Poissons zèbres
Création et maintien de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiées pour l’étude des protéines impliquées dans l’organisation structurale des neurones
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
31 550 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour créer et maintenir des lignées génétiquement modifiées. Une partie subit à trois mois, sous anesthésie, une coupe de la nageoire caudale pour le génotypage, suivie de 72 heures de semi-isolement au plus. Les poissons porteurs de mutations retrouvées chez des patients atteints de neuropathies peuvent présenter des difficultés de nage, des troubles sensoriels et des déformations du squelette, et les surnuméraires ou ceux au génotype jugé sans intérêt sont tués dès que les cohortes sont établies. Le nombre de 31 550 n'est pas justifié, le porteur écrivant que pour ce projet "aucun test statistique n'est applicable", et les bénéfices sont renvoyés "au-delà de 5 ans".
Objectifs
Ce projet porte sur l'étude de maladies héréditaires rares qui touchent les nerfs, appelées neuropathies périphériques. Les neurones sont des cellules spécialisées qui transmettent les informations entre le cerveau, la moelle épinière, les muscles et les organes sensoriels. Lorsque ces cellules ne fonctionnent plus correctement, les personnes atteintes développent progressivement une faiblesse musculaire, des difficultés à marcher, une perte de sensibilité des mains et des pieds, ainsi que des troubles de l'équilibre. Certaines formes de ces maladies peuvent également réduire l'espérance de vie. À l'heure actuelle, il n'existe pas de traitement permettant de les guérir ; les soins proposés visent uniquement à limiter les symptômes. Pour comprendre les mécanismes responsables de ces maladies et développer de nouveaux traitements, il est nécessaire de disposer de modèles animaux reproduisant les principales caractéristiques observées chez les patients. Le poisson zèbre est particulièrement adapté à ces études, car son système nerveux présente de nombreuses similitudes avec celui de l'Homme. De plus, ses embryons sont transparents, ce qui permet d'observer directement le développement des neurones et leur fonctionnement au cours du temps. Dans ce projet, nous créerons et maintiendrons des lignées de poissons zèbres portant des modifications génétiques permettant d'étudier le rôle de protéines essentielles au bon fonctionnement des neurones. Ces lignées seront utilisées pour observer l'apparition des anomalies nerveuses et pour reproduire certaines neuropathies humaines. À plus long terme, ces modèles permettront d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d'évaluer l'efficacité de futurs candidats médicaments avant leur développement chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans une démarche de recherche fondamentale visant à mieux comprendre le rôle des protéines impliquées dans l'organisation et le maintien de l'architecture des neurones, ainsi que leur contribution au développement de neuropathies héréditaires. À plus long terme (au-delà de 5 ans), les connaissances acquises pourraient permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et contribuer au développement de stratégies de traitement visant à prévenir ou corriger les mécanismes responsables de ces neuropathies.
Procédures
La création et le maintien de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux transgéniques. Cette procédure d'identification nécessite le prélèvement d’un morceau de tissu de la nageoire caudale du poisson afin d’en extraire l’ADN. Ce prélèvement, d’une durée inférieure à 5 minutes, sera réalisé sous anesthésie une seule fois au cours de la vie de l’animal, à 3 mois. Classiquement, cette technique ne génère pas de dommages ni de mortalité. Il s’agit-là du seul geste invasif qu’auront à subir les poissons zèbres une fois dans leur vie.
Impact sur les animaux
Nous ne nous attendons pas à ce que les protéines étudiées induisent des nuisances dans les lignées transgéniques créées. Seuls les poissons transgéniques portant les mutations retrouvées chez les patients, ont le potentiel de générer des effets indésirables (difficultés de locomotion, sensorielles et déformation du squelette). Ces défauts pourraient induire un stress modéré ainsi qu’un défaut de nage chez ces poissons n’entrainant pas, au vu de la littérature sur les patients, de mortalité. Lors de la création de ces lignées, un certain nombre de poissons zèbres seront amenés à subir un prélèvement de nageoire caudale pour identification qui peut induire du stress et de la douleur. Après le prélèvement, les poissons sont placés en semi-isolement et cela peut induire un stress léger chez les poissons.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux d’intérêt (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois puis mis à mort. Les animaux surnuméraires ou de génotype non intéressant pour l'étude, seront mis à mort dès que les cohortes d'intérêt seront établies.
Remplacement
Le projet vise à acquérir une meilleure compréhension fondamentale des protéines contrôlant l'architecture des neurones. Bien qu'il existe des systèmes d'étude de cellules in vitro, ces modèles sont fortement limités car les neurones ne sont pas matures et ne permettent pas d'étudier complètement les fonctions de ces protéines. Par conséquent, il n'existe actuellement aucun système in vitro qui réponde aux deux critères de complexité et de transparence des tissus, nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Cela nous rend dépendants de l'utilisation de systèmes in vivo. Les embryons de poisson zèbre ont un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, avec tous les types de cellules pertinents, qui est déjà fonctionnel au stade larvaire et qui a une transparence tissulaire ce qui en fait un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques. Nous souhaitons établir des lignées poisson-zèbre transgéniques afin de disposer d’outils pour étudier la biologie des neurones.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre de poissons à élever jusque l’âge de 3 mois, une estimation préalable de l’efficacité des techniques utilisées sera réalisée sur des œufs de poisson zèbre sauvages à 24-48h heures post fécondation. Nous limiterons également au maximum le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de nageoire caudale pour identification en réalisant les prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres. Ainsi, dès lors que le nombre d’animaux nécessaires à la génération des lignées sera obtenu, les prélèvements seront stoppés. Pour le maintien des lignées créées, seul le nombre de poissons zèbres nécessaire au maintien de chaque lignée sera conservé, ce qui correspond à une vingtaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. L'ensemble de ces dispositions nous permet de réduire au maximum le nombre de poissons utilisés sans compromettre l'obtention de résultats. Étant donné que les poissons générés dans cette DAP sont des animaux reproducteurs, aucun test statistique n'est applicable à ce projet.
Raffinement
Tous les poissons adultes seront élevés en aquarium en conditions d’hébergement standard, avec une surveillance hebdomadaire. Les individus devant subir la procédure d'identification par prélèvement de nageoire caudale seront placés sous anesthésie avant la procédure. Pendant cette procédure, l'exposition à l'anesthésique sera minimisée en effectuant rapidement les manipulations tout en s'assurant que le poisson est suffisamment sédaté pour ne pas sentir les manipulations. Le plus petit morceau de nageoire possible sera prélevé afin de faciliter la cicatrisation et minimiser l’impact de cette procédure sur les animaux. La récupération de l'anesthésie sera étroitement surveillée : si le réveil n'est pas observé dans les 10 minutes, l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance. Nous réduirons au minimum le temps d'isolement des animaux (72h maximum). Les animaux seront traités par lots de 16 ce qui permet de former des bancs réduisant ainsi le stress des poissons. Les poissons ayant subi la procédure seront surveillés pendant 15 jours soit le temps minimum de cicatrisation afin que tout comportement ou aspect anormal puisse être évalué lors des contrôles de routine effectues par les soigneurs. Des points limites précoces et adaptes aux modèles d'étude ont été définis (points limites d'altération de la morphologie ou de comportement). En cas d'atteinte d'un seuil limite, les poissons seront euthanasiés.
Choix des espèces
Grâce à la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme, le poisson zèbre est un modèle idéal pour étudier les fonctions des gènes et des protéines qui sont pertinentes pour la physiologie et la pathologie humaines. Les embryons de poisson zèbre ont un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, avec tous les types de cellules pertinents pour nos questions biologiques. En outre, la transparence des embryons de poisson zèbre permet de suivre des processus dynamiques dans un contexte d'organisme entier à l'aide de techniques non invasives. Les poissons de ce projet seront génotypés/prélèvement d'un bout nageoire à partir de 3 mois de développement pour minimiser les nuisances induites par ce prélèvement et mis en reproduction entre 4 mois et 18 mois. Au-delà, le poisson peut présenter des signes de vieillissement qui pourraient impacter son bien-être.
Impact des composés bioactifs produits par des cyanobactéries sur le microbiote des larves de poisson-zèbre et son rôle dans la protection contre l’infection
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
La mort des larves tient lieu de point limite : infectées par une bactérie après exposition à des extraits de cyanobactéries, celles que leur microbiote ne protège pas peuvent mourir sans signe de souffrance repérable auparavant, selon le porteur. 4 644 larves de poisson-zèbre vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Elles subissent d'abord 24 heures de balnéation dans ces extraits, à des doses dont le porteur ne peut exclure des "effets néfastes", puis trois heures de balnéation infectante. Il reconnaît une douleur ou un stress "que l'on ne peut quantifier", qu'il dit de courte durée puisque "la mort intervient alors très rapidement".
Objectifs
Les altérations des milieux aquatiques par les efflorescences de cyanobactéries sont susceptibles de modifier le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Les préjudices associés à ces efflorescences comprennent des perturbations de la chaîne trophique, une diminution de la pénétration de la lumière dans l’eau, une diminution de l’oxygène dissous disponible, mais également la production de métabolites secondaires potentiellement bioactifs et parfois toxiques pour certains organismes qui y sont exposés. En effet, de nombreux genres de cyanobactéries sont susceptibles de produire et/ou de relarguer dans le milieu aquatique des molécules aux propriétés potentiellement bioactives, délétères, voire toxiques. Si les effets toxicologiques (sensu-stricto) de ces microorganismes et de leurs métabolites sont connus sur certaines cellules ou tissus de vertébrés, notamment téléostéens, on ignore leur impact sur le microbiote procaryote associé (i.e. la communauté microbienne associée) et les répercussions sur la santé de l’organisme hôte. Des travaux menés ces dernières années ont montré que le microbiote, localisé à l’interface entre un organisme et le milieu extérieur, peut jouer un rôle important dans la physiologie de l’hôte, mais aussi dans de nombreux traits dont la résistance aux pathogènes. A ce jour, peu d’études se sont ainsi efforcées de caractériser la réponse des poissons à différentes compositions d’efflorescences de cyanobactéries (incluant différents génotypes produisant différents cocktails de métabolites bioactifs). Le présent projet propose d’étudier l’effet de l’exposition à des doses non toxiques de différentes efflorescences de cyanobactéries sur le microbiote de la larve du poisson-zèbre en s’intéressant notamment à son rôle protecteur contre l’infection par un pathogène.
Bénéfices attendus
Les relations entre hôte, microbiote et environnement sont encore peu explorées, encore moins dans le cadre de stress éco-toxicologiques. Cette étude constituera un prérequis indispensable au développement de ce sujet encore vierge et, à terme, ces travaux permettront de mieux appréhender les conséquences (éco)toxicologiques des efflorescences de cyanobactéries et de la production de métabolites bioactifs associés.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles ou procédures chirurgicales ne seront réalisés dans le cadre de ce projet. Les interventions sur larves vigiles seront les suivantes : - Balnéation extraits de bactéries – 1 fois pendant 24 h sur larves vigiles à 5 jour post-fertilisation. - Infection par balnéation – 1 fois pendant 3 heures sur larves vigiles à 6 jour post-fertilisation.
