Rongeurs

Génétiquement prédisposées à développer un lupus, 726 souris de la lignée MRL/lpr vont être utilisées dans des procédures classées au niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. À partir de dix à onze semaines, elles développent d'elles-mêmes une maladie auto-immune généralisée, avec atteintes des reins, de la peau, des articulations et des vaisseaux, dont la gravité culmine vers dix-sept semaines. Le porteur écrit qu'aucun prélèvement ni acte chirurgical n'est prévu sur ces animaux. La souffrance sévère tient donc au fait de les laisser développer la maladie jusqu'à son plein établissement avant de les tuer pour prélèvement.

Objectifs

Ce projet de recherche fondamentale vise à mieux comprendre les mécanismes de l’inflammation du système nerveux (neuroinflammation) et de la dégradation de la myéline (démyélinisation) dans le contexte du neurolupus, une forme neurologique du lupus. Le projet utilise la souris MRL/lpr, un modèle reconnu du lupus humain. Ces animaux développent spontanément des symptômes similaires à ceux observés chez les patients : atteintes rénales, production d’auto-anticorps, gonflement des ganglions lymphatiques, activation excessive du système immunitaire et troubles du comportement. Ces caractéristiques rendent ce modèle particulièrement adapté à l’étude des formes neurologiques du lupus. L’autorisation demandée concerne le maintien d’un élevage de souris MRL/lpr afin de disposer de tissus cérébraux pour la préparation de cultures cellulaires. Ces cultures permettront d’étudier, dans un environnement contrôlé, les mécanismes impliqués dans le neurolupus et d’autres maladies neuroinflammatoires. Ce travail contribuera à la réduction du recours à l’expérimentation animale in vivo, grâce à la création de cultures primaires et de banques de cellules réutilisables. Le projet respecte ainsi les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement) et vise à limiter au maximum l’impact sur les animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Ce projet présente des bénéfices scientifiques et médicaux. Il vise à identifier des marqueurs moléculaires et cellulaires spécifiques du neurolupus, afin d’améliorer le diagnostic précoce et de favoriser le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Il permettra également de mieux comprendre les interactions entre cellules microgliales et oligodendrocytaires, deux types de cellules cérébrales impliquées dans la réponse immunitaire et la formation de la myéline. Ces connaissances pourraient contribuer à limiter la neuroinflammation et à favoriser la réparation des tissus nerveux. À plus long terme, ce travail pourrait conduire à la mise au point de traitements ciblés pour le neurolupus, une complication neurologique sévère du lupus érythémateux disséminé, et bénéficier également à la recherche sur d’autres maladies neuroinflammatoires comme la sclérose en plaques. Retombées potentielles pour la santé humaine ou animale : Les retombées concernent principalement la santé humaine. Les résultats pourraient améliorer la compréhension des atteintes neurologiques du lupus et d’autres maladies auto-immunes, et contribuer au développement de thérapies plus efficaces et mieux tolérées. De façon indirecte, ces avancées profiteront aussi à la santé animale en améliorant la connaissance des mécanismes inflammatoires communs à plusieurs espèces.

Procédures

Aucun prélèvement ni procédure chirurgicale sur ces animaux n'est prévu.

Impact sur les animaux

À partir de 10 à 11 semaines d’âge, les souris MRL/lpr développent spontanément un phénotype de type lupus reproduisant plusieurs caractéristiques du lupus érythémateux disséminé humain, avec notamment une réponse auto-immune entraînant une inflammation généralisée et à des lésions touchant divers organes,tels que les vaisseaux, la peau, les articulations et les reins. La sévérité de l’atteinte évolue avec l’âge : elle est modérée entre 10 et 14 semaines, puis s’aggrave à partir de 15 semaines, pour atteindre un pic à 17 semaines et le plein établissement du phénotype lupique. Les animaux sont identifiés précocement par tatouage, sans recours au génotypage, les croisements étant réalisées exclusivement entre individus de la même lignée (MRL/lpr × MRL/lpr). et suffisamment sévère, avec une inflammation systémique marquée et des atteintes d’organes bien développées, notamment rénale, cutanée et articulaire. Cela permet d’évaluer les mécanismes physiopathologiques et/ou l’efficacité des interventions dans un contexte de maladie avérée, plus proche des formes cliniquement significatives du lupus humain, tout en conservant une fenêtre d’intervention compatible avec le bien-être animal et les points-limites définis.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement

Remplacement

Pour étudier le fonctionnement des cellules cérébrales, il est nécessaire de prélever du tissu cérébral chez la souris. Avant de choisir ce modèle, différentes alternatives ont été examinées. À ce jour, aucune méthode informatique (in silico), aucun organoïde cérébral ni aucune lignée cellulaire existante ne permet de reproduire fidèlement les interactions complexes entre les microglies et les oligodendrocytes dans le contexte d’une maladie auto-immune spontanée comme le lupus. L’utilisation de tissus provenant de souris MRL/lpr reste donc la méthode la plus adaptée pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera strictement limité aux besoins expérimentaux définis par le protocole. Les prélèvements de tissus seront mutualisés afin de réaliser plusieurs analyses à partir d’un même animal. Les protocoles d’isolement cellulaire seront optimisés pour maximiser la viabilité et le rendement des cellules, ce qui permettra de limiter les répétitions et d’exploiter pleinement chaque prélèvement. De plus, la mise en place d’une banque de cellules cryoconservées assurera la disponibilité d’un matériel biologique durable, permettant des analyses complémentaires sans recourir à de nouveaux animaux. Sur la base des besoins expérimentaux, il est estimé qu’un effectif de 12 animaux par mois sera suffisant pour couvrir l’ensemble des analyses, conformément au principe de Réduction des 3R.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des souris sont adaptées à leurs comportements naturels. Les animaux sont maintenus en groupes sociaux et les cages sont enrichies avec des matériaux favorisant le comportement naturel : éléments de nidification (ouate de cellulose, frisure de papier kraft), tunnels et bâtonnets à ronger. Ces enrichissements stimulent l’activité motrice, les interactions sociales et la thermorégulation grâce à la construction de nids. Les cages sont placées sur des portoirs ventilés et les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation d’au moins 15 jours. Cette période permet de réduire le stress lié au transport, de favoriser l’adaptation au nouvel environnement et de détecter précocement toute anomalie comportementale ou posturale. Après acclimatation, les accouplements sont réalisés dans les conditions habituelles d’élevage. La durée totale des études ne dépasse pas 17 semaines.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de choix pour l’étude des pathologies neurologiques et immuno-inflammatoires en raison de la forte homologie génétique avec l’humain (≈ 99 %), d’une neuroanatomie bien caractérisée et d’une physiopathologie largement documentée. Elle offre une excellente reproductibilité expérimentale, une facilité de manipulation et permet d’obtenir des résultats transposables aux neuropathologies humaines dans des délais compatibles avec les contraintes expérimentales. Parmi les lignées disponibles, le modèle MRL/lpr est particulièrement reconnu et validé pour reproduire fidèlement les caractéristiques cliniques et immunologiques du lupus érythémateux disséminé, y compris ses formes neuropsychiatriques (neurolupus). Ce modèle présente une activation spontanée des réponses auto-immunes et une atteinte neurologique progressive, ce qui en fait un outil particulièrement pertinent pour l’étude des mécanismes de neuroinflammation et de démyélinisation dans un contexte auto-immun spontané. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte à 17 semaines, période correspondant au pic de développement de la pathologie lupique dans le modèle MRL/lpr. Cet âge a été déterminé sur la base de la littérature scientifique et correspond à la phase où les manifestations cliniques et immunologiques du lupus sont pleinement établies. Ce choix garantit la pertinence biologique du modèle et la reproductibilité des résultats expérimentaux.

Toutes tuées à l'issue pour récupérer leurs tumeurs, 12 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Six reçoivent une injection de cellules de cancer du pancréas dans l'abdomen, six autres une greffe par chirurgie de vingt minutes, puis toutes passent par des imageries sous anesthésie et développent une tumeur pouvant provoquer malnutrition, perte de poids et détresse sévère. Cette étude pilote vise à améliorer le taux de prise de greffe pour, selon le porteur, "réduire" le nombre d'animaux des protocoles suivants. Douze souris sont donc rendues gravement malades au nom d'expériences encore à venir.

Objectifs

Cette étude pilote vise à déterminer si en modifiant notre méthodologie de transplantation des cellules cancéreuses, nous parvenons à améliorer le taux de prise de greffe (et donc à réduire le nombre d’animaux à impliquer dans les prochaines procédures), à contraindre le développement tumoral aux limites de l’organe ciblé (le pancréas), sans que ces actes chirurgicaux supplémentaires ne détériorent le bien-être animal ou ne perturbent le compartiment immunitaire antitumoral des souris.

