Rongeurs

À deux mois, une partie des souris passe à un régime riche en graisse, d'autres appartiennent à une lignée qui devient obèse d'elle-même, et les souris concernées peuvent développer une obésité et un diabète qui gênent leurs déplacements. Elles passent quatre fois 24 heures en pléthysmographie, quatre échocardiographies sous anesthésie, des mesures de pression et des prises de sang, puis vers quatre mois et demi une chirurgie pour implanter dans les voies aériennes un dispositif contre l'apnée du sommeil. 160 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent en dernier une seconde chirurgie, sans réveil, avant d'être tuées pour l'analyse de leurs tissus.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une maladie fréquente touchant près d’un milliard de personnes dans le monde. Il se caractérise par une occlusion répétée au cours du sommeil des voies aériennes supérieures entraînant une chute du taux d’oxygène, une augmentation du dioxyde de carbone ainsi qu'une fragmentation du sommeil. Le SAOS est associé à une importante morbi-mortalité d’origine cardiovasculaire. En effet, il favorise la survenue de maladies comme l’hypertension artérielle, l’insuffisance cardiaque ou encore l’accident vasculaire cérébral. Le traitement de cette pathologie représente donc un véritable enjeu de santé publique. Si des traitements efficaces du SAOS existent (traitement de référence : pression positive continue), leur utilisation au long cours est limitée. Ainsi, en France, à 3 ans de l’initiation du traitement du SAOS, plus de la moitié des patients ont arrêté son utilisation en raison des effets secondaires trop fréquents. Les principales raisons d’abandon sont : des douleurs liées au port du masque ou à l’orthèse d’avancée mandibulaire, une sécheresse buccale, une obstruction nasale, ou encore des déplacements dentaires. Des approches médicamenteuses sont également en cours d’évaluation mais sont associés à des effets secondaires importants et à une efficacité moindre. Ces effets secondaires comprennent des sensations de nausées ainsi que des difficultés d’endormissement particulièrement délétères dans les maladies du sommeil. Une des limites des approches médicamenteuses est le fait qu’elles visent à traiter une maladie localisée (aux voies aériennes supérieures) par un traitement systémique. Au regard de ces éléments, il existe un besoin important d’alternatives thérapeutiques pour favoriser l’adhésion des patients aux traitements. Une approche localisée, dépourvue d’effets secondaires est donc nécessaire pour répondre aux besoins de santé des 1,5 millions de français diagnostiqués d’un SAOS et sans traitement. Ce projet vise à proposer une alternative à la pression positive continue au travers de l’insertion d’un dispositif médical dans les tissus des voies aériennes supérieures.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus reposent sur le traitement du SAOS (syndrome d’apnées obstructives du sommeil) et donc les patients atteints d’un tel syndrome dont le nombre est actuellement estimé à près d’un milliard dans le monde. Dans un premier temps, le produit développé et validé sera proposé en seconde ligne thérapeutique. En effet, la pression positive continue est une thérapeutique éprouvée et installée de longue date et restera l’indication première dans le traitement des apnées hypopnée obstructives du sommeil. Mais, en France, 50 pour cent des patients l’interrompent soit près d’un million cinq cents milles patients. Les raisons de cette interruption sont les contraintes liées au port d’un masque chaque nuit et l’entretien du matériel ainsi que les effets secondaires ressentis par les patients. Aussi, ce dispositif pourrait être proposé aux patients réfractaires en premier lieu. D’autre part, une première étude auprès d’une cohorte de patients atteints de SAOS a montré qu’y compris chez les patients ayant maintenu leurs traitements, la quasi-totalité serait volontaire pour avoir une alternative thérapeutique aussi efficace mais moins contraignante. En effet, notre solution permettrait de s’affranchir des contraintes inhérentes au traitement actuel, cette dernière ne nécessitant l’application d’aucun masque sur le visage, d’aucun matériel lourd difficile à transporter, et de source d’énergie pour fonctionner. Dans un second temps, le traitement pourra être proposé en première intention, initialement dans les formes modérées puis, dans les formes sévères du syndrome d’apnées obstructives du sommeil. Il existe ensuite des perspectives de traitement chez les patients ayant des formes légères de SAOS avec un traitement précoce de prévention du risque cardiovasculaire. Enfin, la technologie développée pourra trouver d’autres champs d’application médical dans les pathologies respiratoires ayant des mécanismes physiopathologiques similaires : trachéobronchomalacie ou dans d’autres pathologies d’organes caractérisées par des occlusions intermittentes de structures anatomiques.