Impact sur les animaux
En procédure 1, les larves seront exposées par balnéation à des extraits de cyanobactéries contenant différents cocktails de métabolites bioactifs et susceptibles d’avoir potentiellement des effets toxiques à hautes doses. Les extraits aux dilutions les plus fortes ne devraient induire que des effets légers (modifications de composition bactérienne) sans effets toxicologiques au niveau anatomopathologique ou comportemental. Cependant, nous ne pouvons pas exclure d’effets néfastes aux doses les plus importantes ici testées, d’où une classification sévère de cette procédure. En procédure 2, les larves seront exposées à une seule dose non toxique d’extraits de cyanobactéries mais seront ensuite infectés par une bactérie capable de tuer les larves axéniques (absence de microbiote) ou arborant un microbiote non protecteur. En effet, afin d’évaluer l’impact des extraits sur le microbiote des larves de poisson-zèbre, nous nous baserons sur la protection conférée par la flore, la mort des larves sera alors majoritairement considérée comme point limite. Des signes de souffrance en amont ne sont en effet que très peu listés et /ou adaptés au stade larvaire et à notre procédure d’hébergement. Leur niveau d’appétit ou leur taille exacte ne peuvent pas être mesurés dans notre système et à ce stade de développement, et l’absence de réponse au stimulus souvent synonyme de souffrance chez l’adulte n’est pas observée de manière systématique avant la mort de la larve. Le développement de l’infection doit engendrer une douleur et/ou un stress à l’animal que l’on ne peut quantifier mais qui reste de courte durée puisque la mort intervient alors très rapidement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car : (i) une majorité aura été en contact avec le pathogène et ils ne peuvent ainsi pas être réutilisés, ni replacés, ni adoptés. (ii) cela permettra les différentes analyses de microbiote prévues
Remplacement
Tandis que des expériences seront d’abord menées in vitro pour déterminer l’impact des métabolites bioactifs produits lors des efflorescences de cyanobactéries directement sur les bactéries isolées du microbiote de la larve de poisson-zèbre, leur impact sur le microbiote et son hôte ne peut être étudié que dans un contexte in vivo nécessitant ainsi le recours à l’expérimentation animale utilisant ici, des larves de poisson-zèbre. En effet, seule une analyse intégrée sur organismes entiers permet de générer une compréhension fine des processus éco-toxicologiques et le poisson zèbre est un modèle in vivo bien caractérisé et pertinent dans ce contexte.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’être minimum tout en permettant l’application des approches statistiques choisies et est basé essentiellement sur des données de la littérature et notre expérience du modèle d’infection chez la larve du poisson-zèbre (voir référence ci-dessous). La première procédure permettra notamment de déterminer une dose non toxique des extraits de cyanobactéries sur la larve du poisson-zèbre pour la suite du projet. Pour cela, celle-ci sera réalisée en deux fois pour minimiser au maximum le nombre de larves exposées aux plus fortes doses toxiques. En effet, seule une première expérience sera faite en utilisant le nombre total de dilutions de chaque extrait. Afin de valider la dose maximale non toxique mais également de déterminer différents paramètres toxicologiques, deux répétitions seront ensuite réalisées mais nous envisageons alors de n’utiliser que les doses égales et inférieures à la plus faible dose ayant entrainé une mortalité pour les larves lors de la première expérience. Cela nous permettra de réduire le nombre de larves exposées à une dose fortement toxique. De plus, ces chiffres ont été établis avec l’aide d’un biostatisticien.
Raffinement
Une observation quotidienne des larves sera réalisée afin de repérer rapidement les signes de souffrance tels que présence de malformation, œdème, hémorragie ou abcès (visible à l’œil ou après observation sous loupe binoculaire), comportement de nage particulier et répété (souvent liée à un problème de développement), courbure inhabituelle. La durée du protocole sera limitée à maximum 15 jours post-fertilisation, contribuant ainsi à réduire la douleur. Enfin, les plaques 12-puits choisies pour l’hébergement des larves (2 larves / puits) satisfont à leurs besoins à ce stade de développement et permettent d’éviter qu’elles ne soient hébergées individuellement.
Choix des espèces
Les préjudices associés aux efflorescences de cyanobactéries sont nombreux et comprennent notamment la production de métabolites secondaires relargués et pouvant affecter certains organismes du milieu aquatique. On ignore notamment l’impact de ces métabolites sur le microbiote des poissons dont les téléostéens et les répercussions d’éventuelles modifications sur leur santé. Ainsi, le présent projet propose d’étudier l’effet de l’exposition à des doses non toxiques de divers efflorescences de cyanobactéries sur le microbiote de la larve de poisson-zèbre en s’appuyant notamment sur son rôle protecteur contre l’infection, et cela ne peut se faire sans le recours à l’expérimentation animale. Seule une analyse sur organismes entiers permet de générer une compréhension fine de ces processus éco-toxicologiques et le poisson zèbre est un modèle in vivo bien caractérisé (notamment du fait de son utilisation en biologie du développement) et pertinent dans ce contexte. Outre l’obtention de pontes, réalisée dans l’animalerie, qui nécessite des poissons-zèbres adultes mâles et femelles, mais non inclus dans ce projet car simplement géniteurs, nos procédures impliquent de n’utiliser que des poissons au stade larvaire de développement. L’utilisation de larves de poissons-zèbre se justifie au niveau scientifique et éthique puisque ces derniers possèdent déjà un système digestif et une réponse immunitaire innée et représentent un modèle pertinent pour la thématique ici proposée, notamment en termes « d’axénisation » et de contrôle de la composition du microbiote intestinal.
Utilisation du poisson zèbre pour l’étude des métastases-modification
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Injectés au stade embryonnaire puis anesthésiés jusqu'à une fois par jour pour des séances d'imagerie de une à deux heures, certains intubés quatre heures d'affilée pendant près d'un an, 680 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés et sévères. Les adultes porteurs de mélanomes nagent moins droit et moins vite, développent des abcès ou des œdèmes, respirent mal, mangent moins et s'éloignent de leurs congénères, et les larves de moins de quinze jours, hébergées seules pour le suivi, peuvent souffrir de l'isolement. Le porteur écrit pourtant que des points limites ont été établis pour éviter "toute souffrance animale". Tous sont mis à mort en fin de procédure, pour les prélèvements et pour empêcher les tumeurs de croître davantage.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier les interactions entre les cellules tumorales circulantes et l'endothélium dans le réseau vasculaire, la sortie des vaisseaux de ces cellules et leur croissance métastatique. Il s'attache notamment à définir la contribution des facteurs sécrétés par les tumeurs et le rôle des cellules non cancéreuses (endothéliales, fibroblastiques et immunitaires) dans ces processus . L'embryon de poisson zèbre permet de visualiser les étapes précoces de la formation des métastases: sortie des vaisseaux sanguins (extravasation), invasion, prolifération dans l'animal vivant. Nous allons comparer le comportement de lignées de cellules tumorales de différentes origines et ayant différentes propriétés biomécaniques et déterminer leurs interactions avec différents composants de la circulation et de la niche métastatique (vaisseaux sanguins, plaquettes, globules rouges, macrophages, neutrophiles etc..). De plus, nous comptons évaluer le rôle de facteurs secrétés par les cellules tumorales, en particulier les vésicules extracellulaires, dans ces processus. Modification: l'utilisation d'une approche CRISPR permet de substituer une lignée transgénique et diminuer le nombre d'animaux.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d'accroitre les connaissances fondamentales sur les étapes précoces de la formation des métastases.
Procédures
Groupe 1: Une injection au stade embryonnaire (48 heures après fécondation). Durée 10 secondes. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour . Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 2: Deux injections au stade embryonnaire (48 heures après fécondation) . Durée 10 secondes chacune. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour . Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 3 Une injection au stade embryonnaire (au stade une cellule). Durée 10 secondes. Photographie une fois par semaine au maximum , sous anésthésie. Imagerie par microscopie sous intubation avec anésthésie , jusqu'à une fois toutes les deux semaines. Durée 4 heures. De 8 à 52 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Chez l'embryon ou la larves, on peut observer un retard de développement suite à l'injection, mais cela reste très rare. Les larves de moins de 15 jours peuvent souffrir de l'isolement. Chez l'adulte, la formation de mélanomes peut entrainer des changements de comportement généralement associés au stress ou à une maladie. Ceux-ci comprennent : une diminution de la qualité de la nage (moins droite et régulière, moins rapide), la formation d'abcès ou d'oedèmes, des difficultés de respiration (visibles par un rythme anormal de dilatation des branchies) ou de prise de nourriture. Les animaux malades peuvent également s'éloigner de leurs congénères.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer des prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître et entrainent plus de nuisances.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable à la réalisation de ce projet car il n'existe pas de modèle permettant de reproduire in vitro toute la complexité du microenvironnement entre le moment où la cellule tumorale quitte la circulation envahit un nouveau tissu et le colonise. Néanmoins, certaines étapes ou certaines interactions sont étudiées in vitro. Nous avons par exemple développé un système de microfluidique permettant de reproduire les interactions entre cellules tumorales soumises à un flux et cellules endothéliales. Nous utilisons également un modèle d'invasion en matrice de collagène in vitro, ainsi que des systèmes de co-culture cellules tumorales-cellules immunitaires. Nous utilisons des lignées de cellules tumorales dérivées de mélanome ou de carcinome mammaire.
Réduction
Nous utilisons des systèmes d'imagerie qui permettent un suivi longitudinal d’un même animal et donc une réduction du nombre total d’animaux nécessaires. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier une équipe réalisant des expériences similaires ailleurs dans le monde. Nous avons établi le nombre d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Modification: l'utilisation de CRISPR permet de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Un traitement anesthésique est prévu avant imagerie des adultes. Les larves en procédure seront hébergés individuellement pour permettre leur suivi longitudinal. Les adultes en procédure seront hébergées en groupe de 10 à 20 pour conserver les interactions sociales essentielles à leur bien être. Les aquariums, en particulier lorsque les larves sont isolées, sont enrichis avec des fonds imprimés représentant des cailloux de rivières. Certains adultes sont isolés pendant 12h pour vérifier qu'ils récupèrent bien des séances d'imagerie. Dans ce cas, ils sont hébergés par 2, mais séparés par une vitre pour leur permettre de maintenir un contact visuel et réduire leur stress. De plus larves et adultes seront nourris quotidiennement avec de la nourriture vivante, ce qui induit des comportements de chasse et augmente le bien être. Cet enrichissement est particulièrement important pour limiter le stress dans les rares cas où les animaux doivent être isolés (plaie ou blessure apparente). Tous les animaux utilisés sont obtenus par croisements sur place et sont donc habitués à notre animalerie. Modifications: amélioration de l'anésthésie et enrichissement des aquariums. Suppression du génotypage.
