Poissons

54 saumons atlantiques vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson est isolé dans un faible volume d'eau moins d'une heure, exposé à une seringue puis infesté par des poux marins, pour comparer une phéromone apaisante et trois analogues censés réduire les infestations en pisciculture. Le porteur indique tuer les poissons avant la métamorphose du parasite pour leur épargner l'irritation la plus sévère, et affirme qu'ils ne peuvent être ni réutilisés ni replacés pour des raisons sanitaires. Il revendique le recours à des "organismes entiers" capables de réagir aux composés, faute de méthode de remplacement.

Objectifs

Il s'agit d'une étude de recherche appliquée investiguant les mécanismes d'action physiologiques de la phéromone apaisante S.N.A.P. (Salmon Nest Appeasing Pheromone) libérée lors de l’éclosion des oeufs de saumon atlantique (Salmo salar). Le copépode marin, Lepeophtheirus salmonis, couramment dénommé "pou du saumon" est un ectoparasite du saumon atlantique, responsable de pertes économiques importantes dans les fermes d’élevage de l’hémisphère nord. Les moyens de lutte actuels sont limités par les problématiques de résistance aux traitements chimiques et de bien-être animal des traitements physiques et mécaniques. L'espèce de salmonidé la plus couramment produite en pisciculture est le saumon atlantique. En dépit de la sélection basée notamment sur la recherche de souches moins farouches, ce poisson continue de présenter des réactions de stress très intenses, aigües, mais aussi chroniques, ayant des conséquences physiologiques importantes, parmi lesquelles on note des altérations des défenses spécifiques et non-spécifiques contre les infections. Ces perturbations sont à l’origine de nombreuses infections bactériennes, virales, fongiques et parasitaires, qui conduisent à l’emploi de différents xénobiotiques (antibiotiques, antiparasitaires, antifongiques, antiseptiques divers), mais aussi de traitements physiques préjudiciables pour le bien-être des poissons, comme les traitements thermiques utilisés lors d’infestation par les poux marins (principalement Lepeophtheirus salmonis). La phéromone S.N.A.P. est une sécrétion composée de l'ester éthylique d'un acide oméga-7 et de l'ester éthylique d'un acide gras saturé. Le produit qui sera utilisé est une composition protégée par un brevet. La phéromone S.N.A.P. augmente l’activité des cellules à mucus de la peau et du tube digestif, et entraîne une diminution de l’attractivité des salmonidés pour les larves infestantes de poux marins. L’objectif de ce programme est de vérifier et comparer l’efficacité d’analogues structuraux de cette phéromone chez le saumon atlantique et d'ainsi mesurer leur capacité à limiter le recours aux traitements médicamenteux.

Bénéfices attendus

La comparaison de la phéromone S.N.A.P. et de ses 3 analogues permettrait de valider leurs effets sur le copépode Lepeophtheirus salmonis et de proposer ce(s) traitement(s) naturel(s) et dépourvu(s) de toxicité, tant pour les poissons, que pour le consommateur et l’environnement, comme alternative aux solutions actuelles. Le contrôle de ces infections et infestations constitue une cause importante de souffrance pour les salmonidés en pisciculture et les nombreuses stratégies actuelles de gestion des poux peuvent, paradoxalement, augmenter le risque de réinfestation en manipulant ou en stressant le saumon atlantique. Ce projet permettra de mettre au point des mesures préventives contre les infestations du saumon atlantique par le copépode Lepeophtheirus salmonis qui seront plus respectueuses du bien être animal que les pratiques actuelles encore autorisées. L'une d'elle consiste notamment à déplacer les saumons atlantiques depuis les cages en mer dans des bassins aménagés sur des bateaux plateformes. Les animaux sont alors plongés dans de l'eau douce chauffée à 37°C (quand l'eau des cages ne dépasse pas 14°C), et ce changement radical d'environnement s'accompagne d'un système de brossage des poissons, avant que ceux-ci ne soient remis en eau de mer.

