Autres poissons
POLLPOP : effets des polluants sur la santé des poissons d’eau douce : des molécules aux populations
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres poissons : 900
1 200 poissons, 900 goujons et carassins et 300 truites, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et les individus de taille extrême relâchés. Ils sont capturés par pêche électrique, exposés deux à trois semaines à des cocktails de polluants en rivière ou en laboratoire, marqués et parfois injectés d'un antigène mimant une attaque parasitaire, puis euthanasiés par surdose d'anesthésique pour mesurer la contamination de leurs tissus. Le porteur indique choisir des doses faibles et des durées courtes pour observer des effets non létaux tout en limitant la mortalité. Les bénéfices se limitent à "mieux comprendre" les effets des pollutions humaines sur la faune sauvage, et le porteur juge le remplacement par culture cellulaire inapplicable à l'étude de stress multiples.
Objectifs
Les écosystèmes aquatiques sont lourdement impactés par les pollutions organiques (pesticides) et inorganiques (métaux) issues des activités agricoles et industrielles, mais leurs effets à long terme sur la santé et les capacités d’adaptation des organismes aquatiques et notamment des poissons sont encore peu évalués, notamment en conditions réalistes de stress multiples (parasites, température…). Le projet vise à évaluer les impacts potentiels des stress environnementaux multiples (notamment chimiques) en combinant des approches en laboratoire et sur le terrain, au plus près du réalisme environnemental.
Bénéfices attendus
A terme les résultats de ce projet permettront de caractériser les effets des pollutions environnementales sur la santé des poissons, et de mieux comprendre les réponses comportementales et physiologiques des animaux soumis aux stress chimiques. Ils permettront donc de mieux comprendre et anticiper les effets des pollutions d'origine humaine sur la santé de la faune sauvage.
Procédures
Pour tester leur réponse aux stress chimiques, des poissons seront exposés à des polluants en dose et cocktails réalistes au plus proche des concentrations trouvées en rivière, et ce pendant une durée maximale de 21 jours pour éviter tout effet mortel, mais observer des effets physiologiques et comportementaux. Dans un premier temps, des approches en laboratoire seront utilisées afin de tester les effets des polluants en conditions contrôlées sur carassins et goujons, notamment des cocktails de contaminants représentatifs du milieu naturel en se basant sur des bases de données existantes. Pour tester la variabilité de réponse entre populations sauvages hétérogènes, plusieurs populations sauvages de goujons ayant évolué dans des rivières plus ou moins polluées seront comparées. Dans un deuxième temps, des expérimentations d’encagement en rivière seront mises en place afin de tester les réponses des poissons en conditions réalistes de multistress sur le terrain. Des goujons issus de populations plus ou moins exposées aux pesticides, et des truites également issues de zones plus ou moins polluées par des métaux, seront transplantés en cage dans des rivières contaminées ou peu contaminées. Les cages seront de dimensions suffisante avec un grillage fin de 5 mm qui laisse passer les invertébrés pour la nourriture. Les poissons seront exposés pendant 14 à 21 jours à des rivières plus ou moins polluées que leur rivière d’origine. Après toutes les expositions en laboratoire ou rivière, les poissons seront anesthésiés, marqués avec des colorants non toxiques par injection sous-cutanée, mesurés (poids et longueur totale), une unique injection sous-cutanée d’antigène mimant une attaque parasitaire pourra être effectuée au niveau de la queue afin de tester l’immunité des poissons. Au total ces interventions sont réalisées en moins de 2 minutes. Enfin les poissons seront euthanasiés par surdose d’anesthésique, et les taux de contamination de leurs tissus seront mesurés, ainsi que leur état de santé à partir de diverses mesures dans les tissus (nageoires, foie, rein, muscles, sang).
Impact sur les animaux
Pour l’ensemble des démarches expérimentales, excepté celles impliquant le carassin domestique et les goujons d’élevage (animaux d’élevage), la capture des individus sauvages sera réalisée par pêche électrique. Cette procédure de pêche peut causer un stress mais elle sera effectuée par des personnels formés et après demande d’autorisation auprès des autorités compétentes via l’utilisation de matériel spécifique respectant la législation en vigueur. Le voltage utilisé sera adapté pour causer une sédation légère et rapide des poissons qui seront ensuite transportés dans des conteneurs isothermes oxygénés puis acclimatés en laboratoire ou dans les cages en rivière pendant 7 jours minimum pour limiter le stress de capture, de transport et de captivité. Les démarches expérimentales (en laboratoire et en rivière) impliquent des expositions à des polluants qui peuvent causer des dommages mais les cocktails et doses seront relativement faibles car représentatives du milieu naturel. De plus, les durées d’exposition seront relativement courtes (21 jours maximum) pour observer des réponses physiologiques mesurables tout en limitant les dommages pathologiques potentiels infligés aux organismes d’étude et la mortalité. En effet l’objectif étant de mimer des niveaux de stress réalistes et des effets non létaux. Le reste des procédures (mesures, prises de sang, injections) aura lieu sous anesthésie de quelques minutes et devrait causer un stress limité.
Devenir
Les animaux pêchés par pêche électrique seront euthanasiés pour être disséqués post-mortem. Les animaux pêchés mais jugés de taille extrême (trop petit ou trop grand) seront immédiatement remis à l'eau après vérification de leur état après passage dans un seau de réveil.
Remplacement
L’objectif de l’étude étant de caractériser l’effet des stress multiples sur la variation des réponses physiologiques des poissons d’eau douce, l’utilisation de méthodes de remplacement (par exemple test sur cultures cellulaires) en vue de limiter le nombre d’animaux vivants utilisés dans le projet ne peut être appliquée. Néanmoins, afin de limiter le prélèvement d’individus dans le milieu naturel, des carassins seront utilisés ainsi que des goujons d’élevages pour remplacer une population sauvage (population de référence non polluée) afin d’affiner la caractérisation des processus physiologiques impliqués dans la réponse à une exposition à des stress multiples.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, un maximum d’information sera tiré de chaque individu en utilisant un maximum de mesures sur les organes pertinents. Nous avons préalablement réalisé une étude statistique pour déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser dans chaque procédure et dans chaque lot pour obtenir un résultat statistiquement probant. A posteriori, des traitements statistiques seront également effectués pour mettre en évidence des différences significatives entre les lots et les modalités d’exposition.
Raffinement
Afin de limiter le stress induit par la captivité des animaux (aquariums et cages), les individus seront maintenus en groupe de 5 à 10 individus maximum avec une densité d’environ 1 cm de poisson pour 1 L d’eau. En laboratoire, la photopériode sera fixée à 12h de jour/12h d’obscurité (lors des phases expérimentales) et la qualité de l’eau sera assurée quotidiennement via la mise en place d’un système de filtration propre à chaque aquarium et la mesure régulière des paramètres physico-chimiques. Dans le cas où certains de ces paramètres (en particulier les produits azotés) dépasseraient les optimums de chaque espèce, des renouvellements d’eau partiels seront effectués. Les aquariums d’exposition seront alimentés avec de l’eau du réseau, filtrée et stérilisée. Pour les phases de stabulation, les bacs seront alimentés par de l’eau du réseau. Des refuges seront introduits dans tous les bacs de stabulation et cages afin de limiter le stress et enrichir le milieu. Il n’est pas possible de placer des refuges dans les aquariums d’exposition en raison de l’adsorption des polluants sur les surfaces des refuges. Un suivi régulier des aquariums et des cages sera effectué quotidiennement pour surveiller l’état des animaux notamment pendant les phases d’exposition.
Choix des espèces
La pertinence de l’utilisation des poissons et plus particulièrement des 3 espèces sélectionnées se justifie par le fait que : - Le carassin domestique Carassius auratus est un animal utilisé depuis plusieurs décennies en recherche. Sa physiologie, son mode de vie et ses besoins sont connus et bien documentés. - Concernant les 2 espèces sauvages, le goujon Gobio occitaniae et la truite fario sauvage Salmo trutta trutta, ces dernières ont été sélectionnées car elles sont bien implantées dans notre zone d'étude. Comme pour le carassin, leur physiologie est connue et bien documentée. - Ces espèces ayant des exigences différentes (en termes d'habitat, de régime alimentaire, de déplacement…), elles sont exposées aux polluants de manière différente. Ainsi, les goujons seront soumis à des contaminations liées aux polluants utilisés en agriculture, alors que les truites seront soumises à des contaminations métalliques minières. Tous les poissons utilisés seront des adultes ou jeunes adultes d’une taille d’environ 10 cm (carassins et goujon adultes, truitelles jeunes adultes). Nous utilisons des adultes pour deux raisons essentielles : - la pêche d'adultes dans le milieu naturel permet de ne pas compromettre la régénération des populations sauvages - les adultes sont sexés et donc sexables. Par conséquent le sexe dans animaux étant connu, il est possible d'intégrer ce facteur de variation à notre étude statistique, pour mettre en évidence un éventuel impact du sexe dans le comportement et/ou la physiologie des animaux exposés aux contaminants.
Optimisation du protocole de marquage par fluorochrome chez l’anguille européenne (Anguilla anguilla) afin d’améliorer la détection externe des marques fluorescentes
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
750 civelles, jeunes anguilles européennes d'une espèce menacée, vont être marquées par immersion dans un colorant fluorescent, 450 tuées pour analyse et 300 relâchées dans le milieu naturel. Le marquage vise à optimiser une détection externe des marques, présentée comme un moyen de "ne plus mettre à mort d'individus" à l'avenir. Le porteur classe les atteintes en souffrance légère et les rattache au transport, au marquage et à une captivité de 180 jours. La mise à mort de 450 civelles se justifie, selon lui, par la mesure précise de la fluorescence dans leurs otolithes, qu'un dispositif portatif ne permet pas encore de lire sur l'animal vivant.
Objectifs
Face au déclin des population d’anguilles européennes, des mesures sont mises en œuvre pour reconstituer les stocks et sauvegarder l’espèce, dans le cadre du plan national de gestion de l’anguille. Des opérations de repeuplement sont réalisées chaque année : des jeunes anguilles (civelles) sont capturées en estuaire et relâchées dans les zones amont des cours d’eau côtiers. Afin d’évaluer le succès de cette pratique de repeuplement, il est nécessaire de pouvoir différencier les individus introduits ; pour cette raison, les civelles capturées sont marquées par immersion dans un colorant avant d’être relâchées. Ce colorant génère une marque fluorescente fixée durablement dans les structures osseuses des jeunes anguilles, et en particulier dans des concrétions de l’oreille interne (otolithes). Par la suite, la contribution et l’efficacité du repeuplement sont évaluées : des anguilles sont capturées dans les secteurs repeuplés puis sont mises à mort pour rechercher la présence d’une marque fluorescente dans leurs otolithes. La possibilité d’une détection externe des marques a été récemment démontrée sur des civelles et des tests réalisés en 2022 ont confirmé la présence de marques dans la mâchoire et les nageoires des civelles, détectable après 60 jours à l’aide d’un dispositif portatif. L’objectif de la présente étude est de poursuivre l’optimisation d’un protocole de marquage, permettant une détection externe des marques fluorescentes sur le long terme (6 mois).