Choix des espèces
Depuis quelques années, il apparait que la progression tumorale chez le poisson zèbre présente d'importantes similarités avec l'homme, d'un point de vue génétique et histologique. Par ailleurs, le poisson zèbre présente l'avantage, notamment par rapport à la souris, de permettre l'observation des tumeurs par imagerie non-invasive dans l'animal vivant. Nous avons récemment montré que des cellules de mélanomes de poisson zèbre sécrètent des vésicules extracellulaires très semblables à celles sécrétées par des lignées de mélanomes humaines (en morphologie et en contenu protéique). Nous avons également montré que nous pouvions suivre ces vésicules extracellulaires marquées par fluorescence dans l'embryon vivant. Nos expériences portent majoritairement sur les stades embryonnaires et larvaires, mais aussi sur les adultes pour certaines investigations.
Maintien et cr?ation de lign?es de poisson-z?bre pour l??tude de g?nes responsables de formes rares de surdit? cong?nitale
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
Les poissons-zèbres de ces lignées portent des mutations responsables de formes rares de surdité humaine, et le porteur prévoit chez eux des malformations de la mâchoire gênant le nourrissage, des malformations des extrémités des membres, une nage circulaire et des difficultés à tenir une posture horizontale. 3 500 poissons-zèbres sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le seul geste décrit est le prélèvement d'un bout de nageoire caudale, une fois, en moins d'une minute, sous anesthésie et analgésie, l'analgésie étant maintenue 48 heures. Les individus qui ne portent ni la mutation ni le transgène sont tués dès le résultat du génotypage, les porteurs servant à la reproduction jusqu'à ce que leur descendance soit elle-même en capacité de se reproduire, moment où ils sont tués à leur tour.
Objectifs
Ce projet vise ? ?tudier, dans le mod?le du poisson-z?bre, des g?nes dont les mutations sont ? l?origine de formes rares de surdit?. Il a pour but de d?crypter les m?canismes pathologiques et d?ouvrir de nouvelles perspectives diagnostiques et th?rapeutiques. Le s?quen?age et l'analyse du g?nome chez des familles de patients a permis d'identifier diff?rentes mutations impliqu?es dans des formes rares de surdit? isol?e ou syndromique (associ?e ? d?autres signes cliniques). Des lign?es mod?les de poissons-z?bres permettant d?analyser l?impact de ces mutations sur le d?veloppement de l'oreille interne et sur l'audition seront cr??es et maintenues. Des lign?es transg?niques permettant de suivre le devenir de certains types cellulaires et de mesurer l'activit? de voies de signalisation au cours du d?veloppement de l'oreille interne seront utilis?es.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la fonction de g?nes dont les mutations sont ? l?origine de formes rares de surdit?. En permettant l?identification des g?nes impliqu?s et le d?cryptage des m?canismes pathologiques qui en d?coulent, il permettra d?am?liorer le diagnostique g?n?tique et d?identifier de potentielles approches th?rapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
- pr?l?vement d'un petit bout de nageoire caudale sous anesth?sie et sous analg?sie: 1 fois, < 1 min
Impact sur les animaux
- anesth?sie : stress - pr?l?vement de nageoire caudale : douleur l?g?re soulag?e par l'analg?sie - isolement : stress - malformations de la m?choire : difficult? de nourrissage - malformation des extr?mit?s des membres : difficult? de maintien de posture et de locomotion - troubles ?ventuels du d?veloppement pouvant induire un stress
Devenir
Proc?dure 1 : les individus non porteurs de la mutation ou du transg?ne seront mis ? mort d?s l?obtention du r?sultat du g?notypage. Les individus porteurs de la mutation ou du transg?ne seront utilis?s pour la reproduction et le maintien de la lign?e et ne seront mis ? mort que lorsque leur descendance sera en capacit? de reproduction. Proc?dure 2 : - durant les 4 premi?res g?n?rations faisant suite ? la cr?ation du mod?le, tous les individus seront conserv?s en 2 lots (non porteur vs porteur de la mutation) pour le suivi du ph?notype dommageable. - ? partir de la 5?me g?n?ration, les individus non porteurs de la mutation seront mis ? mort d?s l?obtention du r?sultat du g?notypage. Les animaux porteurs de la mutation ou du transg?ne seront utilis?s pour la reproduction et le maintien de la lign?e et ne seront mis ? mort que lorsque leur descendance sera en capacit? de reproduction.
Remplacement
Le projet vise ? mieux comprendre comment l'oreille interne se forme pendant le d?veloppement embryonnaire, aussi bien dans des conditions normales que lorsqu?elle est touch?e par des maladies g?n?tiques rares. Ce processus est tr?s complexe et d?pend de nombreux facteurs, comme les interactions avec d?autres parties du cerveau et les influences de l?environnement. A ce jour, il n?est pas encore possible de reproduire compl?tement ce d?veloppement in vitro en laboratoire, car il s?agit d?un ph?nom?ne d?licat et interconnect? qui s'organise selon une architecture tridimensionnelle tr?s complexe. ?tudier des organismes vivants reste essentiel pour avancer dans la compr?hension de ces maladies et imaginer de nouveaux traitements.
Réduction
Le nombre d?animaux n?cessaire pour ce projet a ?t? rigoureusement calcul? selon les exp?riences ant?rieures, afin de limiter leur utilisation tout en garantissant la r?alisation du projet.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement adapt? et enrichi. Les poissons sont ?lev?s ? 28?C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/nuit de 14/10h. Le bien-?tre des animaux est assur? au quotidien, par un contr?le pr?cis des param?tres d?eau, de lumi?re et de temp?rature et une observation journali?re des poissons. Le milieu des poissons est enrichi avec l'apport de nourriture vivante stimulant l'instinct de pr?dation. Nous veillerons ?galement ? l'enrichissement social des poissons et nous veillerons ? une mise en reproduction r?guli?re. Pour ?viter toute douleur, les pr?l?vements de nageoire caudale sont r?alis?s sous anesth?sie g?n?rale et analg?sie. A la suite du g?notypage, les poissons sont maintenus en analg?sie pendant 48h. Pour les lign?es nouvellement cr??es, l?apparition d?un potentiel ph?notype dommageable sera suivi lors de la croissance des premi?res g?n?rations. Du fait de l?implication des g?nes ?tudi?s dans le d?veloppement de l'oreille interne, les poissons des nouvelles lign?es g?n?r?es pourraient pr?senter des difficult?s sp?cifiques dans la locomotion ou le maintien de posture (nage circulaire, mobilit? restreinte, difficult?s ? maintenir une posture horizontale), qui pourraient perturber la capacit? des poissons ? s?alimenter ou g?n?rer un stress. Le comportement des animaux face ? la nourriture sera observ? quotidiennement par les zootechniciens, qui seront attentifs ? un amaigrissement des poissons et ? des signes comportementaux de stress (immobilit? prolong?e, nage uniquement en surface ou au fond du bac). Des points limites stricts et sp?cifiques au projet seront mis en place.
Choix des espèces
Le d?veloppement de l'oreille interne du poisson-z?bre est tr?s similaire ? celui de l?Homme, notamment en ce qui concerne les g?nes impliqu?s, les types cellulaires intervenant et leur organisation. Cette esp?ce pr?sente plusieurs avantages pour la recherche : elle est tr?s prolifique, se d?veloppe rapidement et permet d??tudier le d?veloppement de l'oreille interne sur les embryons aux stades 1-5 jours post-f?condation, en utilisant peu d?animaux adultes reproducteurs. Les pr?l?vements pour suivi g?n?tique des animaux seront r?alis?s chez les adultes.
Etude de la différenciation sexuelle chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Capturés à l'épuisette puis amputés d'environ 10 % de leur nageoire caudale sous anesthésie, des poissons zèbres passent environ cinq minutes par procédure d'identification génétique. 33 600 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et le porteur annonce la mise à mort des poissons génétiquement modifiés à l'issue du projet. L'objet est de déterminer si un gène appelé wt1 commande la formation des ovaires ou des testicules chez cette espèce, en modifiant son activité dès les premiers stades de l'embryon. Les effets de ces modifications restent inconnus, un retard de croissance ou une infertilité étant annoncés comme possibles, et aucune procédure autre que le prélèvement de nageoire n'est décrite pour un effectif de cette taille.
Objectifs
De nombreuses maladies humaines présentent des différences selon le sexe des patients, aussi bien dans leur fréquence que dans leur évolution. Il est donc important de prendre en compte le sexe des individus dans les études utilisant des modèles animaux. Le poisson zèbre constitue un modèle de référence pour l’étude du développement et de nombreuses pathologies humaines. Cependant, les mécanismes génétiques impliqués dans la détermination sexuelle chez cette espèce restent encore mal caractérisés dans les souches utilisées en laboratoire, ce qui limite la prise en compte du sexe comme variable biologique dans les études utilisant ce modèle. Ce projet vise à comprendre le rôle d'un gène appelé wt1, déjà connu pour être essentiel dans le développement des organes reproducteurs chez les mammifères. Comme ce gène existe également chez le poisson zèbre, nous voulons déterminer s'il joue un rôle similaire. Pour répondre à cette question, nous modifierons l'activité de ce gène dès les premiers stades du développement de l'embryon, puis nous observerons les conséquences de ces modifications sur le développement des ovaires ou des testicules et par conséquent sur tout le développement sexuel de l’individu. L'objectif est de mieux comprendre comment le sexe est déterminé chez le poisson zèbre et d'améliorer l'utilisation de cette espèce comme modèle pour la recherche biomédicale.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes de détermination du sexe dans cette espèce facilitera l’interprétation des études biomédicales utilisant ce modèle, notamment lorsque l’incidence ou la progression des phénotypes étudiés dépend du sexe. Les bénéfices attendus sont de nature fondamentale et contribueront à l’amélioration des connaissances en biologie du développement et en biologie de la reproduction.
Procédures
Les manipulations des poissons nécessitent leur capture à l'aide d'une épuisette, ce qui peut provoquer un stress temporaire. Pour les identifier, un seul prélèvement correspondant à environ 10 % de la nageoire caudale (environ 2 mm²) sera effectué sous anesthésie, après administration d'un analgésique pour limiter la douleur. L'ensemble de la procédure dure environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles associées à ce projet sont principalement liées aux procédures d’identification des génotypes et aux conséquences possibles des modifications génétiques. Le génotypage des animaux porteurs de mutations ou de transgènes nécessite un prélèvement d'un fragment de la nageoire caudale. Cette procédure invasive peut induire un stress transitoire, une gêne de courte durée ainsi qu’une diminution temporaire de l’activité de nage ou une modification passagère du comportement alimentaire. Les effets des modifications génétiques sur le développement sexuel du poisson zèbre étant encore inconnus, des effets indésirables ne peuvent être totalement exclus tels un retard de croissance ou l’infertilité.