Procédures

Les animaux seront soumis à un isolement social et à un environnement de volume limité: 1 évènement unique par animal de 1 h maximum. Les animaux seront soumis à l'administration d'un traitement dans le volume d'eau à l'aide d'une seringue, c'est à dire à une perturbation liée à la proximité d'un opérateur et à la présence de la seringue dans le cristallisoir: 1 seul évènement par animal pour 35 poissons (les 7 individus du lot témoin 2 ne sont pas concernés). Temps d'injection de 15 secondes environ. Les animaux subiront l'infestation par les copépodes Lepeophtheirus salmonis: 1 seul évènement par animal de durée maximale d'1 h pour 35 poissons (les 7 individus du lot témoin 2 ne sont pas concernés).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour les animaux sont le recours à un isolement social et la limitation de l'environnement à une enceinte de volume restreint à 5 L d'eau de mer: ces deux contraintes ne sont appliquées que pendant un laps de temps court, celui de la durée du test (< 1h). Deux autres événements potentiellement perturbateurs seront subis par quasiment tous les poissons: l’introduction de la seringue qui permet d'administrer le traitement (durée environ 15 secondes) et l’introduction des copépodes. Le témoin 2 se distingue des autres traitements par le fait qu'il n'y a pas introduction de la seringue dans le cristallisoir. Dans ce cas-là, l'opérateur n'approche donc pas sa main de l'enceinte pour réaliser un traitement. L'irritation engendrée par l’accrochage superficiel des larves de copépode Lepeophtheirus salmonis restera bénigne comme en atteste la littérature scientifique: la brièveté du test ne permet pas en effet à la métamorphose en larve chalimus de s’opérer, ce qui évite l’irritation plus sévère liée à l’ancrage du filament dans la peau du poisson. Les molécules utilisées dans les traitements mis en oeuvre sont sans effets indésirables attendus, soit parce qu'elles ne modifient pas la nature du milieu (absence de traitement ou eau de mer), soit parce qu'il s'agit d'une phéromone apaisante propre à l'espèce considérée, ou d'analogues structuraux de celle-ci, qui sont autorisés comme additifs alimentaires et sont dépourvus de toute toxicité. Ces molécules sont donc inoffensives pour les poissons, notamment à la dose de 6 ppm. Les autres manipulations, pêche, déversement, relèvent de pratiques zootechniques courantes qui ne justifient pas un classement en procédure expérimentale.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car ils ne peuvent ni être ré-utilisés, ni être replacés, dans ce dernier cas pour des raisons sanitaires.

Remplacement

La présente étude possède une composante physiologique très importante. Elle doit nécessairement porter sur des êtres vivants, qui représentent des systèmes biologiques intégrés, où de multiples organes/tissus fonctionnent de façon associée et coordonnée. En effet, l’utilisation de traitements sémiochimiques est une stimulation sensorielle par exposition à des phéromones qui nécessite l’utilisation d’organismes entiers pouvant détecter et réagir aux composés testés. La détection de ces composés peut engendrer une cascade de réactions physiologiques pouvant mener à une modification du comportement ou de la physiologie de l’animal. Cela ne peut être obtenu et observé que sur animaux entiers pouvant pleinement exprimer leurs comportements et physiologies naturels. Il n'existe pas actuellement de méthodes de remplacement pouvant simuler ces changements suite à une stimulation sensorielle.

