Poissons

3 880 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiés pour porter des mutations liées à des malformations humaines du visage et du cœur, ils subissent un prélèvement d'un fragment de nageoire sous anesthésie, et le porteur indique que les lignées peuvent présenter des malformations du squelette et de la tête. Des tests comportementaux de nage en réponse à des stimuli sonores et lumineux sont réalisés sur les larves. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" car les études in vitro ne rendent pas compte du développement en trois dimensions du cœur ou des mâchoires.

Objectifs

Les malformations congénitales, diagnostiquées dans 2-3% des naissances sont un enjeu majeur de Santé Publique. Les malformations du visage et du cœur sont une composante fréquente des syndromes de malformations congénitales humaines et sont donc d'une importance clinique majeure. Les deux impliquent généralement une lourde charge médicale et chirurgicale. De plus, parmi les malformations congénitales humaines, les malformations affectant la forme du visage sont peut-être les plus frappantes en raison des attentes culturelles et des conséquences psychologiques. La majorité des alterations du visage et du coeur sont la conséquence d’un défaut de développement de l’embryon qui est provoqué par la mutation d’un gène. L’objectif de ce projet est d'élucider les mécanismes moléculaires et développementaux qui causent des malformations grâce à l’analyse de poissons zèbres qui portent des mutations dans certains gènes.

Bénéfices attendus

L'étude des poissons zèbres qui portent des mutations dans des gènes récemment identifiés dans des pathologies humaines devrait fournir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires responsables de ces maladies rares et sur le développement normal du visage, du cœur et du cerveau.

Procédures

Les animaux subiront des prélèvements sous anesthésie d'un bout de nageoire, pour l’analyse de l’ADN. La procédure consiste à anesthésier le poisson adulte jusqu’à absence de réflexe au toucher (environ 3 minutes) puis un segment de 3mm de la nageoire caudale est coupé. Le poisson est ensuite placé à nouveau dans l’eau et il se réveille au bout de 1-2 minutes. Les poissons régénèrent spontanément leurs nageoires en quelques jours et il n’y a pas d’effets nocifs à long terme. Cette procédure sera nécessaire pour chaque animal génétiquement modifié et sera effectuée une seule fois au cours de la vie de l'animal.

Impact sur les animaux

Les lignées génétiquement modifiées pourront présenter des malformations du squelette, de la tête (diminution de la taille de la mâchoire, aplatissement de la face) ou des altérations des paramètres de la nage témoignant de problèmes moteurs ou de nutrition (amaigrissement).

Devenir

Procédure 1 : Tous les poissons génétiquement modifiés et âgés entre 20-24 mois (âge à partir duquel ils n’arrivent plus à se reproduire) ou toujours en vie à la fin du projet, seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Procédure 2 : À la fin de la procédure qui a pour but l'étude post-mortem de l’ensemble des caractères visibles de poissons mutants, les poissons seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Procédure 3 : À la fin de la procédure, qui a pour but l'observation, sur une brève période, du comportement de nage des larves en réponse à des stimuli sonores et lumineux, les poissons seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique.

Remplacement

Notre objectif est de comprendre les mécanismes moléculaires et développementaux qui sous-tendent certaines malformations du visage et du cœur et la déficience intellectuel. Le recours à des modèles animaux est indispensable pour réaliser ces études car les études in vitro ne peuvent pas complètement rendre compte de la complexité des processus mis en jeu, par exemple, le développement complexe en 3 dimensions du coeur ou les interactions entre des populations de cellules qui donneront lieu aux mâchoires.

Réduction

Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Nous générerons uniquement le nombre d’animaux nécessaires à nos projets. La fécondité élevée chez cette espèce est un avantage, car elle permet d’obtenir beaucoup d’embryons, à partir d’une population restreinte de reproducteurs adultes.

Raffinement

Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance journalière, avec un dénombrement des poissons affectés par symptôme. Compte-tenu des gènes impliqués, des malformations du squelette de la tête ou de la capacité de nager sont attendues parmi les phénotypes spécifiques. De ce fait, ces altérations ne seront pas un critère éliminatoire. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lésion) ou comportementaux (fort amaigrissement, immobilité) seront suivis et scorés tout au long de la croissance du poisson. Les poissons dépassant les points limites définis seront euthanasiés. La procédure de prélèvement d’un fragment de la nageoire caudale (pour l’analyse de l’ADN) sera réalisée sous anesthésie générale. De plus, un enrichissement du milieu sera effectué par la constitution de groupes sociaux, la mise en reproduction régulière et l’ajout de nourriture vivante.