Procédures

Certains animaux auront un phénotype dommageable pendant toute la durée du projet (obésité, diabète). Certains animaux auront ce phénotype suite à la mise en place d'un régime alimentaire riche en gras (à partir de 2 mois de vie et pendant toute la procédure). La composition corporelle sera évaluée au début de la procédure (animal vigile, 3 fois, 3 minutes). Des prélèvements sanguins seront réalisés (animal vigile, 4 fois, 1 minute). Plusieurs enregistrements seront effectués au cours du projet : 1)mesure de la pression artérielle (animal vigile, 4 fois, 10 minutes), 2)mesure respiratoire par pléthysmographie (mesure des paramètres respiratoires) (animal vigile, 4 fois, 24h), 3)mesure de la saturation en oxygène (animal vigile, 4 fois, 1h) et 4)echocardiographie (animal sous anesthésie générale, 4 fois, 20 minutes). Tous les animaux auront une chirurgie pour l'implantation du dispositif médical à évaluer (animal sous analgésie et anesthésie locale et générale, 1 fois, 30 minutes). Enfin les animaux auront un prélèvement sanguin sans réveil (animal sous analgésie et anesthésie générale, 1 fois, 2 minutes) et une chirurgie sans réveil avant l'euthanasie (animal analgésié et anesthésié, 1 fois, 30 minutes).

Impact sur les animaux

Certains animaux inclus dans ce projet auront un phénotype dommageable et pourront développer un diabète et une obésité pouvant altérer leur déplacement. La mise en place d'un aliment mou pourra provoquer une pousse excessive des incisives. Les mesures de la composition corporelle ainsi que les différents enregistrements réalisés (mesure de la pression artérielle, mesure du volume pulmonaire, mesure de la saturation en oxygène) pourront engendrer un stress chez les animaux. Les prélèvements sanguins pourront provoquer un hématome et un rare risque d'infection. Les échographies cardiaques seront réalisées sous anesthésie générale ce qui peut provoquer une hypothermie et une détresse cardiorespiratoire dans de très rares cas. Une chirurgie implantatoire et une chirurgie sans réveil seront réalisées sur tous les animaux, en plus des nuisances liées à l'anesthésie, les animaux pourront également ressentir de la douleur modérée en péri-opératoire ainsi qu'un risque d'infection ou de cicatrisation au niveau de l'incision.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires en vigueur afin de réaliser les prélèvements tissulaires nécessaires aux analyses histologiques et biologiques. Ces analyses permettront d’évaluer l’intégration du dispositif implanté, la tolérance tissulaire et les mécanismes associés aux effets observés lors du suivi respiratoire.

Remplacement

Le développement du dispositif médical est réalisé en plusieurs étapes. Une version adaptée aux essais sur souris est conçue en parallèle d'une version destinée aux essais sur banc. Les essais sur banc permettent de vérifier le bon fonctionnement du dispositif, notamment sa réponse à une activation magnétique, et d'ajuster sa conception avant son utilisation chez l'animal. Cette phase d'optimisation permet de limiter les essais in vivo en validant au préalable les principales caractéristiques techniques du dispositif. Ensuite, un organisme vivant est nécessaire pour évaluer la faisabilité, la tolérance, la stabilité et l'efficacité du dispositif implantable. Il n'est pas possible de reproduire in vitro la complexité des interactions entre le dispositif, les tissus cervicaux, les mouvements respiratoires et les voies aériennes supérieures. L'évaluation de l'implantation, de son intégration tissulaire, de son activation et de son effet sur la perméabilité des voies aériennes nécessite l'utilisation d'un modèle murin in vivo. Ces paramètres ne peuvent être étudiés de manière pertinente que chez un organisme vivant, dans lequel les interactions anatomiques et physiologiques sont préservées.

Réduction

Le nombre d'animaux a été déterminé afin d'obtenir des résultats statistiquement exploitables tout en limitant leur utilisation. Une étude pilote sera d'abord réalisée sur un nombre restreint de souris (groupes de 5 souris) ne présentant pas de phénotype dommageable afin d'optimiser et de maîtriser la technique chirurgicale d'implantation. Une seconde étude pilote sera réalisée sur des animaux avec un phénotype induit similaire. La taille des groupes expérimentaux a été calculée à l'aide d'un logiciel avec des critères prédéfinis afin de déterminer la taille finale de l'échantillon nécessaire pour détecter des différences statistiquement significatives. L'effectif minimal est donc de 8 animaux par groupe. Cet effectif a été porté à 10 animaux par groupe afin de tenir compte des pertes potentielles liées à la zootechnie, aux complications chirurgicales ou à d'autres aléas expérimentaux, tout en garantissant une puissance statistique suffisante. Au total, 160 souris seront utilisées pour l'ensemble du projet.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Tout d'abord, le diabète des animaux sera contrôlé hedomadairement afin de le déceler précocement, le change des cages pourra également être augmenté en cas d'augmentation de la miction. Un bâton à ronger sera disponible dans les cages des animaux sous régime alimentaire mou. Pour limiter le stress des animaux, ils seront habitués aux différents tests réalisés et quand cela est nécessaire, ils seront sous anesthésie. Pour les chirurgies, les animaux seront sous analgésie et anesthésie afin de prévenir stress et douleur. Les animaux sous anesthésie seront maintenus sur tapis chauffant pour limiter l'hypothermie et un gel ophtalmique sera déposé sur les yeux pour limiter l'assèchement occulaire. Pour une meilleure récupération post-opératoire, les animaux seront placés sur litière douce et un gel appétant sera disposé dans leur cage. Ainsi, la douleur et le stress sont limités en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