Devenir
A l’issue du projet, les animaux étant génétiquement modifiés seront mis à mort
Remplacement
Ce projet a été conçu et sera conduit dans le respect de la règle des 3R (remplacer, réduire, raffiner) : le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour étudier la biologie du développement et les mécanismes de différenciation sexuelle, qui reposent sur des processus dynamiques impliquant interactions tissulaires, vascularisation et organisation tridimensionnelle. À ce jour, les approches in vitro (cultures cellulaires, organoïdes) ne permettent pas de reproduire de manière fiable ces processus complexes et présentent des limites pour l’étude du développement des ovaires et des testicules in vivo. Néanmoins, une veille scientifique sera assurée et, si des méthodes alternatives pertinentes et validées deviennent disponibles, elles seront privilégiées afin de remplacer tout ou partie de l’utilisation des poissons zèbres.
Réduction
La planification des croisements et l'identification des animaux porteurs des modifications génétiques d'intérêt permettront d'ajuster la production animale aux besoins stricts du projet et d'éviter toute surproduction. Les schémas de croisement seront optimisés afin d'obtenir les animaux présentant les caractéristiques génétiques recherchées avec un nombre minimal d'animaux. Les effectifs ont été estimés à partir des proportions mendéliennes attendues des différents profils génétiques et du sex-ratio attendu chez le poisson zèbre (environ 50 % de femelles et 50 % de mâles), ainsi que du nombre d'animaux nécessaire à la réalisation des analyses prévues. Les modifications génétiques étant susceptibles d'influencer ce sex-ratio, les effectifs seront ajustés au cours du projet en fonction des résultats obtenus si cela est nécessaire. Les groupes de reproducteurs seront constitués de manière à respecter le comportement grégaire de l'espèce, à garantir la présence des deux sexes et à disposer d'un effectif suffisant pour la réalisation des analyses, tout en prévoyant des périodes de repos. Lorsque cela sera compatible avec les objectifs scientifiques, les mêmes individus pourront être utilisés pour plusieurs analyses afin de limiter le nombre total d'animaux utilisés. La production de nouveaux animaux sera interrompue dès que le nombre d'individus nécessaire à la réalisation des analyses prévues aura été obtenu.
Raffinement
Plusieurs mesures seront mises en œuvre afin de minimiser la douleur, le stress et la souffrance des animaux. Les prélèvements de nageoire caudale seront réalisés sous anesthésie, avec une durée d’anesthésie limitée au strict nécessaire et un prélèvement de taille minimale pour l’analyse génétique. Compte tenu de la forte capacité de régénération de la nageoire caudale chez le poisson zèbre, aucune séquelle durable n’est attendue. Une surveillance post-procédure sera assurée jusqu’à la reprise d’un comportement normal de nage et d’alimentation. Des points limites sont définis : tout animal présentant un réveil prolongé ou des troubles persistants de la nage sera euthanasié par surdose d’anesthésique afin de prévenir toute souffrance prolongée. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes aux recommandations pour l’espèce (densité adaptée, enrichissement du milieu et suivi sanitaire régulier) afin de limiter le stress et de favoriser leur bien-être.
Choix des espèces
Le poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle largement utilisé pour étudier le développement des organes et de nombreuses maladies humaines. Cependant, les mécanismes qui déterminent si un individu devient mâle ou femelle restent encore mal compris chez cette espèce. Mieux comprendre ces mécanismes permettra d'améliorer l'interprétation des études utilisant ce modèle, notamment lorsque le sexe influence les résultats. Cette recherche présente également un intérêt plus général, car elle permettra de mieux comprendre comment les mécanismes de détermination du sexe ont évolué chez les vertébrés. Elle pourrait aussi avoir des applications en aquaculture, où la maîtrise du sexe des animaux peut être utile. Enfin, le poisson zèbre est particulièrement adapté à ce type d'étude grâce aux nombreux outils disponibles pour modifier son patrimoine génétique et à des conditions d'élevage bien maîtrisées. Les analyses seront réalisées sur des poissons âgés de 19 à 30 jours après la fécondation, une période au cours de laquelle les organes reproducteurs se développent progressivement et se différencient pour former des ovaires ou des testicules.
Création de lignées de poissons-zèbres pour l’étude de la cicatrisation cutanée
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Tous tués en fin de projet parce qu'ils sont génétiquement modifiés et donc jugés non adoptables, 1 920 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour produire des lignées mutantes croisées avec des lignées fluorescentes dont d'autres travaux se serviront ensuite pour étudier la cicatrisation de la peau. Une minorité subit une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie pour l'identification génétique, ce qui suppose un isolement pouvant durer jusqu'à dix jours. Ces poissons sociaux peuvent alors s'immobiliser comme s'ils dormaient profondément ou changer de couleur sous l'effet du stress, et une partie des lignées développe à partir de six mois une déviation de la colonne vertébrale et un amaigrissement. Le porteur justifie le choix du poisson zèbre par ses capacités de réparation de la peau, du cœur ou de la queue et par la transparence de ses embryons, et décrit cet élevage de mutants comme un outil "puissant et indispensable".
Objectifs
Cette demande d'autorisation concerne la création de poissons zèbres génétiquement modifiés. Une meilleure réparation de la peau après blessure est une préoccupation majeure chez l'homme. Ainsi, dans la plupart des cas, après blessure, la surface de la peau se répare bien, au contraire de la partie inférieure de la peau. Il y a alors souvent formation d'une cicatrice qui peut être associée ou non à une perte de fonctions. Le poisson zèbre, lui, est un modèle de choix pour étudier la cicatrisation, car il présente des capacités étonnantes de réparation de sa peau mais aussi de plusieurs de ses organes (le cœur ou le cerveau par exemple). Pour autant, on ne sait pas précisément comment le poisson zèbre arrive à réparer aussi bien sa peau après blessure. L'objectif de notre projet est d'étudier la cicatrisation du poisson zèbre. Cette demande d'autorisation concerne plus particulièrement la nécessité, pour le projet, d'élever des poissons mutants. Ces mutations ciblent différents acteurs de la cicatrisation. Les poissons mutants seront croisés avec des poissons fluorescents permettant de visualiser respectivement les cellules superficielles de la peau ou les cellules de défense de l'organisme contre les agressions extérieures (une blessure par exemple).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est la mise à disposition de poissons qui pourront être utilisés pour l'étude de la cicatrisation cutanée. Ces poissons mutants ciblent différents acteurs de la cicatrisation de la peau et seront croisés avec des poissons fluorescents permettant de visualiser respectivement les cellules superficielles de la peau ou les cellules de défense de l'organisme contre les agressions extérieures (une blessure par exemple). A plus long terme, une meilleure compréhension des mécanismes de cicatrisation cutanée pourrait être précieuse en médecine humaine. L'épiderme conserve une grande capacité de réparation chez l’homme tandis que la réparation de la couche dermique profonde entraîne, dans la majorité des cas, la formation d'une cicatrice qui peut être associée à une perte substantielle de sa structure, de ses propriétés mécaniques et de sa fonction d'origine. Faciliter et améliorer la cicatrisation cutanée et minimiser l'impact esthétique sur le patient en améliorant la restauration de l'épiderme mais surtout du derme restent donc des préoccupations majeures pour garantir une bonne réparation des tissus et améliorer le bien-être des patients.
Procédures
Certains poissons seront soumis à une unique biopsie d'un fragment de nageoire réalisée sous anesthésie d'une durée d'environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Pour certains poissons, à partir de 6 mois, les signes à surveiller sont l'apparition d'une déviation de la colonne vertébrale et un amaigrissement. De plus, pour connaître l'identité génétique des poissons, il est nécessaire de prélever un petit bout de sa nageoire caudale, ce qui peut causer du stress chez le poisson, étant donné qu’il faut le capturer et le manipuler. Enfin, par nature, les poissons-zèbres sont des animaux sociaux qui ont besoin d’interaction avec leurs congénères afin de vivre au mieux durant les périodes de repos et d’activités. Les poissons zèbres placés en isolement lors de la période d'identification peuvent donc développer des comportements anormaux comme une apparence de sommeil profond, ou encore un changement de couleur dû au stress. La période d'isolement ne dure pas plus de 10 jours et est communément bien plus courte mais les délais d'obtention des cartes d'identité génétique peuvent nécessiter un isolement jusqu'à 10 jours maximum.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de projet. Les animaux étant tous génétiquement modifiés, on ne peut donc pas les faire adopter en fin de procédure.
Remplacement
Le processus de réparation de la peau intervient dans un environnement complexe qu'il n'est pas possible de reproduire entièrement in vitro. Par exemple, le recrutement des cellules de défense de l'organisme est un paramètre important. Par conséquent, l'utilisation d'animaux vivants est nécessaire pour ce projet.
Réduction
La capacité de fécondation externe des poissons zèbres permet d'obtenir facilement des embryons sans mise à mort des parents et donc de réduire le nombre d'animaux à utiliser. La sélection des poissons fluorescents (au stade embryonnaire) permet de n'élever et ne conserver que les poissons intéressants. Une minorité de poissons élevés pendant les 2 ans subira le prélèvement nécessaire pour établir son identité génétique. Le nombre de poissons nécessaires a été optimisé afin d'assurer la pérennité de chaque lignée.
Raffinement
Les poissons génétiquement modifiés susceptibles de développer des symptômes seront suivis avec une fréquence rapprochée, en portant une attention particulière aux signes préoces connus pour cette lignée. Des points limites adaptés à la procédure et suffisamment prédictifs et précoces ont été établis pour éviter tout mal être et souffrance des animaux. Les accouplements sont réalisés sur des paillasses recouvertes de photographies de flore aquatique afin de limiter le stress le plus possible. La réalisation des prélèvements de l’extrémité de la nageoire caudale (située à l'extrémité du tronc du poisson) sera effectuée sous anesthésie générale. Lors des périodes d'isolement, les animaux seront placés par 2 dans un bac avec un séparateur au milieu afin qu'il y ait échange hormonal et que les poissons isolés puissent tout de même voir et sentir leur congénère. De plus, lors de cet isolement les poissons bénéficieront de nourriture vivante (artémia).
Choix des espèces
Les outils génétiques disponibles chez le poisson zèbre peuvent aider à identifier le rôle des acteurs impliqués dans la réparation parfaite de la peau après blessure et de les suivre en temps réel . Ce projet d'élevage et de création de mutant va ainsi constituer un outil puissant et indispensable pour permettre ensuite de comprendre le rôle de ces acteurs. Le poisson zèbre est un modèle de choix pour étudier la réparation parfaite de ses organes chez les vertébrés car il montre des capacités de réparation étonnantes comme celle du cœur ou encore de sa queue. D'autres avantages comme le développement externe et rapide des embryons, leur transparence ainsi que celle des jeunes alevins et leur traçabilité génétique en font pourtant un modèle idéal pour l'imagerie de la dynamique de la cicatrisation. Dans nos conditions d’élevage, les poissons adultes atteignent leur maturité sexuelle à 6 mois et sont donc utilisés comme reproducteurs entre 6 et 12 mois pour produire les géniteurs de la génération suivante. L'identification génétique par biopsie d'un fragment de nageoire est réalisée sur des poissons de 3 à 5 mois car la distinction entre mâles et femelles ne peut pas être détectée plus tôt (pas de chromosome sexuel). Aussi nous pouvons préserver un bon ratio mâle-femelle dans nos élevages.