Réduction

Préalablement à cette étude, et afin de réduire le nombre de sujets nécessaires à la mise-en-évidence de l’efficacité des différents analogues potentiels, une étude des pharmacophores de la phéromone S.N.A.P. en bioinformatique a été menée, ce qui a permis de réduire leur nombre à 3. Avec les deux témoins (absence de traitement et traitement à l'eau de mer), la phéromone de référence et les 3 analogues, le nombre total de traitements à tester est ainsi ramené à 6. De précédentes études réalisées sur un nombre de sujets similaires par modalité, ont pu, via une ANOVA à un critère, complétée d'un test d'homoscédasticité (test de Levene) et de normalité (Shapiro-Wilk) et en utilisant la méthode des comparaisons multiples de Tukey, montrer une sensibilité suffisante pour mettre en évidence des différences significatives entre traitements. Différentes répétitions de tests comparables ont validé une bonne robustesse et reproductibilité du test d’attractivité, avec 7 sujets par groupe de traitement: c’est le nombre que nous avons retenu, portant l'effectif total d’animaux utilisés dans le test d’infestation à 42: 6 traitements X 7 individus/traitement.

Raffinement

Les manipulations susceptibles d’entraîner stress majeur ou douleur, seront réalisées post-mortem. La mise à l’isolement social et la limitation à un environnement de volume réduit seront limités au temps du test (< 1h). De plus les cristallisoirs seront placés sous une tente en nylon blanc afin d'éviter que la présence et les mouvements des opérateurs à proximité, ou qu'une intensité lumineuse trop forte, ne génèrent une perturbation supplémentaire des poissons. La fixation des copépodes, à la surface de la peau, reste une irritation bénigne et superficielle, ainsi qu’en témoigne la littérature. Les poissons sont sacrifiés avant la métamorphose du copépode Lepeophtheirus salmonis en chalimus, ce qui écarte les animaux de l'infestation par ce stade du parasite qui possède un ancrage cutané générateur d’inflammation.

Choix des espèces

Il s’agit de l'espèce de salmonidés la plus massivement produite en aquaculture. Les saumons seront au stade smolt, jeunes sujets pesant environ 200g. Ce stade est compatible avec le test d’attractivité, les smolts constituant la population la plus attractive pour les poux.

1 332 poissons, carpes, tanches, gardons et sandres, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisés ou gardés comme géniteurs. Ils sont répartis dans des étangs expérimentaux et pesés puis mesurés à deux reprises sous anesthésie, pour tester l'effet d'une séparation temporaire des espèces sur la productivité et la biodiversité d'une polyculture d'étang. Le porteur décrit un projet à finalité zootechnique visant à optimiser les pratiques d'élevage tout en préservant la richesse en espèces. Il affirme que la modélisation in silico de ces interactions n'est pas encore possible mais que les données recueillies doivent y contribuer.

Objectifs

L’expérience Pacage en étang s’inscrit dans le cadre d’un projet financé par l’Europe, qui a pour objectif d’établir de nouvelles pratiques alliant le respect de l’environnement, la biodiversité et la productivité des polycultures de poissons en étang. La définition de la composition de la polyculture est le thème central de ce projet, c’est-à-dire d’être capable de définir les différentes espèces de poissons à élever et d’en établir leurs effectifs. Ces propositions de pratiques prendront en compte l’ensemble des compartiments biologiques du système et la diversité qui le compose pour produire la ressource de manière plus durable. Ce projet s’appuie sur une co-construction de scenarii avec des représentants professionnels et sur une démarche expérimentale en étang. L’expérience Pacage en étang vise à tester l’effet d’une segmentation temporaire de l’étang, permettant la séparation des espèces (carpes, tanches, gardons, sandres), sur la productivité totale en poisson, la croissance de chaque espèce, le recrutement en juvéniles, les paramètres physicochimiques du milieu et la biodiversité en invertébrés (macro-invertébrés et zooplancton) et en macrophytes.Le projet vise à caractériser les interactions entre les facteurs du milieu, les différentes espèces et la biodiversité aquatique, dans la conduite de la polyculture de poissons en étang. En particulier, nous cherchons à caractériser l’effet du regroupement temporaire des espèces ayant différents rôles fonctionnels et trophiques sur la productivité totale en poisson, la croissance de chaque espèce, le recrutement en juvéniles, les paramètres physicochimiques du milieu et la biodiversité en invertébrés (macro-invertébrés et zooplancton) et en macrophytes. Les rôles majeurs des différentes espèces retenues sont, pour la carpe commune : bioturbation et croissance rapide ; pour la tanche et le gardon : production de juvéniles et alimentation opportuniste ; pour le sandre : prédateur pour invertébrés et juvéniles de poisson. Les données récoltées permettront d’alimenter une modélisation trophique des systèmes d’étangs en polyculture, à même de représenter l’effet des interactions entre espèces.