Bénéfices attendus
La lecture externe des marques permettrait en premier lieu une simplification du protocole de détection, et ouvrirait d’autre part des perspectives intéressantes et novatrices vers la détection des marques sur animaux vivants, permettant notamment de ne plus mettre à mort d’individus, réduire le temps de lecture des marques et d’augmenter la taille de l’échantillon analysé.
Procédures
Les animaux seront soumis au marquage par immersion dans une solution de marqueur fluorescent, selon 4 traitements et un contrôle. La durée des interventions sera de 13.5 minutes pour 3 traitements (balnéations "flash") et de 6h pour le dernier traitement (balnéation longue).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables potentiels sur les animaux concernent le transport après capture, le marquage et le maintien en captivité. Toutefois, ces effets peuvent être considérés comme légers au vu de l’expérience des opérateurs dans le transport et le marquage des civelles, qui sont communément réalisés dans le cadre du programme de repeuplement.
Devenir
750 civelles seront capturées, transportées, marquées puis stabulées pendant 180 jours en aquarium puis en bassins (mésocosmes). A l'issue de la stabulation, 450 individus seront mis à mort et le restant des individus encore en vie (300 individus) sera remis en liberté. La mise à mort se justifie pour pouvoir mesurer précisément l’intensité de la fluorescence à l’aide d’un dispositif de détection portatif.
Remplacement
La civelle est l’objet d’étude et ne peut pas être remplacée pour cette expérience de recherche de fluorescence externe. Les résultats obtenus sur une autre espèce de poisson ne pourraient être transposés à la civelle, du fait de sa singularité morphologique (poisson serpentiforme), anatomique (épiderme translucide) et comportementale (activité nocturne).
Réduction
L’effectif de 750 individus (15 lots de 50 individus) tient compte de la mortalité attendue en milieu contrôlé au stade civelle (maximum 25-30%). A 3 occasions au cours du suivi (60, 120 et 180 jours), un effectif de 10 individus par lot sera analysé. Ainsi, au total 450 individus seront mis à mort et analysés, afin de prendre en compte la variabilité inter-individuelle du niveau de fluorescence, potentiellement importante si l’on se réfère aux résultats des études réalisées en 2022. Les individus non analysés seront relâchés dans le milieu naturel sur les sites de repeuplement (au maximum 300 individus).
Raffinement
Lors du transport et du marquage, la concentration en oxygène sera contrôlée et les densités d'individus dans les contenants seront faibles. Les aquariums seront enrichis à l’aide de caches permettant aux civelles de s’abriter. Les individus seront nourris, la concentration en déchets métaboliques sera surveillée et la concentration en oxygène et la température seront également contrôlées. Des changements d’eau seront réalisés si nécessaire, notamment en période de fort réchauffement estival, et une toile d’ombrage sera alors placée au-dessus des mésocosmes pour limiter le réchauffement. A l'issue de la procédure ou bien en cas d'atteinte de points limites adaptés à l'espèce (critères comportementaux d'arrêt de souffrance), les individus seront mis à mort après une anesthésie préalable.
Choix des espèces
L’anguille est une espèce menacée au niveau européen, qui fait l’objet d’un plan de conservation à l’échelle nationale. L’évaluation des pratiques de repeuplement par une méthode de détection externe non létale représente un fort enjeu pour la gestion future. Les animaux seront utilisés au stade civelle car c'est le stade utilisé en France pour réaliser les opérations de repeuplement d'anguille.
Effet de la température sur la spermatogénèse du Medaka
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
120 medakas vont être utilisés, quarante tués à l'issue et quatre-vingts réutilisés ensuite, dans des procédures déclarées de gravité légère à modérée. Les mâles sont exposés jusqu'à 32 degrés puis subissent des prélèvements de sperme répétés sous anesthésie, et les femelles sont pêchées pour décrocher à la main leurs grappes d'œufs avant d'être remises à l'eau. Le porteur indique que cette chaleur provoque un stress thermique et altère la spermatogénèse, et tue les mâles exposés qu'il ne peut plus réemployer. Il relie ce travail au réchauffement climatique et à l'aquaculture, et affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier la spermatogénèse à température augmentée.
Objectifs
Les poissons présentent une importante plasticité phénotypique (grande capacité d'adaptation) face aux variations environnementales. A l’interface entre l’environnement et l’ensemble des gènes, des molécules dites « méthyl » constituent un code dit « épigénétique » ou méthylation de l'ADN. Elles sont capables d’interagir avec l’ADN sous l’influence de l’environnement et permettre par exemple, la mise en place d'un métabolisme adapté à un changement de température. Chez la truite arc-en-ciel, une augmentation de 4°C de la température d’élevage durant la spermatogénèse entraîne des modifications de la méthylation de l’ADN des spermatozoïdes produits. Ces spermatozoïdes sont cependant fonctionnels, et donc susceptibles de transmettre leurs modifications épigénétiques à la descendance, et d’en impacter leurs performances, ou au contraire, favoriser leur adaptation à un environnement changeant. Les gènes impactés concernent la spermiogénèse (fonction de reproduction) et de métabolisme lipidique (fonction de croissance). Ces résultats soulignent la nécessité de tester, chez une espèce modèle le permettant, comment des variations épigénétiques induites au niveau des gamètes, notamment par des augmentations de température, peuvent impacter les performances des descendants, et le caractère inter-générationnel de cet effet, dans un contexte de réchauffement climatique. Le medaka est parfaitement adapté, du fait de son court temps de génération, et de l'importance des ressources génétiques disponibles. Cependant, nous devons dans un premier temps déterminer pour cette espèce, la température minimale, les temps et durée d'exposition à partir desquels un phénotype est observé sur le spermatozoïde, ceci afin de calibrer les conditions expérimentales et minimiser le nombre d'animaux utilisés par la suite, voire éviter de dépasser 30°C si cela n'est pas nécessaire. L'objectif de ce projet est donc de déterminer la température et/ou la durée d'exposition à partir desquelles une baisse de fertilité des spermatozoïdes est observée. Trois températures seront testées : 32°C, 29°C, 25°C (contrôle), et deux durées d'exposition : 1 mois et 2 mois, à un temps de la vie des individus : au stade adulte (3.5 mois). Nous testons 2 températures suboptimales car nous souhaitons trouver la plus faible variation de température pouvant créer un effet (au plus près possible de la physiologie). 29°C correspond également au +4°C déjà étudié chez la truite.
Bénéfices attendus
Nous nous intéressons au gamète mâle, comme vecteur intergénérationnel d'information sur les conditions de vie des individus (potentiellement changeantes). L'objectif à long terme du projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse des poissons à une augmentation de température, à l'échelle inter- puis trans-générationnelle, dans un contexte de changement climatique. Il s'agit donc d'évaluer leur aptitude à s'adapter au fil des générations, ou au contraire, mettre en évidence les possibles challenges de performances auxquels ils font face en étudiant plus particulièrement les effets sur les capacités reproductives. Pour les espèces d'aquaculture ces connaissances pourront influencer les pratiques d'élevages. En effet, la température de l’eau est une composante particulièrement difficile à moduler en élevage ouvert classique, et la période estivale coïncide avec des étapes clefs de la gamétogénèse chez de nombreuses espèces domestiques, dont les salmonidés. L’augmentation des températures estivales ces dernières années pose la question de la plasticité de ce processus gamétogénétique et de la façon dont les dernières étapes de la spermatogénèse peuvent être affectées. Le développement récent des élevages en système clos (eau recirculée) permet dans une certaine mesure de contrôler ce paramètre, mais les coûts de réfrigération de l’eau imposent de bien connaitre les limites de température qui permettent de maintenir le bien-être et les performances des animaux. Aborder l’impact des températures d’élevage pendant la gamétogénèse est donc un enjeu important pour l’aquaculture à la fois continentale et marine.
Procédures
Les seules interventions prévues sont des prélèvements réalisés concernant uniquement les gamètes : prélèvements de sperme, et prélèvement d'oeufs (fécondés ou non). Les prélèvements de sperme seront réalisés à 3 moments : au début de la mise en bacs expérimentaux (à 3.5 mois), 1 mois après l'exposition aux températures tests (à 4.5 mois) et 2 mois après l'exposition aux températures tests (à 5.5 mois). Ils seront réalisés sous anesthésie et durent moins d'une minute. Pour cela, après anesthésie, les poissons sont sortis de l'eau et placés sous loupe binoculaire. Grâce à une légère pression exercée sur la partie ventrale, environ 1 à 2 uL de sperme sont émis et collectés dans une pipette. Les poissons sont alors placés en bac de réveil. Les prélèvements d'oeufs auront lieu dans le cadre des tests de fécondité des mâles : à partir de 4.5 mois + 4 jours et ce, chaque jour pendant une semaine, et à partir de 5.5 mois + 4 jours et ce, chaque jour pendant une semaine. Le prélèvement des oeufs est une pratique d'élevage classique qui consiste à pêcher la femelle et à décrocher manuellement la grappe d'oeufs plaquée sur l'abdomen. La femelle est ensuite remise immédiatement dans son bac et les oeufs sont déposés dans une boîte de pétri (remplie d'eau d'élevage) pour observation et comptage. Pour ces deux procédures, les expérimentateurs sont munis de gants en latex et les animaux sont pêchés délicatement à l'aide d'une petite épuisette.
Impact sur les animaux
Un test de température a déjà été réalisé au laboratoire sur les Medaka. Celui-ci a permis de déterminer que les capacités reproductives des animaux était altérée à partir de 33°C. Pour ces raisons, nous souhaitons nous placer à 32°C. Les risques potentiels attendus : stress thermique ; modifications de la prise alimentaire et métabolisme énergéntique ; altération de la spermatogénèse ; stress de capture.
Devenir
Les 40 animaux ayant vécu à température augmentée seront euthanasiés car ils ne pourront plus être réemployés pour d'autres expériences. En revanche, les animaux élevés en conditions contrôle pourront être réutilisés.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous recherchons précisément les mécanismes intervenant pendant une spermatogénèse à température augmentée.
Réduction
Le nombre d’animaux est adapté au plus juste pour permettre des analyses statistiques fiables malgré les fortes variabilités entre les individus.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l'espèce (photopériode, qualité d'eau, densité, conditions sanitaires) à l'exception du lot de mâles exposés à 32°C. Il s'agit cependant précisément de l'objet de l'étude (effet du réchauffement) et la littérature ne montre pas de mortalité chez des médakas élevés à cette température. Les bacs seront enrichis (ajout de plantes artificielles), les animaux toujours manipulés délicatement, avec des gants en latex et pêchés avec une petite épuisette. Les mesures de taille et de poids, ainsi que les prélèvements d’œufs et de spermes sont des gestes doux, très rapides et non invasifs. Les prélèvements de sperme, nécessitant un geste précis, seront réalisés sous anesthésie pour limiter le stress des animaux. Les mesures de taille et poids seront réalisées lors de la même anesthésie et très rapidement (une minute estimée par animal, mesures poids, taille, et prélèvement du sperme compris).
Choix des espèces
Choix de l'espèce medaka Oryzias latipes : - court temps de génération en prévision d'étude d'effets inter- et transgénérationnels - spermatogénèse continue (et non saisonnière) - techniques édition génome et épigénome accessibles - ressource importante pour intégration de données bio-informatiques, bibliographie, outils moléculaires (anticorps par exemple) - spermatozoïde à histones (contrairement au zebrafish), plus proche des modèles mammifères Nous travaillerons avec des adultes de 3.5 mois car nous souhaitons étudier la spermatogénèse qui a lieu chez les mâles adultes, et la capacité des spermatozoïdes à féconder des oeufs (émis par des femelles adultes de 4.5 mois, puis 5.5 mois).
