Rongeurs

Génétiquement modifiées pour reproduire une épilepsie humaine, 600 souris développent des crises spontanées et imprévisibles pouvant provoquer leur mort subite. Le RNT les classe en souffrance modérée et prévoit de les répartir sur cinq ans. Elles ne reçoivent pas d'injection et sont surtout soumises au stress des manipulations, les prélèvements se faisant sur animaux morts. Le porteur affirme qu'aucun traitement n'existe et que le passage par un modèle vivant est une étape "indispensable" avant tout essai chez l'enfant.

Objectifs

Certaines mutations génétiques provoquent une épilepsie dans l'espèce humaine. Cette épilepsie peut se manifester par de fréquentes crises survenant durant les tous premiers mois de vie (avant l'âge de 3 mois). Cette activité épileptique est souvent accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle qui reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Ce modèle va nous permettre de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de déveloper de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

L'utilisation de ce modèle animal permettra de tester de nouvelles approches thérapeutiques et à terme de proposer de nouvelles thérapies aux patients concernés.

Procédures

Les souris ne recevront aucune injection. Elle sont soumises uniquement au stress lié aux manipulations. Les prélèvements sont effectués sur animaux décédés. L’effectif concerné est de 600 souris sur une durée de 5 ans.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ce projet sont sujets à des crises d'épilepsie, spontannées et imprévisibles. Ces crises provoquent la mort subite des animaux dans le pire des cas, ou une perte de connaissance suivie d'une récupération spontannée en quelques minutes dans la majorité des cas. Il n'y a aucun autre effet indésirable connu chez ces animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative à l'utilisation d'animaux vivants n'est susceptible de répondre aux objectifs du projet. Le passage par un modèle vivant est une étape indispensable avant d'envisager un essai thérapeutique pédiatrique.

Réduction

La variabilité inter-individuelle est réduite par l'utilisation de souches de souris stables au niveau génétique. Une analyse de puissance statistique est réalisée en amont de chaque procédure afin de limiter l’étude au nombre d'animaux nécessaires pour répondre à la question posée grâce à un outil statistique dédié.

Raffinement

L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées au maximum par 5 dans des cages enrichies (litière, dôme et bandelettes en carton) avec nourriture et eau ad libitum, dans une pièce thermo-contrôlée en alternance jour/nuit (12/12). Ils sont vérifiés quotidiennement par un personnel formé. Des points limite clairs sont définis pour l'élevage de tous les animaux et les animaux seront euthanasiés lorsqu'ils atteindront les critères d'interruption.

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Nous analyserons les animaux à différents âges entre la naissance et l’âge de 1 an. Tous seront utilisés pour la caractérisation histologique et moléculaire de la pathologie. Chez l'Homme, la maladie est détectée quelques jours à quelques semaines après la naissance. Notre projet a pour objectif d’observer et phénotyper les animaux dès la naissance jusqu’à l’âge adulte pour identifier les phases critiques de développement de la pathologie et mieux cibler la période à partir de laquelle un traitement devra être envisagé.

Opérées au cerveau sous anesthésie, avec une intervention pouvant atteindre deux heures, 532 souris subissent ensuite jusqu'à sept tests comportementaux, et une partie d'entre elles un stress chronique provoqué par de la corticostérone ajoutée à l'eau de boisson. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance modéré et seront tuées à l'issue, le cerveau prélevé. L'objectif déclaré est de préciser le rôle des neurones excitateurs et inhibiteurs du cortex insulaire dans l'anxiété. Le protocole installe donc un état anxieux chez des animaux dont le RNT détaille par ailleurs longuement les conditions d'hébergement.

Objectifs

L’anxiété est une réponse psychologique et physiologique anticipatrice face à une menace potentielle. À un niveau modéré, elle est adaptative : elle augmente la vigilance et facilite l’évitement du danger. Les troubles anxieux apparaissent lorsque cette réponse devient durablement excessive et se maintient en l’absence de menace identifiable. Malgré l’existence de traitements (antidépresseurs, benzodiazépines), une proportion importante de patients présente une efficacité limitée et/ou des effets indésirables qui altèrent le fonctionnement quotidien (somnolence, troubles de l’attention, baisse de la vigilance, confusion…). Cette situation représente un enjeu majeur de santé publique et un fardeau socio-économique considérable. Progresser vers de nouvelles stratégies thérapeutiques nécessite donc de mieux comprendre les mécanismes cérébraux qui sous-tendent l’anxiété. Parmi les régions impliquées, le cortex insulaire (insula) occupe une place centrale. Des méta-analyses d’études d’imagerie fonctionnelle chez des patients souffrant de troubles anxieux rapportent des altérations de l’activité de l’insula par rapport à des témoins sains, suggérant que cette région constitue un nœud important des circuits de l’anxiété. Des travaux précliniques montrent également que les neurones excitateurs de l’insula antérieure augmentent leur activité dans des contextes anxiogènes, et que réduire l’activité de cette région diminue les comportements de type anxieux. En revanche, la contribution des neurones inhibiteurs de l'insula reste beaucoup moins caractérisée, il est donc essentiel de déterminer comment l’équilibre entre transmission excitatrice et inhibitrice, au niveau des neurones et des synapses, façonne les circuits qui soutiennent l’anxiété physiologique et pathologique. Ce projet vise à préciser le rôle relatif des composantes excitatrice et inhibitrice de l’insula antérieure dans les comportements liés à l’anxiété, en répondant à deux questions principales : (1) quel est le profil d’activité des neurones inhibiteurs de l’aIC dans des situations anxiogènes ? (2) une modulation sélective de la transmission excitatrice ou inhibitrice peut-elle réduire les comportements anxieux ?