Choix des espèces

Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette de la tête et de la mise en place de l’orientation du cœur car ces processus chez le poisson zèbre sont similaires à ceux des mammifères. Le poisson permet du fait de la transparence des embryons et des larves, une observation non invasive des organes et cellules in vivo. Il permet d’établir des lignées génétiquement modifiées. -Pour la sélection des nouvelles lignées, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale pour l’analyse d’ADN sera réalisé sur poisson adulte, car prélever ce tissu aux stades plus jeunes serait trop endommageant. -L'analyse d'orientation du cœur sera réalisée sur des embryons âgés de moins de 5 jours post fertilisation, car l'orientation du cœur est déjà établie avant ce stade. -Les analyses du développement du squelette seront réalisées à trois stades clefs du développement : formation du squelette de la mâchoire à 5-7 jours post fertilisation ; début de la formation du crâne à 4 semaines post fertilisation ; squelette entièrement formé à 3 mois de vie. -L’observation de la taille sera réalisée sur des poissons à trois stades clefs de la croissance du poisson : à 18 jours post fertilisation, un stade larvaire ; à 28 jours post fertilisation, un stade juvénile, lorsque la plupart des caractéristiques adultes ont été acquises, sans maturité sexuelle ; à 11 semaines post fertilisation, un stade adulte. -Les tests comportementaux seront réalisés sur des poissons âgés de 10 jours post fertilisation, une étape à laquelle le développement neurologique est suffisamment mature pour pouvoir tester le comportement en réponse à des stimuli.

370 poissons sauvages, bars européens et lieus jaunes, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque individu subit une chirurgie abdominale sous anesthésie pour l'implantation de marques électroniques, avec prélèvement d'écailles et d'un fragment de nageoire. 350 poissons sont relâchés en mer après marquage et 20 sont tués en milieu contrôlé pour caler le protocole sur le lieu jaune. Le porteur indique que le traumatisme de la pêche, de l'anesthésie et de la chirurgie peut entraîner des mortalités, et juge ces connaissances "indispensables" à la gestion des pêches.

Objectifs

Un manque de connaissance existe sur les habitats dont les poissons ont besoin pour se reproduire, se nourrir ou grandir, et sur leurs connectivités, empêchant une mise en œuvre à grande échelle de l’approche écosystémique des pêches. Pour atteindre le double objectif d’optimisation des équilibres entre les différents usages des richesses de l’océan tout en préservant la biodiversité et de minimisation des impacts des activités humaines sur les écosystèmes marins, l’approche écosystémique des pêches doit pouvoir s'appuyer sur des connaissances relatives à l'écologie du mouvement des espèces et à la fréquentation des habitats essentielles et leur connectivité. Le projet cherchera à combler ces lacunes par le déploiement d’un réseau de télémétrie acoustique et le suivi par marquage des déplacements d’une sélection d’espèces d’intérêt halieutique. Nous analyserons les mouvements et migrations du bar européen (Dicentrarchus labrax) et du lieu jaune (Pollachius pollachius) au stade adulte en Manche. Ces espèces cibles sont des composantes importantes des écosystèmes littoraux étudiés et des espèces commercialement importantes pour la région. Ces connaissances participeront à la compréhension de la structure spatio-temporelle de ces populations et de la manière dont elles exploitent les habitats marins, éléments indispensables pour la mise en place de la gestion écosystémique des pêches. Dans ce cadre, notre étude prévoit de marquer 370 poissons sauvages adultes (bar européen (Dicentrarchus labrax) et lieu jaune (Pollachius pollachius)). Ces opérations de marquage se basent sur un protocole qui a été développé et validé sur le bar adulte lors d’une étude pilote (2010-2012) et d’une étude à grande échelle (2014-2016) pour suivre ses mouvements et migrations. La présente demande d’autorisation de projet concerne 2 procédures de classe modérée : la première concerne l’adaptation du protocole de marquage au lieu jaune (n=20 individus), qui se déroulera en milieu contrôlé à l’issue d’une période d’acclimatation d’individus sauvages aux structures expérimentales ; la deuxième procédure concerne le marquage en milieu naturel de poissons sauvages adultes (n=350 individus ; 50%-70% bar et 30%-50% lieu jaune).