Bénéfices attendus

A court terme, notre étude pilote devrait permettre de raffiner notre méthodologie d’implantation des cellules pancréatiques dans nos modèles précliniques. De ce fait, cela réduira le nombre d’indivdus nécessaires aux protocoles tout en diminuant les nuisances subies (tumeur limitée au pancréas). A plus long terme, cette étude s’inscrit dans un projet de recherches translationnelles visant à améliorer les stratégies thérapeutiques disponibles pour les patients atteints de cancer du pancréas.

Procédures

Les 12 souris de cette étude seront transplantées avec des cellules tumorales pancréatiques. 6 d’entre elles via une injection péritonéale qui engendrera une brève douleur légère, les 6 autres via une intervention chirurgicale de 20min sous anesthésie. Le développement tumoral sera évalué une fois par semaine (4x au total) par imagerie non invasive mais nécessitant l’anesthésie des animaux (10minutes/souris). Enfin, les 12 animaux subiront également 2 prélèvements sanguins (durée = moins d’une minute) à l’aide de matériel dédié aux rongeurs, un avant transplantation et un second à l’arrêt de l’étude. Ces 2 prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse de même que la mise à mort des animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une pathologie tumorale potentiellement grave pouvant engendrer une détresse sévère repérable par l’apparition de malnutrition, d’une perte de poids et d’une réduction de l’activité. Les manipulations et les anesthésies peuvent être source d’angoisses.

Devenir

Afin de caractériser l’efficacité et la spécificité pancréatique des méthodes de transplantations, nous devons récupérer en fin d’expérience les tumeurs de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Notre projet avant d’impliquer des souris, fait appel à différents modèles expérimentaux développés in vitro à partir de cultures de cellules. Cependant, l’analyse du rôle du métabolisme mitochondrial dans le dialogue entre les cellules tumorales et leur environnement immunitaire dans le contexte ou non d’une thérapie, ne peut être étudiée de manière satisfaisante que sur des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur le taux de prise de greffe et la nature de l’infiltrat immunitaire intra tumoral. Ainsi, il ressort que 6 animaux/groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et une pesée à minima bihebdomadaire, par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être et de points limites prédictifs et spécifiques au projet. Les greffes, les prélèvements et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie gazeuse et sur tapis chauffant, afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance des animaux. Une analgésie per-opératoires sera appliquée lors de la chirurgie. Enfin, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé non invasif à savoir des acquisitions de bioluminescence par imagerie optique sous anesthésie volatile.

Choix des espèces

Le recours aux animaux est indispensable pour ce projet préclinique s’inscrivant dans un programme global d’étude physiopathologique du dialogue systémique entre les cellules tumorales pancréatiques et leur environnement immunitaire qui ne peut se faire que dans un organisme vivant. Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’humain pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées cellulaires murines constitue aussi un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules cancéreuses dans des souris receveuses de même fond génétique et l’étude du système immunitaire antitumoral. Les souris receveuses seront implantées avec des cellules cancéreuses pancréatiques murines à l’âge de 6 à 10 semaines, ce qui est un âge classique pour ce type de modèle expérimental de tumeur induite par greffe de cellules cancéreuses.

Cinq heures d'implantation d'électrodes dans le cerveau, précédées d'une injection intracérébrale de trois heures, 120 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous mis à mort pour l'analyse de leur cerveau. Les animaux naviguent ensuite dans un grand labyrinthe pendant que des électrodes enregistrent leur activité cérébrale et que l'optogénétique module certains neurones. Le projet cherche à comprendre comment le cerveau encode et stocke la mémoire spatiale. Le porteur revendique plus de vingt ans d'expérience sur ce type d'implantation et présente le rat comme peu coûteux et facile à héberger.