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont multiples : (i) approfondir la compréhension des mécanismes de transmission neuronale impliqués dans l’anxiété ; (ii) ouvrir la voie à l’identification de stratégies visant à restaurer les altérations observées chez les patients atteints de troubles anxieux ; et (iii) favoriser des avancées méthodologiques et techniques en recherche neurobiologique.

Procédures

A l’âge adulte (semaine 9), tous les animaux subiront une chirurgie cérébrale d’un maximum de 2h suivie d’une période de 4 semaines de récupération. La totalité des animaux seront ensuite soumis à une batterie de tests comportementaux (7 au maximum d’une durée comprise entre 10 et 30 minutes) étalés sur 2 semaines à raison d’un test par jour.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues sont les suivantes : peur ou stress liés aux manipulations et aux tests comportementaux. Les contacts avec l’expérimentateur, les changements d’environnement et l’exposition à des tests standards peuvent provoquer une anxiété passagère. Les protocoles de stress chronique (corticostérone dans l’eau de boisson) peuvent altérer temporairement l’état général, avec notamment une perte de poids, une baisse d’activité, une diminution de la prise alimentaire ou un aspect du pelage moins soigné. Les interventions chirurgicales cérébrales, réalisées sous anesthésie générale, peuvent entraîner un ralentissement transitoire au réveil, ainsi qu’une douleur postopératoire, une inflammation locale, un risque d’infection, une perte de l’implant, des lésions liées au grattage au niveau de la tête et une gêne due au relief de l’implant. Enfin, les outils utilisés pour moduler l’activité des neurones peuvent induire des changements transitoires du comportement, en lien avec les effets attendus de la manipulation expérimentale.

Devenir

A l’issu du projet, les souris seront euthanasiées pour prélèvement du cerveau.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connectivité des neurones et de leurs propriétés de codage d’informations au cours de comportements complexes. Par conséquent, cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. Des méthodes telles que la culture cellulaire ne permettent pas la quantification des connexions neuronales ou de la mesure de l’activité en réponse à une stimulation sensorielle in vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous adopterons une approche statistique rigoureuse permettant d'obtenir des résultats fiables avec un minimum d'animaux. Le nombre d'animaux nécessaires a été soigneusement calculé pour garantir la robustesse des résultats tout en limitant leur utilisation. Nous utiliserons également des techniques avancées de neurosciences computationnelles pour maximiser les données comportementales extraites de nos souris. Des logiciels utilisant l’intelligence artificielle seront employés pour analyser ces comportements et constituer une base de données détaillée. Ces méthodes permettent de tirer le maximum d'informations de chaque animal tout en minimisant leur nombre.

Raffinement

Pour réduire la souffrance imposée par le protocole et améliorer le bien-être des animaux, les mesures suivantes seront appliquées : Les animaux seront hébergés en cages collectives, regroupés par fratrie pour éviter l’isolement social. Les cages seront enrichies avec du matériel de nidification pour améliorer leur confort. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée par le personnel animalier, y compris les week-ends et jours fériés. Avant le début de l’expérience, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par l’expérimentateur, qui passera ensuite à une surveillance quotidienne pendant toute la durée de l’expérience. Les observations incluront la vérification de la prise alimentaire, le poids, le comportement, la vivacité et l’état du pelage. Pour prévenir la douleur après chirurgie, un médicament antidouleur sera administré. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. La température corporelle de l’animal sera contrôlée et maintenue, et un gel sera appliqué sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Après la chirurgie, une petite quantité de solution stérile sera administrée pour éviter la déshydratation, et de la nourriture humidifiée sera mise à disposition au sol de la cage. L’état de l’animal et la bonne cicatrisation de l’incision au niveau de la tête seront contrôlés quotidiennement pendant la semaine suivant la chirurgie. En cas de signes d’infection (rougeur, gonflement, écoulements, saignement), la plaie sera nettoyée et désinfectée avec un antiseptique. Le vétérinaire sera informé et décidera si un traitement supplémentaire est nécessaire. Si l’animal présente 3 des signes ci-dessous sur 3 jours consécutifs sans amélioration, il sera euthanasié : infection de la plaie, perte de poids de 15 % ou plus sans reprise, déshydratation, prostration, perte d’interaction avec l’environnement, agressivité accrue, réduction de mobilité. Dans tous les cas, si l’état général de la souris ne s’améliore pas sous 24 h, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de référence pour l’étude des circuits de la peur et des troubles anxieux. Par ailleurs, la région cérébrale étudiée, le cortex insulaire présente chez la souris une organisation et une cyto-architecture comparables à celles observées chez l’humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte (9 semaines), afin de travailler sur des neurones et circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées matures.