Bénéfices attendus

L’expérience pacage en étang doit permettre d’éclairer les interactions entre espèces dans le cadre de polyculture de poisson en étang. Le rôle de ces espèces et de leur conduite sur la biodiversité sera mis en évidence dans l’objectif d’optimiser les pratiques d’élevage pour améliorer les impacts sur l’environnement et préserver la richesse en espèces, tout en maintenant une production rentable pour l’exploitant. De façon plus générale, ce travail doit contribuer aux réflexions en cours sur le rôle de la diversité sur la robustesse et la résilience des systèmes d’élevage.

Procédures

Mesures biométriques non invasives réalisées deux fois, de façon ponctuelle.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux consistent en la manipulation en début et fin d’expérience, afin de réaliser des mesures (poids, longueurs) individuelles et les répartir dans leurs structures d’accueil (étangs expérimentaux en début d’exprience, étangs de stockage en fin d’expérience).

Devenir

Les poissons n’ayant subi aucun traitement invasif, pourront être réutilisés dans des expériences ultérieures ou servir de géniteurs pour utilisation interne à l’installation expérimentale.

Remplacement

Cette expérience est principalement à vocation zootechnique. Elle nécessite le recours aux espèces utilisées en élevage classique. Le manque de recul et de modèle sur les interactions entre les espèces aquatiques d’élevage, il n’est pas encore possible de réaliser ce type d’expérience in silico. Néanmoins, les données récoltées dans le cadre de l’expérience, ont vocation à alimenter des démarches de modélisation qui vont dans le sens de la limitation au recours aux animaux à l’avenir.

Réduction

Les proportions des différentes espèces et leurs effectifs ont été déterminés pour représenter les pratiques d’empoissonnement en polyculture d’étang courrantes. Il est n’est pas possible de les diminuer sans perdre le caractère plausible des pratiques. Le nombre de trois répliquats est le minimum que nous pouvons admettre pour obtenir des résultats statistiquement exploitables.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances envers les poissons, les conditions de contention sont surveillées, notamment en maintenant un renouvellement d’eau lors des stockages temporaires et le contrôle des comportements. Avant chaque manipulation pour mesures (non invasives), les poissons sont anesthésiés, afin de limiter le stress, les risques de chute, limiter la durée hors d’eau en augmentant la rapidité des mesures de biométrie. La phase de réveil est contrôlée dans des bassins séparés par espèce, avec renouvellement d’eau.

Choix des espèces

Les espèces choisies : carpe commune (Cyprinus carpio), tanche (Tinca tinca), gardon (Rutilus rutilus) et sandre (Sander lucioperca), sont représentatives des polycultures de poissons d'étangs extensifs ou semi-intensifs en France. Ce sont par ailleurs, des espèces particulièrement tolérantes aux bas niveaux de qualité d’eau, ce qui les rend tolérantes aux manipulations. Les carpes et les sandres sont de petites tailles (un an de croissance), afin d’optimiser leur croissance dans le dispositif. Les tanches et les gardons sont des géniteurs afin d’optimiser leur reproduction.

450 animaux non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère : 150 truites, 100 porcs, 100 poulets, 50 dindes et 50 autres oiseaux. Chaque animal sert de support à la formation de personnel aux gestes techniques, écouvillonnages, prises de sang et injections, avec au maximum trois actes par individu. La mise à mort fait elle-même partie de la formation, non pour produire des connaissances mais pour entretenir les compétences d'expérimentateurs. Le porteur affirme que le remplacement complet par vidéos et modèles inertes n'est pas possible, la maîtrise des gestes ne s'acquérant selon lui qu'en pratiquant sur animal vivant.

