Autres poissons

720 killifishs (classés en autres poissons) vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Hébergés individuellement, ils subissent des tests de locomotion spontanée, d'anxiété et de cognition, un protocole d'exercice forcé de trois heures par jour et des séances de locomotion forcée, pour étudier un vieillissement accéléré. Le porteur décrit un amaigrissement et des changements comportementaux d'anxiété ou de résignation liés au vieillissement rapide de l'espèce. Il justifie le choix du killifish par sa rapidité et son coût moindre par rapport au rongeur et le présente comme un modèle "unique et indispensable".

Objectifs

Une problématique importante inhérente à la recherche sur les maladies associées au vieillissement est le temps nécessaire pour laisser les animaux développer naturellement certains phénotypes symptomatiques du vieillissement. En effet, les animaux modèles vertébrés utilisés couramment dans la recherche biomédicale comme la souris ou le poisson-zèbre ont des durées de vie pouvant dépasser les 3 ans. Ce temps incompressible ralentit énormément, les avancées de la recherche visant à diminuer les effets négatifs associés à l’âge. Afin de bénéficier de modèles de vieillissement accélérés permettant d’augmenter considérablement l’efficacité de la recherche, nous proposons d'utiliser le modèle de vieillissement accéléré, l'African Turquoise Killifish, et d'étudier l'efficacité (i) de modulations nutritionnelles, (ii) de traitements chroniques avec des substances naturelles ou synthétiques, (iii) des protocoles d'exercice chronique ou (iv) l'impact d'une manipulation génétique

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires en jeu au cours de l'âge. Nous pourrons évaluer quels événements biologiques sont à l'origine de la diminution de la locomotion, du déclin cognitif. Ceci permettra de désigner de nouvelles approches thérapeutiques comme les modulations nutrionnelles ou certains types d'exercice physique afin de mieux prendre en charge les pathologies liées à l'âge.

Procédures

Interventions: 1/génotypage: ne concerne que les animaux GMO, 1 intervention de deux minutes (sous anesthésie) 2/Locomotion spontanée: 3 interventions/poisson pour une durée de 90 minutes 3/Anxiété/cognition: deux interventions/poisson pour une durée de 60 minutes 4/Exercice chronique: 1 intervention/poisson 3heures/jours, 3 jours par semaine pendant 4 semaines 5/ Locomotion forcée: 2 interventions /poisson 120 minutes

Impact sur les animaux

Globalement pour l'ensemble de ces interventions, les nuisances où effets indésirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement naturellement rapide chez l'African Turquoise Killifish. Les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnées de changements comportementaux de type anixiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium).

Devenir

L'ensemble des poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés puisqu'il nous est nécessaire de prélever principalement le cerveau, le foie, l'intestin, ou le muscle squelettique (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les composantes moléculaires (attrition des télomères, cassures du double brin d'ADN, sénescence, séquençage ARN etc) qui nécessitent de prélever le tissu musculaire et donc l'euthanasie préalable des poissons.

Remplacement

Dans le cadre de ce protocole nous comptons générer 3 lignées génétiquement modifiées. Ces manipulations génétiques combinées à la puissance exploratoire du modèle killifish font de ces poissons un modèle unique et indispensable à l'échelle de l'organisme entier pour étudier de manière intégrée le rôle de nos cibles d'intérêts dans la progression du vieillissement (principe de remplacement).

Réduction

Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 10 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction) (tests non paramétriques, e.g t-tests, test de Mann&Whitney, One or two-Way ANOVA).

Raffinement

Les animaux soumis inclus dans les procédures sont hébergés individuellement dans un bac de 3 litres dans l'eau osmosée dont les paramètres biologiques sont trés controlés avec notamment une temperature de 28°C, un pH de 7, 5 et une salinité de 1000uS. Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie* lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental (principe de raffinement). * :La procédure d'anesthesie se fait en plongeant le poisson dans un volume de 200mL d'eau osmosée où l'anesthésique est administrée par voie balnéatoire. L'anesthésie est jugée satisfaisante, lorsque le poisson est ventre en l'air avec mouvement operculaire lent.

Choix des espèces

L'African Turquoise Killifish ou Nothobranchius furzeri est génétiquement modifiable et permet des études de grandes envergures de la même portée tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses, que celles menées chez le rongeur. De plus, un nombre quasi indéfini d’événements biologiques est quantifiable par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un nombre croissant de lignées transgéniques ont été générées et sont disponibles dans la communauté scientifique, et permettent de répondre à de vraies questions biomédicales. En tant que laboratoire académique nous pouvons facilement avoir accès à un grand nombre de lignées transgéniques (peu onéreuses). Pour toutes ces raisons, le Turquoise killifish est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser et étudier les pathologies liées à l'âge.