Etude comportementale des civelles (Anguilla anguilla) du site du grau de la Fourcade aux Saintes-Maries-de-la-Mer par marquage V.I.E.
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
10 000 civelles d'anguille européenne, espèce en danger critique d'extinction, vont être capturées puis relâchées dans leur milieu, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque individu est anesthésié puis reçoit sous la peau une petite quantité d'élastomère servant de marque, avant un réveil et une remise à l'eau près du lieu de capture. Le porteur indique que le marquage peut causer un stress et une gêne postopératoire de courte durée. L'objectif déclaré est de suivre le comportement migratoire des civelles pour évaluer une passe à poissons, dans une visée de conservation de l'espèce.
Objectifs
Le site du grau de la Fourcade aux Saintes-Maries-de-la-Mer ne permet pas à ce jour une migration naturelle des civelles vers la lagune du Vaccarès. L'accès à la lagune est en effet conditionnée par la gestion des martelières du grau de la Fourcade et la majorité des civelles sont actuellement capturées au sein d'une passe-piège à anguilles juxtaposée au grau. Le suivi de cette passe-piège mené depuis 2004 permet ainsi d'étudier l'évolution des arrivées de civelles et d'améliorer leur colonisation dans la lagune du Vaccarès. Le site du grau de la Fourcade sera néamoins équipé courant 2024 d'une passe à poisson couplée d'une passe à anguilles dont le but est d'améliorer la colonisation naturelle des civelles vers la lagune du Vaccarès. Le projet vise à étudier le comportement migratoire des civelles sur ce site afin de favoriser une gestion des martelières plus efficace et déterminer à terme si la passe à anguille nouvellement installée permet le franchissement des civelles vers la lagune du Vaccarès. Ces connaissances sont indispensables pour protéger cette espèce en "Danger critique d'extinction".
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apprécier l'efficacité de la future passe à anguille et ainsi nuancer les éventuelles variations de capture à la passe-piège. De plus, une meilleure connaissance du comportement de migration des civelles permettra de déterminer l'importance de la colonisation naturelle selon les conditions environnementales rencontrées et préconniser une gestion des martelières compatible avec la colonisation des civelles dans le Vaccarès.
Procédures
Sédation/anesthésie profonde (5-10 minutes), introduction d'une petite quantité d'élastomère sous la peau de l'animal à l'aide d'une seringue sous anesthésie générale (30 secondes), suivi d'un réveil et de la remise en contact avec les congénères dans un bac de stabulation (environ 2h en observation).
Impact sur les animaux
L'anesthésie, la biométrie peuvent occasioner un stress de courte durée pour les animaux au moment de leur manipulation. Le marquage par V.I.E peut induire un stress et une douleur/gêne post-opératoire de courte durée.
Devenir
Tous les individus capturés sont relâchés dans le milieu naturel, à proximité de leur lieu de capture. A chaque session de marquage, un lot témoin de 50 individus sera maintenu en couve à proximité du lieu de capture afin d'attester du bon état des individus marqués. Ces individus seront également relâchés à la fin de chaque session.
Remplacement
L'étude vise à étudier le comportement d'individus sauvages dans leur milieu naturel. Les connaissances scientifiques actuelles ne permettent pas la reproduction en captivité de l'Anguille européenne et il n'est donc pas possible de trouver de subsitut.
Réduction
Le marquage a été limité à cinq campagnes de deux sessions. Cette approche permet de limiter l'impact sur le milieu (836 000 individus capturés en moyenne à la passe-piège entre 2004 et 2021), tout en assurant un nombre d'individus suffisant pour que les résultats soient exploitables sur le plan scientifique.
Raffinement
Avant et après le marquage, de l'enrichissement est proposé aux animaux pour limiter leur stress durant leur stabulation (habitats artificiels pour se cacher, recouvrement des bacs pour un maintien dans l'obscurité, oxygénation des bacs).
Choix des espèces
Le grau de la Fourcade représente un des sites majeur du recrutement en civelles de la façade méditerranéenne française. L'anguille, classée en danger critique d'extinction, bénéficie d'un plan de gestion national, décliné à l'échelle du bassin méditerranéen par le PLAGEPOMI. Le suivi de la reconquête effective des axes de migration sur ce site à enjeu représente un fort interêt pour cette espèce. Les anguilles seront marquées au stade civelle, individus arrivant de la mer et amorçant leur phase de colonisation vers la lagune du Vaccarès. Tous les individus appartiennent à la même espèce : Anguilla anguilla.
Formation réglementaire destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales et des projets sur modèles aquatiques : Travaux pratiques sur espèces aquatiques
- Formation professionnelle
Poissons zèbres : 140
Autres poissons : 60
216 animaux aquatiques (xénopes, poissons-zèbres, carpes koï) vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée à l'issue, d'autres adoptés ou réutilisés d'une session à l'autre. Les xénopes femelles reçoivent une injection d'hormone puis un massage abdominal pour prélever des ovocytes, les poissons-zèbres un prélèvement de gamètes et une biopsie de la nageoire, le tout lors de travaux pratiques de formation. Le porteur présente ces séances comme une obligation réglementaire et emploie surtout des animaux "de réforme". Il affirme que le remplacement des animaux vivants est "impossible" pour la pratique, tout en l'évoquant pour la théorie.
Objectifs
Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procedures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de cette séance, les expérimentateurs maitriseront les aspects élémentaires de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.
Bénéfices attendus
A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leurs travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, seront autant d'éléments permettant d'améliorer la condition des animaux détenu en captivité.
Procédures
Les xénopes femelles seront soumises à une injection, sous contention d’une minute, d'hormone gonadotropine par session de travaux pratiques, le lendemain un prélèvement d’ovocyte par massage abdominal sera réalisé pour une durée de 2 minutes maximum. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes par individu (sperme et ovocytes) de manière non- invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale, l’ensemble de la manipulation n’excédera pas 10 min par individu, réalisé sous anesthésie. Les carpes koï seront soumises à une anesthésie n’excédant pas 10min.
Impact sur les animaux
La majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie par balnéation (tricaïne ou benzocaïne) limitant les sources d’inconfort pour les animaux. Le seul effet indésirable potentiel pourra it apparaître suite à la biopsie de la nageoire caudale. Bien qu'il s'agisse d'un organe capable de régénération, il présente des nocicepteurs, c'est pourquoi un analgésique sera administré en post-prélèvement. Les animaux seront manipulés à l’aide d’une épuisette, pouvant présenter une légère source de stress lors des transferts de bac à bac.
Devenir
Poisson-zèbre et carpe koï : En fin de procédure les animaux seront mis-à-mort ou adopté si leur état de santé le permet. Xénopes : Les animaux seront maintenus en vie pour être réutilisée d'une année à l'autre, les procédures etant faiblement invasives.
Remplacement
Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible. Toutefois, lors des enseignements théoriques, le recours aux méthodes alternatives (IPS, organoïdes, organes sur puces, impression 3D de tissus, utilisation d’embryons) est largement évoqué et encouragé dès que cela est possible.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (pour chaque session, 1 à 2 animaux par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires, ainsi qu’un nombre restreint d’animaux pour les démonstrations par les encadrants) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard, animaux dit de réforme : anciens reproducteurs ou individus ne présentant pas les standards commerciaux (carpes-koï), dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques. Nous nous efforcerons de réutiliser une partie des animaux d'une session à l'autre lors des sessions de TP rapprochées, les xénopes femelles seront réutilisées sur plusieurs sessions sur plusieurs années.
Raffinement
Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations, un maximum de 12 stagiaires (soit 1 formateur pour 4 apprenants) par session sera respecté, permettant un suivi des animaux au plus près et un encadrement strict des gestes techniques. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie, l'application d'un analgésique sera systématique afin de miniser toute douleur potentielle. Des points limites prédictifs stricts et adaptés au projet de formation sont mis en place et appliqués dès leur seuil atteint.
Choix des espèces
Poisson-zèbre et xénope sont les principales espèces utilisées à des fins scientifiques. Leurs facilités d'élevage, la vaste documentation disponible et la large communauté scientifique en font des modèles de choix. Les connaissances zootechniques disponibles et les caractéristiques biologiques (induction de ponte, nombres d'œufs, température, etc.) de ces 2 espèces permettent de présenter l'ensemble des manipulations élémentaires réalisées lors des procédures expérimentales mises en œuvre dans les projets de recherche. Les poissons étant un groupe paraphylétique composé d'une immense diversité d’espèces, il est important de pouvoir effectuer les manipulations sur un modèle différent. Cette formation est ouverte à une large communauté scientifique, travaillant sur un éventail d’animaux très varié. La carpe koï, poisson téléostéen d’eau froide, présente des caractéristiques complémentaires au poisson- zèbre tropical, notamment du fait de sa taille et de son écologie, elle permettra de mettre en évidence des aspects spécifiques à prendre en considération notamment lors des anesthésies. Xenopes et poissons-zèbres : les animaux utilisés seront uniquement des adultes sexuellement matures. L'ensemble des manipulations et observations doivent être réalisées sur des animaux adultes afin d'apporter aux stagiaires les meilleurs éléments de formations pour leur procédures futures, d'autre part l'induction de pontes par injection d'hormone ne peut s'effectuer que sur des femelles xénopes adultes. Carpe koï : les animaux seront des juvéniles, de l’ordre de 10 à 15 cm non-encore sexuellement différenciés
Étude préliminaire des déplacements de chevaines, brèmes, perches communes et gardons entre un refuge thermique hivernal (affluent) et le cours d’eau principal
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
24 poissons sauvages de quatre espèces (chevaines, brèmes, perches, gardons) vont être utilisés, relâchés vivants dans leur rivière plutôt que tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont capturés par pêche électrique, anesthésiés, puis reçoivent par chirurgie un émetteur acoustique implanté dans l'abdomen et une injection d'antibiotique. Le porteur suit leurs déplacements entre un affluent-refuge et le cours principal pour comprendre l'effet du changement climatique sur ces regroupements hivernaux. Il affirme que le comportement en milieu naturel ne peut s'étudier ni en conditions contrôlées ni par modélisation.
Objectifs
Évaluer l’impact du changement climatique sur les écosystèmes aquatiques continentaux passe par la connaissance des stratégies de sélection de l'habitat des espèces et de l’accessibilité des habitats. Ces stratégies sont dépendantes des espèces et du stade de développement des individus. La dimension thermique de ces habitats a été peu étudiée jusque là. Si la notion de refuge thermique froid estival a rapidement été identifiée, notamment dans le cadre de la gestion des espèces d’eau froide, des études récentes ont pu mettre en évidence l’importance de refuges chauds hivernaux, en particulier pour la croissance individuelle. Par ailleurs, des observations de terrain récentes ont mis en évidence la présence de "hot spots" plurispécifiques saisonniers de forte densité de poissons. Ces regroupements massifs pourraient jouer un rôle majeur dans la dynamique des populations et méritent à ce titre d’être étudiés précisément. Le projet testera l'hypothèse que les regroupements hivernaux de poissons sont déterminés par des discontinuités thermiques entre les affluent et la rivière principale lors des pics de froid hivernaux. Le objectifs seront (i) de renseigner les mouvements des poissons entre le cours principal et les affluents refuges en période hivernale, (ii) de mettre en évidence les déterminismes environnementaux de ces mouvements (température, débit) et (iii) d'évaluer l’impact d’obstacles à la migration sur ces mouvements. La réalisation du projet nécessite la capture de poissons lors du regroupement dans l'affluent, leur marquage par implantation chirurgicale d’un émetteur acoustique et le suivi de leurs déplacements par télémétrie active (recherche mobile-active sur le secteur d’étude). Quatre espèces de poissons seront ciblées du fait de leur présence avérée dans le regroupement et du fait de la diversité des stratégies d'utilisation de l'habitat qu'elles représentent.