Porteurs d'un transgène humain qui déclenche à lui seul la maladie, 1200 rats génétiquement modifiés vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tués à l'issue pour le prélèvement d'organes. Sous le seul effet du transgène, ils développent des arthrites, une colite, parfois une inflammation de la peau ou de l'œil, avec douleur, perte de poids et mobilité réduite. Ils reçoivent des injections quotidiennes pendant six à douze semaines lors des essais de molécules. Le porteur qualifie ce rat de modèle le plus "percutant" de la spondylarthrite, la souffrance venant ici de la maladie que l'animal porte par construction.

Objectifs

l’objectif majeur de notre projet est de comprendre le rôle pathogène du HLA (Antigènes des Leucocytes Humains)-B27 au cours de la spondyloarthrite (SPA) utilisant le modèle expérimental de SPA : le rat transgénique HLA-B27 afin de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Au cours de ces dernières années, nous avons cherché à comprendre pourquoi nous observons une proliferation anormale des lymphocytes T pro-inflammatoires producteurs de la cytokine inflammatoire (IL-17) chez le rat B27, le modèle animal le plus pertinent et le plus proche de la SpA humaine. Nos résultats ont mis en évidence que l’IL-27 (une cytokine anti-inflammatoire) et ICOS (une molécule de costimulation) étaient deux nouvelles cibles thérapeutiques prometteuses pour le traitement de la SpA. En ce qui concerne l’IL-27, elle a eu un effet protecteur en réduisant la sévérité des manifestations inflammatoires chez le rat B27, tout en inhibant les réponses des lymphocytes inflammaoires et la production d'IL-17. Nos résultats ouvrent des nouvelles perspectives même pour des patients qui ne repondent pas aux traitements actuellement disponibles.

Procédures

Post-mortem, des organes lymphoides des animaux seront prélévés en quelques minutes (environ 2-3) pour une analyse cellulaire ou histologique. Durant les essais pré-cliniques, les animaux seront injectés (durée de l'injection quelques secondes) intraperitoneal tous les jours pendant 6-12 semaines. Pour les experiences ex-vivo un minimun de 2 animaux non transgéniques et 2 animaux transgéniques seront utilisés et les experiences seront répétées 5 à 6 fois. Pour les essais pré-cliniques, nous utiliserons des groupes de 6 à 8 animaux par groupe.

Impact sur les animaux

Le rat transgénique pour HLA-B27 est à l’heure actuelle le modèle animal le plus percutant de cette pathologie. Dans ce modèle surviennent spontanément, sous le seul effet du transgène et probablement en association avec le fond génétique du rat, toutes ou une partie des manifestations de la spondylarthrite ankylosante. Ainsi, ces animaux développent des manifestations comme des arthrites et une colite. Certains animaux développent aussi une l’inflammation de la peau ou de l’œil. Ces manisfestations peuvent engendrer chez ces animaux de la douleur, perte de poids et parfois une mobilité reduite.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, à l'exception de l'elevage, les animaux seront mise à mort pour les prélèvements d'organes nous permettant d'etudier les céllules, les organes et les méchanismes impliqués dans la pathogénèse de la maladie. Dans d'autres cas, les animaux seront utilisés pour étudier le potentiel thérapeutique des certaines molécules à partir du prélèvements d'organes et analyse cellulaire.

Remplacement

Toutes les molécules avec un potentiel thérapeutique seront d’abord testées in vitro en utilisant des lignées cellulaires à la place des animaux par exemple. Seulement après validation in vitro, ces molécules seront téstées chez les animaux afin d'étudier leur potentiel thérapeutique dans le traitement contre les spondyloarthrites.

Réduction

Comme prévu, dans les essais pré-cliniques, le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe de traitement sera de 6 et 8. Ce nombre d’animaux par groupe nous permet de réaliser des analyses statistiques robustes permettant d’établir quelques conclusions pertinentes sur des paramètres abordés dans notre projet. Il ne nous paraît pas envisageable de réduire ce nombre d’animaux par groupe dans de futurs projets, si l’on souhaite garder des analyses statistiques pertinentes.