66 roussettes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces petits requins pêchés en mer sont soumis à des changements de salinité et de température pendant 24 heures avec quatre prélèvements sanguins, avant d'être tués pour disséquer leur moelle épinière et caractériser des cellules nerveuses, afin d'étudier l'adaptation des requins aux variations de leur milieu. Le porteur affirme que ces variations restent dans la gamme naturelle et n'attend de stress que lors des manipulations et des prises de sang. Il indique qu'aucune culture de ces cellules n'est possible faute de connaissances, et qu'il n'existe donc "pas d'alternative" in vitro.

Objectifs

Chez les poissons, comme chez les autres vertébrés, l’organisme adapte sa physiologie aux variations de son environnement grâce à la perception des fluctuations environnementales comme par exemple les variations de températures ou de lumière par son système nerveux central qui contrôle alors les sécrétions hormonales, notamment au niveau de l’hypophyse, qui régulent différentes fonctions biologiques. En plus du cerveau, il existe chez les poissons un système nerveux supplémentaire situé à l'extrémité caudale de la moelle épinière, appelé système neurosécréteur caudal. Ce système neurosécréteur caudal jouerait un rôle dans la coordination de différents processus physiologiques de l’organisme en réponse à des variations de salinité ou de température, comme montré récemment dans la littérature chez le flétan. Chez les requins, le système neurosécréteur caudal est constitué de neurones géants appelés cellule de Dahlgren. Bien qu’identifiées depuis longtemps, aucune étude récente n'a porté sur la caractérisation plus poussée de ces cellules. L'objectif du présent projet est d’analyser et de comparer les sécrétions hormonales des cellules de Dhalgren isolées à partir de roussettes adultes mâles qui auront été soumises à des changements de température et de salinités sur un temps court et dans le respect du principe des 3R.

Bénéfices attendus

L’analyse de la réponse hormonale des cellules de Dahlgren chez des animaux soumis à des variations de température et de salinité nous permettra d’établir ou non si ces cellules peuvent jouer un rôle essentiel dans l’adaptation des requins aux contraintes environnementales liées au changement climatique. A plus long terme, les bénéfices susceptibles de découler de cette étude chez une espèce de requin largement abondante sont de différents niveaux : (1) apporter des connaissances sur un modèle de requin qui seront bénéfiques à la compréhension des capacités d’adaptation d’autres espèces de requins dont les populations sont en danger ; (2) comparer les résultats obtenus sous un angle de l’évolution des espèces et d’identifier ainsi des processus fondamentaux conservés ; (3) disposer de marqueurs hormonaux en tant qu’outil pour caractériser les capacités d’adaptation d’une espèce donné en fonction de son environnement et ainsi adapter cet environnement pour un meilleur bien-être dans le cadre de programmes de préservation d’espèces aquatiques ou d’élevages. L’absence de variations hormonales des cellules de Dahlgren posera la question d’un autre rôle de ces cellules et c’est pourquoi nous prélèverons, en fin d’expérimentation, un maximum de tissus biologiques chez un même animal pour explorer différentes fonctions physiologiques.

Procédures

Des roussettes mâles adultes seront pêchées puis acclimatées dans des bacs de grande dimension alimentés avec de l'eau de mer naturelle à 15°C et sous un cycle de lumière artificielle 8L:16D correspondant aux conditions optimales décrites dans la littérature. Trois procédures dont les paramètres seront dans la gamme des conditions naturelles pour les requins, seront mises en place : (1) Test de salinité de 24h effectué sur 3 lots : 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer non diluée (100%) vers une eau de mer 100% (lot contrôle) ; 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer diluée (eau de mer à 80%) vers une eau de mer 100% ; 1 lot de 6 animaux transférés d’une eau de mer 100% vers une eau à 80%. (2) Test thermique de 24h effectué sur 3 lots : 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 15°C (contrôle) ; 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 10°C ; 1 lot de 6 animaux transférés de 15°C vers 20°C. (3) Test combinant les changements de température et de salinité et qui portera sur 5 lots, chacun de 6 animaux, sur une durée de 24h : eau de mer 100% vers 100% à 15°C; eau de mer 80% vers100% à 10°C; eau de mer de 80% vers 100% à 20°C; eau de mer 100% vers80% à 10°C; eau de mer de 100% vers 80% à 20°C. Pour l’ensemble des animaux, une série de 4 prélèvements sanguins à 0h, 6h, 12h et 24h après les transferts, de moins de 1mL et n’excédant pas, au total, 10% du volume sanguin de l’animal sera effectuée pour des analyses biochimiques. A la fin des expérimentations, les animaux seront mis à mort pour récupérer un grand nombre de tissus biologiques dont les moelles épinières pour la caractérisation des cellules de Dahlgren. Ces dernières seront analysées par des approches techniques hautement résolutives afin d’obtenir des résultats significatifs à partir d’un minimum de cellules, et donc d’animaux, collectées.