Bénéfices attendus
L’hypothèse principale du projet est que les regroupements hivernaux de poissons constatés dans des affluents sont déterminés par des discontinuités thermiques entre ces affluents et le cours principal durant les pics de froid hivernaux. L’expérimentation de suivi par télémétrie acoustique active permettra de mieux comprendre l’arrivée des poissons dans un affluent et la destination (dispersion du banc) de ces poissons dans le cours principal. Ce projet apportera des connaissances essentielles à propos de la répartition spatiale et temporelle des poissons, notamment en cas de stress thermique. Une meilleure compréhension des besoins de connectivité entre tous les habitats fonctionnels (refuge, alimentation, reproduction) pour les poissons permettra de (i) mieux définir et gérer la continuité piscicole et (ii) protéger les zones refuges (refuges thermiques par exemple). Dans un contexte de changement climatique, la présence de refuges thermiques pourrait s’avérer déterminante pour la résilience de certaines populations. L’étude se focalise sur quatre espèces de poissons dont les exigences écologiques sont différentes, afin de suivre les déplacements des poissons après le regroupement dans le refuge thermique.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés individuellement et un acte chirurgical simple d'environ 5 min permettra d’implanter un émetteur acoustique dans la cavité générale. Le poids de l’émetteur est très faible par rapport à la masse du poisson marqué. Le poisson anesthésié est maintenu en immersion, de manière à ce que ses branchies soient constamment irriguées par la solution d’anesthésie, lui permettant de continuer à respirer. Enfin, une injection intramusculaire d’antibiotique à large spectre et longue action est réalisée pour limiter le risque d’infection.
Impact sur les animaux
Les poissons subiront un premier stress lors de leur capture, inhérent à la pêche électrique. Cette technique est réputée pour engendrer peu de mortalité. Ensuite le stress peut être généré par la manipulation des individus et par l’acte chirurgical réalisés par les expérimentateurs. Les conditions de stabulation et balnéation-sédation et une surveillance continue des poissons permettront de limiter au maximum le stress des individus manipulés. En cas de blessure ou de stress manifestes, les poissons seront mis à mort par immersion dans un bac avec un sur-dosage d'anesthésique.
Devenir
Tous les animaux capturés et tous les animaux opérés seront rapidement relâchés vivant dans leur milieu d’origine.
Remplacement
Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné qu’il s’agit d’étudier le comportement des individus en milieu naturel. De ce fait il n’est pas envisageable de réaliser cette expérimentation sur d’autres individus ni de réaliser ces expérimentations en conditions contrôlées. L’absence de connaissances quantitatives sur les déplacements annule également toute possibilité de modélisation. Le modèle poisson issu du milieu naturel est pertinent pour cette étude et ne peut donc pas être remplacé pour répondre à la problématique posée.
Réduction
Il s’agit d’une étude préliminaire et le nombre de poissons étudié est minimisé tout en assurant l’observation d’un nombre suffisant d’individus pour émettre des premières hypothèses à propos de leurs comportements. De ce fait, les analyses sont souvent descriptives et réalisées à l’échelle individuelle, tant la variabilité inter-individuelle des comportements est forte. Un petit nombre d’individus n’est donc pas un problème pour ce genre d’étude. Pour cette expérience, n=24 individus seront utilisés au total et relâchés vivants dans leur milieu d’origine. Ce total, qui correspond à un effectif de six individus prélevés (idéalement trois juvéniles et trois adultes) pour chacune des quatre espèces cibles sera suffisant pour effectuer des analyses biologiques classiques en télémétrie (comportement de déplacement) en limitant au maximum le nombre d’individus manipulés, permettant ainsi de respecter la règle réduction des 3 R.
Raffinement
Les poissons seront capturés et placés en stabulation le plus rapidement possible, dans des bacs de 80 L remplis d’eau de la rivière d’origine, renouvelée toutes les heures. L’expérimentation étant prévue en période froide (décembre – février), la température et l’oxygène dissous seront peu limitants. Un bulleur permettra d’assurer une parfaite oxygénation de l’eau des bacs. Le remplacement fréquent de l’eau des bacs empêchera le risque de choc thermique entre bacs ou entre milieu naturel et bacs. D’autre part les poissons ciblés resteront peu de temps dans ces bacs. Les autres poissons capturés (espèces non ciblées ou de masse trop faible) seront remis dans leur milieu d’origine directement. Les bacs seront munis de couvercles diminuant lumière, stress et tentative de fuite. L'anesthésie permettra de limiter la souffrance de l'animal lors de la mise en place de la marque. Cette marque ne dépassera jamais 2% de la masse du poisson dans l'air. Ces marques permettent de localiser individuellement les poissons sans obligation de les recapturer pour récupérer des données. Enfin une antibiothérapie préventive en intramusculaire permettra pour chaque individu marqué d'éviter les risques d'infection.
Choix des espèces
L’objectif est de caractériser le comportement de déplacement de poissons sauvages en milieu naturel entre le cours principal d’un fleuve et son affluent, où s’opèrent des regroupements hivernaux. Ainsi, seules les principales espèces déjà observées dans l'affluent sont pertinentes pour l’expérimentation. Les quatre espèces ciblées et les stades de développement retenus pour chaque espèce (juvénile et adulte) représentent différentes stratégies d’utilisation de l’habitat.
Réponses physiologiques et comportementales de la sardine face à une baisse en oméga-3 dans l’alimentation et une hausse de température des océans chez la sardine Sardina pilchardus.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
360 sardines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 180 tuées pour prélever leurs tissus et 180 gardées vivantes pour observer une ponte. Chaque poisson subit douze biométries sous anesthésie et deux biopsies musculaires, puis des mesures de métabolisme et un test de fuite face à un prédateur, sous un régime pauvre en oméga-3 et une eau réchauffée. Le porteur étudie l'adaptation de l'espèce au changement climatique, en vue de modéliser l'état des stocks. Il affirme qu'il est "indispensable" d'expérimenter sur cette espèce, dont la physiologie serait mal connue.
Objectifs
L'étude vise à comprendre comment les fonctions physiologiques et comportementales d’une espèce de petit poisson pélagique, la sardine Sardina pilchardus, s’ajustent face aux conditions environnementales. En particulier, l’objectif est d’étudier comment sont impactées les performances physiologiques de cette espèce de fort intérêt écologique et halieutique en termes de croissance, taux métaboliques, et comportement anti-prédateur, face à un scénario futur couplant une baisse en oméga-3 dans l’alimentation et une hausse de température des océans.
Bénéfices attendus
Les données physiologiques et comportementales obtenues permettront de mieux comprendre les réponses physiologiques et comportementales de la sardine, espèce dont la physiologie est mal connue, dans un contexte de changement climatique. Aussi, les données obtenues au niveau de l’individu seront utilisées par la suite dans notre projet pour modéliser les réponses au niveau de la population. Ceci permettra à terme de mieux comprendre la répartition des stocks, mais aussi la qualité des stocks en termes d’oméga 3, dans un contexte de changement climatique.
Procédures
- Tout au long du conditionnement, nous suivrons le taux de croissance individuel à travers des biométries bimensuelles. Chaque poisson (n=360) subira donc 12 biométries d’environ 2 minutes chacune. - Tout au long du conditionnement, nous suivrons également la composition en acides gras individuellement sur les 360 individus par (1) une première biopsie réalisée au T0 du conditionnement sur le flanc gauche, au-dessus de la ligne latérale, (2) une seconde biopsie musculaire réalisée 2 mois après le début du conditionnement, cette fois sur le flanc droit, au-dessus de la ligne latérale. Chaque poisson (n=360) subira donc 2 biopsies, qui dure chacune environ 5 minutes. - Entre 4 et 6 mois après le début du conditionnement, les performances physiologiques et comportementales des individus seront évaluées: • A l’issue de 4 mois de conditionnement, les taux métaboliques des 360 individus, c’est à dire la quantité d’oxygène consommée par unité de poids et de temps, seront mesurés par respirométrie 4 fois par bassin, sur 24h (durée totale estimée pour tester les 12 bassins : environ 2 semaines). • A l’issue de 5 mois de conditionnement, les performances de fuite seront mesurées sur 180 individus, à raison de 5 individus à la fois, par analyse vidéo sur 24h, (durée totale estimée pour tester les 180 individus : environ 1 mois). La réponse de fuite mesurée en tant que telle ne dure que quelques secondes, mais les animaux seront gardés 24h en tout dans le bassin test. • Un prélèvement sanguin, durant environ 3 minutes, sera effectué à la suite des mesures de réponses de fuite, c’est-à-dire environ 6 mois après le début du conditionnement, sur ces mêmes 180 individus. - Des mises à jeun de 24h seront effectuées avant chaque biométrie, biopsie, mesure de respirométrie et mesure de réponse de fuite
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus concernent : (1) la biométrie qui nécessite une anesthésie puis une contention des animaux, et qui peut alors générer un stress léger durant environ 3 minutes par poisson, (2) les biopsies qui nécessitent une anesthésie, une contention, et une cicatrisation, et qui peuvent alors générer une douleur et un stress modéré pendant environ 5 minutes, (3) la respirométrie (mesure des taux métaboliques) peut générer un stress léger si le niveau d’oxygénation du bac descend en dessous du seuil de 75% d’oxygène, considéré comme la limite de la normoxie. Ce stress n’excèdera pas 15 minutes, qui est la durée durant laquelle la pompe permettant le renouvellement d’eau reste fermée pour permettre la mesure de consommation en oxygène des individus, (4) la réponse de fuite peut générer un stress modéré durant environ 5 minutes, lié au fait que nous stimulons les individus avec un stimulus expérimental mimant un prédateur, et cherchons à générer une réponse de fuite, (5) le prélèvement sanguin lié à l’anesthésie et à la contention peut générer un stress modéré et une douleur pendant environ 3 minutes, (6) le cumul des actes sur un même individu peut générer un stress sévère d’une dizaine de minutes, notamment du fait que les prises de sang seront effectuées juste après la mesure de réponse de fuite.
Devenir
A l’issue de la procédure, 180 animaux ayant subi le test de de fuite seront mis à mort pour prélever leurs différents tissus nécessaires à l'analyse des acides gras, à la mesure de l'expression de gènes (foie, muscle, cerveaux, yeux), ainsi qu'à la détermination de l’âge (otolithes). Les 180 autres seront gardés en vie et replacés dans un bassin commun pour voir si une ponte naturelle a lieu, puisque la période correspondra à une période de ponte en milieu naturel, et que des pontes spontanées ont déjà été obervées dans d'autres laboratoires à cette période.