Raffinement

Nous envisageons, en cas de présence d’arthrites causant une difficulté de la mobilité des rats, de mettre de l’alimentation dans la cage afin que les rats puissent s’alimenter correctement. Du change de cages, deux fois par semaine , seront prévus pour les cages où il y aura des animaux très malades avec diarrhées. Nous mettrons en place l'ajout de fromage aux femelles gestantes et aux petits pour améliorer leur croissance. A partir de 7 semaines d’âge l'etat de santé des animaux sera observé et nous utiliserons un tableau de scoring de la maladie (voir tableau ci-dessous). Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 20% ou atteignant le score total de 15 (= point limite) seront sacrifiés. Score maximal total = 27 Semaine 7……Semaine X Poids (g) Diarrhée Absente=0 Modérée = 1 Importante= 2 Profuse=3 Anite=+1 Articulations Normale=0 Gonflée = 1 à 4 Patte AV gauche Patte AV droite Patte AR gauche Lésions cutanées 1 à 4 Ongles= +1 Orchite Absence=0 Présence=1 Uvéite Absence=0 Présence=1

Choix des espèces

Le rat transgénique pour HLA-B27 est à l’heure actuelle le modèle animal le plus relevant de cette pathologie. Dans ce modèle surviennent spontanément, sous le seul effet du transgène et probablement en association avec le fond génétique du rat, toutes les manifestations de la spondylarthrite ankylosante. Notre objectif est donc de comprendre le rôle pathogène du HLA-B27 au cours de la pathologie en utilisant ce modèle. Il est important de souligner que des souris portant le même transgène ne développent aucun signe de la maladie. Nous utiliserons des animaux à un état précoce du développement de la maladie (environ 3 semaines) ne présentant pas encore des signes cliniques, par exemple pour les expériences nécessitant d’utiliser des cellules en absence d’inflammation ou dans le cas de traitement in vivo précoce. Dans ce cas, les animaux seront marqués à l’encre et génotypés avant leur utilisation. Pour toutes les autres expériences, en utilisant de rats adultes qui presentent des signes cliniques (la maladie est etablie) nous utiliserons un protocole classique de marquage à l’oreille et génotypage à partir d’échantillons de l'oreille marquée. Des rats adults (entre 3 mois et 6 mois d'âge) seront utilisés pour certaines expériences.

Opérés pour la pose d'un cathéter permanent d'auto-administration d'alcool, 256 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. La chirurgie de trente à quarante-cinq minutes se fait sous anesthésie, suivie d'un entraînement à consommer de l'alcool et de tests avec divers composés pharmacologiques. Le porteur signale des risques d'infection, de plaies liées au léchage de la zone opérée et de perte des sutures. À la fin, les rats sont tués et leur cerveau prélevé pour mesurer l'activité cérébrale.

