes vaccinaux, la valence vaccin protéique est impliquée dans l’induction d’une réponse immunitaire sérique. (2) Evaluer l’impact de la fréquence (répétitions) des doses administrées du candidat vaccin. L’administration de plusieurs rappels vaccinaux pourrait augmenter l’amplitude des réponses immunitaires protectrices. (3) Evaluer l’impact de la voie d’inoculation en administrant le vaccin candidat par la voie orale (administration mucosale). En effet, lors des essais précédents, seule la voie intramusculaire a été testée. Or, d’après certains résultats précédents, l’induction de réponse immunitaire mucosale a été retrouvée chez des poulets partiellement protégés. La voie orale pourrait donc être intéressante pour stimuler la voie mucosale qui pourrait avoir un rôle sur la réduction de la charge caecale en Campylobacter. (4) Suivre tout un panel de réponses immunitaires dont les anticorps spécifiques circulants et mucosaux (anti-YP437), la réponse cellulaire et la composition du microbiote intestinal en réponse au vaccin en présence de Campylobacter. En effet, lors des essais précédents, seuls les paramètres de l’immunité systémique et mucosale ont été mesurés. Toutefois, il est possible que les efficacités vaccinales soient liées aux réponses humorales spécifiques, à l’immunité mucosale intestinale, à l’immunité cellulaire et/ou à la composition du microbiote intestinal qui pourrait interagir avec Campylobacter, et/ou le vaccin et/ou le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce suivi devrait nous donner des indications sur ce qui est important selon différents paramètres testés (fréquence et voie d’inoculation, nature du vaccin) pour induire une réponse immunitaire protectrice contre Campylobacter chez le poulet en étudiant les interactions système immunitaire/microbiote et de Campylobacter au sein des intestins du poulet suite à la vaccination. L’étude de la voie orale permettra d’apporter des réponses sur la stimulation de la voie mucosale et d’être plus adapté à la vaccination de terrain dans les élevages. Le concept est innovant car l’adjuvant utilisé pour la voie orale n’a encore jamais été testé chez des poulets de chair.

Procédures

Plusieurs lots seront vaccinés par voie intramusculaire ou orale et infectés par Campylobacter par voie orale. Les prélèvements d’organes (caecum, rate et bourse de Fabricius) et de fluides (sang et bile) auront lieu après mises à mort des animaux. Au total, 7 lots de poulets de chair (souche Ross 308) seront utilisés. Lot 1: Vaccinés par la protéine YP 437 deux fois aux jours 5 et 12 par voie intramusculaire et infecté par Campylobacter au jour 19. Lot 2: Témoin placebo du lot 1 Lot 3: Vaccinés par la protéine YP 437 quatre fois au jours 5, 12, 19 et 28 en intramusculaire et infecté par Campylobacter au jour 19. Lot 4: Témoin placebo du lot 3 Lot 5: Vaccinés par la protéine YP 437 deux fois au jours 5 et 12 par voie orale et infecté par Campylobacter au jour 19. Lot 6: Témoin placebo du lot 5 Lot 7: Témoin challenge (non vacciné mais infecté par Campylobacter). Les poulets des lots 1 à 4 seront inoculés par voie intramusculaire. Les lots 1 et 3 seront inoculés avec le vaccin contenant la protéine YP 437 émulsionnée dans un adjuvant alors que les lots 2 et 4 seront inoculés avec un placebo (PBS + adjuvant). Les poulets du lot 5 seront inoculés avec le vaccin contenant la protéine YP 437 émulsionnée dans un adjuvant par voie orale alors que les poulets du lot 6 seront inoculés également par voie orale mais avec un placebo (PBS + adjuvant). Les lots 5 et 6 seront au total vaccinés 4 fois alors que les lots 1 à 4 seront au total vaccinés 2 fois. Le lot 7 ne sera pas vacciné. Tous les poulets seront infectés par voie orale par Campylobacter au jour 19. L’essai se déroulera comme suit: J1 : Naissance et mise en place des poussins au sein des animaleries et mise à mort de 5 poussins pour prélèvements de vésicules vittelines afin de vérifier le statut indemne en Campylobacter. J5 : Première vaccination pour tous les lots sauf le 7. J12 : Deuxième vaccination pour tous les lots sauf le 7. J19 : Infection avec Campylobacter par voie orale sur tous les animaux et mise à mort de 5 animaux par lot pour prélèvements de fluides et d’organes. Troisième vaccination pour les lots 5 et 6. J22 : Récolte de fientes à même le sol afin de vérifier la colonisation en Campylobacter suite à l’infection des poulets 3 jours avant. J28 : Quatrième vaccination pour les lots 5 et 6. J42 : Fin de l’essai, mise à mort de 16 animaux par lot pour prélèvements de fluides et d’organes. Au total, 152 animaux seront utilisés pour cette procédure.

Impact sur les animaux

Le vaccin protéique a déjà été utilisé lors d’expérimentations précédentes chez les poulets de chair, et aucune réaction indésirable n’a été décelée suite à la vaccination. L’adjuvant utilisé par voie intramusculaire a déjà été utilisé et n’a pas provoqué d’effets indésirables. L’adjuvant utilisé par voie orale n’a jamais été inoculé chez le poulet mais il a déjà été testé chez d’autres modèles animaux (bovin, porcin, poisson, murin) sans effets indésirables. Par ailleurs, Campylobacter est considérée comme une bactérie commensale des poulets, et à ce titre est asymptomatique. En outre, la souche utilisée a déjà fait l’objet de plusieurs essais in vivo et aucun effet indésirable n’a été observé. Il n’est donc attendu à ce qu’aucun effet indésirable ne survienne tout au long de l’essai.