Impact sur les animaux

Les variations de température et/ou de salinité qui seront appliquées sont dans des gammes physiologiques et naturellement rencontrées par les requins, dont la roussette ; il n’y a donc pas de nuisance ou d’effet indésirable attendu sur la base de ces variations. Par contre, un stress et inconfort est attendu lors de la prise (manipulation) des animaux lors des transferts d’une condition à l’autre ainsi que lors des prélèvements sanguins. Ces derniers correspondent à un degré de sévérité de classe légère. Une acclimatation et une sédation sont envisagées.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement des cellules de Dahlgren en vue de leur caractérisation moléculaire et le prélèvement de différents organes pour analyser l’impact des variations de température et/ou de salinité sur différentes fonctions biologiques. Du fait de leurs localisations dans la moelle épinière, les cellules de Dahlgren ne peuvent être prélevées qu’après dissection.

Remplacement

L’impact des variations environnementales sur la physiologie de ce requin sera abordé en ciblant les cellules de Dahlgren mais également en prélevant un nombre maximum de tissus biologiques chez un même animal afin d’avoir une analyse plus large et plus intégrée. L'accès à la veine caudale, dans laquelle les hormones des cellules de Dahlgren sont libérées, est facilement accessible et permettra une analyse des sécrétions dans le temps et évitera ainsi d’utiliser des animaux supplémentaires. L’utilisation de culture de cellules de Dahlgren n’est actuellement pas possible du fait, justement, de l’absence de connaissances sur ces cellules spécifiques et il n’y a donc pas d’alternative in vitro disponible. Cependant, les hormones identifiées au niveau des cellules de Dahlgren au cours de ce projet seront, par ailleurs, testées in vitro sur des lignées cellulaires pour étudier leur mode d’action.

Réduction

L’expérimentation in vivo est réduite à 6 animaux par condition expérimentale pour permettre une analyse statistique appropriée pour les faibles effectifs. Les variations testées de température et de salinité, la durée de l’expérimentation ainsi que les temps de prélèvement des échantillons sanguins ont été définis et réduits au minimum sur la base des données bibliographiques. Ces données ont notamment montré qu’une exposition de la petite roussette, ou d’une autre espèce de requin, dans un milieu de salinité différente provoquait une variation significative des paramètres plasmatiques à 6h et que la réponse de tissus biologiques impliqués dans l’osmorégulation était observée entre 12h et 24h après le changement de milieu. Les températures choisies correspondent à celle qui impacte (20°C) ou non (10°C) la spermatogenèse et à celle qui impacte (20°C) ou non (15°C) la croissance embryonnaire de la roussette. Ces températures correspondent également à une augmentation de 5°C des température moyennes de surface des océans dans les scénarios de changement climatique. Ces données bibliographiques nous ont donc permis de bien cerner les conditions à tester et d’éviter l’utilisation d’un nombre plus important d’animaux. De plus, l’utilisation de technologies performantes à haute résolution permet d'obtenir des données statistiquement analysables à partir de faibles quantités d’échantillons, ce qui permet de limiter le nombre de cellules de Dahlgren à prélever, et donc d’animaux. Un maximum d’organes sera prélevé sur un même animal pour des études ultérieures liées au projet et pour leurs utilisations dans des projets différents réalisés par d’autres chercheurs s’intéressant à cette espèce.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant au minimum 4 semaines avant les expériences dans des systèmes à flux ouvert avec de l'eau de mer naturelle à 15°C, sous un cycle de lumière artificielle 8L:16D et ils seront en groupe à raison d’une densité de 5 animaux / 100L (environ 35kg/m3). Cette période de 4 semaines est justifiée par une préconisation généralement admise de 2 semaines de délai entre le transport des animaux et leur inclusion expérimentale auxquelles sont rajoutés 2 semaines minimum qui permettront une manipulation des animaux (caresses du museau, caresses ventrales, prise en main dans les bacs, tests d’immobilité tonique). Au cours de cette période, les animaux seront nourris de poissons ou de mollusques ad libitum à une fréquence d'une fois par semaine, ce qui est en accord avec le mode d'alimentation des requins. Les animaux seront également pesés et mesurés puis identifiés par un marquage externe (fil de couleur placé autour du corps devant la nageoire dorsale). Lors des tests, les animaux seront transférés dans un bac de 100L (hauteur de 60 cm) permettant une nage sans contrainte et ainsi assurer une bonne irrigation des branchies et, selon les conditions, permettant également aux animaux de boire. Lors de ces tests une observation de comportements de stress (nage rapide et comportement de fuite hors du bassin, rougeurs de la peau) entrainera aussitôt l’exclusion des animaux. Pour les prélèvements sanguins les animaux seront transférés dans un bac de petite dimension (1m x 0.30m) pour permettre leur sédation et la mise en place d’une pompe buccale non invasive pour assurer l’irrigation des branchies. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour procéder aux prélèvements des tissus biologiques.