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie du mouvement des espèces suivies et ainsi de répondre aux questions suivantes : Comment se comportent-elles sur la verticale ? Dans quel but ? Quels sont les habitats fréquentés et quelles fonctions (alimentation, reproduction, croissance, etc.) permettent-ils de réaliser ? Existe-t-il des migrations saisonnières entre ces habitats ? Comment ces mouvements structurent-ils la population ? Existe-t-il des sous-populations démographiquement indépendantes ? Il existe très peu de connaissances à ce sujet sur le lieu jaune. Bien moins que pour le bar européen, pour lequel un gros effort de marquage a eu lieu dernièrement. Cependant, pour ce dernier, les résultats attendus de ce projet permettront de démontrer l’intérêt à moindre risque (en terme de maitrise du protocole de marquage) d’un réseau pérenne de télémétrie acoustique (inexistant en Manche), de préciser la délimitation de 2 sous-populations à la fois côté français et côté anglais de la Manche à l’aide de reconstructions validées. Ces connaissances relatives à l'écologie du mouvement de ces 2 espèces d’intérêt halieutique, que le marquage en milieu naturel rend possible, serviront de cas concrets pour implémenter l’approche écosystémique des pêches sur les sites suivis afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines en général.

Procédures

La présente demande d’autorisation de projet concerne 2 procédures de classe modérée : la première concerne l’adaptation du protocole de marquage au lieu jaune (n=20 individus), qui se déroulera en milieu contrôlé à l’issue d’une période d’acclimatation d’individus sauvages aux structures expérimentales ; la deuxième procédure concerne le marquage en milieu naturel de poissons sauvages adultes (n=350 individus ; 50%-70% bar et 30%-50% lieu jaune). Lors de ces 2 procédures, bars et lieus jaunes seront soumis à une intervention chirurgicale nécessaire à l'implantation de marques électronique et acoustique dans la cavité abdominale. Il y aura une chirurgie par individu, sauf pour 10 individus de la procédure 1. Elle se fera sous anesthésie et des antalgiques seront donnés par injection intra-musculaire pour minimiser les douleurs post-opératoires. Des prélèvements auront lieu de 4 écailles et d'un fragment de nageoire caudale afin de déterminer l'âge des individus et faire des analyses génétiques respectivement.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus du marquage en milieu naturel sont des mortalités liées au traumatisme de l’expérimentation (pêche, anesthésie et chirurgie) et à la cicatrisation de la suture (infection). Des problèmes de croissance, de comportement et de mouvement liés à l’encombrement des marques dans la cavité abdominale peuvent être aussi attendues, cependant le poids total des marques ne représentant pas plus de 2% de la masse corporel des poissons marqués, ces effets devraient être minimes. Les effets indésirables attendus du marquage en milieu controlé sont les mêmes qu'en milieu naturel, à la différence que les individus pourront être surveillés. En milieu controlé, il se rajoute le stress de la captivité et des conditions d'élevage.

Devenir

L'objectif de l'étude est d’analyser les mouvements et les migrations du bar européen (Dicentrarchus labrax) et du lieu jaune (Pollachius pollachius) au stade adulte en Manche afin de mieux comprendre la structure spatio-temporelle de ces populations et la manière dont elles exploitent les habitats marins, éléments indispensables pour la mise en place de la gestion écosystémique des pêches. Il est donc indispensable de travailler sur des animaux issus du milieu naturel et que nous relacherons dans le milieu naturel après leur marquage. 20 individus seront prélevés dans le milieu naturel et sacrifiés (euthanasie en fin d'expérimentation) pour adapter en milieu controlé un protocole de marquage, qui sera ensuite utilisé sur le terrain.