Objectifs

La consommation excessive d’alcool est un enjeu majeur de santé publique et une des principales causes évitables de morbidité et de mortalité chez l’humain. Cette consommation est motivée principalement par la recherche d’un état d’intoxication soit dans un but de recherche de plaisir et d’émotions positives, soit dans un but de réduction d’émotions négatives, telles que l’anxiété. Afin d’en comprendre les mécanismes biologiques, la consommation d’alcool a été largement étudiée chez le rat. Toutefois, à ce jour, les effets motivant la consommation d’alcool chez le rat restent encore incertains. Est-elle principalement motivée par le plaisir du goût de l’alcool ou par les effets ressentis après ingestion et absorption de l’alcool dans le sang ? Une bonne connaissance de ces effets est essentielle afin de développer des modèles animaux de consommation d’alcool plus pertinents pour la recherche de traitements efficaces. Ce projet vise donc à étudier et comparer la consommation d’alcool par différentes voies d’administration : orale, intragastrique et intraveineuse. Cette étude permettra de décomposer et mesurer les contributions du goût de l’alcool et des effets ressentis après ingestion et absorption de l’alcool sur sa consommation. Le projet prévoit également de mesurer les modifications de l'activité du cerveau liées à ces différentes contributions.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera d’identifier les différents effets motivant la consommation d’alcool chez le rat et leur influence relative. Le second bénéfice sera d’évaluer la sensibilité de ces effets à différents traitements pharmacologiques. Enfin, un autre bénéfice sera d’identifier les changements de l’activité du cerveau liés aux différents effets de l'alcool motivant sa consommation.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de courte durée pour la mise en place d'un cathéter à demeure pour l’auto-administration d’alcool. Ces chirurgies, d’une durée moyenne comprise entre 30 minutes et 45 minutes, seront réalisées sur couverture chauffante, en conditions aseptiques, sous anesthésie chimique et sous analgésie appropriée. Au cours des phases expérimentales, les animaux seront entraînés et testés dans des différentes tâches comportementales. Au cours de la dernière phase de test, ils seront testés avec différents composés pharmacologiques afin d’étudier les mécanismes neuropharmacologiques de leur consommation d’alcool. Enfin, des prélèvements sanguins ponctuels de faible volume seront réalisés afin de mesurer l’alcoolémie. Le nombre de prélèvements par animal sera limité à trois au total : une fois pendant la phase d’apprentissage, une fois pendant la phase des tests comportementaux et une fois pendant la phase de tests pharmacologiques. Dans chaque cas, le prélèvement sera effectué environ 10 minutes après la fin d’une séance d’auto-administration.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des procédures dont le degré de gravité principal est léger et qui ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (habituation, anesthésie, analgésie, conditions aseptiques, suivi post-opératoire), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir au cours du projet. Les nuisances attendues sont principalement liées aux procédures chirurgicales. Celles-ci incluent un risque d’inflammation ou d’infection, l’apparition éventuelle de plaies liées à un toilettage excessif de la zone opérée, ou une perte prématurée des sutures avant cicatrisation complète. Les prélèvements sanguins ponctuels pourront entraîner un inconfort transitoire. Aucune nuisance particulière n’est anticipée lors des test comportementaux de mesure de la consommation d’alcool. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter et de prévenir rapidement tout signe d’inconfort, de stress ou de douleur.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux seront prélevés post-mortem pour effectuer une mesure de l'activité globale du cerveau.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (jeunes adultes, mâles et femelles), élevé en groupe dans un environnement enrichi contenant un tunnel en carton et un os à ronger. Ce recours à l’animal se justifie par l’impossibilité d’étudier, chez l’être humain, de manière contrôlée et éthiquement acceptable, les déterminants comportementaux et neurobiologiques de la consommation d’alcool, en particulier lorsqu’elle implique des manipulations invasives ou répétées. Par ailleurs, il n’existe actuellement pas de modèles in vitro, ex vivo ou in silico permettant de reproduire de façon réaliste les interactions complexes entre comportements de consommation, conséquences pharmacologiques de l’éthanol et organisation cérébrale. Les lignées cellulaires ou autres modèles alternatifs ne permettent pas de rendre compte de ces dimensions intégrées.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été calculé au minimum nécessaire à la réalisation des objectifs scientifiques, en tenant compte des contraintes expérimentales propres au projet et de l’effectif par groupe, par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ont été conçues afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance, et le stress des animaux tout au long du projet. Les interventions chirurgicales nécessaires à la mise en place des cathéters seront réalisées sous anesthésie chimique et sous analgésie appropriée, en conditions aseptiques et sur couverture chauffante. La durée des chirurgies sera limitée au strict nécessaire et une surveillance attentive sera assurée tout au long de l’intervention. En fin de chirurgie, les animaux recevront une prise en charge adaptée visant à favoriser la récupération, incluant une réhydratation. Les animaux seront ensuite placés en cage de réveil sous surveillance jusqu’au retour à un état de vigilance normal, avant d’être relogés dans leur cage avec leur congénère. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne tout au long du projet afin de détecter précocement tout signe d’inconfort, de douleur ou d’altération de l’état général (perte de poids, modification du comportement, altération de l’aspect physique). Les interventions visant à réduire ou supprimer l’inconfort seront gradées. En cas d’apparition de signes légers, des mesures de nursing seront mises en place, incluant un accès facilité à la nourriture et à l’eau. Si nécessaire, des traitements analgésiques supplémentaires seront administrés et une réhydratation sous-cutanée pourra être réalisée. Les prélèvements sanguins ponctuels seront effectués par du personnel formé, selon des procédures minimisant l’inconfort et la durée de contention.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire constitue un compromis. Cette espèce est suffisamment proche des êtres humains pour servir de modèle animal pertinent des phénomènes d’addiction, par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple les invertébrés, à l’exception possible des céphalopodes). Les animaux utilisés seront des rats jeunes adultes au début des procédures expérimentales (âge moyen d’environ 2 mois). Cette période du développement correspond à une phase de vulnérabilité particulière vis-à-vis des comportements de consommation d’alcool et est donc pertinente au regard des objectifs du projet.

92 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour mettre au point un modèle de pneumonie due à la bactérie Tropheryma whipplei. L'infection se fait par aspiration dans la gorge, précédée d'un prélèvement de sang à la lancette sur animal éveillé. Le porteur évoque une atteinte des voies respiratoires et une douleur transitoire après la procédure. Le texte annonce un suivi des animaux infectés sans préciser les critères d'observation ni les signes qui déclencheraient une mise à mort anticipée.

Objectifs

Tropheryma whipplei est une bactérie associée à un large spectre d’affections chez l’Homme, s’étalant d’un portage asymptomatique à des infections chroniques systémiques. Les avancées des techniques de détection et de séquençage à haut débit ont profondément modifié l’épidémiologie de ces infections. Ainsi, un nombre croissant d’études suggère que T. whipplei est un agent de pneumonies aigues. Dans ce contexte, nous souhaiterions explorer de manière exhaustive la pneumonie induite par T. whipplei afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de l’infection. Compte tenu des données épidémiologiques, nous devons modéliser la pneumonie d’aspiration et la pneumonie communautaire. Ce projet s’articulera donc autour de l’établissement et de la comparaison de 2 modèles de pneumonie : un modèle de pneumonie d’aspiration par aspiration oro-pharyngée de T. whipplei et un modèle de pneumonie communautaire par inhalation.