Choix des espèces

L’espèce utilisée, Scyliorhinus canicula est un requin Carcharhiniforme non classé comme vulnérable (Least Concern) sur la liste rouge de l’UICN (Union internationale pour la conservation de la nature). Du fait de son abondance et de la disponibilité de données scientifiques, dont génomiques, cette espèce est considérée comme une espèce modèle pour l’étude des requins. Ces derniers appartiennent au groupe des poissons cartilagineux (Chondrichtyens) qui regroupe également les holocéphales (ou chimères) et les raies. Au cours de l’évolution, les poissons cartilagineux ont divergé des vertébrés osseux il y a environ 420 millions d’années. Ils constituent donc un taxon d’intérêt pour les études phylogénétiques. De plus, les études en physiologie des poissons s’intéressent très peu à celle des requins et des raies alors qu’ils constituent un groupe très différent des poissons osseux et qu’ils sont de plus en plus menacés dans nos écosystèmes marins. Seuls des animaux adultes de sexe mâle seront utilisés. Les roussettes mâles atteignent une maturité sexuelle à 6,6 ans pour une taille de 54 cm. Afin d’utiliser des lots homogènes, nous identifierons les animaux au préalable dans une gamme de taille de 60±3 cm et de poids de 680±30g. L’utilisation d’adultes est justifiée par le fait de prélever des animaux en milieu naturel qui aient eu des cycles de reproduction, donc moins impactant pour la ressource, et de disposer d’animaux de taille suffisante pour le prélèvement des échantillons biologiques.

200 petites roussettes, une espèce de requin, vont être utilisées dès le stade œuf dans des procédures classées en gravité légère, avec l'objectif de les relâcher en mer sous réserve de l'accord d'un vétérinaire. Elles sont marquées, mesurées chaque mois et exposées pendant un an à des champs électromagnétiques reproduisant ceux des câbles de parcs éoliens, avec des tests de respirométrie de 24 heures et des enregistrements vidéo de leur comportement. Le porteur reconnaît que la littérature manque de points limites pour l'expérimentation sur les poissons et que l'exposition prolongée pourrait altérer leur santé, auquel cas les individus seraient tués. Il présente le projet comme un appui à la fois à la conservation et à l'"exploitation durable" des espèces marines, dans le contexte du développement des énergies marines.

Objectifs

Dans le contexte de changement climatique, la production d’énergie constitue l’un des défis socio-économiques et environnementaux majeurs des décennies à venir et soulève d’importants enjeux stratégiques, économiques et financier. Les énergies marines renouvelables (EMR), basées sur le vent, les marées et les courants marins font des océans et des mers une source inépuisable d’énergie permettant de produire de l’électricité. Parmi elles, les parcs éoliens offshores (OWF) sont aujourd’hui en plein essor notamment en Europe. Les OWF peuvent induire du bruit, des vibrations, l’interruption de continuité écologique et des perturbations liées aux champs électromagnétiques qui peuvent avoir des impacts potentiellement négatifs sur les espèces marines. En transportant l’énergie produite, les câbles électriques sous-marins au sein des OWF génèrent des champs électromagnétiques (CEM) qui peuvent affecter le comportement d’espèces électro- et magnéto-sensibles , qui utilisent les champs électromagnétiques pour se déplacer et se nourrir. La forte croissance de l’éolien offshore risque d’amplifier ces effets mais les informations existantes sur leurs conséquences sur les communautés ichtyologiques restent aujourd’hui encore insuffisantes. Les études réalisées sont limitées à quelques espèces d’intérêt commercial et sur une durée relativement courte. Ce projet vise à répondre à cette lacune et à identifier et évaluer les effets des parcs éoliens en mer et leur raccordement sur les requins, espèces élétro-sensibles. L’état de santé des individus sera évalué à travers un panel d’indicateurs : survie, mesures taille/poids (i.e. biométrie) et suivi de la croissance, développement, métabolisme énergétique (i.e. indicateur de stress évalué via des mesures de consommation d’oxygène au repos et à l’effort)