Remplacement

Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser les mouvements individuels en milieu naturel, il n’est pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement. Il est nécessaire de faire des marquages électroniques de poissons qui seront ensuite relâchés dans le milieu naturel. Deux sources de données seront utilisées pour reconstruire les mouvements des individus marqués : 1) des données de température et de profondeur acquise à haute fréquence temporelle par les marques DST permettent d’inférer les mouvements grâce à de la modélisation ; 2) des données de télémétrie acoustique permettent de détecter la présence de poissons marqués (émetteur acoustique) sur un réseau de récepteurs déployé en milieu côtier. La combinaison des deux approches permettra de valider les mouvements obtenus par modélisation. Du fait que nous ne disposons pas de retours d’expérience de marquage sur le lieu jaune en milieu naturel et que ce poisson soit une espèce plus fragile que le bar, il est indispensable d’évaluer en milieu controlé la survie des individus marqués et l’adaptation du protocole de marquage à cette espèce notamment en termes de sédation et d’anesthésie.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique. Procédure 1 (adaptation du marquage au lieu jaune en milieu contrôlé): L'expérience sera conduite sur 2 lots de 10 poissons chacun. L'analyse consistera à la comparaison des taux de survie et d'indice de condition par traitement statistique pour petits échantillons. Procédure 2 (marquage en milieu naturel): Il est prévu de marquer, dans le milieu naturel, 350 poissons adultes (50%-70% bar européen et 30%-50% lieu jaune) sur 3 sites répartis en Manche. Ce nombre est un compromis entre le coût de l'opération et le nombre de recaptures escomptées de 15% en moyenne soit 17 poissons par site et 51 poissons au total, ces recaptures devant être considérées comme représentatives des populations étudiées.

Raffinement

Pour la phase de captivité, les mesures de raffinement tiennent compte des contraintes zootechniques et notamment de la densité minimale d’animaux requise pour permettre aux animaux d’exprimer les meilleurs répertoires physiologiques et comportementaux possibles. Lors du marquage, les poissons seront anesthésiés et seront surveillés de manière régulière. Ils seront retirés de la procédure dès qu'un point limite sera atteint. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale), la perte de poids ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies). La méthode de mise à mort envisagée est une euthanasie par administration d'une dose létale d'anesthésiant après sédation. Les expérimentations en mer utiliseront des techniques de pêche qui n’altèrent que peu l’état de santé des poissons capturés (ligne ou palangre). Si leur condition corporelle est bonne, les individus seront maintenus en groupe dans de grands bassins afin qu’ils s’y sentent bien (comportement calme). Lors du marquage, les poissons seront anesthésiés et seront surveillés au moins deux heure avant d’être relâchés dans le milieu naturel. Ils seront retirés de la procédure dès qu'un point limite sera atteint. Les points limites auront été affinées via la première procédure en milieu contrôlé. La méthode de mise à mort envisagée est une euthanasie par administration d'une dose létale d'anesthésiant après sédation.

Choix des espèces

Le projet se focalise sur le bar européen, poisson d'intérêt écologique, économique et sociale. La structure spatio-temporelle de cette ressource remet en cause la délimitation actuelle des stocks de bar. Il existe un besoin d’affiner nos connaissances sur l’espèce au niveau de la zone de mélange de stocks, i.e. en Manche. Le projet s’intéresse aussi au lieu jaune, poisson d'intérêt écologique, économique et sociale dont les stocks sont classés à données limitées, conjugué à un manque patent de connaissances sur l'écologie de cette espèce. Du fait, de son poids économique plus important et de ses enjeux de gestion omniprésents (reconstitution de la biomasse du stock Nord, et remise en cause des limites de stocks), le marquage de bars est jugé prioritaire. La proportion attendue des espèces marquées pourra être plus forte pour le bar, i.e. 50%-70% de bars et 30%-50% de lieus jaunes. Nous nous focaliserons sur le stade adulte, car il permettra d'améliorer nos connaissances sur les migrations de reproduction et les zones de frayère, habitats essentiels à protéger pour exploiter durablement ces espèces.

72 poissons, daurades royales et loups sauvages, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une marque électronique est implantée dans leur cavité péritonéale sous anesthésie, puis chaque individu est placé en tunnel de nage et exposé à un réchauffement, un refroidissement ou une hypoxie pour mesurer sa perte de performance. Le porteur indique que la mise à mort finale sert à récupérer la marque et les données enregistrées. Il présente ces seuils de tolérance comme utiles à de futurs plans de gestion des stocks de pêche.