Bénéfices attendus

T. whipplei peut provoquer diverses infections qui sont relativement rares dans le monde. Avec le développement de la biologie moléculaire et si la capacité de détecter cette bactérie a augmenté ces dernières années, son importance dans les échantillons des voies respiratoires inférieures reste incertaine. Ainsi, ce projet permettra de mieux comprendre la mise en place des pneumonies à T. whipplei, notamment le contexte de leur apparition (pneumonie aigue communautaire ou pneumonie d’aspiration). Il mettra également en évidence des éléments critiques dans l’établissement et la physiopathologie de l’infection pulmonaire à T. whipplei. Enfin, il permettra de définir également de développer des outils diagnostiques et éventuellement pronostiques de telles infections.

Procédures

Un prélèvement sub mandibulaire sera effectué sur souris vigile avant l'infection à l'aide d'une lancette (Golden Rod 4MM). Quelques gouttes (100 microlitres environ) de sang sera prélevé sans dépasser le rapport volume/ poids réglementaire. D'autres prélèvements seront réalisés sur animaux morts.

Impact sur les animaux

Des altérations de l'épithélium des voies aériennes peuvent être observées, bien que généralement modérées et transitoires suite à l’aspiration oro-pharyngée. Il est possible que les souris présentent une douleur transitoire post-procédure. L’infection par T. whipplei pourrait causer une pneumopathie et éventuellement conduire à une diminution de la compliance pulmonaire.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux pour prélèvements de fluides et organes.

Remplacement

Bien que nous menons parallèlement des études in vitro visant à évaluer la capacité de T. whipplei à infecter les cellules épithéliales, Il est nécessaire de tester nos observations dans un modèle de souris afin de se rapprocher des conditions physiopathologiques de la pneumonie induite par T. whipplei et d’en comprendre les mécanismes sous-jacents.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit grâce à la mutualisation des techniques et analyses sur un même animal. De plus, du fait de notre expérience (effets modérés de l’infection à T. whipplei), nous avons déterminé que 10 animaux/groupe sont nécessaires à notre étude pour observer une différence statistique significative entre les groupes. D’autre part, pour la procédure 1, nous avons proposé une étude pilote sur 12 souris qui permettra de tester les paramètres utilisés et de les ajuster si besoin.

Raffinement

La mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel ainsi que le suivi quotidien de l’état de santé des animaux permettront le raffinement de ce projet. Ainsi, les animaux seront hébergés en respectant le nombre maximum d’individus par cage (5 souris par petite cage ou 10 par grande), dans des cages équipées d'igloo et matériel à ronger afin d’offrir un environnement enrichi et approprié. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement dès le moindre signe de souffrance en envisageant l’utilisation d’antalgiques. Dès lors qu’un animal aura atteint le score entre 9 et 12 la souris sera euthanasiée dans le but de réduire toute douleur, souffrance et angoisse. Suivant notre grille de score, pour un score entre 5 et 8, un suivi et un analgésique pourra être administré. Au besoin, les souris recevront des croquettes à leur portée ou de la nourriture et de l’eau gélifiée ad libitum.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de choix pour l’étude du système immunitaire, et les infections respiratoires chez la souris peuvent reproduire de façon fiable l’inflammation pulmonaire, la réponse immunitaire, la production de cytokines et l’évolution clinique observées chez l’homme. Afin de limiter les variations dues à des différences d’âge, des souris adultes de 6 à 8 semaines seront utilisées.

Pour une étude pilote sur la fibrose pulmonaire, 32 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un inducteur de fibrose par aspiration dans la gorge, sous anesthésie brève, puis peuvent perdre du poids dans la semaine qui suit. Leur mise à mort permet de quantifier la fibrose sur les poumons prélevés. Le porteur présente ce travail comme préliminaire, destiné à décider s'il est utile de poursuivre sur davantage d'animaux.

Objectifs

La fibrose pulmonaire est une maladie grave des poumons. Dans ce contexte, certaines cellules du système immunitaire jouent un rôle important avec un déséquilibre entre les cellules. Parmi ces cellules, les lymphocytes T CD4 peuvent avoir des effets opposés. Nos travaux récents, ont montré NLRP3 pourrait être impliqué dans le contrôle de cet équilibre. Pour mieux comprendre si NLRP3 peut modifier cet équilibre, nous proposons de réaliser une première étude pilote dans des souris transgéniques en provoquant une fibrose pulmonaire expérimentale. Nous étudierons si cette absence de NLRP3 aggrave ou modifie les lésions pulmonaires. Cette étude préliminaire permettra de savoir s’il est utile de poursuivre ce travail dans un projet de recherche plus large.