Remplacement
Cette étude vise à caractériser les réponses physiologiques et comportementales de la sardine (croissance, synthèse des acides gras, taux métaboliques, évitement des prédateurs) face aux changements environnementaux. Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser le résultat d’interactions complexes entre différents tissus et fonctions, il n’est pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement. En effet, les processus étudiés s’appliquent à l’organisme vivant, dans son intégrité et toute sa complexité.
Réduction
Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte-tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans cette étude. L’estimation a été faite à partir de données de variabilités (notamment de croissance, de données d’expression de gènes, et de mesures d’acides gras) obtenues dans des expériences préalables sur d’autres espèces moins grégaires (prise en compte de la puissance des tests statistiques). Pour permettre d’utiliser un minimum d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les mesures de respirométrie et de réponses de fuite. Pour tester l’effet du conditionnement sur les variables étudiées, nous utiliserons des tests de comparaison de moyennes du type ANOVA à un facteur et ANOVA à mesures répétées.
Raffinement
Les mesures de raffinement tiennent compte des contraintes zootechniques et notamment de la densité minimale d’animaux requise pour permettre aux animaux d’exprimer les meilleurs répertoires physiologiques et comportementaux possibles. Lors des marquages, des biométries, des biopsies, et prises de sang, les poissons à jeun seront sédatés légèrement par injection directement dans leur bac d’origine d'un anesthésiant pour limiter leur stress et faciliter la pêche. Ils seront ensuite délicatement pêchés à l’aide d’un bécher opaque, pour limiter la manipulation des animaux et la perte des écailles (les sardines étant particulièrement sensibles aux manipulations), puis transvasés dans un seau d'anesthésiant. Ce bain d’anesthésiant contiendra également une solution à base d’aloé vera qui permet de former une petite pellicule sur la peau des poissons limitant ainsi la perte des écailles et les lésions dues à la manipulation. Afin de favoriser une récupération rapide de la biopsie, une incision superficielle de 5 mm de la peau au-dessus de la ligne latérale après asepsie permettra au punch à biopsie d’atteindre le muscle sans enlever de peau. A la suite de la biopsie, un antiseptique puis une goutte de colle chirurgicale recommandée par notre vétérinaire référent seront appliquées sur la zone incisée. Pour la mesure des taux métaboliques par respirométrie, l’ensemble du montage expérimental sera placé derrière un rideau, et le système mis en place directement dans les bassins permettra d’éviter aux individus le stress d’un transport, et de ressentir les modifications de changements cycliques du régime d’écoulement. Le niveau d’oxygénation du bassin sera contrôlé en permanence et ne descendra pas en dessous de 75% de saturation en oxygène, considéré comme la limite de la normoxie. Les animaux seront en surveillance permanente. Ils seront retirés de la procédure dès que le point limite sera atteint (les points limites sont décrits dans l’item prévu à cet effet). Pour le test de fuite, qui génère un stress qui est très souvent rencontré en milieu naturel, chaque individu ne sera testé qu'une seule fois. Le poisson sera complètement isolé de l’environnement extérieur, et son comportement sera observé en permanence par vidéo.
Choix des espèces
Le projet se focalise sur la sardine (Sardina pilchardus), petit poisson pélagique d'intérêt écologique et économique. L'étude vise à comprendre comment les fonctions physiologiques et comportementales de cette espèce de petit pélagique s’ajustent face aux conditions environnementales. Il est donc indispensable d'expérimenter sur cette espèce. Stade adulte de première année (20 g et 14 cm environ). Il s’agit du stade qui permet le meilleur taux de survie après la pêche en milieu naturel. Grâce à leurs sonars, les pêcheurs sont capables, avant même de jeter le filet à l’eau d’avoir une idée de la taille des individus du banc et donc de savoir s’ils correspondent à ceux que l’on cherche. Aussi, la période de juin nous assure de trouver des individus d’un an environ. L’âge exact des individus ne pourra toutefois être confirmé qu’après sacrifice et prélèvement des otolithes, à l’issue de l’expérience.
Formation réglementaire destinée aux personnes concevant ou réalisant des procédures expérimentales et des projets sur modèles aquatiques : Travaux pratiques sur espèces aquatiques
- Formation professionnelle
Autres poissons : 240
800 poissons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie réutilisée ou adoptée et environ 450 tués. Des poissons zèbres subissent un prélèvement de gamètes et une biopsie de la nageoire sous anesthésie, tandis que des carpes koï et poissons rouges sont manipulés par les stagiaires, non pour produire des connaissances mais pour entraîner de futurs expérimentateurs. Le porteur décrit une formation réglementaire encadrée par un arrêté et censée améliorer le bien-être des animaux non-humains détenus. Il affirme que le remplacement des animaux par un modèle est "impossible" lors des travaux pratiques.
Objectifs
Les formations concepteurs sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Cet aspect pratique, à but éducatif, doit donc permettre aux stagiaires futurs concepteurs ou applicateurs de procedures expérimentales de se familiariser avec les manipulations élémentaires sur les principales espèces aquatiques utilisées à des fins scientifiques. A l'issue de cette séances, les expériementateurs maitriseront les aspects élémentaire de zootechnie et seront en mesure de réaliser des anesthésies et des mises à mort dans le respect de la réglementation en vigueur.
Bénéfices attendus
A l'issue de la formation les stagiaires seront réglementairement formés, auront acquis les connaissances et techniques leur permettant de garantir le maintien du bien-être animal dans le cadre de leur travaux de recherche scientifique. La prise en charge de la douleur, l'identification précoce des signes cliniques des animaux, seront autant d'élements permettant d'améliorer la condition des animaux détenu en captivité.
Procédures
Les carpes koï/poissons-rouges et les poissons-zèbres seront soumis à une anesthésie. Les carpes koï ne seront pas soumises à des prélèvements. Les poissons-zèbres seront soumis à un seul prélèvement de gamètes (sperme et ovocytes) de manière non-invasive, et une biopsie d'une faible portion de la nageoire caudale. La durée des interventions ne devra pas excéder 2 minutes pour les femelles et 4 minutes pour les mâles. Dans le cas de poissons-zèbres gardés d'une session sur l'autre, nous veillerons à ce que le lot d'individus qui est déjà passé en procédure n'en subisse pas une deuxième et ne soient utilisés que pour la mise en reproduction.
Impact sur les animaux
L'ensemble des manipulations réalisées par les stagiaires est encadré par des professionnels et un vétérinaire spécialisés sur les espèces aquatiques. La majeure partie des manipulations sera réalisée sous anesthésie. L'anesthésie peut être considérée comme une nuissance en tant que telle. Ainsi, celle-ci n'excédera pas 10 minutes au total. Le temps de recouvrement de l'anesthésie est en général rapide et le poisson reprend ses comportements natatoires rapidement. Les manipulations faites sous anesthésie, à savoir le fin-clip et le prélèvement de gamète, sont considérées aussi comme des nuisances. Parmi les effets indésirables potentiels nous pouvons lister : comportement d'aversion pour l'anesthésique, douleur suite à la biopsie, comportements de stress (tels que la désorientation) suite au réveil ou à la manipulation à l'épuisette. Concernant la biopsie de la nageoire caudale (fin-clip) : Bien qu'il s'agisse d'un organe capable de régénération, la nageoire caudale présente des nocicepteurs, c'est pourquoi un analgésique sera administré en post-prélèvement.
Devenir
carpe koï/poisson-rouge : En fin de procédure les animaux seront mis à mort ou adoptés si leur état de santé le permet. Poisson-zèbre : en cas de sessions rapprochées, les animaux seront maintenus en vie et réutilisés pour la mise en reproduction. Si les sessions sont trop éloignés, les poissons-zèbres seront mis à mort ou adoptés si leur état de santé le permet.
Remplacement
Dans le cadre de la réglementation, lors de séances de Travaux Pratiques le remplacement des animaux par un modèle alternatif est impossible.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés est calculé au plus juste (un animal par espèce et par binôme/trinôme de stagiaires) et la quantité est toujours adaptée au nombre de stagiaires. Nous utiliserons dans la mesure du possible des animaux adultes issus de l'élevage standard (animaux dit de réforme) dont le devenir est la mise à mort dans le but de ne pas produire d'animaux destinés exclusivement à la réalisation de ces travaux pratiques.
Raffinement
S’agissant d’une formation réglementaire soulignant les bonnes pratiques zootechniques, un soin particulier sera apporté à l’enrichissement de l’environnement (ajout d’éléments de décors, pondoirs avec une plage etc.), des éléments d’enrichissement alimentaire (zooplanctons) seront également apportés (1 fois par jour si possible). Une grille de score pour la détection des points limites sera utilisée, que ce soit lors des procédures mais aussi lors de l'observation quotidienne des animaux. La grille de score regroupe différents paramètres à observer chez le poisson (apparence physique, respiration, comportements alimentaire, social et natatoire) et donne un score aux problèmes observés. En fonction du score obtenu, l'animal va soit être monitoré très attentivement, soit soigné, soit euthanasié. Un minimum de 3 formateurs expérimentés sera présent en permanence lors des séances de manière à encadrer au plus près les stagiaires lors des manipulations. Une attention toute particulière est portée pour la diminution des contraintes exercées aux animaux, la majeure partie des manipulations sera réalisée sous anethésie.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est la principale espèce utilisée à des fins scientifiques. La facilité d'élevage, la vaste documentation disponible et la large communauté scientifique en font un modèle de choix pour la recherche. Les connaissances zootechniques disponibles et les caractéristiques biologiques (facilité de reproduction, nombres d'œufs, température, etc.) de cette espèce permettent de présenter de manière optimale l'ensemble des manipulations élémentaires réalisées lors des procédures expérimentales mises en œuvre dans les projets de recherche. La carpe koï est un poisson téléostéen d’eau froide, présentant des caractéristiques complémentaires au poisson-zèbre tropical, notamment du fait de sa taille et de son écologie. Il en va de même pour le poisson rouge. Poissons-zèbres : les animaux utilisés seront uniquement des adultes sexuellement matures. L'ensemble des manipulations et observations doivent être réalisées sur des animaux adultes afin d'apporter aux stagiaires les meilleurs éléments de formations pour leur procédures futures. Carpes koï : les animaux seront des juvéniles, de l’ordre de 10 à 15 cm non-encore sexuellement différenciés. Poissons-rouges : les animaux seront des adultes de réforme.
Description d’un protocole de perfusion-fixation trans-cardiaque chez les poissons téléostéens pour l’étude de cellules souches du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
432 poissons de plusieurs espèces vont être utilisés, mis à mort sous anesthésie profonde par la perfusion d'un fixateur chimique dans le cœur. La procédure est finale et ne vise pas à produire des connaissances biologiques nouvelles mais à mettre au point et publier un protocole de fixation adapté aux petits poissons. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale ne permet d'étudier un tissu par immuno-histologie ou microscopie électronique, et que la qualité de fixation obtenue réduira à terme le nombre d'individus utilisés. Les espèces concernées sont des poissons zèbres, médakas, astyanax et cichlidés, étudiés à trois stades de développement.