Objectifs

Le Golfe du Lion est une des zones les plus productives de la Méditerranée. La zone côtière est constellée de lagunes qui sont de véritables nourriceries et zones d’alimentation pour la faune marine. Les lagunes sont aussi des écosystèmes vulnérables, particulièrement sensibles aux effets des changements globaux. Notamment, des vagues de chaleur et des épisodes d’hypoxie estivaux sont susceptibles de stresser les organismes résidents, entraînant une baisse de leur performance physiologique, voire même menaçant leur survie. De nombreuses espèces de poisson à haute valeur économique occupent les lagunes du Golfe de Lion au cours de leur cycle de vie, et l'altération anthropique de ces habitats pourrait largement affecter les dynamiques de ces populations. Dans ce contexte, la daurade royale et le loup représentent des cas d’étude par excellence. Ces espèces exploitent tous les ans les lagunes en tant que nourriceries estivales, permettant aux individus de constituer des réserves pour la saison hivernale en mer ouverte. Il est essentiel comprendre l’importance des lagunes pour le maintien des stocks de poissons à haute valeur économique dans le Golfe du Lion, afin de développer des plans de gestion. En particulier, pour mieux comprendre comment les effets du changement climatique affecteront le cycle biologique des espèces exploitant les lagunes. L'objectif général de ce projet est de mieux comprendre l’écophysiologie des daurades et loups sauvages, issus des lagunes en période estivale. En particulier, leurs performances physiologiques en termes de capacité de nage, et comment des changements de température et des épisodes d'hypoxie peuvent influencer cette capacité. Nous cherchons à établir des seuils de tolérance sous-létaux, en utilisant une perte de la performance de nage comme indicateur.

Bénéfices attendus

Les données du présent projet, sur les seuils sous-létaux au-delà desquels la température et l’hypoxie nuisent à la performance de nage, permettront de mieux interpréter des migrations saisonnières entre lagune et mer, mais aussi les migrations ponctuelles vers la mer en été, pour échapper à des conditions extrêmes dans les lagunes. Ces informations seront utiles pour informer le développement de plans de gestion, des stocks de daurade royale et loup, et des habitats clé pour leurs cycles de vie.

Procédures

Les poissons seront équipés avec une marque électronique dans leur cavité péritonéale, sous anesthésie générale. La durée de l'opération est moins de 30 minutes. Cette chirurgie sera suivie par 96 heures de récupération dans un bassin isolé des perturbations humaines. Puis, chaque individu sera placé dans un tunnel de nage pour 48 heures et subira deux procédures en séquence. Premièrement, un test de performance de nage, puis un test de tolérance à un stress (réchauffement, refroidissement, hypoxie). Chaque test dure entre 4 et 6 heures, avec 20 heures de récupération entre les deux tests.

Impact sur les animaux

Les nuisances et les effets indésirables devraient être limités, les procédures sont d'une sévérité modérée. Les 96 heures de récupération de la chirurgie permettent aux poissons de regagner une fréquence cardiaque baisse et stable, situation qui se met en place à partir de 72 heures. Les procédures en tunnel de nage ne sont pas douloureuses, et la performance de nage dans le tunnel n’est pas différente entre les poissons qui portent une marque et des poissons qui n’ont pas subi une intervention chirurgicale.

Devenir

A la fin des procédures, tous les animaux (72) seront euthanasiés pour récuperer la marque éléctronique et les données de fréquence cardiaque et d'accélération corporelle.

Remplacement

Il est impossible de remplacer les daurades et les loups sauvages par des autres modèles, l'intérêt du projet étant justement de regarder l'impact sur ces espèces.

Réduction

Le nombre total d'individus testés sera limitée à n = 36 de chaque espèce, parmi lesquels n = 12 seront exposés à chaque facteur environnementale (n = 72 animaux en total). Le nombre de 12 individus exposés à chaque facteur environnemental (réchauffement, refroidissement, hypoxie) permettra d'établir des réponses moyennes de chaque population d’étude, en tenant compte de la possibilité d'une variation interindividuelle. Les réponses seront évaluées statistiquement en utilisant des modèles linéaires mixtes et des analyses de variance.

Raffinement

Tout a été mis en place pour limiter la souffrance et le stress des animaux liés au placement des capteurs. Le capteur sera placé dans la cavité péritonéale sous anesthésie, en proximité du coeur afin de capter les signaux bioélectriques (électrocardiogramme) qui permettent de calculer la fréquence cardiaque. Le placement du capteur sera suivi par un minimum de 96h de récupération dans des bassins externes isolés des perturbations humaines, avec une alimentation journalière « ad-libitum ». Les procédures en tunnel de nage sont bien établies chez les poissons et sont des techniques largement maîtrisées et utilisées par l’ensemble de la communauté scientifique, ainsi que par notre équipe. L’objectif de nos protocoles est de limiter au maximum la souffrance et le stress des animaux pendant les manipulations, avec capture des poissons sous l’eau et placement dans les tunnels sans exposition à l’air, suivi par une durée minimale d’acclimatation de 4h. Les poissons sont à l’abri de toute nuisance visuelle et sonore pendant la récupération et les expériences. Cela permet d'obtenir des mesures valides et fiables de leurs réponses aux facteurs environnementaux, qui ne sont pas influencées par un état préalable de souffrance, stress ou agitation.