Etude de la plasticité cérébrale (neurogenèse adulte) après l’accouplement chez le poisson-zèbre
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Une injection unique sous anesthésie, de quelques dizaines de secondes, constitue toute la procédure déclarée pour 285 poissons zèbres, dans des expériences classées à un niveau de souffrance léger. Tous sont tués à l'issue pour prélever leur cerveau. L'objet est de vérifier si la parade nuptiale ou la présence de l'autre sexe stimule la production de nouveaux neurones, en comparant des groupes de mâles et de femelles avec ou sans interaction reproductive. Le résumé ne dit ni ce que contient l'injection, ni comment l'effectif de 285 a été calculé, la réduction renvoyant à des lignées transgéniques et à une "bonne puissance statistique" sans avancer un chiffre.
Objectifs
Le cerveau adulte des vertébrés est hautement plastique et s’adapte en permanence aux expériences de vie telles que l’exercice, la nutrition, et le stress. En plus des changements dans les connexions entre neurones déjà présents, il peut aussi produire de nouveaux neurones : c’est la neurogenèse adulte. Chez la souris, par exemple, la grossesse entraîne la production de nouveaux neurones qui s’intègrent dans des régions du cerveau impliquées dans l’odorat. Pour devenir fonctionnels, ces neurones doivent migrer vers les bonnes zones et établir des connexions avec les réseaux existants, un processus auquel participent d’autres cellules du cerveau. Une question encore peu étudiée est de savoir si les caractéristiques du trajet de migration de ces nouveaux neurones influencent leur durée de vie. Pour y répondre, nous comparons deux espèces : la souris, chez laquelle cette neurogenèse est transitoire après la reproduction, et le poisson zèbre, chez lequel elle pourrait être continue. Nous faisons l’hypothèse que, chez le poisson zèbre, des situations liées à la reproduction, comme la parade nuptiale ou la présence du sexe opposé, peuvent stimuler la production de nouveaux neurones. Pour tester cette hypothèse, nous analysons différents groupes de poissons (mâles et femelles, avec ou sans interaction reproductive) afin d’étudier les changements dans deux régions cérébrales impliquées dans l’odorat et le comportement.
Bénéfices attendus
La recherche proposée permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur la plasticité du cerveau adulte.Le bénéfice principal de ce projet est de comprendre si de nouveaux neurones sont formés à la suite d’un accouplement chez le poisson-zèbre, une espèce chez laquelle aucun comportement parental n’a été décrit, contrairement à la souris. A plus long terme, une meilleure compréhension des mécanismes et des conditions favorables à la neurogenèse adulte pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies visant à exploiter le potentiel des cellules souches neurales pour la régénération cérébrale et, par conséquent, contribuer au traitement des maladies neurodégénératives.
Procédures
Dans ce projet, les poissons adultes recevront une injection unique sous anesthésie au début de la procédure. La durée de l'injection est de quelques dizaines de secondes.
Impact sur les animaux
Les injections induisent une douleur temporaire au point de l’injection, et se feront sous anesthésie. Les injections sont susceptibles d'induire un inflammation ou des lésions, avec une fréquence très rare.
Devenir
A l'issue des procèdures, les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau.
Remplacement
Il est actuellement impossible de reproduire in vitro le milieu hormonal/environnemental/comportemental accompagnant l’expérience physiologique de la reproduction chez le poisson. De plus, l’objectif de cette étude étant de comprendre les mécanismes de plasticité cérébrale liée à la reproduction, elle ne peut pas être réalisée autrement que sur des animaux vivants, car on ne dispose pas actuellement de modèle in vitro reproduisant la complexité du fonctionnement du cerveau.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé en fonction des lignées transgéniques utilisées, en accord avec l’objectif de chaque procédure. Le nombre de poissons par groupe a été déterminé en fonction : - du nombre nécessaire pour assurer une bonne puissance statistique des résultats - de la variabilité biologique intrinsèque à l’espèce et aux techniques d’analyses utilisées
Raffinement
Les aquariums seront munis d’un fond de couleur foncée pour réduire le stress. Avant chaque injection, les poissons seront pesés pour adapter précisément le volume injecté à leur poids corporel. La contention sera limitée au strict nécessaire et une anesthésie appropriée sera utilisée afin de minimiser la douleur et le stress liés à la manipulation. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne, renforcée pendant plusieurs heures après les injections : état corporel et prise alimentaire, apparence externe, signes cliniques (notamment respiratoires), locomotion et comportement. Toute source de stress (densité, bruit, température, alimentation) sera étroitement contrôlée. Si les points limites sont atteints, une mise à mort sera réalisée.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un très bon modèle pour étudier la neurogenèse adulte. La neurogenèse chez les poissons est répandue et se poursuit tout au long de la vie, coordonnant la croissance du système sensoriel avec l'ajout continu de neurones dans le cerveau. L’intérêt de l’étude est d’analyser le cerveau de poissons après accouplement. Les femelles et mâles de l’étude seront donc utilisés à l’âge adulte, après la maturité sexuelle (estimée de 3 à 4 mois après la naissance).
Étude fonctionnelle de gènes pertinents dans l’étiopathogénie de la scoliose idiopathique chez le poisson-zèbre – EU2/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
27 116 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacun pouvant rester isolé jusqu'à quatorze jours en attendant son résultat de génotypage. Le prélèvement se fait sur la nageoire caudale sous anesthésie, et les poissons retenus enchaînent jusqu'à dix trajets entre deux établissements et cinq séances d'imagerie sous anesthésie générale, entre huit semaines et douze mois d'âge. Douze gènes sont inactivés séparément pour provoquer des déformations de la colonne vertébrale, dont le porteur admet qu'elles peuvent aussi affecter la croissance et la reproduction des animaux. L'effectif tient largement à la mortalité attendue entre le stade larvaire et l'âge adulte. Tous sont tués à l'issue, une partie pour les analyses post-mortem, le reste parce que leur modification génétique interdit tout replacement.
Objectifs
La scoliose idiopathique adolescente est une déformation tridimensionnelle de la colonne vertébrale qui touche 1 à 3 pourcents des enfants et adolescents, et dont l’origine reste aujourd’hui inconnue. Notamment, les mécanismes génétiques conduisant à cette déformation sont très mal élucidés. Ce projet aura pour objectif de mieux les comprendre. Il repose sur l’étude de familles présentant des cas de scoliose idiopathique, ainsi que sur l’analyse de modèles de poisson-zèbres mutants ayant développé des déformations vertébrales. L’analyse familiale, combinant l’analyse des déformations et une analyse génétique, a permis l’identification de six gènes d’intérêt. Par ailleurs, six autres gènes ont été mis en évidence à partir de lignées de poissons-zèbres mutants présentant des déformations vertébrales. Nous utiliserons dans ce projet des poissons zèbre et inactiverons séparément les gènes d’intérêt identifiés comme impliqués dans la déformation de la colonne vertébrale, afin d’étudier leur rôle dans l’apparition de la scoliose. Nous réaliserons chez ces poissons une analyse clinique par imagerie visant à détecter des déformations similaires à celles observées chez les patients, et nous étudierons leur comportement. Ce projet se réalisera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la scoliose idiopathique et, à terme, sa prise en charge. En étudiant le rôle de douze gènes candidats à l’aide de modèles de poissons-zèbres mutants, il permettra d’identifier les mécanismes biologiques à l’origine des déformations tridimensionnelles de la colonne vertébrale et de mieux caractériser les facteurs génétiques impliqués. La validation de l’implication de certains gènes contribuera à enrichir les connaissances fondamentales sur la physiopathologie de cette pathologie encore largement méconnue. Ces avancées pourraient, à plus long terme, avoir des retombées cliniques significatives. D’une part, une meilleure identification des déterminants génétiques pourrait permettre le développement d’outils diagnostiques plus précoces et plus précis, fondés sur l’analyse du génome. Cela favoriserait une meilleure anticipation de l’évolution de la scoliose, notamment en termes de sévérité, et une adaptation plus précoce de la prise en charge. D’autre part, l’identification des voies moléculaires impliquées pourrait ouvrir la voie, à plus long terme, à des approches thérapeutiques ciblées. Ce projet s’inscrit ainsi dans une perspective de médecine personnalisée, visant à mieux évaluer le risque individuel en fonction du profil génétique des patients et à adapter en conséquence les stratégies de suivi et de traitement, qu’il s’agisse de mesures conservatrices (comme le port d’un corset) ou d’interventions chirurgicales. En résumé, ce projet a pour objectif de faire progresser les connaissances sur les facteurs de risque de la scoliose idiopathique afin d’améliorer, à terme, le diagnostic, le suivi et la prise en charge des patients.
Procédures
Une partie des animaux sera testée sur le comportement (Etablissement 1) alors qu’une partie sera imagée pour caractérisation des déformations de la colonne vertébrale (Etablissement 2). Etablissement 1 : Afin de connaitre le patrimoine génétique des poissons zèbre génétiquement modifiés, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale est réalisé sous anesthésie générale. Un seul prélèvement est effectué par animal et ce en moins de 2 minutes. En attendant les résultats du génotypage (14 jours maximum), les poissons sont hébergés individuellement afin de garantir leur identification et d’éviter des confusions d’identification. Pour les études des comportements, les poissons seront transférés individuellement dans les arènes afin d’être filmé dans un temps limité (1h, 4 sessions au total). Etablissement 2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (établissement 1) jusqu’au centre d’imagerie (établissement 2) pour la réalisation d’une imagerie aux stades de 8 semaines, puis 3 ,4, 6, 12 mois. La durée du trajet est inférieure à 1h (animal vigile, 10 trajets au total). L’imagerie a lieu sous anesthésie générale et dure moins de 4 minutes pour chaque animal (5 sessions au total). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Concernant la création (6 gènes) ou la maintenance (6 gènes) de lignées mutantes pour ces 12 gènes au total (établissement 1), le phénotype dommageable attendu correspond à une déformation tridimensionnelle de la colonne vertébrale sans impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter. Nous ne pouvons pas exclure que l’inactivation d’un des gènes puisse entrainer en outre des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance ou leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique (établissement 1) est une petite plaie associée à un inconfort de courte durée. Le prélèvement est réalisé sous anesthésie générale qui génèrera un potentiel risque d’arrêt cardiorespiratoire en lien avec l’anesthésie, ce risque sera minime en raison de la très courte durée de l’anesthésie ainsi que la faible profondeur de narcose. Les animaux devront être hébergés seuls dans l’attente des résultats du génotypage (14 jours maximum) ce qui génèrera un stress. Le transport entre les deux établissements ainsi que la réalisation de l’imagerie par micro-tomodensitométrie peuvent être source de stress ou d’angoisse pour les poissons. Le protocole d’imagerie (établissement 2) est réalisé sous anesthésie générale et dure moins de 4 minutes, ce qui peut entrainer un risque d’arrêt cardiorespiratoire en lien avec l’anesthésie. Les tests comportementaux (établissement 1) seront associés à un stress social pour les poissons en raison du changement d’environnement et de l’individualisation (1h) nécessaire pour le test. La manipulation des poissons à l'aide d'une pipette en plastique peut également être source de stress et présenter un risque de blessure mécanique pour les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés, une partie afin de faire des analyses post-mortem pour répondre à notre question scientifique, et l’autre partie car ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Les études de l’effet de mutations génétiques sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la forme de la colonne vertébrale ni de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de l’absence de contact au sol via des membres, sont facilement susceptibles de développer des torsions axiales de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) et constituent ainsi un modèle de choix pour l’étude des déformations tridimensionnelles de la colonne vertébrale rappelant les scolioses idiopathiques chez l’humain.