Objectifs

Notre projet de recherche fondamentale vise à comprendre comment le cerveau encode et mémorise les informations. Pour cela, nous utilisons une approche expérimentale basée sur l’étude de rats, soumis à une procédure permettant d’explorer le fonctionnement de leur cerveau au cours de tâches mnésiques. Chez le rongeur, l’environnement est représenté dans des réseaux de neurones répartis dans différentes régions du cerveau, principalement le cortex et l’hippocampe. Les informations encodées circulent à travers ces circuits avant d’y être stockées de façon plus ou moins durable. Cependant, les mécanismes précis de cette circulation et de cette stabilisation de l’information restent encore mal connus. Par ailleurs, plusieurs études, y compris les nôtres, suggèrent que le thalamus jouerait un rôle essentiel dans le transfert d’informations entre l’hippocampe et le cortex, mais les processus impliqués demeurent à élucider. Pour communiquer entre eux, les neurones utilisent une activité électrique, sous forme de potentiels d’action et d’oscillations des potentiels de champ. En implantant des électrodes dans l’hippocampe, le thalamus et le cortex, nous enregistrons ces signaux. Des outils mathématiques, notamment issus du machine learning, nous permettent ensuite de les décoder lorsque les animaux effectuent des tâches de mémoire spatiale. Nous combinons cette approche avec des techniques d’optogénétique, qui permettent de moduler spécifiquement l’activité de certains groupes de neurones, afin de déterminer comment ces trois régions cérébrales coopèrent pour encoder et consolider les informations. Un tel projet est essentiel pour mieux comprendre l’activité cérébrale à la base de la mémoire. Il s’agit d’un enjeu majeur non seulement pour la recherche fondamentale, mais aussi pour la santé publique : les pathologies affectant la mémoire, dont l’impact social et humain est croissant, restent encore mal prises en charge en raison d’une compréhension insuffisante des mécanismes cérébraux sous-jacents.

Bénéfices attendus

En enregistrant et en manipulant les réseaux neuronaux impliqués dans l’apprentissage et la consolidation de la mémoire spatiale, ce projet apportera à court terme des avancées majeures en recherche fondamentale sur les mécanismes cérébraux qui sous-tendent la mémoire. À plus long terme, ces connaissances contribueront à mieux comprendre les pathologies affectant la mémoire, dont l’impact social et humain est croissant, et à ouvrir de nouvelles pistes pour améliorer leur prévention et leur prise en charge. Ce projet représente ainsi un enjeu essentiel, à la croisée de la recherche fondamentale et de la santé publique.

Procédures

Deux chirurgies (injection intracérébrale, 3h environ, et implantation d'électrodes intracérébrales, 5h environ) sont réalisées sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Les deux interventions invasives prévues seront réalisées sous anesthésie générale, et un traitement complet sera mis en place avant, pendant et après l’opération afin de prévenir toute douleur ou inconfort. Notre équipe dispose de plus de vingt ans d’expérience dans l’implantation de ce type d’électrodes. Nous opérons généralement un à deux rats dans une même série (à quelques jours d’intervalle), ce qui permet un suivi attentif et individualisé de leur état. La cicatrisation après ce type d’intervention est habituellement rapide, et les animaux sont en général prêts à participer aux tâches comportementales environ une semaine après la chirurgie. L’injection de l’outil optogénétique est très ciblée : elle permet d’introduire dans une région précise du cerveau, et dans un type de neurones défini, une protéine (appelée opsine) qui réagit uniquement à une stimulation lumineuse délivrée localement par une microfibre optique. Le vecteur viral utilisé n’est pas pathogène : il s’agit simplement d’une enveloppe inoffensive servant à transporter la séquence génétique nécessaire à l’expression de l’opsine. La tâche de mémoire proposée consiste à naviguer dans un grand labyrinthe pour retrouver le chemin menant à une récompense. Cette tâche a été conçue pour s’inspirer du comportement naturel du rat. Afin de réduire tout stress susceptible d’altérer les performances et le bien-être des animaux, ceux-ci sont longuement habitués à l’expérimentateur et à l’environnement du labyrinthe avant le début des expériences.

Devenir

en fin de procédure, tous les animaux sont euthanasiés afin de collecter les cerveaux pour des analyses anatomiques