Choix des espèces

La daurade royale et le loup sont des espèces côtières de premier plan en Méditerranée française, tant pour l'importance de leur exploitation, leur valeur commerciale et leur aquaculture, que pour leurs aspects emblématiques. Aujourd'hui concernées par les plans de gestion des petits métiers en Méditerranée, de nombreux aspects de leurs cycles de vie restent pourtant inconnus. L’acquisition des connaissances sur leur capacité de nage et leur tolérance à la température et à l'hypoxie est primordiale pour une compréhension des migrations de ces espèces et leur utilisation des lagunes côtières. Ces informations seront un appui aux mesures de gestion de ces espèces en Occitanie. Les animaux seront tous adultes reproducteurs et auront une masse comprise entre 300 et 700g, une taille qui permet le placement des capteurs électroniques dans la cavité péritonéale.

86 carpes juvéniles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par leur alimentation une cyanotoxine, la microcystine-LR, pendant dix jours, suivis de vingt et un jours sans contamination, avant prélèvement post-mortem du foie et des muscles. Le porteur affirme choisir des doses inférieures au seuil létal pour éviter tout effet toxique, et présente ces données comme "indispensables" à l'évaluation du risque sanitaire. L'exposition vise à mesurer l'accumulation et l'élimination de la toxine chez un poisson parfois consommé.

Objectifs

Les cyanobactéries sont des bactéries photosynthétiques capables de coloniser des environnements très divers, qu’ils soient terrestres, marins ou dulcicoles. En eau douce, lorsque les conditions environnementales (température, nutriments, lumière, etc.) sont favorables, principalement en périodes estivales et automnales, ces organismes sont capables de proliférer rapidement, formant des « blooms », ce qui entraine des désagréments visuels et olfactifs mais peut également poser des problèmes sanitaires. En effet, certaines cyanobactéries sont productrices de toxines. Les toxines produites, appelées cyanotoxines sont susceptibles d’affecter la faune mais également l’homme via notamment une exposition alimentaire (consommation d’organismes aquatiques ou d’eau contaminée) ou récréative par le biais de la pratique d’activités nautiques (baignade, sports nautiques, etc.). Les microcystines (MC) sont les cyanotoxines les plus fréquemment rencontrées et les plus étudiées, connues pour leur toxicité. Les MC font l’objet d’une réglementation quant à leur teneur dans l’eau destinée à la consommation humaine, et de recommandations de suivi concernant leur présence dans les eaux récréatives. Les MC s’accumulent notamment chez les poissons, sous une forme libre bien étudiée, mais aussi sous une forme liée aux protéines, très peu prise en considération bien que majoritaire dans les tissus. De plus, d’autres zones d’ombre demeurent, comme les cinétiques d’accumulation des deux formes dans la chair de poisson, et le temps nécessaire de dépuration. Malheureusement, les données disponibles dans la littérature sont insuffisantes et ne permettent pas de répondre entièrement aux questions posées. Elles ont néanmoins permis de définir des fréquences de consommation de poisson à ne pas dépasser selon la contamination en MC-LR (variant de MC le plus étudié), pour les enfants et les adultes. Dans le cadre de ce projet nous avons pour objectif de déterminer la cinétique d'accumulation et d’élimination de la MC-LR chez la carpe, en conditions contrôlées. Afin de tenir compte de l’existence des MC accumulées sous forme libre ou liée aux protéines, ces deux formes seront analysées par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS).

Bénéfices attendus

A l’issue de cette étude, nous disposerons de données en matière de cinétique d’accumulation de la MC-LR sous formes libre et liée aux protéines chez des carpes juvéniles après exposition quotidienne répétée pendant 10 jours à une dose non létale de toxine, ainsi que de données de cinétique d’élimination des deux formes de MC-LR sur une période de 21 jours. De telles données ne sont actuellement pas disponibles dans la littérature, et pourtant indispensables pour aider à l’évaluation du risque sanitaire.