Objectifs

Dans le cadre de l'expérimentation animale, les personnes accomplissant des actes vétérinaires sur les animaux doivent avoir les compétences techniques nécessaires pour le faire. Ces compétences sont acquises au cours de la formation initiale et doivent être maintenues régulièrement par des formations pratiques validées par l'établissement utilisateur (arrêté du 1er Février 2013). Les formations spécifiques en expérimentation animale officiellement reconnues proposent souvent des applications pratiques ciblées sur les modèles murins et peu étendues à d’autres espèces terrestres ou aquatiques, ce qui ne correspond pas aux besoins des essais expérimentaux sur animaux de rente. Le but de ce projet est de permettre aux personnes d'acquérir ou de perfectionner les bons gestes pour la réalisation des actes vétérinaires sur les volailles et/ou sur les porcs et les poissons (prélèvements, injections, anesthésie, mise à mort, …). Il comporte trois procédures : l'une pour les volailles (espèces poules ou poulets Gallus gallus, dindes et canards), l'autre pour les porcs (Sus scrofa) et la dernière pour les poissons (Truite arc en ciel Oncorhynchus mykiss). Les formations sont destinées aux personnes réalisant des actes vétérinaires lors d’essais mis en oeuvre par leur laboratoire.

Bénéfices attendus

La réalisation de gestes techniques sur les volailles, les porcs et les poissons est un enjeu majeur compte tenu des besoins dans la réalisation de multiples projets expérimentaux sur les animaux de rente. Offrir des conditions optimales à nos agents pour se former en amont de la réalisation des actes permet de disposer de personnes pouvant réaliser ces gestes avec la meilleure assurance possible lorsque cela est nécessaire. Cela constitue la meilleure garantie d’une prise en compte du bien-être des animaux et des manipulateurs au cours de ces interventions et leur est ainsi bénéfique.

Procédures

Pour la volaille, il s'agit : d'écouvillonnages, de prises de sang, d'injections ou d'instillations, de prélèvements de fiente. Pour les porcs, il s'agit : d'écouvillonnages, de prises de sang, de prélèvements de salive, d'injections. Pour les poissons, il s'agit : d'observations visuelles des comportements anormaux, de prises de sang, d'anesthésie, d'injections. Les actes décrits pour chacune des espèces sont des actes très brefs, n’excédant pas la minute pour les volailles et les porcs et 10 min pour les poissons (anesthésie). Le nombre d'actes maximum (tout acte confondu) est limité à 3 par animal, avec un temps de repos entre chaque prélèvement.

Impact sur les animaux

Les procédures ne devraient pas être à l'origine de souffrance prolongée pour les animaux. Les actes décrits pour chacune des espèces sont des actes très brefs (n’excédant pas la minute pour les volailles et les porcs, maximum 10 minutes pour les poissons (anesthésie) et sont, pour certains (ex : injection IP ou IM à un poisson) pratiqués sous anesthésie. Les formations sont journalières. Les animaux seront donc systématiquement mis à mort au plus tard, en fin de journée.

Devenir

La mise à mort fera partie de la formation.

Remplacement

Les personnes seront formées en premier lieu à l'aide de démonstration enregistrées en vidéo, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Elles s'exerceront ensuite sur modèle inerte (lorsque disponible) avant de pratiquer sur animal vivant pour permettre d’acquérir plus de fluidité dans les gestes. Toutefois, le remplacement complet des animaux n'est pas possible, puisque le but de ce projet est la maîtrise des gestes et que celle-ci ne peut s'acquérir qu'en pratiquant.