Devenir

Les prélèvements d’organes et fluides seront réalisés après la mise à mort de l’animal. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale.

Remplacement

La volaille et notamment le poulet de chair représente la source majeure de campylobactériose pour l’homme. Campylobacter fait partie de la flore naturelle des poulets qui le portent de manière asymptomatique. La colonisation intervient entre la seconde et troisième semaine après l’éclosion. Le but de cette étude ici est de contribuer au développement de vaccins contre cette bactérie chez le poulet afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Campylobacter. La mise en place de la protection vaccinale contre Campylobacter fait intervenir à la fois le système immunitaire composé de différentes cellules et le microbiote intestinal. En l’absence de lignée cellulaire (population de cellules ayant une capacité de se diviser et donc de se multiplier) ou d’organoïdes (modèle d'un organe) pouvant mimer le système immunitaire aviaire et les interactions Campylobacter-microbiote-système immunitaire, aucune stratégie alternative visant à évaluer l’immunogénicité d’un vaccin inoculé aux poulets ou l’impact de la vaccination sur le microbiote n’est disponible. Le poulet est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure.

Réduction

Les animaux seront utilisés au seuil de la pertinence scientifique et statistique. Au jour 19 (avant infection par Campylobacter per os), 5 poulets par lot seront mis à mort pour avoir un nombre d’animaux par lot minimal pour appliquer les tests statistiques fiables pour les paramètres étudiés. Au jour 42, en raison de la variabilité interindividuelle importante du dénombrement de Campylobacter, il est nécessaire d’avoir à minima 15 animaux par lot afin de comparer les charges caecales en Campylobacter, reflétant l’efficacité vaccinale. Des tests de comparaison de moyennes seront effectués pour analyser les résultats des différents lots à chaque date de prélèvement. Des tests paramétriques (Student ou Anova) seront utilisés lorsque les critères de normalité et d’homogénéité des variances seront réunis. Sinon des tests non paramétriques (Kolgomorov-Smirnov ou Kruskall Wallis) seront utilisés.

Raffinement

Dans nos expériences précédentes, avec le vaccin à base des protéines YP437, aucun symptôme ou effet indésirable n’a été détecté chez les animaux étudiés (avec deux injections de vaccin). Le protocole a été établi pour limiter au maximum le nombre de manipulation par animal. Néanmoins, afin de pouvoir bien évaluer l’immunogénicité du vaccin et la preuve du concept, il apparait opportun, dans deux groupes, de réaliser 3 rappels vaccinaux au lieu d’un seul. Pour ces animaux, comme pour l’ensemble des animaux par ailleurs, le personnel expérimenté apportera la même attention à chaque injection pour éviter/limiter les inconforts au moment de l’injection. D’après notre expérience, les vaccins se diffusent très bien en intramusculaire et une garde au niveau de l’aiguille rattachée à la seringue peut être ajoutée pour que l’aiguille soit bien positionnée et bien adaptée à la dimension de la cuisse du poulet. L’adjuvant utilisé par voie intramusculaire a déjà été utilisé et n’a pas provoqué d’effets indésirables. L’adjuvant utilisé par voie orale n’a jamais été inoculé chez le poulet mais il a déjà été testé chez d’autres modèles animaux (bovin, porcin, poisson, murin) sans effets indésirables. Afin de limiter les gestes invasifs et le stress chez les animaux, les prélèvements de sang auront lieu lors de la saignée à la veine jugulaire après mise à mort des animaux. Par ailleurs, Campylobacter est considérée comme une bactérie commensale des poulets, et, à ce titre, l’infection est asymptomatique. En outre, la souche utilisée a déjà fait l’objet de plusieurs essais in vivo et aucun effet indésirable n’a été observé. Aucun effet indésirable n’est donc attendu au cours de cet essai. Néanmoins, les animaux seront observés quotidiennement. Si toutefois, une altération de l’état de santé était observée quelle que soit la raison, les animaux concernés seront mis à mort en cas d’atteinte des points limites suivants : blessure grave, prostration, absence de réaction après sollicitation (absence de réponse à des stimuli tactiles et visuels), anorexie ou impossibilité de s’abreuver ou de s’alimenter.

Choix des espèces

Campylobacter fait partie de la flore naturelle des poulets qui le porte de manière asymptomatique. La colonisation de cette flore intervient entre la seconde et troisième semaine après l’éclosion. Le but des études ici est de contribuer au développement de vaccins contre cette bactérie chez le poulet afin de réduire in fine le risque d’infection humaine par Campylobacter. Le poulet est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de notre procédure. Des poussins de 1 jour seront utilisés et élevés jusqu’à 42 jours. Le but est de suivre les réponses immunitaires et l’influence du microbiote avant au jour 19 et suite à l’infection par Campylobacter au jour 42, âge moyen testé lors des précédents essais et cohérent avec l’âge d’abattage des poulets de chairs pour la consommation.