Bénéfices attendus

L’implantation d’un parc éolien offshore entraine une modification de l’habitat. Au vu de la forte croissance de ces projets de développement, il est nécessaire de mieux connaitre les effets de ces structures sur les écosystèmes marins. Il existe très peu de connaissances à ce sujet les requins. Ces connaissances relatives à la biologie de ces espèces d’intérêt serviront de cas concrets pour la mise en place de suivi pérennes des populations aux sein des OWF afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines en général. Les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément comment les requins réagissent aux champs électromagnétiques. Ils permettront d’améliorer les connaissances des impacts des EMR sur les espèces marines et ainsi apporteront les informations essentielles aux gestionnaires et décideurs pour répondre aux enjeux de développement des EMR sans nuire au maintien de la biodiversité marine.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure de marquage sous cutané juste apres l'éclosion. Ce marquage durera une minute environ par individu. Cette marque permettra d'identifier chaque individu durant la phase expérimentale juvenile. Il y aura une procédure par individu qui durera 12 mois. Biométrie : une fois par mois les individus seront pesés et mesurés pour assurer un suivi de leur croissance et de leur bonne condition (indice de fulton) Mesures de respirométrie : chaque mois, chaque individu sera testé en respirométrie afin d’évaluer sa capacité métabolique aérobie. Ce test durera 24 h et 12 juvéniles par condition (i.e. contrôle, 3 différents champs électromagnétiques) seront testés soit 6 poissons par bassin. Tests comportementaux : les tests comportementaux auront lieu 1 fois par mois au stade juvenile soit pour 6 fois sur 6 mois. Une camera placée au dessus de chacun des bassins permettra d'enregistrer leur comportement à différents temps de la journée. L'experimentateur n'interviendra pas dans le bassin ni sur les animaux mais enclanchera les enregsitrement à des temps donné (1fois 2h le matin, 1 fois 2h l'apres midi, 1 nuit).

Impact sur les animaux

La littérature récente souligne le manque de connaissances s'agissant des points limites (objectifs et quantitatifs) applicables pour l'expérimentation sur les poissons, les réponses à la douleur étant par ailleurs très variables entre les espèces. L’ensemble des manipulations (mise en bassin, anesthésie, mesures taille poids, réveil, chasse avec un stick, respirométrie) seront réalisées sur une période de temps optimisée afin de minimiser un maximum ce stress. La condition des poissons (indice de condition, état général) sera évaluée au niveau individuel durant toute l’expérimentation. Le manque de connaissances sur l’impact des champs électromagnétiques sur les requins de manière générale ne permet pas de déterminer la sévérité de ce type d’exposition en amont. L’exposition aux champs électromagnétiques pourrait avoir des effets indésirables sur l’espèce étudiée. Li’solement sensoriel des individus dans les respiromètres pourrait engendrer un léger stress.

Devenir

Les individus seront relâchés dans l’environnement après accord d’un vétérinaire. Le cas échéant les individus seront euthanasiés. En effet les individus vont etre exposés de manière prologée à des champs électromagéntiques. SI cette expostion altere le développement ou a santé des individus ils ne pourront etre relachés dans l'environnement. Les individus marqués sont maintenus en vie et utilisés durant toute l’expérimentation

Remplacement

Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser l’impact des champs électromagnétiques sur les requins, aucune méthode alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne peut être envisagée puisqu’aucune méthode de remplacement ne saurait reproduire le développement et le comportement de cette espèce. Nous ne pouvons pas imiter la complexité d’un organisme en entier subissant des conditions particulières impactant sa biologie et son comportement en milieu naturel Aussi, pour atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines, l’évaluation de l’état écologique de l’écosystème marins doit pouvoir s'appuyer sur des connaissances relatives à l'écologie et la biologie des espèces vivants dans l’habitat impacté.

Réduction

Le nombre d’individus a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique L’exposition se fera au stade œuf de 4 semaines jusqu’au stade juvénile. En prenant en compte l’incertitude de la fécondation des œufs, du bon développement des embryons et la littérature existante, un nombre total de 25 individus par bassin est conseillé afin d’intégrer une variabilité naturelle représentative et ainsi garantir la robustesse des analyses statistiques et des résultats pouvant être extrapolé à l’échelle de la population.