Objectifs
La qualité de la fixation est cruciale pour le succès des protocoles histologiques. L’efficacité de la fixation par immersion dans le fixateur est limitée par la taille de l’échantillon considéré ; de par la lente diffusion de la molécule fixative au centre du tissu. De plus, la fixation-perfusion cardiaque permet une perfusion immédiate du fixateur à travers la circulation sanguine. Actuellement, dans les études chez les tétrapodes, la fixation-perfusion cardiaque est la technique standard dans les études histologiques. Enfin, l’avantage de la perfusion cardiaque est impérative lorsque l’homogénéité de fixation est cruciale comme pour les études d’épitopes labiles en immunohistologie ou dans les expériences de microscopie électronique. Alors qu’il existe de nombreuses publications décrivant la perfusion cardiaque pour les tétrapodes, aucune n’est adaptée aux poissons. Ce protocole permet de réaliser la dissection et la perfusion-fixation cardiaque chez les poissons téléostéens, les poissons zèbres, les médakas et les cichlidés.
Bénéfices attendus
Tout d’abord ce projet concerne l’étude des régions des cellules souches du toit optique chez les téléostéens. D’autre part, la présente demande d’autorisation de projet permettra de publier un protocole de perfusion-fixation adapté au petits poissons téléostéens qui manque actuellement à la communauté scientifique. De plus, la très bonne fixation que permet la perfusion permettra de réduire grandement le nombre d’individus utilisé pour les expériences d’immuno-histologie et de microscopie électronique. En effet comme tous les tissus sont parfaitement fixés en plus du cerveau, ceux-ci peuvent être tous étudiés dans d’excellentes conditions éventuellement par différentes équipes et pour différents projets.
Procédures
Les poissons ne seront soumis qu’à l’unique procédure décrite dans cette demande d’autorisation de projet. Cette procédure est finale et comporte la mise à mort sous anesthésie profonde par la perfusion-fixation intra-cardiaque de fixateur liquide (formaldehyde et/ou glutaraldéhyde). La procédure doit être réalisée en 3 à 5 minutes comptées après que le poisson est sorti du mélange anesthésique.
Impact sur les animaux
Les nuisances concernant un lot de poissons avant la mise à mort par perfusion-fixation peuvent être dues à : 1- Leur déplacement de l’animalerie vers le laboratoire de perfusion ; 2- Les poissons étant perfusés un par un, la pêche au filet du poisson dans son aquarium pour le mettre dans l’aquarium d’anesthésie peu stresser le poisson concerné et brièvement ses congénères, cet opération est réalisée environ en une minute ; 3- Le pincement la queue du poisson pour tester du niveau de profondeur de l’anesthésie, puis lorsque on teste une seconde fois l’anesthésie en positionnant les aiguilles de contention. Passé ce dernier stade et après la dissection du cœur, le poisson est mis à mort par la procédure de perfusion-fixation.
Devenir
L’ensemble des poissons de ce projet seront soumis à une anesthésie profonde suivie par la perfusion-fixation intra-cardiaque de fixateur liquide (formaldehyde et/ou glutaraldéhyde. Cette procédure est finale.
Remplacement
Il n’y a aucune alternative non animale pour étudier un tissu biologique par immuno-histologie ou par microscopie électronique. Notre étude nécessite un échantillonnage d'espèces proches phylogénétiquement et dans le cadre de notre projet d’étude comparée, ces espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées.
Réduction
Pour ce projet, le nombre de poisson prévu a été calculé dans le but le réduire au minimum. Ce type d’étude histologique et de microscopie électronique ne nécessite pas en elle-même un nombre statistique d’individus étudiés. De plus, l’établissement du protocole de perfusion-fixation aboutira à une réduction du nombre d’individus utilisé de fait de la qualité de la fixation obtenue dans la communauté des chercheurs travaillant sur les petits téléostéens.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être des poissons sera assuré par les zootechniciens compétents de l’institut. Pour les poissons élevés à l’institut (zébrafish, médakas, astyanax), les individus resteront dans l’animalerie jusqu’à ce que l’ensemble des équipements nécessaires soient en place. Comme indiqué ci-dessus, les individus prévus pour une journée de perfusion, seront amenés dans une zone de stabulation proche mais suffisamment éloigné de la zone de perfusion pour que les bruits ne génèrent pas de stress. Puis les poissons seront prélevés un par un puis déplacé près de la zone de perfusion et anesthésiés loin de la zone de stabulation. Pour les cichlidés qui ne sont pas encore élevés au laboratoire mais qui sont achetés en animalerie, les jours de perfusion seront adaptés à leurs livraisons, c’est-à-dire qu’ils seront perfusés le jour de leur arrivée au laboratoire afin que leur stress du voyage ne se poursuive pas inutilement.
Choix des espèces
D’une part, les espèces zébrafish, médakas et astyanax sont reconnus par un grand nombre de publications comme des poissons modèles pour les analyses neuro-anatomiques étudiant les structures cérébrales de téléostéens à petits cerveaux. D’autre part, des espèces moins connues de cichlidés présentent des comportements complexes (émotions, motivation, apprentissage) et présentent de plus grand cerveaux (Amatitlania nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra). Notre projet vise à réaliser une étude comparative phylogénétique entre toutes ces espèces du point de vue neuro-anatomique, immuno-histologique et comportemental. L’avantage du choix de ces espèces est que certaines sont relativement proche phylogénétiquement mais qu’elles présentent a la fois des différences importantes entre leurs structures cérébrales. Pour ces études nous aurons donc besoin de procéder à ces comparaisons à la fois comportementales, anatomiques et immuno-histologiques. Pour toutes ces espèces nous avons donc besoin de valider le protocole de perfusion-fixation trans-cardiaque. Pour les espèces de zébrafish, médakas et d’astyanax nous étudions trois stades de développement (3 semaines, 1 mois et 3 mois) car nous cherchons à connaître le rôle des niches de cellules souches dans le développement du toit optique une structure du cerveau des téléostéens. Les cichlidés nous intéressent pour leurs capacités comportementales de haut niveau et seul le stade adulte nous intéresse pour cette étude.
Evaluation du potentiel effet perturbateur endocrinien de substances et d’effluents sur des poissons sexuellement matures
- Protection de l’environnement
Autres poissons : 8320
11 880 poissons, poissons zèbres et autres espèces, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère. Ils sont maintenus vingt et un jours dans une eau contenant des substances chimiques ou des effluents, avec des effets que le porteur décrit comme irréversibles, changement de sexe, baisse de la fécondité et modification du comportement. Les poissons exposés sont tués à la fin de l'essai, ceux des groupes témoins pouvant être réutilisés. Le porteur justifie le recours à l'animal par l'absence de test alternatif validé par l'OCDE et par la conformité réglementaire de son activité.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer l’impact des substances chimiques sur le système endocrinien des groupes de poisson exposés, composés de mâles et de femelles sexuellement mâtures, sur une durée limitée de leur cycle biologique (21 jours).
Bénéfices attendus
Le projet visant à évaluer l’effet néfaste des substances et effluents testés sur la santé des organismes aquatiques, il participe activement à la protection et la préservation de l’environnement.
Procédures
Pas de prélèvements prévus sur animaux vigiles. L'exposition se fait via le milieu d'essai, les animaux baignants dans des concentrations en substance maintenues constantes durant 21 jours tout au long des procédures.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont les suivants : - Changement de sexe des organismes exposés (par exemple : les femelles peuvent développer des caractères sexuels masculins, les mâles peuvent produire de la vitéllogénine,…) ; - Diminution du nombre d’œufs pondu par la femelle et/ou diminution de la qualité du sperme chez le mâle ; - Diminution du taux de fécondité ; - Changement du comportement pouvant impacter l’ensemble des activités métaboliques des poissons exposés (par exemple : diminution de l’appétit, aggresivité,…) ; L’ensemble de ces nuisances seraient irréverssibles, même si les poissons ne sont plus exposés.
Devenir
Les poissons issus du contrôle et du contrôle solvant pourront être réutilisés. Les poissons exposés à des substances chimiques seront mis à mort à la fin de la procédure. Lorsque des prélèvements terminaux sont réalisés sur les organismes, tous les organismes sont mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives non animales comprennent : les méthodes in sillico (références croisées, modèle mathématique prédictif tel que le modèle « Quantitative Structure-Activity Relationship ») ; les méthodes in vitro (comprenant les tests sur lignées cellulaires ou sur organoïdes) ; et les recherches bibliographiques (partage de données entre industriels, Fiches de Données de Sécurité). Malheureusement les méthodes ci-dessus ne peuvent être appliquées pour plusieurs raisons : Premièrement, l’insuffisance de données disponibles pour les molécules testées. Les méthodes in sillico ont une forte dépendance aux bases de données disponibles concernant la substance d’essai (notamment aux fiches de données de sécurité). Néanmoins dans le cadre de notre activité, ces données sont absentes ou insuffisantes pour permettre d’établir des modèles robustes. De plus certains processus, comme les effets sur le comportement ou les effets à long termes, sont difficiles à paramétrer dans ces modèles. Deuxièmement, le manque de concordance entre les lignées cellulaires seules et les organismes complets. Les méthodes in vitro ne peuvent prendre en compte l’ensemble des interactions complexes tissus-organes ce qui empêche de connaitre l’effet global d’une molécule sur un organisme. Troisièmement : les limites expérimentales. Dans le cas d’utilisation de culture cellulaire, le milieu de culture peut en lui-même constituer un biais. En effet, il peut potentiellement interagir avec les xénobiotiques et empêcher, ou aggraver, leur toxicité ce qui ne permet pas de statuer sur son danger réel en cas de rejet dans l’environnement. Dernièrement, la validité réglementaire des méthodes alternatives. La mise sur le marché européen des produits de consommations s’appuie sur des règlements adoptés au sein des pays membres de l’Union Européenne. Malheureusement à ce jour, aucun test alternatif n’a été standardisé et intégré aux normes de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economique) concernant les perturbateurs endocriniens. L’activité de l’établissement s’appuyant sur les normes de l’OCDE, et les Bonnes Pratiques de Laboratoires, l’utilisation de méthodes alternatives non standardisés peut conduire à une invalidité des études auprès des instances réglementaires. Par conséquent, pour les raisons citées, il n’est pas encore possible de remplacer l’expérimentation animale au sein de notre établissement.
Réduction
Comme cité plus haut, l’établissement utilisateur suit les normes de l’OCDE dans le cadre de son activité. Ces normes intègrent les règles des 3R et définissent un nombre d’organisme le plus réduit possible tout en garantissant la robustesse des tests statistiques. Concernant la partie statistique, celle-ci est détaillée dans deux documents : 1) la norme relatif au projet (par exemple, pour le présent projet, il s’agit de l’annexe 8 de la norme OCDE 229 montré en Figure 1), et 2) le guide « Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, OCDE Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No.54 ». De plus, avant de démarrer l’essai préliminaire, une veille bibliographique est réalisée. Si cette veille permet de déterminer la Concentration Maximale Tolérée, et donc la gamme de concentration de l’essai définitif, alors l’essai préliminaire n’est pas réalisé. Dans le cas contraire, les organismes témoins de l’essai préliminaire peuvent être réutilisés dans l’essai définitif.