Procédures

Pendant la durée de l'étude, les animaux ne seront soumis à aucune intervention, le mode d'exposition des animaux à la toxine étant l'alimentation volontaire. La toxine est mélangée pendant notre étude à des aliments pour poissons issus du commerce. Les concentrations choisies de toxines sont basées sur la littérature scientifique afin de se placer en deçà des concentrations léthales pour la carpe. Une pré-étude de 10 jours sera consacrée aux choix de la dose de MC, trois concentrations seront testés afin de choisir la concentration optimale permettant une accumulation chez l’animale sans observer de toxicité. La concentration choisie sera alors administrée par alimentation volontaire pendant une période de 10 jours suivie d’une période d’élimination de 21 jours sans contamination.

Impact sur les animaux

Le choix des concentrations utilisées durant la pré-étude (strictement en deçà de la dose léthale pour la carpe) permet d’éviter tout effet indésirable pour le poisson. Les animaux seront suivis quotidiennement et différents points limites seront suivis. Une attention particulière sera apportée à la surveillance des poissons après chaque période d’alimentation.

Devenir

L’objectif de notre étude est de pouvoir suivre l’accumulation et l’élimination des formes totales de MC chez la carpe. L’analyse des formes totales de MC nécessite de réaliser des prélèvements post-mortem des tissus (muscles, foie). Aucune autre procédure ne peut permettre d’estimer la présence de MC chez le poisson.

Remplacement

L'objectif de ce projet est d'étudier la cinétique d'accumulation et d'élimination des microcystines chez la carpe suivant une exposition par voie alimentaire. Pour ce faire, seules les expérimentations sur des organismes vivants sont susceptibles de nous permettre d’évaluer l’assimilation et l'élimination à la suite d'expositions à des doses contrôlées de toxine. Aucun autre modèle ne nous permet actuellement de remplacer leur usage.

Réduction

Dans un premier temps, notre étude nécessite de déterminer la toxicité de la microcystine-LR via une exposition par alimentation volontaire quotidienne pendant 10 jours chez des carpes juvéniles d’un été et pesant en moyenne 30g. Dans un objectif de raffinement, cette pré-étude permettra d’ajuster au mieux les doses utilisées par la suite et donc d’éviter les effets toxiques chez les poissons employés lors de l’étude cinétique tout en ayant néanmoins une accumulation suffisante chez les organismes afin de détecter et déceler les variations de microcystines chez les carpes au cours du temps d’exposition et de dépuration. A la suite de cette pré-étude, la concentration choisie sera utilisée pour le reste de la procédure. Des carpes juvéniles seront exposées pendant différents plusieurs pas de temps d'exposition (1 à 10 jours) et une période d'élimination (1 à 21 jours) sera observée. Ces durées ont été choisies pour mimer la durée des épisodes de proliférations de cyanobactéries auxquels les carpes peuvent être exposés dans leur milieu naturel.

Raffinement

Les carpes d’un été (30g en moyenne) seront placés dans des bacs de 120 litres, ces bacs présentent des parois lisses et opaques pour ne pas blesser les poissons et diminuer leur stress. L’eau des bacs sera renouvelée à hauteur de 30% chaque semaine afin de maintenir les conditions de stabulation constantes devant rester conforme aux conditions d'élevage classiques et non stressantes pour ces animaux. Chaque semaine, des tests biologiques colorimétriques permettront de s’assurer de la bonne qualité de l’eau des bacs. Des pompes seront placées dans chacun des 4 espaces de l’aquarium pour permettre une circulation de l’eau homogène dans l’ensemble de l’aquarium. Pour limiter le stress, des enrichissements tels que des tuyaux PVC et des plantes aquatiques apportent une zone refuge pour les poissons. En travaillant avec des conditions d’élevages adaptées à l’espèce employée et non stressantes et en privilégiant une méthode d'exposition non-invasive (l'alimentation volontaire), notre étude vise à limiter au maximum de manipuler ou de placer les animaux dans des conditions stressantes ou douloureuses. De plus, un suivi quotidien sera réalisé avec des points limites adaptées à l'espèce (changement de position dans la colonne d'eau ; consommation de nourriture ; apparence physique).

Choix des espèces

Les Cyprinidés dont la carpe (Cyprinus carpio) sont exposés aux cyanobactéries lors de proliférations massives par leur régime alimentaire. Ces poissons accumulent ainsi des cyanotoxines telles que la microcystine dans le foie mais également dans la chair. Or, la consommation occasionnelle de cette espèce pourrait donner lieu à un risque sanitaire. Les carpes utilisées seront au stade juvénile (un été, 30g en moyenne) dans l'objectif de minimiser la taille et le poids des individus pour faciliter l'expérimentation.