Raffinement

Dans le cadre des procédures, plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors de l’élevage, de mesures biologiques telles que le poids et la taille, des tests comportementaux et l’évaluation de l’état de santé de l’organisme via des indicateurs de stress Une surveillance de routine sera effectuée quotidiennement dans les bassins d’élevage. Une bonne oxygénation du milieu et une température de 16°C seront maintenus tout au long de l’expérience, un cycle jour/nuit de 13h/11h. Les bassins seront enrichis de tubes PVC permettant de mettre à disposition des cachettes pour les individus. Lors de leur manipulation, en plus de l’utilisation d’anesthésiant, les individus seront placés en immobilité tonique afin de limiter le stress et la douleur. Les individus seront retirés de la procédure dès qu’un point limite sera atteint. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale) ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies). Une fois éclos, les juvéniles seront surveillés quotidiennement afin de s’assurer du bon état de santé des individus et bon état des installations. Des suivis plus poussés, notamment des tests comportementaux (e.g. prise alimentaire, locomotion) et écophysiologiques (métabolismes aérobie, indice de condition, croissance) , seront assurés par les agents une à deux fois par mois. Au bout d’un an, un point d’étape sera réalisé sur les travaux effectués sous la forme d’un rapport intermédiaire et d’une réunion dédiée. A l’issue de ces expérimentations, si les résultats le permettent, les données seront analysées et valorisées sous forme d’article(s) scientifique(s).

Choix des espèces

Les requins sont des espèces électrosensibles susceptible être impactées par les champs électro- magnétiques générés par les OWF. L’ensemble de ces espèces sont présentes sur les différents sites d’étude avec un degré de mobilité plus ou moins importants. La petite roussette (classée « préoccupation mineure » par l’IUCN) présente globalement une sédentarité au site avec des déplacements relativement limités. L'étude débutera au stade embryonnaire (oeuf de 3-4 semaines) jusqu'au stade juvénile de 6 mois. Les oeufs sont fixés par les femelles sur le lieu de ponte qui peut être par consequent un parc éolien. Ensuite, les juvéniles sont très peu mobiles à la naissance et vont rester sur la zone de ponte quelques mois. Afin d' évaluer l'impact des champs électromagnétiques sur le développement il est donc nécessaire d'exposer les individus à partir du stade embryonnaire. Le stade de 3-4 semaines permet de s'assurer de l'a viabilité et de la fécondation des oeufs avec un embryon qui commence à être visible. Cela permet de ne pas exposer d'oeufs dits "clairs" et non fécondés.

4 260 médakas et cichlidés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Ils sont élevés pour fournir des œufs et des animaux dans le cadre de "prestations" à des laboratoires, les femelles voyant leur abdomen gratté pour récolter les œufs, et une partie est soumise à des tests de conditionnement opérant pendant une vingtaine de jours avant une étude neuroanatomique après leur mise à mort. Le porteur veut montrer que ces poissons disposent d'une mémoire de travail et de fonctions cognitives comparables à celles des mammifères et des oiseaux. Il affirme que les comportements observés "ne peuvent être remplacés" et nécessitent une approche sur l'animal vivant.

Objectifs

Ce projet a pour but de maintenir des élevages de médakas et de cichlidés dans le but 1/ de la fourniture d’oeufs et d’animaux dans le cadre de prestations à des laboratoires privés ou publiques, 2/ d’études comportementales. Les fonctions exécutives représentent les capacités cognitives nécessaires pour organiser une séquence d’actions vers un but (comportements dirigés par un but). Cela implique une mémoire de travail, de l’attention et un contrôle inhibiteur (capacité à ne pas être distrait par des stimuli non pertinents), qui sont les composantes de base de tâches telles que la planification, la prise de décision, le raisonnement ou la résolution de problèmes. L’observation comportementale des poissons téléostéens suggère que les fonctions cognitives d’ordre supérieur ne sont pas limitées aux mammifères et aux oiseaux. Certains poissons téléostéens comme les Labres et les Cichlidés présentent des comportements semblables à ceux de l’utilisation des outils, l’utilisation du miroir (reconnaissance de soi), la pensée logique telle l'inférence transitive (la reconnaissance d'un lien entre deux objets), la reconnaissance individuelle, et une communication multimodale complexe. Notre projet consiste donc à étudier le comportement de cichlidés (Neolamprologus Brichardi, Amatitlania nigrofasciata) et de médaka (Oryzias latipes) lors de taches de conditionnement opérant afin d'évaluer la mémoire de travail.