Raffinement
Les mesures visant à réduire les nuisances sur le bien-être des animaux durant la procédure sont les suivantes : 1) Les organismes sont acclimatés pendant deux semaines avant le début de la procédure afin de réduire le stress lié au changement de conditions de maintien (passage des conditions d’élevage aux conditions expérimentales) ; 2) Les conditions environnementales (température, luminosité, paramètres physico-chimiques de l’eau) sont réglées de manière optimales. Elles sont strictement maintenues et sont contrôlées régulièrement afin d’éviter toutes variations environnementales pouvant impacter le bien-être des organismes ; 3) Une ronde quotidienne est mise en place et permet d’observer quotidiennement les organismes afin d’évaluer leur état de santé ; 4) Une feuille de points limites a été établie afin de détecter le plus précocement possible d’éventuels signes de souffrance. Si l’organisme dépasse un certain seuil, ce dernier est retiré du test et mis à mort .
Choix des espèces
Danio rerio, Oryzias latipes et Pimephales promelas sont des espèces recommandées par l’OCDE. En effet, elles sont reconnues comme étant des espèces modèles en biologie, c’est-à-dire qu’elles possèdent des qualités importantes pour la recherche dont : 1) une biologie bien connue (dimorphisme sexuel bien documenté, génétique maîtrisée) ; 2) elles sont faciles à maintenir en élevage et à faire se reproduire (descendance nombreuse, développement rapide) ; 3) elles sont économiquement accessibles et faciles à manipuler en expérimentation (petite taille) ; 4) elles sont robustes (résistance à la consanguinité, aux maladies et aux stress environmentaux) ; et 5) les résultats expérimentaux obtenus avec ces espèces sont transposables à d’autres poissons d’eau douce. L’ensemble de ces critères montre que ces espèces sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisant compte tenu de l’activité de l’établissement utilisateur. Des poissons adultes, sexuellement mâtures et identifiables doivent être utilisés pour la procédure. En effet la procédure vise a étudier la reproduction et le développement de caractères sexuels secondaires.
Elaboration d’un protocole pilote pour alimenter et mesurer le stress de l’exposition nocturne à la lumière artificielle chez le mulet-porc
- Conservation des espèces
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
100 mulets-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Capturés en milieu naturel, ils sont exposés sur trois nuits à une lumière artificielle nocturne, puis tués par surdose d'anesthésique pour prélèvement de sang, de muscle et de foie, afin de calibrer un protocole de mesure du stress lié à la pollution lumineuse. Le porteur décrit un stress à la capture et au transport et une perte de poids légère pendant l'acclimatation, sans autre manipulation directe. Il présente l'étude comme pilote, préalable à un dispositif de plus longue durée qui fera l'objet de futures demandes d'autorisation.
Objectifs
Ce projet est une étude pilote destinée à concevoir un protocole d’alimentation et de mesure indirecte du stress chez le mulet-porc, dans le cadre du développement d’un projet expérimental sur un plus long terme. Celui-ci visera à analyser l'effet sur la biodiversité aquatique, d'une forme de stress spécifique aux milieux urbains, à savoir la pollution lumineuse nocturne. Nous avons choisi de réaliser cette étude sur des mulets-porcs juvéniles car il s’agit d’une espèce commune, largement répandue dans les milieux aquatiques urbanisés européens et connue pour se nourrir exclusivement de biofilms (couches de micro-organismes qui se forment sur des surfaces en contact avec l'eau) lorsqu’ils sont juvéniles. Ce comportement alimentaire est recherché car le projet global cherchera à analyser les effets du stress lumineux sur une fonction essentielle au fonctionnement des écosystèmes aquatiques : l’interaction alimentaire plante-poissons. Les poissons seront capturés en milieu naturel par nos soins grâce à des filets spécifiques à la pêche aux civelles donc sans risque de blessure des animaux et transportés dans nos installations. Nous mettrons ensuite à leur disposition des biofilms produits naturellement sur place, et ferons évoluer la lumière de telle façon à simuler les modes d'éclairage urbain les plus répandus. Nous verrons ainsi les effets de cette pollution lumineuse à la fois sur l’alimentation des poissons (quantités ingérées, fréquences des repas) et sur leur niveau de stress. Pour la quantification de celui-ci, de l'eau des aquariums sera régulièrement prélevée et analysée, avant qu'une fois les poissons euthanasiés, on réalise des mesures sur leur sang, muscles et foie. C'est ensuite la recherche de la présence de cortisol dans l'eau et/ou dans le sang qui nous permettra d'évaluer le niveau de stress des poissons exposés aux effets de la lumière. Des prélèvements d’organes et tissus renseigneront en parallèle sur l’évolution de la composition en lipides en fonction du mode d’alimentation, et ce afin d’évaluer l’effet sur l’interaction alimentaire biofilm-poisson.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette étude pilote à court terme sont de tester la faisabilité et les paramètres d’un protocole de mesure indirecte du stress du poisson en réponse à un stress lumineux. A moyen terme, l’étude pilote permettra de concevoir un dispositif expérimental réaliste pour étudier les réponses comportementales (en particulier alimentaires) et le stress induit par la pollution lumineuse nocturne chez le mulet-porc. Cette espèce de poisson a été choisie puisqu’elle représente un maillon essentiel au bon fonctionnement des écosystèmes aquatiques soumis à pression urbaine. A long terme, la démarche expérimentale permettra d’apporter des éléments de connaissance scientifique fondamentale robustes sur la réponse de la biodiversité aquatique, et plus généralement du fonctionnement des écosystèmes aquatiques, à divers facteurs de stress urbain. Ils alimenteront des recommandations de gestion des espaces publics urbains, notamment pour ce qui concerne la réduction, la mitigation ou la gestion des effets des éclairages publics sur l'environnement.
Procédures
Les poissons seront capturés en milieu naturel avec des techniques de pêche au filet. Toutes les précautions seront prises pour éviter des blessures aux animaux au cours de cette étape. Ils seront ensuite transportés pendant deux heures dans des sacs de transport adaptés. Les poissons, d’une espèce capable de vivre aussi bien dans l’eau douce que dans l’eau salée, seront ensuite acclimatés à l’eau de l’aquarium, d’une salinité plus basse que celle des milieux de capture, par le respect de seuils d’acclimatation progressifs accompagnés d’observations comportementales continues. Ils resteront ensuite en quarantaine sanitaire pendant 21 jours. Puis, ils seront alimentés avec un aliment naturel, le biofilm (la couche de micro-organismes qui se forme sur des surfaces en contact avec l'eau), dont l’appétence en condition de captivité sera testée. Si ce biofilm venait à être négligé, des granulés commerciaux le remplaceront. Certains poissons seront ensuite soumis à un stress lumineux nocturne d’une durée au total courte (3*12 h maximum d’exposition nocturne). L’ensemble des poissons destinés à l’expérimentation sera euthanasié à diverses étapes pour les besoins des prélèvements indispensables à l’interprétation des résultats : prises de sang pour y mesurer le cortisol qui sera comparé aux mesures réalisées dans l’eau, extraction de muscles et de foie pour analyse des profils en lipides. Ces profils illustrent pertinemment le rôle des plantes dans le fonctionnement des réseaux alimentaires de l’écosystème.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent être soumis à un stress lors de leur capture et pendant leur transport, qui durera environ deux heures, ainsi que lors du transfert dans l’aquarium. Au cours de la procédure visant à habituer les poissons à se nourrir en captivité de biofilms, une perte de poids des animaux, légère mais sans conséquences sur leur bien-être, est possible. Ensuite, au cours de la procédure destinée à tester un protocole de mesure indirecte du stress, certains individus seront exposés aux effets d'une lumière nocturne, d’intensité légère, pendant 3 nuits, c'est à dire durant 36 heures non consécutives. C’est l’effet de ce stress, mimant une exposition à la pollution lumineuse nocturne, qui est recherché. Les effets attendus sont d’ordre comportemental (mobilité accrue, frénésie alimentaire, stress modéré), et d’ordre physiologique (accumulation de cortisol dans le sang et excrétion de cortisol dans l’eau du milieu). En dehors de ces nuisances légères, aucune manipulation directe n’est prévue sur les animaux. Tous seront néanmoins euthanasiés (selon le mode réglementaire, c’est-à-dire qu’une fois que les poissons auront été anesthésiés par balnéation, une augmentation de la quantité du produit anesthésique dans l’eau produira leur euthanasie) en fin d’expérimentation pour les besoins de prélèvements de sang, muscle et foie nécessaires à l’interprétation des résultats.
Devenir
Les 100 poissons impliqués sont euthanasiés. 10 le sont dès le début du projet, servant ainsi de « témoins », 20 à 30 autres le sont à la fin de la période d’alimentation par le biofilm ou les granulés, ceci pour la détermination du profil lipidique. Enfin, 60 seront euthanasiés après l’exposition à la lumière. Ces euthanasies sont justifiées par le besoins de prélèvements destinés à recueillir les paramètres indispensables aux résultats de l’étude pilote déployée dans le cadre de l‘élaboration d’un dispositif multiannuel. Celui-ci fera l’objet de futurs dépôts de demandes d’autorisation d’expérimenter au fur et à mesure de l’avancée du projet.
Remplacement
Les finalités de l’expérimentation pilote sont de juger de la faisabilité et du calibrage d'un protocole d’alimentation et de mesure du cortisol excrété par des animaux vivants dans l’eau du milieu suite à une exposition à un stress léger. L’expression du stress et les réponses comportementales complexes attendues ne peuvent pas être abordées par l’usage d’un modèle de remplacement simplifié (par exemple, des cultures cellulaires) en l’état actuel des connaissances. De plus, le choix d’une espèce sauvage très répandue dans les écosystèmes aquatiques urbanisés d’Europe, plutôt que d’un modèle biologique expérimental plus standardisé (poissons zèbres ou medaka par exemple) permettra d’optimiser les résultats du projet à large échelle.
Réduction
Le nombre d’animaux intégrés à l’étude pilote est limité au strict minimum requis pour une analyse statistique fiable de l’effet de l’exposition lumineuse sur le comportement alimentaire des animaux. L’expérimentation est constituée de 3 procédures qui s’enchainent sur tout ou partie des mêmes animaux afin d’optimiser leur usage. Ce nombre de 100 inclut un total de 10 surnuméraires capturés pour pallier une mortalité potentielle pendant la capture, le transport et l’acclimatation aux conditions d’hébergement (soit une mortalité estimée à environ 10%).
Raffinement
En dehors des étapes de capture, transport et transfert, les poissons ne seront jamais manipulés. Une fois pêchés, les poissons seront placés dans des viviers de dimensions adaptées à leur nombre et à leur taille, puis placés délicatement dans des sacs de transport gonflés aux 2/3 à l'oxygène pur et hermétiquement fermés. Ces sacs seront déposés dans un contenant assurant leur stabilité pendant le transport jusqu'au site expérimental. Une fois les poissons sur place, des seuils progressifs d'acclimatation leur permettront de s'habituer à l'eau de leur aquarium. Par ailleurs, le seul transfert qui sera réalisé ensuite sera celui du lot de 60 poissons destinés à l’exposition lumineuse ; il sera effectué à l'aide d'épuisettes à mailles fines, entre le bac de quarantaine où auront été accueillis les poissons dès leur arrivée sur site, vers les aquariums où se dérouleront les expositions lumineuses. Les poissons seront nourris pendant l'expérimentation. La qualité, la quantité et la fréquence de l’alimentation seront ajustées en fonction des observations réalisées in situ. Au moins une fois par jour, des animaliers formés de longue date viendront contrôler visuellement l’état des poissons. Des mesures continues des différents paramètres de l’eau (température, pH, …) ainsi que des mesures ponctuelles des produits azotés, garantes de la qualité de l'eau, permettront de maintenir des conditions environnementales optimales tout au long de l’expérimentation. Les bassins seront dimensionnés pour offrir un espace de mobilité confortable aux animaux (bassins de 30 L pour des individus de 8±2 cm de longueur totale). Les poissons ne seront jamais isolés mais placés en groupes de minimum 5 à maximum 100 individus selon les étapes. Toutes les étapes expérimentales auront lieu dans une même salle dédiée afin que les poissons s’habituent à un environnement visuel et sonore unique et constant. Enfin, les aquariums seront nus car un abri serait de peu d’intérêt pour le mulet-porc qui est une espèce mobile se déplaçant dans la colonne d’eau en dehors des activités alimentaires qu'il mène sur le fond. La présence d’une cache pourrait par ailleurs nuire à l’interprétation des résultats. Cependant, une des parois de chaque aquarium sera munie d’un décor mimant un décor de rivière afin potentiellement d’améliorer le confort des animaux.