Remplacement

L’objectif de ce projet est de comprendre comment le cerveau traite et stocke les informations liées à la mémoire. À ce jour, ces mécanismes restent encore largement méconnus et ne peuvent pas être étudiés sans observer le fonctionnement du cerveau dans un organisme vivant. Il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant de reproduire de manière fiable l’ensemble des processus cérébraux impliqués dans la mémoire, notamment les interactions dynamiques entre différentes régions du cerveau au cours du comportement. Les approches non animales, telles que les modèles informatiques, les cultures de cellules ou les organoïdes cérébraux, sont utiles pour répondre à certaines questions spécifiques, mais elles ne permettent pas d’étudier la mémoire telle qu’elle s’exprime dans un cerveau intact, en interaction avec le corps et l’environnement. L’expérimentation animale reste donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. Le rat est utilisé comme modèle expérimental car il s’agit de l’espèce la plus pertinente pour ce type d’étude. De nombreuses recherches ont montré que les structures cérébrales impliquées dans la mémoire, ainsi que leur organisation générale, sont largement conservées entre les rongeurs et l’être humain. Les connaissances acquises chez le rat constituent ainsi une base essentielle pour comprendre les mécanismes de la mémoire humaine et favoriser, à terme, une meilleure prise en charge des troubles de la mémoire.

Réduction

La mémoire étant un processus propre à chaque individu, chaque rat constitue une unité expérimentale à part entière. À l’heure actuelle, les mécanismes précis de la mémoire restent encore mal connus et de nombreux facteurs peuvent influencer les résultats. Il n’est donc pas possible de prévoir à l’avance l’ampleur des effets observés ni de calculer précisément le nombre d’animaux nécessaires par des méthodes statistiques classiques. Afin de limiter le recours aux animaux, nous procédons par étapes. Les expériences débutent avec de très petits groupes de rats (un à trois animaux par condition expérimentale, incluant les groupes contrôles et les groupes soumis à différentes manipulations). Cette approche progressive permet d’évaluer rapidement la variabilité des résultats et d’ajuster les protocoles si nécessaire, sans utiliser un nombre excessif d’animaux. Lorsque les résultats le justifient, les groupes sont complétés progressivement jusqu’à atteindre un effectif minimal permettant des analyses statistiques fiables (au moins huit animaux par groupe). Des méthodes statistiques adaptées sont alors utilisées pour comparer les groupes et identifier uniquement les différences réellement significatives. Cette stratégie permet d’arrêter les expériences dès que des conclusions robustes peuvent être tirées, évitant ainsi l’utilisation d’animaux supplémentaires non nécessaires.

Raffinement

Ce projet met en œuvre de nombreuses mesures visant à réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long de l’expérimentation. Des points limites clairement définis et suffisamment précoces sont intégrés à chaque étape de la procédure afin de garantir une prise en charge rapide et adaptée en cas de difficulté. Toutes les interventions invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée systématiquement à des traitements antalgiques avant, pendant et après la chirurgie. Ces mesures permettent de prévenir efficacement la douleur liée aux interventions. Après chaque opération, les animaux reçoivent une hydratation sous-cutanée et sont maintenus au chaud jusqu’à leur réveil complet, afin de favoriser une récupération rapide et confortable. Une alimentation adaptée, sous forme de nourriture ramollie et appétente, est mise à disposition durant les premiers jours suivant la chirurgie pour limiter la perte de poids et faciliter la convalescence. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement à l’aide d’examens cliniques simples incluant notamment le suivi du poids et de paramètres physiologiques. Cette surveillance permet de détecter précocement tout signe de douleur ou de mal-être. En fonction des observations, des traitements antalgiques complémentaires peuvent être administrés. Si nécessaire, les animaux peuvent être temporairement retirés du protocole expérimental afin de leur laisser le temps de récupérer. En cas d’atteinte d’un point limite majeur, une euthanasie est réalisée après sédation, conformément aux recommandations en vigueur. Le bien-être animal est également pris en compte dans les conditions d’hébergement et de manipulation. Les rats sont logés en groupe dans des cages spacieuses, avec un accès libre à l’eau et à la nourriture, et bénéficient d’un enrichissement de leur environnement (matériaux de nidification, tunnels et objets variés). Un temps important est consacré à l’habituation et à la manipulation douce des animaux par les expérimentateurs, afin de réduire le stress et de respecter au mieux le comportement naturel de l’espèce.

Choix des espèces

Ce projet utilise des rats comme modèle expérimental qui est l'espèce de référence dans le cadre de l’étude des mécanismes de la mémoire. Les régions cérébrales impliquées sont conservées entre les rongeurs et l’humain. De nature très curieuse et de par leur cacapités d'exploration innée pour l'espèce, le rat est l'espèce de choix pour intéroger la mémoire spatiale. De plus, le rat est une espèce peu couteuse et facile d’approvisionnement et d’hébergement.