Réduction

Les personnes seront formées en premier lieu à l'aide de démonstrations enregistrées en vidéo, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Elles s'exerceront ensuite sur modèle inerte (lorsque disponible) avant de pratiquer sur animal vivant pour permettre d’acquérir plus de fluidité dans les gestes. Toutefois, la pratique sur animaux est indispensable pour l'acquisition de la maîtrise des gestes. Le nombre d’animaux utilisés sera néanmoins réduit au nombre minimum suffisant pour l’acquisition et la maîtrise des différents actes.

Raffinement

Le but de ce projet est le raffinement, permettant d'une part aux personnes de réaliser les actes avec les gestes les plus indolores et les moins stressants possibles pour les animaux ainsi que pour les manipulateurs et d'autre part à réduire les manipulations aux seuls actes utilisés lors des autres projets expérimentaux du laboratoire. Le produit qui sera injecté ou instillé sera un produit indolore (sérum physiologique). Pour les poissons, une injection de puce électronique sera également effectuée. La formation sera donnée par des personnes ayant une parfaite maîtrise des actes. Le personnel formé visualisera d'abord des enregistrements vidéo, s'exercera ensuite sur modèle inerte (lorsque disponible) avant de pratiquer sur animal vivant. Les animaux seront élevés en groupe, en cage, au sol ou en bassin et bénéficieront d'un enrichissement social. Ils auront à leur disposition des objets manipulables (porcs, volailles) ou des enrichissements (algues en plastique, cachettes) pour les poissons. Ils seront nourris selon leurs besoins et, pour les animaux terrestres, abreuvés à volonté. Ils seront examinés au cours d'une visite quotidienne tout au long de la période d'élevage.

Choix des espèces

Les espèces poule, dinde, canard, porc et poisson sont des espèces classiques de l’élevage d'animaux producteurs de denrées. L'âge des animaux sera fonction des besoins de la formation (liés aux essais prévus). Pour les volailles : ils vont de 1 jour (rare) à 5-7 semaines. Dans certains cas, les animaux pourront avoir 10-12 semaines. Pour les porcs : ils vont de 1 jour (rare) à 6 mois. Pour les poissons : ils seront âgés d'envion 6 mois (+/- 30g).

160 médakas vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Les poissons, dont le gène auts2a est modifié par CRISPR, sont isolés huit heures pour des tests comportementaux d'apprentissage, puis tués par surdose d'anesthésique. Le porteur étudie la transmission à la descendance d'effets liés à ce gène qu'il dit impliqué dans plusieurs pathologies humaines dont l'autisme. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative à l'animal vivant pour observer des réponses comportementales issues d'une fécondation naturelle.

Objectifs

Des températures suboptimales lors de la période de reproduction ont montré une baisse de l’expression maternelle d’un gène, auts2a, impliqué dans de nombreuses neuropathologies humaines : Trouble du spectre autistique, schizophrénie, Retard mental, etc … . Ce projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires des stades précoces du développement embryonnaire qui entrainent des modifications des phénotypes comportementaux chez une espèce de poisson modèle, le médaka (Oryzias latipes). Par une approche d’édition de génome (CRISPR/Cas9) nous réaliserons deux lignées de médaka n’exprimant pas la protéine auts2a, ce qui nous permettra de réaliser des phénotypages comportementaux et moléculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les effets intergénérationnels de stress parentaux, par exemple thermiques liés au réchauffement climatique, sur les comportements adaptatifs de la descendance chez des poissons d'élevage. L'identification du rôle clé joué par le gène auts2 dans cette transmission chez un poisson modèle contribuera à renforcer les connaissances scientifiques sur la transmission maternelle et/ou paternelle de ce gène impliqué dans de nombreuses pathologies humaines.

Procédures

Les animaux seront isolés pendant 8h afin de s'habituer à un nouvel environnement (nous déterminerons ainsi leurs capacités d'apprentissage des caractéristiques nouvelles de cet environnement). Cet isolement entraîne un stress modéré pour le médaka puisque son activité de nage redevient régulière et le poisson remonte en surface (indicateur d'absence de stress) après moins d'une heure.