Choix des espèces
Le mulet-porc est une des rares espèces de poissons connues pour se nourrir de biofilms au stade juvénile, ce comportement alimentaire spécifique étant essentiel pour atteindre les objectifs de long terme envisagés dans le projet global supportant l’étude pilote. Ces objectifs viseront au développement d’une démarche expérimentale multiannuelle intégrant différents représentants de la biodiversité aquatique (poissons et plantes d’espèces diverses). De plus, la capture de mulets-porcs en milieu saumâtre puis leur placement en milieu dulcicole pour l’expérimentation sont possibles puisqu’il s’agit d’une espèce dont le cycle de vie se déroule à la fois en eau salée et en eau douce. Le mulet-porc est par ailleurs largement répandu dans les milieux aquatiques urbanisés mondiaux dont l’étude est ciblée par le projet global, ce qui permettra d’optimiser la portée des résultats dans un contexte international. C’est aussi l’espèce la plus abondante dans les zones où les captures sont envisagées : ainsi, l’impact de celles-ci sur les ressources naturelles sera minimisé. Les poissons impliqués seront des juvéniles de 8±2 cm de longueur totale. Cette taille est en effet celle à laquelle les mulets-porcs sont décrits comme consommateurs exclusifs de biofilms en milieu naturel. Le fait de choisir des juvéniles limitera aussi les effets potentiels des captures sur les ressources naturelles. Enfin, des poissons de petite taille sont recherchés afin d’optimiser le compromis entre confort des animaux et conditions optimales pour la fiabilité des mesures du cortisol dans l'eau.
Définition du ratio en acides gras essentiels dans l’alimentation des alevins de truite arc-en-ciel dès le premier repas
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
720 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 tuées pour des prélèvements et 600 remises dans un circuit d'élevage. Après douze semaines de nutrition, ces alevins subissent un stress de confinement de dix minutes destiné à mesurer leur réponse physiologique, pour définir le ratio d'acides gras essentiels de leur aliment. Le porteur indique que le confinement fait monter le cortisol et la consommation d'oxygène, et affirme que le retour à de bonnes conditions limite les nuisances. Il conclut que l'étude porte sur le métabolisme et la résistance au stress et ne peut être menée ni sur lignée cellulaire ni par modélisation, l'objectif affiché étant de remplacer la farine et l'huile de poisson dans les aliments d'aquaculture.
Objectifs
La composition optimale des acides gras alimentaires est une condition préalable à la réussite de l'élevage des alevins de poissons. Un apport adéquat d'acides gras essentiels au cours des premiers stades de développement des alevins de poisson est essentiel pour la progression normale de la neurogenèse (formation de neurones fonctionnels) et ainsi le développement du cerveau. Pour les alevins de poisson, la substitution de l'huile de poisson par des huiles végétales peut potentiellement entraîner des déficiences ou des déséquilibres en acides gras essentiels chez les alevins de poissons, qui ont été impliquées dans une variété de troubles, telles qu'une réponse retardée et accrue au stress, une réduction de l'activité phagocytaire contre les pathogènes, la réduction de la réactivité aux stimuli auditifs et de l'acuité visuelle, une altération du développement cérébral. Dans ce contexte, il est nécessaire de déterminer les besoins en acides gras essentiels des alevins de truite arc-en-ciel dès leur premier repas pour pouvoir établir les effets sur la physiologie métabolique du poisson ainsi que sur leur capacité de tolérance au stress pour à terme pouvoir remplacer, de la manière la plus adaptée aux besoins du poisson, la farine et l’huile de poisson dans les aliments aquacoles. Pour répondre à cela, un essai d’alimentation de 12 semaines comprenant 8 traitements sera conduit en triplicat sur des truites arc-en-ciel dès leur premier repas élevées dans des conditions optimales. Au total, 7200 poissons seront utilisés pour cet essai d'alimentation soit 900 poissons par traitement. Les 8 traitements correspondront à 8 aliments présentant des profils en acides gras différents. Les aliments sont formulés sur la base de la composition des aliments actuellement commercialisés chez la truite, de façon à couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels de l’animal. Après 12 semaines de nutrition, afin d’évaluer la capacité des alevins à tolérer un stress, en d'autres termes la robustesse des alevins, en fonction de l’aliment reçu, un sous-groupe de 720 poissons (n=90 par traitement) sera soumis à un stress de confinement pendant 10min puis remis dans de bonnes conditions. Le reste des poissons mis en élevage ne sera pas stressé.
Bénéfices attendus
Cette expérimentation permettra de définir le ratio optimal en acides gras essentiels dans l’aliment à destination des alevins de truite arc-en-ciel dès leur premier repas pour déterminer l’influence de différents apports en acides gras essentiels par la nutrition sur la sensibilité et la résilience à un stress chez la truite arc-en-ciel et donc des indications sur sa robustesse. Malgré le contrôle des conditions d’élevage, les poissons sont soumis à de multiples perturbations liées aux systèmes de production ou aux variations de leur milieu. Ces perturbations peuvent être à l’origine d’une augmentation de la fragilité des animaux et d’une dégradation de leur bien-être et de leur état de santé. Favoriser la robustesse des poissons est donc une solution pour lutter contre ces perturbations. L'expérimentation permettra d’établir chez la truite arc-en-ciel le lien entre la nutrition en acides gras (stockage, mobilisation et transfert des acides gras), et la réponse physiologique face à un stress (paramètres liés au bien-être, aux systèmes immunitaire et inflammatoire). Cette expérimentation servira de base pour la définition de formules alimentaires durables (sans huile et farine de poisson) adaptées le plus possible aux besoins nutritionnels des alevins de truite dès leur premier repas afin de favoriser la robustesse du poisson.
Procédures
Un sous-groupe de poissons (720) sera soumis après 12 semaines d'élevage à un stress de confinement de 10 min suivi par un retour dans de bonnes conditions d'élevage.
Impact sur les animaux
L'élevage ne créera aucune nuisance ou effet indésirable sur les animaux car c'est un protocole classique d'élevage avec des aliments qui répondent entièrement aux besoins nutritionnels des poissons. Le stress de confinement (procédure expérimentale réalisée sur 720 poissons) a été réduit au temps minimal permettant de voir une réponse physiologique au stress. Il entrainera une hausse de l'hormone de stress (cortisol) qui entrainera une hausse de la consommation en oxygène. Le retour à de bonnes conditions dès la fin du stress entrainera dans un premier temps une augmentation de l'activité de nage du poisson puis ensuite le poisson reviendra progressivement à son état physiologique avant stress (dans les 2h suivant le stress), cela permettra donc de limiter au maximum les nuisances chez le poissons.
Devenir
120 poissons stressés seront euthanasiés 40 minutes après le stress de confinement pour des prélèvements biologiques en vue d'analyses biologiques. Le confinement est généralement considéré comme un défi stressant pour les poissons, mais, contrairement aux facteurs de stress tels que les changements de température, la disponibilité de l'oxygène ou les infections parasitaires, le confinement ne remet pas directement en cause l'état de santé du poisson donc n'impactera la future vie du poisson. Ainsi, les 600 poissons restants stressés par confinement non utilisés pour les prélèvements biologiques seront remis dans un circuit classique d'élevage mais ne serviront plus à des expérimentations animales.
Remplacement
L'étude porte sur l'impact d'un régime alimentaire sur le métabolisme et la résistance au stress des animaux, elle ne peut donc pas être appréhendée sur lignée cellulaire ou par modélisation.
Réduction
Pour une espèce comme la truite, il est nécessaire d’avoir une biomasse d’élevage minimale d’élevage pour optimiser le bien-être de l’animal et éviter tout comportement agressif (relation dominant/dominé). Une faible densité d’élevage altère la survie, la croissance et l'efficacité alimentaire de la truite arc-en-ciel avec une altération de ses réponses physiologiques. Afin de réduire au maximum le nombre de poisson mis en élevage tout en maintenant une densité d’élevage optimale, les poissons seront élevés lors des premiers jours dans des petits paniers (20x20cm) placés dans des bassins avec un renouvellement d’eau important. Ensuite, les poissons, lorsqu’ils auront atteint la taille de 0.5 gramme, seront transférés dans des cages plus grandes (60 x 60 cm) toujours dans une optique de préserver une biomasse d’élevage optimale. Les effectifs ont donc été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes et de la littérature pour maintenir des densités d’élevage optimales qui ne modifient pas le comportement des poissons ainsi que ses réponses physiologiques. Le nombre d’individus à utiliser a ainsi été réduit le plus possible (en adaptant la taille des paniers à celle des poissons) mais calculé pour obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, des études antérieures sur la nutrition des alevins de la truite arc-en-ciel nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet. La croissance, ainsi que le métabolisme des alevins de truite arc-en-ciel, est sujette à une très forte variabilité. Ainsi, le nombre d'animaux utilisés a été calculé au plus juste pour permettre de détecter des différences pour les paramètres physiologiques, biochimiques et moléculaire étudiés. Pour la mise en place du stress par confinement, nous avons prévu un nombre d'animaux minimal en réalisant le stress dans une petite épuisette permettant de réaliser le stress de confinement dans les meilleures conditions possibles
Raffinement
Les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux : volume d'eau adapté avec renouvellement en continu, rythme jour/nuit naturel, et de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche. Au début de l'élevage, les jeunes alevins seront élevés dans des paniers pour pouvoir obtenir une densité d'élevage suffisante au démarrage au vu de la petite taille des animaux. Le panier sera directement plongé dans le courant d’eau. La cuve sera nettoyée tous les jours avec un tuyau siphonnant. Dès que les poissons auront atteint une densité correcte, ils seront relâchés dans un bac d’élevage plus grand. Le stress de confinement a été réduit au temps minimal (10min) permettant de voir une réponse physiologique au stress, le retour à de bonnes conditions dès la fin du stress permettra de limiter au maximum les nuisances chez le poissons. Les animaliers en charge des élevages contrôleront le comportement et les mortalités des animaux au cours du stress mais aussi de l'élevage. En cas de dépassement des points limites, les animaux concernés seront anesthésiés puis euthanasiés par surdose d'anesthésiant.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est choisie en raison de son importance agronomique et commerciale (première production piscicole française). L'essai démarrera avec des alevins de truite dès le 1er repas.