Bénéfices attendus

Cette étude est une première étape pour mieux comprendre une maladie appelée fibrose pulmonaire, qui abîme les poumons et rend la respiration difficile. Le but de cette étude est de voir si une protéine joue un rôle important dans la maladie. C’est une étude exploratoire, c’est-à-dire une étude de départ, qui sert à savoir si cela vaut la peine d’aller plus loin. Cette recherche aidera à mieux comprendre comment fonctionne le système immunitaire dans la fibrose pulmonaire. Ces informations sont importantes pour décider si ce travail doit être poursuivi avec des études plus grandes, ou arrêté s’il n’apporte pas de résultats utiles. À plus long terme, mieux comprendre ces mécanismes pourrait aider les chercheurs à développer de nouveaux traitements pour les personnes atteintes de fibrose pulmonaire.

Procédures

Les souris recevront une administration d’un inducteur de fibrose par aspiration oropharyngée. Cette intervention sous anesthésie générale dure 30 secondes maximum.

Impact sur les animaux

Le modèle expérimental décrit dans ce projet est couramment utilisé en recherche dans le domaine de la fibrose pulmonaire. Entre 2 et 7 jours après l’induction du modèle, les souris peuvent perdre du poids. Lors des réveils de l’anesthésie, les animaux connaissent quelques minutes de désorientation, rapidement résolues par la reconnaissance de leur environnement.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéines) et analyses des populations immunitaires par cytométrie en flux

Remplacement

Les poumons sont des organes très complexes, composés de plus de 40 types de cellules différentes. La fibrose pulmonaire est une maladie qui fait intervenir plusieurs mécanismes dans les poumons, comme l’inflammation et la transformation des tissus. Ainsi, pour bien comprendre cette maladie, il est nécessaire d’étudier l’organe entier, car aucun test en laboratoire sur des cellules seules ne peut remplacer l’étude chez un animal.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, cette étude est d’abord une étude pilote, c’est-à-dire une petite étude exploratoire. Elle permettra de vérifier si la protéine qui nous intéresse a un effet sur l’évolution de la fibrose et sur l’équilibre entre les cellules. En menant d’abord cette étude préliminaire, nous pourrons décider s’il est utile de faire une étude plus grande, ce qui évite d’utiliser un grand nombre d’animaux sans raison scientifique. De plus, notre équipe possède déjà beaucoup de données obtenues sur des cellules in vitro en laboratoire. En combinant ces informations avec l’étude pilote, nous utilisons le minimum d’animaux nécessaire tout en obtenant des résultats fiables.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un environnement confortable, avec lumière, température et bruit contrôlés, dans des cages adaptées pouvant accueillir jusqu’à 10 animaux. Elles disposeront d’éléments pour jouer et se cacher, comme des tunnels en plastique et des papiers, afin de réduire le stress et l’ennui. Elles auront aussi de la nourriture spéciale à volonté, comme des aliments gélifiés ou des morceaux de pommes, pour éviter la perte de poids. Le suivi sera quotidien, assuré par du personnel qualifié, afin de détecter rapidement tout signe de malaise. Une attention particulière sera portée pour s’assurer qu’elles reprennent une activité normale après l’anesthésie.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris pour cette étude car elles sont le meilleur modèle connu pour étudier la fibrose pulmonaire. Beaucoup de recherches ont déjà utilisé des souris pour cette maladie, ce qui permet de comparer facilement nos résultats avec ceux d’autres équipes dans le monde. Les souris ont aussi l’avantage d’être les seules espèces où il est possible de créer des animaux transgéniques. Les souris permettent également de réaliser plusieurs types d’injections et de prélèvements, un peu comme ce qui se fait chez l’homme en recherche clinique. Pour cette étude, nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et pesant au moins 21 grammes. À cet âge, elles sont considérées comme adultes, avec des poumons et un système immunitaire bien développés. D’après notre expérience, la fibrose, est plus toxique chez les souris petites. Pour limiter ce risque, nous choisissons des souris suffisamment grandes et robustes : des mâles pesant plus de 21 grammes, afin de réduire les signes de malaise.

Suspension à une grille, tapis roulant, immersion de la queue en eau froide, plaque froide: 80 souris modèles de la maladie de Charcot-Marie-Tooth subissent une série de neuf tests comportementaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à huit semaines. Les tests de sensibilité au froid et de force sont décrits comme sources de stress léger et transitoire. Une mesure de l'activité électrique musculaire se fait sous anesthésie générale. Le porteur affirme que ces souris ne présentent aucun signe de douleur ni incapacité, alors que le protocole les soumet à des tests répétés de sensibilité thermique et musculaire.