Réduction
Le projet prévoit l’utilisation de 27 116 poissons zèbres. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, l’effectif a été défini en tenant compte : (i) des stades clés du développement pertinents pour tester les hypothèses du projet en incluant des poissons mâles et femelles ; (ii) de la répartition génétique attendue lors de croisements ; (iii) du nombre minimal d’animaux requis pour détecter des effets morphologiques, estimé à partir d’analyses statistiques issues d’études pilotes; (iv) du taux de mortalité entre le stade larvaire (6 jours) et l’âge adulte (3 mois) lié à la sensibilité de l’espèce aux conditions environnementales durant le développement précoce et v) des variations de l’environnement impactant la survie, la reproduction et le ratio male-femelle. Nous avons utilisé des tests statistiques pour définir les effectifs nécessaires dans nos lots expérimentaux. Les résultats de nos expériences seront analysés avec les tests statistiques adaptés afin d’obtenir une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Afin de limiter les procédures invasives, le prélèvement pour identifier le patrimoine génétique des poissons génétiquement modifiés sera réalisé préférentiellement sur de très jeunes larves par une méthode non invasive. Si cela n’est pas possible nous aurons recours à un prélèvement invasif sur les poissons adultes. Dans ce cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal sous anesthésie générale, par manipulation atraumatique, avec un prélèvement le plus petit possible et à l'aide d'instruments désinfectés. Les poissons seront maintenus en hébergement individuel uniquement pendant la durée nécessaire à l'identification génétique, pour une durée typiquement de 7 jours et exceptionnellement jusqu' à 14 jours maximum en cas de difficultés rencontrées pour les analyses. Cette durée sera toujours la plus courte possible, dès les résultats connus les animaux seront remis en groupe. Les poissons de lignées génétiquement modifiés présenteront une déformation de la colonne vertébrale qui ne doit pas impacter leur capacité à se nourrir ou se déplacer. Nous assurerons un suivi et une prise en charge spécifique pour ces animaux, si nécessaire, pour limiter au maximum l’impact de cette déformation sur leur bien-être et leur état général. Lors des tests comportementaux les poissons seront habitués à la salle de comportement pendant 30 minutes avant le début des tests afin de réduire leur stress. Lors des analyses morphologiques, le transport des poissons vers un site d'imagerie est organisé de manière à limiter le stress, avec des contenants adaptés, un contrôle de la température et un temps de trajet réduit au minimum. Toutes les manipulations seront réalisées de manière douce et calme, avec le matériel adapté et de façon à réduire au maximum le stress induit pour les animaux. Tous les animaux seront observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration entre les équipes de recherche, l’équipe vétérinaire et la structure chargée du bien-être animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des poissons.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre partage environ 70 pour cent de son génome avec l'humain et peut être modifié génétiquement avec succès par injection d'outils d'édition génique dans ses œufs. Dès l’âge de 3 mois, les poissons zèbre se reproduisent fréquemment, avec un seul couple adulte pouvant pondre plusieurs centaines d'œufs. Dans le cadre de l'étude de la scoliose, une déformation tridimensionnelle de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont peu adaptés. Le soutien apporté par leurs membres antérieurs leur permet de compenser partiellement cette déformation et d'en limiter la progression. Le poisson-zèbre, en revanche, constitue un modèle pertinent pour l'étude des déformations vertébrales. Sa colonne vertébrale présente des similitudes structurelles avec celle de l'humain, avec une organisation longitudinale composée de vertèbres mobiles et de disques intervertébraux organisés en plusieurs segments. L'analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par tomodensitométrie chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études antérieures. La génération et le maintien des lignées seront réalisés à partir de poissons âgés de 3 à 18 mois. Le prélèvement pour génotypage sera effectué au stade larvaire (2 à 3 jours jours post-fécondation) lorsque possible ou sur des adultes de 3 à 6 mois, âge optimal permettant une bonne récupération après anesthésie et limitant l’impact du prélèvement grâce à leur taille. L’analyse comportementale portera sur les stades larvaires de 1 à 4 semaines, période durant laquelle le comportement de recherche de nourriture est essentiel au développement, alors que les altérations morphologiques ne sont pas encore visibles. Cette fenêtre permettra de détecter d’éventuelles anomalies comportementales précoces. L’évolution du phénotype de scoliose sera étudiée par imagerie à 2 mois (stade juvénile à forte croissance, comparable à l’aggravation pubertaire chez l’humain), puis à 3, 4, 6 et 12 mois (stade adulte). Cette approche longitudinale permettra de suivre la progression de la déformation spinale au cours du temps. Le génotypage sera effectué au stade adulte et quand c’est possible sur des larves âgées de 1 à 6 jours post-fécondation.
Rôle de la glande pinéale dans l’établissement, le maintien et le photoentrainement des rythmes circadiens chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
8 800 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expériences portent sur des larves, dont 150 subissent l'ablation au laser des prolongements nerveux sortant de la glande pinéale, puis sont maintenues huit jours au maximum avant d'être tuées, l'anxiété induite étant évaluée en observant si elles se collent aux parois de leur boîte. L'objectif déclaré est de comprendre la synchronisation des horloges circadiennes, avec pour retombée annoncée une meilleure connaissance de la mélatonine, molécule largement consommée par les humains. Sur le remplacement, le porteur écrit qu'aucune stratégie sans animaux n'est "malheureusement" disponible aujourd'hui pour étudier les réseaux neuronaux du comportement locomoteur.
Objectifs
Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques gouvernant la mise en place et le fonctionnement du système nerveux central en utilisant le poisson zèbre comme organisme modèle. Nous procédons à des analyses histologiques sur des larves sauvages et transgéniques pour différents transgènes marqueurs de structures cérébrales. L’autre aspect de ce projet consiste en la réalisation de mesures d’activité locomotrice sur larves sauvages, mutantes ou enfin traitées avec un agent pharmacologique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'identifier les mécanismes permettant la synchronisation des horloges circadiennes chez un animal diurne, le poisson zèbre. Il contribuera à une meilleure compréhension du fonctionnement de la mélatonine, une molécule largement consommée par la population humaine soit sous prescription ou sous forme de complément alimentaire.
Procédures
Un lot d'animaux (150 larves tests) sera soumis à une ablation des prolongements axonaux sortant de la pinéale par méthode au laser. Ces animaux seront ensuite conservés durant au maximum 8 jours avant mise à mort.
Impact sur les animaux
Aucun des traitements n'induira de malformation ou létalité. Il est possible qu'une anxiété soit induite chez les larves traitées qui sera mesurée par thigmotaxie (rapport entre le temps passé au bord plutot qu'au centre de la boite).
Devenir
Toutes les larves utilisées seront mises à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
L'étude des réseaux neuronaux sous tendant le comportement animal (locomotion) ne peut être effectué in silico, in vitro ou ex vivo en sorte qu'aucune stratégie de remplacement n'est malheureusement disponible aujourd'hui pour ce projet.
Réduction
L'équipe s'intéresse uniquement au comportement des larves. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d’oeufs nécessaires à notre expérimentation. Pour obtenir des larves, ous utilisons des accouplements avec plusieurs mâles et femelles ce qui permet de diminuer le nombre d’expériences réalisées. Le fait d’analyser 96 larves simultanément et durant quatre jours permet de réduire le nombre de fondateurs nécessaires pour nos analyses. Les nombres de larves utilisées correspondent aux standards utilisés dans des études similaires pour atteindre des valeurs statistiques satisfaisantes. Nous utilisons des stratégies génétiques (transgènes plutot que mutations) permettant de diminuer le nombre d'animaux utilisés au minimum possible.
Raffinement
Durant les procédures, les larves sont maintenues dans des conditions optimales de température (27 degrés). Nous utilisons une grille de scoring qui a été validée par l'établissement elle fait appel à des mesures de comportement effectuées durant les expériences et à des observations sur la morphologie des larves. En effet, les larves anxieuses ont tendance à recher la proximité des parois. Leur niveau d'anxiété peut donc être évalué de manière simple.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un animal diurne donc plus pertinent à étudier que les rongeurs pour les questions de rythme circadien. Les larves de poisson zèbre ont des rythmes locomoteurs très marqués, plus robustes que ceux des adultes. Un rythme locomoteur robuste est observé à 5 jours de développement. Nos analyses de locomotion démarrent donc à ce stade.
Generation de lignées transgéniques pour étudier la formation de l’organe olfactif chez le poisson zébre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
1 312 poissons zèbres sur 2 920 vont être tués parce qu'ils ne portent pas le bon génotype, les 1 608 autres étant gardés pour la reproduction, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Certains individus issus de douze des trente lignées créées subissent une biopsie de moins de deux minutes, seul geste invasif prévu, suivie d'un isolement de moins de trois jours. Les adultes ne servent qu'à produire des embryons, dont le développement externe permet l'imagerie à haute résolution sur le vivant. Le porteur présente ce modèle comme permettant la transgenèse "sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur", dans un projet qui prévoit la mise à mort de 1 312 poissons au tri génotypique.
Objectifs
Notre projet vise à caractériser les mécanismes gouvernant la mise en place du système olfactif en utilisant le poisson zèbre Danio rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours du développement de cette structure, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent sur la mise en place précoce du système olfactif dont les évènements interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 30 nouvelles lignées pour visualiser les étapes précoces de la formation de notre structure d'intérêt et pour analyser le rôle de ces gènes candidats dans la mise en place précoce du système olfactif.
Bénéfices attendus
Le projet nous permettra d’établir de nouvelles lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons à mieux comprendre la mise en place de l’organe sensoriel olfactif. De plus ces lignées seront accessibles à toute la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle des molécules d’adhésion jonctionnelle, d'enzymes ou pour établir un modèle poisson zèbre de développement des neurones dopaminergiques impliqués dans de nombreux processus et pathologies.
Procédures
Certains individus issus de 12 lignées générées, pourront subir une biopsie. Le temps total de la procédure sera le plus court possible (moins de 2 min). Le prélèvement sera le seul geste invasif faits sur les animaux et une seule fois dans leur vie.