Impact sur les animaux

Les phénotypes entraînés par la mutation n’induisent pas de souffrance et ne sont donc pas dommageables pour l’animal (il s’agit essentiellement de modifications des réponses émotionnelles et cognitives bénignes).

Devenir

Mise à mort selon la réglementation en vigueur pour l'espèce (surdose d'anesthésie)

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation des animaux dans cette expérimentation car nous recherchons précisément des mécanismes intervenant pendant une fécondation naturelle perturbée par la modification ou l’absence d’une protéine impliquée dans le neurodéveloppement ainsi que les réponses comportementales des poissons (vivants donc) issus de cette fécondation.

Réduction

Concernant les tests comportementaux, nous comparerons 4 génotypes différents, avec un nombre équitable de femelles et de mâles par génotype, ce qui nécessite un minimum de 20 poissons (10 femelles et 10 mâles) par génotype pour réaliser des tests statistiques robustes.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les manipulations des animaux seront réalisées le plus rapidement possible pour limiter le stress. Pour les tests comportementaux, les conditions environnementales seront les mêmes qu’en condition d’élevage hormis un isolement obligatoire pour l’analyse du comportement. Il n’y aura aucune procédure douloureuse. A la fin des tests, ils seront euthanasiés selon la procédure de mise à mort réglementaire.

Choix des espèces

L’analyse de l’expression du transcriptome à différents stades de développement embryonnaire est rendue possible par les spécificités biologiques du médaka. En effet, Il produit une trentaine d’œufs de manière quotidienne, ce qui permet un grand échantillonnage. Son développement embryonnaire est plus lent que celui du zebrafish (9 jours contre 2 jours), ce qui permet une meilleure précision lors de l’étude et l’observation du développement des œufs (qui sont translucides). De plus, le médaka ne possède que le paralogue auts2a (comme l’homme) tandis que le zebrafish possède les paralogues auts2a et auts2b (dont on ne connaît pas la fonction). Les injections auront lieu sur des œufs au stade 1 cellule (15 minutes après leur fécondation) et seront issus de poissons matures de souche sauvage. Les études comportementales porteront sur des poissons âgés entre 3 et 5 mois. Avant 2 mois les médakas montrent une activité plus importante et une grande variabilité inter-individuelle et avant 3 mois leur phénotype adulte n’est pas atteint ce qui rend leur détection par le logiciel ethovision XT plus difficile (la couleur des médakas s’assombrissant avec le temps).

750 civelles d'anguille européenne, espèce menacée, vont être utilisées dans des procédures classées en gravité légère, marquées par immersion dans une solution d'alizarine après un choc osmotique. À l'issue de la stabulation, 390 individus sont tués pour mesurer l'intensité de la fluorescence au microscope, les 360 restants étant relâchés sur les sites de repeuplement. Le porteur vise une lecture externe du marquage qui permettrait, à terme, d'évaluer le repeuplement sans tuer d'individus. Il affirme que le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette recherche menée sur la civelle.

Objectifs

Dans le cadre du plan de gestion de l’anguille, des opérations de captures de civelles en estuaire et de repeuplement des fleuves côtiers sont réalisées chaque année. L’évaluation de cette pratique est basée sur une technique de marquage de masse des civelles à l’alizarine Red S, un colorant fluorochrome qui génère une marque détectable durablement dans les structures calcifiées, notamment dans les otolithes, concrétions de l’oreille interne. La détection de la marque fluorescente requiert le sacrifice d’un échantillon d’individus capturés dans le milieu naturel, afin de déterminer la contribution de l’alevinage dans la population d’anguilles. La possibilité d’une détection externe des marques fluorescentes sur des civelles a été démontrée dans la littérature à partir d’un autre marqueur fluorescent, mais pas avec l’alizarine Red S. Des tests préliminaires réalisés selon le protocole de marquage couramment employé ont montré la présence de marques légères dans la mâchoire et les nageoires des civelles, mais souvent de courte durée. L’objectif de la présente étude est la mise au point d’un protocole de marquage à l’alizarine Red S, permettant spécifiquement une détection externe et durable des marques fluorescentes, qui pourrait à termes permettre l’évaluation de la contribution de l’alevinage, sans sacrifice d’individus.