Bénéfices attendus

Ces tests comportementaux ont déjà donné de bons résultats sur une autre espèce de poisson. L'idée de ce projet est de pouvoir montrer que ces tests sont applicables sur différentes espèces de poissons mais aussi de montrer que les poissons ont une mémoire de travail fonctionnelle. Par la suite, en combinant des approches anatomiques, comportementales et pharmacologiques, il serait possible d’identifier les zones de cerveau impliquées dans les fonctions exécutives chez les poissons.

Procédures

Lors de l'elevage de médaka, la récolte des œufs s’effectue le matin, en grattant l’abdomen des femelles. Nous veillons à ce que le geste soit rapide et que la femelle soit maintenue dans l’eau afin de limiter le stress de l’animal. Les animaux seront soumis à des tests comportementaux de type conditionnement opérant basé sur un système d'apprentissage par récompense. Il y a aura 4 tâches comportementales différentes mais chaque animal ne sera soumis qu'à une seule de ces tâches. Les tâches comportementales sont répétées pendant 20 jours maximum à raison d'une quinzaine de minutes par jour.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de l’élevage des animaux, aucune nuisance ne devrait être détectée sur les animaux. Si un quelconque effet délétère est observé (mal-être, maladie, blessure), une grille de point limite déterminera la marche à suivre concernant le devenir du poisson (ajout d’enrichissement, isolement, soin, ou euthanasie).

Devenir

Tous les animaux utilisés seront euthanasiés à la fin du projet afin de pouvoir procéder à une étude neuroanatomique après les tests comportementaux.

Remplacement

Dans le cas de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées. Les comportements observés sur les animaux aquatiques sont non prévisibles ou reproductibles. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les études comportementales se font directement sur l’animal vivant et sont réalisées dans des conditions optimales de bien être pour l’animal. De plus les études comportementales peuvent apporter des informations fondamentales en relation avec de grandes questions biologiques.

Réduction

Une attention particulière sera portée à la gestion du cheptel, notamment via le logiciel Anibio, afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaires au maintien du cheptel et aux prestations de services. Pour le comportement, nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses et nous privilégierons des tests statistiques non-paramétriques (Mann Whitney U test, test de Kruskal Wallis, test de Wilcoxon). Par ailleurs, lors d’analyses comportementales l’animal pourra être son propre témoin ou encore être utilisé lors de plusieurs procédures expérimentales diminuant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Il est à noter que les animaux pour l’étude du comportement seront issus de l’élevage dédié à la production d'œufs.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Le médaka est une espèce grégaire, il est donc placé en groupe dans les aquariums d'élevage. Les cichlidés étant des poissons territoriaux, nous avons mis en place des cachettes sous forme de tuyau pvc afin de réduire les comportements agressifs. Les paramètres de la qualité de l ‘eau seront surveillés, ainsi que le bien être et la santé de nos poissons. Nous n'attendons pas de souffrance lors de nos tests mais dans chaque cas, nous suivrons les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience ou à une euthanasie. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, rétraction des pigments.

Choix des espèces

Les poissons téléostéens ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses comportementales, aussi bien pour des comportements « innés » (fonctions motrices et sensorielles) que pour des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage).Ces comportements ont déjà été observé chez plusieurs espèces de cichlidés. De plus la croissance rapide du médaka, son développement externe dans un œuf avec tous les stades de développement directement accessibles et sa facilité de modification génétique en font un modèle de choix. Nos tests de comportement font appel à l'apprentissage ce qui nécessite la maturité du système nerveux ; celle-ci est atteinte à partir de 3 mois chez le médaka ce qui correspond à la maturité sexuelle. Pour avoir des individus de bonne taille, les tests sont donc généralement réalisés sur des individus âgés de six mois à un an chez le médaka. Les cichlidés n'ayant pas la même croissance les tests peuvent être réalisé à partir de 6 mois.

3 600 poissons juvéniles, sars et saupes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont maintenus en cage un mois dans des zones portuaires, une partie déplacée d'un milieu peu pollué vers un milieu pollué, avant des prélèvements post-mortem d'otolithes, de foie, de muscle et de branchies. Le porteur reconnaît que l'encagement et l'exposition chimique peuvent induire un stress additionnel, qu'il estime non létal. L'objectif déclaré est de mieux cadrer les opérations de restauration écologique des ports.