Impact sur les animaux
Les animaux générés par transgénèse seront observés et sélectionnés dès le 1er jour, ainsi toutes malformations du développement seront écartées rapidement. Ils seront suivis journalièrement, afin de détecter le plus précocement possible tous signes de souffrances, et ce sur 2 générations. Les individus issus de certaines lignées mutantes homozygotes, pourront présenter précocement des signes cliniques liés à l'âge. Le prélèvement de tissu invasif peut provoquer un stress lié à la manipulation (quelques secondes) et à l'isolement (
Devenir
Les animaux n'ayant pas le bon génotype seront mis à mort. Les autres animaux seront conservés à des fin de reproduction.
Remplacement
Des recherches ont montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains parmi lesquels 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, cela en fait donc un très bon modèle pour comprendre le développement de l’organe olfactif et la modélisation des maladies humaines. De plus, le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus intéressante pour l’injection, le suivis du développement embryonnaire et l’imagerie sur le vivant. C’est pourquoi notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre. L’espèce animale et notamment l’organisme entier utilisé ne peut donc être remplacée. Cela nécessite une approche in vivo sur l’animal.
Réduction
L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées. Nous utilisons les individus hétérozygotes comme "contrôles équivalents" pour avoir dans un même croisement d'individus hétérozygotes tous les génotypes d'intérêt pour nos expérimentations. Enfin, nous pouvons générer des individus adultes porteurs de transgènes et de mutations pour réduire le nombre d'adultes utilisés dans nos expérimentations.
Raffinement
Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement des méthodes non invasives d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour comprendre la formation de l'organe sensoriel olfactif à l'aide de lignées transgéniques fluorescentes qui marquent le territoire olfactif et les différentes populations cellulaires qui le composent.
Choix des espèces
Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques et morphomètriques régissant la mise en place du système olfactif dont la perturbation peut conduire chez l’Humain à des pathologies allant de la stérilité à l’anosmie. L’utilisation d’une approche in vivo sur un animal vertébré est nécessaire pour comprendre ces processus dynamiques et complexes. Le poisson zèbre présente de nombreux avantages dont la possibilité de procéder à de l'imagerie « in vivo » à haute résolution grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet également aisément et de façon non-invasive, le recourt à la transgénèse ainsi qu’à la mutagénèse dirigée pour établir les lignées mutantes ou transgéniques stables nécessaires à la dissection des processus moléculaires impliqués. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe, ce qui permet d'avoir accès à ses embryons facilement, et surtout sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulent entre le stade 1 cellule (oeuf) et 4 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. En effet, la mise en place du système olfactif s'effectue entre 12 heures post fécondation (hpf) et 36hpf. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives.
Étude fonctionnelle de gènes pertinents dans l’étiopathogénie de la scoliose idiopathique chez le poisson-zèbre – EU1/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Un supplément de 30 % est ajouté à l'effectif pour absorber la mortalité et les variations du sex-ratio, ce qui porte le projet à 27 116 poissons zèbres, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Douze gènes sont inactivés séparément pour provoquer des déformations de la colonne vertébrale, un morceau de nageoire caudale est prélevé sous anesthésie pour le génotypage, et chaque poisson attend seul dans son bac jusqu'à quatorze jours le résultat de cette analyse. Les animaux font ensuite jusqu'à dix trajets vers un centre d'imagerie et cinq passages sous anesthésie, à 8 semaines puis à 3, 4, 6 et 12 mois, pour suivre la progression de la déformation. Le porteur retient le poisson zèbre justement parce qu'il n'a pas de membres pour compenser une torsion de la colonne, contrairement aux quadrupèdes, et attend une déformation qui n'empêche ni de nager ni de se nourrir.
Objectifs
La scoliose idiopathique adolescente est une déformation tridimensionnelle de la colonne vertébrale qui touche 1 à 3 pourcents des enfants et adolescents, et dont l’origine reste aujourd’hui inconnue. Notamment, les mécanismes génétiques conduisant à cette déformation sont très mal élucidés. Ce projet aura pour objectif de mieux les comprendre. Il repose sur l’étude de familles présentant des cas de scoliose idiopathique, ainsi que sur l’analyse de modèles de poisson-zèbres mutants ayant développé des déformations vertébrales. L’analyse familiale, combinant l’analyse des déformations et une analyse génétique, a permis l’identification de six gènes d’intérêt. Par ailleurs, six autres gènes ont été mis en évidence à partir de lignées de poissons-zèbres mutants présentant des déformations vertébrales. Nous utiliserons dans ce projet des poissons zèbre et inactiverons séparément les gènes d’intérêt identifiés comme impliqués dans la déformation de la colonne vertébrale, afin d’étudier leur rôle dans l’apparition de la scoliose. Nous réaliserons chez ces poissons une analyse clinique par imagerie visant à détecter des déformations similaires à celles observées chez les patients, et nous étudierons leur comportement. Ce projet se réalisera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la scoliose idiopathique et, à terme, sa prise en charge. En étudiant le rôle de douze gènes candidats à l’aide de modèles de poissons-zèbres mutants, il permettra d’identifier les mécanismes biologiques à l’origine des déformations tridimensionnelles de la colonne vertébrale et de mieux caractériser les facteurs génétiques impliqués. La validation de l’implication de certains gènes contribuera à enrichir les connaissances fondamentales sur la physiopathologie de cette pathologie encore largement méconnue. Ces avancées pourraient, à plus long terme, avoir des retombées cliniques significatives. D’une part, une meilleure identification des déterminants génétiques pourrait permettre le développement d’outils diagnostiques plus précoces et plus précis, fondés sur l’analyse du génome. Cela favoriserait une meilleure anticipation de l’évolution de la scoliose, notamment en termes de sévérité, et une adaptation plus précoce de la prise en charge. D’autre part, l’identification des voies moléculaires impliquées pourrait ouvrir la voie, à plus long terme, à des approches thérapeutiques ciblées. Ce projet s’inscrit ainsi dans une perspective de médecine personnalisée, visant à mieux évaluer le risque individuel en fonction du profil génétique des patients et à adapter en conséquence les stratégies de suivi et de traitement, qu’il s’agisse de mesures conservatrices (comme le port d’un corset) ou d’interventions chirurgicales. En résumé, ce projet a pour objectif de faire progresser les connaissances sur les facteurs de risque de la scoliose idiopathique afin d’améliorer, à terme, le diagnostic, le suivi et la prise en charge des patients.
Procédures
Une partie des animaux sera testée sur le comportement (Etablissement 1) alors qu’une partie sera imagée pour caractérisation des déformations de la colonne vertébrale (Etablissement 2). Etablissement 1 : Afin de connaitre le patrimoine génétique des poissons zèbre génétiquement modifiés, un prélèvement du tissu de la nageoire caudale est réalisé sous anesthésie générale. Un seul prélèvement est effectué par animal et ce en moins de 2 minutes. En attendant les résultats du génotypage (14 jours maximum), les poissons sont hébergés individuellement afin de garantir leur identification et d’éviter des confusions d’identification. Pour les études des comportements, les poissons seront transférés individuellement dans les arènes afin d’être filmé dans un temps limité (1h, 4 sessions au total). Etablissement 2 : Les animaux seront transportés de l’animalerie (établissement 1) jusqu’au centre d’imagerie (établissement 2) pour la réalisation d’une imagerie aux stades de 8 semaines, puis 3 ,4, 6, 12 mois. La durée du trajet est inférieure à 1h (animal vigile, 10 trajets au total). L’imagerie a lieu sous anesthésie générale et dure moins de 4 minutes pour chaque animal (5 sessions au total). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Concernant la création (6 gènes) ou la maintenance (6 gènes) de lignées mutantes pour ces 12 gènes au total (établissement 1), le phénotype dommageable attendu correspond à une déformation tridimensionnelle de la colonne vertébrale sans impact majeur sur la capacité des poissons à se mouvoir ou à s’alimenter. Nous ne pouvons pas exclure que l’inactivation d’un des gènes puisse entrainer en outre des modifications de la physiologie des animaux et potentiellement affecter leur croissance ou leur capacité à se reproduire, sans pour autant les empêcher de se nourrir ou de se déplacer. L’effet indésirable prévu chez les animaux suite aux prélèvements de tissu au niveau de la nageoire caudale pour identification génétique (établissement 1) est une petite plaie associée à un inconfort de courte durée. Le prélèvement est réalisé sous anesthésie générale qui génèrera un potentiel risque d’arrêt cardiorespiratoire en lien avec l’anesthésie, ce risque sera minime en raison de la très courte durée de l’anesthésie ainsi que la faible profondeur de narcose. Les animaux devront être hébergés seuls dans l’attente des résultats du génotypage (14 jours maximum) ce qui génèrera un stress. Le protocole d’imagerie (établissement 2) est réalisé sous anesthésie générale et dure moins de 4 minutes, ce qui peut entrainer un risque d’arrêt cardiorespiratoire en lien avec l’anesthésie. Les tests comportementaux (établissement 1) seront associés à un stress social pour les poissons en raison du changement d’environnement et de l’individualisation (1h) nécessaire pour le test. La manipulation des poissons à l'aide d'une pipette en plastique peut également être source de stress et présenter un risque de blessure mécanique pour les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés, une partie afin de faire des analyses post-mortem pour répondre à notre question scientifique, et l’autre partie car ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Les études de l’effet de mutations génétiques sur lignées cellulaires ne permettent pas d’analyser la forme de la colonne vertébrale ni de suivre l’apparition de scolioses. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les poissons-zèbres, du fait de l’absence de contact au sol via des membres, sont facilement susceptibles de développer des torsions axiales de la colonne (contrairement aux quadrupèdes par exemple) et constituent ainsi un modèle de choix pour l’étude des déformations tridimensionnelles de la colonne vertébrale rappelant les scolioses idiopathiques chez l’humain.
Réduction
Le projet prévoit l’utilisation de 27 116 poissons zèbres. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, l’effectif a été défini en tenant compte : (i) des stades clés du développement pertinents pour tester les hypothèses du projet en incluant des poissons mâles et femelles ; (ii) de la répartition génétique attendue lors de croisements ; (iii) du nombre minimal d’animaux requis pour détecter des effets morphologiques, estimé à partir d’analyses statistiques issues d’études pilotes; (iv) du taux de mortalité entre le stade larvaire (6 jours) et l’âge adulte (3 mois) lié à la sensibilité de l’espèce aux conditions environnementales durant le développement précoce et v) des variations de l’environnement impactant la survie, la reproduction et le ratio male-femelle. Pour réduire le nombre d’animaux à élever, nous mettrons en place un protocole de génotypage au stade larvaire, en commençant par les gènes tph2 et uts2r. La réussite de ce protocole pourrait permettre de génotyper les animaux dès le stade larvaire, puis de n’élever que ceux nécessaires à la procédure 2 et la procédure 3. L’identification rapide des mutations impliquées dans des anomalies du développement reposera sur l’analyse de larves âgées de 2 à 6 jours (hors champ de la directive). L’inactivation du gène d’intérêt sera réalisée par une méthode d’édition génétique ciblée permettant d’observer rapidement les effets phénotypiques chez les larves et les jeunes poissons de la première génération. Pour nos calculs de puissance, nous utilisons nos résultats précédents sur des gènes impliqués dans les déformations. Nous utilisons un calculateur basé sur un t-test indépendant qui compare des animaux injectés contrôles à des animaux chez lesquels le gène ciblé a été modifié. Les tests statistiques utilisés dans nos publications sont des modèles linéaires à effets mixte qui tiennent compte de la taille de la ponte, de l’effet ponte en plus du génotype. Nous utiliserons au maximum 27 116 poissons zèbres, répartis en quatre lots expérimentaux. Du fait de variations de l’environnement impactant la survie et le ratio male/femelle, un delta maximum de 30 pourcents est ajouté.