Bénéfices attendus

La lecture externe des marques permettrait en premier lieu une simplification du protocole de détection, et ouvrirait d’autre part des perspectives intéressantes vers de la détection des marques sur animaux vivants, permettant notamment de ne plus sacrifier d’individus, réduire le temps de lecture et d’augmenter la taille de l’échantillon analysé.

Procédures

Marquage par immersion dans une solution de marqueur fluorescent. 2 types de marquage par balnéation seront testées : - Balnéation Longue : Balnéation des poissons dans 20L de solution d’Alizarine Red S à la concentration de 150 mg/l pendant 3h (lot n°1) ou 9h (lot n°2). - Balnéation Courte : Un choc osmotique est préalablement réalisé afin de favoriser l’assimilation rapide du marqueur fluorescent pendant 3.5 minutes puis une balnéation de 10 minutes dans 2L de solution d’alizarine à 1000ppm (lot n°3) ou 2000ppm (lot n°4).

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables potentiels sur les animaux concernent le transport après capture, le marquage et le maintien en captivité. Toutefois, ces effets peuvent être considérés comme légers au vu de l’expérience des opérateurs dans le transport et le marquage des civelles, communément réalisés dans le cadre des transferts de civelle destinées au repeuplement.

Devenir

Transport, marquage puis stabulation de 750 civelles. A l'issue de la stabulation (3e et dernière procédure), mise à mort de 390 individus et replacement en liberté du restant des individus encore en vie. La mise à mort se justifie pour pouvoir mesurer précisément l’intensité de la fluorescence à l’aide d’un microscope à épifluorescence et d’un dispositif de détection portatif et mettre au point une procédure de lecture.

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette expérience de recherche de fluorescence externe qui implique de travailler nécessairement sur la civelle.

Réduction

L’effectif prévu (50 individus / lot) tient compte de la mortalité attendue en milieu contrôlé au stade civelle (maximum 25-30% avec le traitement BL3 ). A l’issue des 60 jours, un minimum de 30 individus par lot doit être analysé, sauf pour les témoins pour lesquels 10 individus par lot seront analysés (12*30 + 30 = 390 individus) en raison de la faible variabilité au sein de ce lot de référence non marqué. Ainsi 90 individus par traitement et 30 témoins seront analysés pour la fluorescence, afin de prendre en compte la diversité des stades pigmentaires dans l’échantillon (pouvant influer sur la détection de fluorescence) et la variabilité inter-individuelle de la fluorescence, potentiellement importante si l’on se réfère à d’autres études sur la rétention des marquages fluorescents. Les individus non analysés seront relâchés dans le milieu naturel sur les sites de repeuplement (au maximum 360 individus).

Raffinement

Les mésocosmes seront enrichis à l’aide de flottangs tout au long de l’expérience, dispositifs permettant aux civelles de s’abriter. Des daphnies seront ensemencées pour leur alimentation. La concentration en déchets du métabolisme azoté sera contrôlée chaque semaine, la concentration en oxygène sera également contrôlée quotidiennement. Des changements d’eau seront réalisés si besoin. Toutefois cela ne devrait pas être nécessaire vu la très faible densité d’individus dans le volume d’eau.

Choix des espèces

L’anguille est une espèce menacée au niveau européen, qui fait l’objet d’un plan de conservation à l’échelle nationale. L’évaluation des pratiques de repeuplement par une méthode de détection externe non létale représente un fort enjeu pour la gestion future. Les animaux seront utilisés au stade civelle car c'est le stade utilisé en France pour réaliser les opérations de repeuplement d'anguille.