Objectifs

Le but de ce projet est de tester une nouvelle approche de traitement pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) à l’aide de modèles de souris. Cette maladie, qui apparaît souvent dès l’enfance, provoque une faiblesse des muscles, une diminution de la sensibilité et des difficultés de coordination, pouvant évoluer vers une perte importante de la mobilité à l’âge adulte. La CMT est liée à un dysfonctionnement des nerfs, notamment de la couche protectrice qui les entoure et permet une bonne transmission des messages nerveux. Les souris utilisées dans ce projet présentent des troubles similaires à ceux observés chez les patients. Dans cette étude, nous croiserons ces souris avec d'autres souris capables de moduler le gène responsable de la maladie afin d’essayer de réduire les atteintes musculaires et nerveuses. Cette approche repose sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées obtenues par des croisements adaptés.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques à l’origine de la maladie, causant des défauts à la fois dans le tissu musculaire et dans le tissu nerveux. Ce projet pourrait également conduire à une preuve de concept thérapeutique pour une maladie aujourd’hui incurable.

Procédures

Les animaux (80) seront soumis à une série de 9 tests comportementaux : test d’aggrippement (durée 3x20s) - test de suspension (durée 3x60s) pour évaluer la force musculaire ; - déplacement sur tapis roulant (max 60s) et – déplacement sur une barre crantée (10x30s environ) pour évaluer la coordination motrice ; -test d’immersion de la queue en bain-marie (3x30s max en tout), -mesure de réactivité sur plaque froide (3x30s max en tout) et -mesure de réactivité cutanée (4x30s par animal) pour évaluer la sensibilité ; -mesure de l’activité des souris par des capteurs (durée de 22h) ; -mesure de l’activité électrique musculaire, sous anesthésie générale (procédure d'une demi-heure) pour évaluer la conduction nerveuse.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées et les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants : – lors de la mesure de la force générale, le fait d’être suspendu à une grille peut engendrer un stress physique transitoire chez l’animal - lors des tests de sensibilité thermique au froid, les animaux peuvent ressentir une sensation d’inconfort liée à l’exposition à une surface froide, pouvant entraîner un stress léger et transitoire. Ces tests sont de courte durée, interrompus dès l’apparition d’une réaction de retrait, et de tel sorte qu'ils ne provoquent pas de lésion tissulaire.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 8 semaines après caractérisation comportementale. Une étude histologique des tissus affectés sera ensuite effectuée.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire, de la coordination motrice et de la conduction nerveuse seraient impossibles à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Dans cette étude, nous utiliserons des souris mâles et femelles issues des croisements pour maximiser les informations obtenues tout en réduisant le nombre total d’animaux. Chaque souris sera suivie longitudinalement, c’est-à-dire qu’elle sera étudiée à plusieurs moments au cours de sa vie, afin de mesurer l’évolution des symptômes musculaires et nerveux. Grâce à cette approche, nous pourrons obtenir des résultats fiables tout en appliquant le principe de réduction : utiliser le moins d’animaux possible pour répondre aux questions scientifiques.

Raffinement

Les nouveau-nés seront avec leurs parents jusqu’au sevrage. Après cette période, les animaux seront hébergés par groupes de 2 à 5 par cage, dans un environnement ventilé. La température sera maintenue constante et un cycle lumineux de 12 heures jour/nuit sera respecté. Chaque cage sera équipée de nids et les animaux auront un accès illimité à l’eau et la nourriture. Un tube par cage sera également disposé. Les souris CMT présentent des difficultés au temps de suspension, de la nourriture en gel ainsi que des pellets seront donc directement placés dans la cage afin de soulager l’animal dans son accès à la nourriture. À partir du moment où les animaux seront au phénotypage (semaine 7 et 8), ils seront contrôlés du lundi au vendredi lors des tests afin de pouvoir détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance ou de stress comme un pelage ébouriffé ou terne, un dos voûté, de l’apathie, des comportements répétitifs (léchage excessif, tourner en rond), une maigreur visible (pesée lundi semaine 7 et semaine 8), ou encore une agressivité envers les congénères. Si un de ces signes se présente de manière sévère ou persistante, un analgésique pourra être administré sous recommandation vétérinaire, ou l’animal sera euthanasié et retiré de l’étude afin de lui éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes biologiques de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) et d’évaluer l’efficacité d’une approche thérapeutique, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable. La CMT est une maladie qui affecte à la fois les nerfs périphériques et les muscles, entraînant des troubles moteurs et sensoriels progressifs. Ces interactions complexes entre nerfs et muscles ne peuvent pas être reproduites de manière fiable dans des modèles cellulaires. Le modèle souris utilisé reproduit les principales caractéristiques de la maladie observées chez les patients, notamment la faiblesse musculaire, les troubles de la coordination et les altérations de la structure et du fonctionnement des nerfs. De plus, l’organisation des systèmes nerveux et musculaire chez la souris est suffisamment proche de celle de l’être humain pour permettre une étude pertinente des mécanismes de la maladie et de la réponse à une intervention thérapeutique. L’utilisation de ce modèle permet ainsi d’évaluer, à l’échelle de l’organisme entier, l’impact d’une modulation génétique sur les fonctions motrices et nerveuses, ce qui est essentiel pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.