90 truites de lac sauvages vont être utilisées, capturées par pêche électrique puis relâchées après marquage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poisson subit sous anesthésie l'insertion chirurgicale d'une marque dans la cavité abdominale, opération de cinq à dix minutes réalisée une seule fois. Le porteur indique que la marque ne modifie ni le déplacement ni le bien-être des poissons, relâchés ensuite pour un suivi par antennes. L'étude sert la gestion halieutique de l'espèce, la capture et la chirurgie étant décrites comme obligatoires pour observer la migration.

Objectifs

La truite de lac représente une espèce emblématique des lacs alpins. Le Plan Départemental pour la Protection des milieux aquatiques et la Gestion de la ressource piscicole identifie le statut de cette espèce comme menacé. Sa particularité réside dans le fait que son cycle biologique comprend une phase de croissance en lac et une phase de reproduction et de production de juvéniles en rivière. De par son cycle biologique particulier, la truite lacustre constitue ainsi l’indicateur ultime de la connectivité entre le lac et ses affluents et donc l’espèce indicatrice de la fonctionnalité des milieux.

Bénéfices attendus

Cette étude rentre dans le cadre d’un objectif d’amélioration : -des dispositifs de franchissement et éventuellement d’appliquer cette méthode sur d’autres sites avant et après aménagement; -des connaissances de l’espèce en vue d’adapter sa gestion dans une optique de préservation.

Procédures

Capture de poissons sauvages par pêche électrique puis insertion chirurgicale, sous anesthésie générale, de marques semi-actives dans la cavité péritonéale (temps d'intervention 5 à 10 minutes). Une seule opération de ce type est effectuée par animal.

Impact sur les animaux

En ce qui concerne l’implantation chirurgicale du poisson et le comportement post-marquage, le déplacement ou son bien-être n'est pas modifié par la présence de la marque. Toutes les précautions sont prises lors de l'intervention chirurgicale pour limiter le risque d'infection. En ce qui concerne les opérations d’échantillonnage par pêche électrique, ces dernières sont mises en œuvre par du personnel formé, elles sont encadrées et réglementées. Toutes les dispositions sont prises pour assurer la sécurité des personnes (port des EPI, utilisation du matériel certifié) et limiter au maximum le risque de blessures ou de dommages vertébraux sur les poissons (réglage des appareils en fonction de la conductivité et de la température de l’eau).

Devenir

Le but de cette étude étant de connaitre les déplacements des truites lacustres dans le temps, les individus marqués seront relâchés post intervention et ne feront pas l’objet de recapture (les individus seront localisés au moyen des antennes fixes et mobiles). Tous les animaux capturés temporairement pour les besoins de marquage seront relâchés.

Remplacement

Le projet consiste en l'étude même du comportement de déplacement des individus de l'espèce truite lacustre ; la capture et le marquage de certains individus sont donc rendus obligatoires pour les besoins de l'étude.

Réduction

La taille de l'échantillon doit être suffisante pour dégager des résultats fiables et statistiquement interprétables. Aussi, un nombre maximal de 90 individus adultes seront recherchées sur les 3 années. Cette taille plutôt "modeste" de l’échantillon suffira pour répondre à toutes nos interrogations quant au comportement reproducteur de cette espèce.

Raffinement

Toutes les manipulations se feront sous anesthésie par du personnel qualifié sur le site d’étude. L'ensemble des poissons ne sera remis à l'eau qu’après contrôle de l’état sanitaire (absence de lésions) et récupération totale de l’anesthésie. Les points limites (comportement du poisson lors de l’anesthésie, pigmentation anormale liée au choc électrique) sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la souffrance de l’animal et exclure des individus avant intervention chirurgicale le cas échéant.

Choix des espèces

Le but de cette étude étant de mieux connaitre le fonctionnement du cycle biologique de cette espèce, et notamment dans sa phase de reproduction (dans les affluents), seuls les géniteurs (mâles et femelles) présents sur le cours d'eau d'intérêt, au cours des différentes campagnes annuelles, seront recherchés pour le marquage. Le ratio poids de la marque / poids de l'individu sera évidemment respecté en utilisant des transpondeurs de type Pit-Tag de 32 mm pour 0.8g (la taille est ainsi adaptée à la taille et au poids de l’individu, celui-ci ne devant pas dépasser 2% du poids de l’individu). Dans le cas de notre espèce recherchée, le poids moyen des individus reproducteurs varie de 200g à 9 000g pour les mâles et de 200g à 10 000g pour les femelles.