Raffinement
Afin de limiter les procédures invasives, le prélèvement pour identifier le patrimoine génétique des poissons génétiquement modifiés sera réalisé préférentiellement sur de très jeunes larves par une méthode non invasive. Si cela n’est pas possible nous aurons recours à un prélèvement invasif sur les poissons adultes. Dans ce cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal sous anesthésie générale, par manipulation atraumatique, avec un prélèvement le plus petit possible et à l'aide d'instruments désinfectés. Les poissons seront maintenus en hébergement individuel uniquement pendant la durée nécessaire à l'identification génétique, pour une durée typiquement de 7 jours et exceptionnellement jusqu' à 14 jours maximum en cas de difficultés rencontrées pour les analyses. Cette durée sera toujours la plus courte possible, dès les résultats connus les animaux seront remis en groupe. Les poissons de lignées génétiquement modifiés présenteront une déformation de la colonne vertébrale qui ne doit pas impacter leur capacité à se nourrir ou se déplacer. Nous assurerons un suivi et une prise en charge spécifique pour ces animaux, si nécessaire, pour limiter au maximum l’impact de cette déformation sur leur bien-être et leur état général. Lors des tests comportementaux les poissons seront habitués à la salle de comportement pendant 30 minutes avant le début des tests afin de réduire leur stress. Lors des analyses morphologiques, le transport des poissons vers un site d'imagerie est organisé de manière à limiter le stress, avec des contenants adaptés, un contrôle de la température et un temps de trajet réduit au minimum. Toutes les manipulations seront réalisées de manière douce et calme, avec le matériel adapté et de façon à réduire au maximum le stress induit pour les animaux. Tous les animaux seront observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration entre les équipes de recherche, l’équipe vétérinaire et la structure chargée du bien-être animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des poissons.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre partage environ 70 pour cent de son génome avec l'humain et peut être modifié génétiquement avec succès par injection d'outils d'édition génique dans ses œufs. Dès l’âge de 3 mois, les poissons zèbre se reproduisent fréquemment, avec un seul couple adulte pouvant pondre plusieurs centaines d'œufs. Dans le cadre de l'étude de la scoliose, une déformation tridimensionnelle de la colonne vertébrale, les modèles animaux quadrupèdes sont peu adaptés. Le soutien apporté par leurs membres antérieurs leur permet de compenser partiellement cette déformation et d'en limiter la progression. Le poisson-zèbre, en revanche, constitue un modèle pertinent pour l'étude des déformations vertébrales. Sa colonne vertébrale présente des similitudes structurelles avec celle de l'humain, avec une organisation longitudinale composée de vertèbres mobiles et de disques intervertébraux organisés en plusieurs segments. L'analyse de la morphologie de la colonne vertébrale par tomodensitométrie chez le poisson-zèbre a déjà été validée par des études antérieures. La génération et le maintien des lignées seront réalisés à partir de poissons âgés de 3 à 18 mois. Le prélèvement pour génotypage sera effectué au stade larvaire (2 à 3 jours jours post-fécondation) lorsque possible ou sur des adultes de 3 à 6 mois, âge optimal permettant une bonne récupération après anesthésie et limitant l’impact du prélèvement grâce à leur taille. L’analyse comportementale portera sur les stades larvaires de 1 à 4 semaines, période durant laquelle le comportement de recherche de nourriture est essentiel au développement, alors que les altérations morphologiques ne sont pas encore visibles. Cette fenêtre permettra de détecter d’éventuelles anomalies comportementales précoces. L’évolution du phénotype de scoliose sera étudiée par imagerie à 2 mois (stade juvénile à forte croissance, comparable à l’aggravation pubertaire chez l’humain), puis à 3, 4, 6 et 12 mois (stade adulte). Cette approche longitudinale permettra de suivre la progression de la déformation spinale au cours du temps. Le génotypage sera effectué au stade adulte et quand c’est possible sur des larves âgées de 1 à 6 jours post-fécondation.
Etude de l’impact du microbiote sur les interactions hôte / agent pathogène infectieux viraux et bactériens
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
3 600 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère pour 2 000 d'entre eux, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes. Ils sont infectés par bain pendant deux à cinq heures, ce qui peut provoquer nécroses, lésions vasculaires et nage erratique. Le projet étudie comment le microbiote intestinal protège le poisson contre les infections virales et bactériennes. Le porteur présente le poisson zèbre comme un modèle qui "permet de remplacer en partie les modèles mammifères", tout en soumettant 3 600 individus à l'infection expérimentale.
Objectifs
L’étude des maladies infectieuses chez le poisson zèbre consiste à caractériser (1) les microbes qui causant des maladies infectieuses, (2) les bactéries naturellement associées au poisson (son microbiote), et leurs interactions. Pour comprendre les maladies infectieuses et leurs mécanismes, on les reproduit au laboratoire. Ceci permet d’étudier les signes cliniques et la mortalité induite, et de comparer les stratégies des microbes causant des maladies en aquaculture, ou affectant la santé humaine. Le microbiote joue un rôle très important pour protéger le poisson contre les infections, en induisant une résistance à la colonisation. Cette protection s’exerce via la compétition pour les ressources, la stimulation du système immunitaire et les interactions complexes au sein des communautés microbiennes. Cependant ces mécanismes restent mal compris. Les recherches menées sur des poissons zèbres « gnotobiotiques », c’est-à-dire à microbiote contrôlé, ont mis en évidence son influence sur la sensibilité aux infections, le développement immunitaire et les réponses inflammatoires. Ces études concernent surtout les stades larvaires, laissant encore peu explorés les effets aux stades juvénile et adulte, alors que la composition du microbiote évolue au cours du développement. Les modèles « gnotobiotiques » s’imposent donc comme des outils essentiels pour étudier les interactions entre l’hôte, son microbiote et les agents pathogènes. L’importance de ces interactions est soulignée par l’usage du poisson zèbre comme modèle en biologie du développement, infectiologie, neurologie et cardiologie. Comprendre les interactions microbiome–hôte permettrait une meilleure standardisation des modèles d’étude. Des modèles de poisson zèbre gnotobiotique existent déjà, couvrant les quatre premières semaines de vie du poisson, potentiellement jusqu’au stade jeune adulte. Divers modèles d’infection ont été standardisés. Les infections par balnéation reproduisent les voies naturelles d’infection des pathogènes étudiés et seront dans ce projet combinées à des prélèvements biologiques post-mortem. Ce projet vise à : (1) caractériser l’impact du microbiote sur les infections virales et bactériennes, (2) analyser les mécanismes des réponses immunitaires chez des poissons à flore contrôlée, et (3) évaluer l’influence du microbiome sur le développement du système immunitaire.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus en fin de projet sont les suivants : - Compréhension de l’impact du microbiome sur la sensibilité aux infections - Compréhension des mécanismes des réponses immunitaires des poissons à flore contrôlée lors de ces infections - Compréhension de l’impact du microbiome sur le développement de l’immunité du poisson-zèbre. Ces éléments sont essentiels pour le développement du modèle poisson zèbre en infectiologie, qui permet de remplacer en partie les modèles mammifères. Le modèle poisson zèbre gnotobiotique peut offrir un contexte expérimental particulièrement pertinent pour modéliser les interactions entre le microbiote et l’hôte et leur impact sur les infections, à la fois chez l’homme (dans le cadre d’approches « One health ») et chez les poissons d’élevage. La prévention des pathologies est un élément essentiel du développement d’une aquaculture plus « durable ».
Procédures
Les immunisations ou infections expérimentales sont réalisées sur poissons vigiles par bain et impliquent une séance de 1 heure (immunisation) - éventuellement réalisée de nouveau une seconde fois si rappel nécessaire- ou 2 à 5 heures (infections)
Impact sur les animaux
Les manipulations ainsi que la mise à jeun 24 heures avant l’infection peuvent engendrer un stress. L’infection peut conduire chez certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’injection, différentes lésions en particulier vasculaires, et une nage erratique.
Devenir
Les poissons de ce projet encore en vie en fin d’expérience seront euthanasiés pour prélèvement d’organes.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles cellulaires permettant d’étudier les réponses immunitaires systémiques des poissons. La compréhension des processus infectieux, la quantification des réponses immunitaires à l’échelle de l’organisme entier et en particulier la protection induite par les vaccins/immunostimulants, les migrations des globules blancs responsables de la protection et de la mémoire immunitaire, plus généralement la compréhension des interactions hôte-agent infectieux nécessitent de soumettre l’animal à une immunisation ou à une infection expérimentale. Le projet associé à cette DAP chez le poisson zèbre ne peut donc être réalisé avec des méthodes alternatives. Seul un animal ayant un système immunitaire adaptatif permet d’évaluer l’induction d’une réponse spécifique de l’antigène par globules blancs, ou un état de résistance lors d’une épreuve d’infection expérimentale.
Réduction
La taille des groupes (50 individus) a été fixée pour permettre à la fois d’évaluer des taux de survie ou de protection et de réaliser les échantillonnages pertinents sur un nombre suffisant d’individus dans le contexte très particulier des poissons zèbres gnotobiotiques sur lesquels nous avons très peu de recul à ce stade. Cette étude permettra précisément de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les projets à venir.
Raffinement
Le stress lié à la manipulation est compensé par anesthésie jusqu’à sédation pour une durée < 2 min. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères. Sous les aquariums, nous positionnerons un poster imitation « substrat ». Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle d’étude important des relations hôte-pathogène. La disponibilité de poissons zèbres gnotobiotiques est essentielle pour réaliser les recherches décrites ici. Des outils de manipulations de l’expression des gènes, de nombreux mutants, et la séquence complète du génome de cette espèce concourent aussi à son succès. De nombreux modèles de maladies humaines ont été développés chez le poisson-zèbre, non seulement chez la “larve” ou le jeune alevin, mais aussi aux stades plus tardifs ; le poisson-zèbre au stade adulte a été en particulier utilisé pour l’étude des relations entre les mycobactéries et leur hôte. Le modèle poisson zèbre est aussi un modèle de criblage de drogues. Il est donc important de comprendre les mécanismes et modalités des réponses immunitaires innées et adaptatives dirigées contre des agents infectieux, dans ce modèle. Dans ce projet, les poissons seront utilisés entre jour 6 post éclosion et 6 mois. Le modèle gnotobiotique a été caractérisé entre 6 et 28 jours post-éclosion. Des expériences seront aussi réalisées à des stades postérieurs, jusqu’à 6 mois afin d’examiner des poissons dont le système immunitaire adaptatif est complètement mature.