Objectifs

L’urbanisation des zones côtières a entrainé des changements extrêmes et irréversibles sur les écosystèmes marins. La destruction des habitats naturels subtidaux est considérée comme une des plus grandes menaces pour la diversité des populations et des écosystèmes marins. C’est pourquoi de plus en plus d’opérations de restauration écologique visant à limiter l’impact des infrastructures «grises» sur les écosystèmes marins voient le jours dans les zones marines urbaines. A ce jour, les projets de restauration menés dans les ports visent à accroitre la complexité tridimensionnelle des ouvrages pour en augmenter la qualité en tant que nourriceries pour les juvéniles de poissons, contribuant ainsi au maintien des populations tout en assurant leurs fonctions. Si ces opérations montrent effectivement une recolonisation des ports par des juvéniles, elles ne prennent généralement pas en compte l’influence des processus denso-indépendants, comme la qualité du milieu environnant. Or, les activités anthropiques font des ports le réceptacle de contaminations microbiologiques et chimiques pouvant impacter les sédiments et la colonne d’eau et affectant négativement la physiologie, la santé, le comportement et la survie des organismes marins, en particulier des jeunes stades de poissons. Afin d’estimer si des opérations de restauration de nourriceries en zones marines urbaines peuvent atteindre leurs objectifs de maintien de la biomasse et de connectivité des populations, il est donc nécessaire d’évaluer au préalable l’impact de ce milieu particulier sur les juvéniles de poissons. L’objectif du projet est de qualifier l’état physiologique des poissons marins côtiers en zones marines urbaines restaurées par comparaison à des zones non urbaines, et de tester l’existence d’une acclimatation et/ou d’une adaptation à la pollution de la population générée par une phase juvénile en zone marine urbaine, au travers de la question : une exposition juvénile à des niveaux de pollution contrastés dans les nourriceries se traduit-elle par une réponse physiologique et écotoxicologique différente des individus?

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre l’effet d’un séjour en nourriceries dans des zones fortements polluées, et permettra de mieux contrôler les conditions de succès des opérations de restauration écologique dans ces milieux.

Procédures

Pas d'interventions et de gestes techniques sur les poissons autres que l'encagement pour une durée d'un mois. Tous les prélèvements seront effectués post-mortem. Les tissus prélevés sont les otolithes, le foie, le muscle, la nageoire caudale et les branchies.

Impact sur les animaux

L’encagement pourrait être une source de stress pour les animaux. Les sars et saupes encagés pourront continuer à exprimer leurs comportements sociaux et alimentaires mais dans un rayon d’action limité par rapport au milieu naturel. Deux populations sur les trois utilisées lors de l’encagement dans les deux zones portuaires (soit au total 80 individus sur 120 par zone portuaire) seront introduites dans un milieu pollué alors qu’elles provenaient d’un milieu moins pollué. Cela pourrait induire un stress additionnel (chimique) sur ces individus, mais ce stress ne devrait pas être létal.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Il est impossible de substituer l’utilisation des animaux pour ce projet, car il a pour but d’étudier l’impact d’un milieu environnant sur la physiologie du poisson.

Réduction

En physiologie/écotoxicologie, étant donné la forte variabilité inter-individuelle attendue dans l’analyse des biomarqueurs, 25 (+ 5) individus correspond au nombre minimum d’animaux nécessaire. Ce nombre est comparable à ce qui est fait en routine dans le cadre des programmes de biomonitoring actif.

Raffinement

Lors de l’encagement, une surveillance accrue sera effectuée (1 plongée par jour) afin d'observer le comportement et le bien-être des poissons. Afin d’enrichir les cages par la colonisation d’algues épiphytes sur les grilles, celles-ci seront immergées 8 semaines avant l’hébergement des poissons. Outre le fait d’offrir un habitat le plus proche possible du milieu naturel, cet enrichissement naturel apportera une source additionnelle de nourriture pour les juvéniles de poissons. De plus, des roches seront ajoutées dans chaque cage afin de reproduire l’habitat naturel.

Choix des espèces

Le sar et la saupe sont des espèces côtières dont la phase juvénile se déroule dans des nourriceries. Les opérations de restauration écologique avec immersion de structures tridimentionnelles dans les ports ont montrés que les juvéniles de ces deux espèces étaient abondantes sur ces sites restorés. De plus, certaines ressources génétiques existent déjà pour ces espèces, ce qui facilitera l’analyse des résultats génétiques obtenus dans ce projet. Les espèces du genre Diplodus sp. et Sarpa salpa sont numériquement bien représentées dans le milieu naturel et l’échantillonnage réalisé ne mettra pas en péril la ressource.