Des souris sans mutation seront utilisées pour réaliser les études préliminaires permettant la mise au point et la validation de la chirurgie d'implantation. Ces souris ont une bonne sensibilité aux effets des régimes riche en gras (prise de poids et modifications métaboliques reproductibles). Le modèle obèse de souris utilisé ensuite est un modèle pertinent pour l'étude du syndrome d'apnées obstructives du sommeil (SAOS) associé à l'obésité. Contrairement aux modèles reposant sur une obstruction artificielle des voies aériennes, elle développe spontanément une obésité polygénique, un syndrome métabolique et des altérations anatomiques des voies aériennes supérieures proches de celles observées chez l'Homme. Elle présente également des caractéristiques cliniques du SAOS, telles qu'une augmentation des épisodes d'apnée-hypopnée, une fragmentation du sommeil et des désaturations en oxygène. Ces similitudes physiopathologiques et anatomiques font de cette souris un modèle translationnel particulièrement adapté pour évaluer l'efficacité de nouvelles approches thérapeutiques visant à maintenir la perméabilité des voies aériennes supérieures. Des animaux adultes seront utilisés car le SAOS augmente avec l’âge, nous avons caractérisé notre modèle préclinique avec des animaux mâles de 5-6 mois donc les animaux entreront en procédure à 2 mois de vie et la chirurgie aura lieu à 4 mois et demi de vie.

2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récupérer leurs organes et "de grands volumes de sang", dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit par chirurgie un fragment d'endomètre greffé dans l'abdomen, qui peut provoquer pertes de poids, douleurs abdominales et léthargie, puis subit des lavages vaginaux, des prélèvements sanguins et des traitements candidats contre l'endométriose. Jusqu'à 30 % de souris en surnombre sont incluses au départ pour former des groupes homogènes, sans que le résumé dise ce qu'il advient de celles qui ne sont pas retenues. Le porteur justifie le choix de souris adultes : elles "pourront ainsi mieux supporter la chirurgie d'induction et les effets secondaires liés à la procédure et aux composés à tester".

Objectifs

L’endométriose est une maladie touchant environ 10% des femmes en âge de procréer. En France, il est estimé que 2.5 millions de femmes sont touchées. Il s’agit d’une maladie inflammatoire chronique de l’appareil génital féminin se caractérisant par une dissémination et un développement de muqueuse utérine (endomètre) en dehors de l’utérus. Les lésions peuvent se situer au niveau de la paroi musculaire de l’utérus (myomètre), des ovaires, ou dans la paroi abdominale sur le péritoine. Ces lésions sont associées à de la fibrose. Cette maladie entraîne des douleurs cataméniales importantes (dysménorrhée), des douleurs pelviennes, abdominales, ombilicales, lombaires chroniques, et une infertilité. Il n’existe pas à ce jour de traitement de l’endométriose, d’où l’importance de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet a pour but développer des modèles d’endométriose par la greffe de tissus endométriales en intrapéritonéal chez des souris receveuses. L’objectif est d’obtenir des lésions d’origine endométriale mimant le plus possible la pathologie humaine. Après un entrainement à la technique de greffe sur animaux morts, une première étude sera réalisée afin de vérifier l’induction d’endométriose. Des candidats de traitement de l’endométriose seront également administrés aux animaux afin de tester leur efficacité. Après cette première étude, une analyse rétrospective sera réalisée afin d’évaluer les modèles et apporter le raffinement nécessaire avant de lancer les études suivantes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en thérapeutique sur l’endométriose. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie, pour lesquelles les options sont pour le moment limitées.

Procédures

La chirurgie d’induction de l’endométriose par la greffe de fragment dans le péritoine sera réalisée 1 fois au cours de l’étude (inférieur à 1 heure). Avant les traitements, les animaux sont sélectionnés pour former des groupes homogènes (stress légers durant quelques heures). Des lavages vaginaux seront réalisés afin de suivre le cycle oestral de la souris ce qui engendrera un léger inconfort. Au cours de l’étude, le développement de l’endométriose pourra engendrer chez les animaux des signes cliniques comme des pertes de poids transitoires et/ou des douleurs abdominales et une forme de léthargie. Le suivi rapproché des animaux permettra de limiter ces signes cliniques à un niveau modéré. Dans le cas d’administrations de traitements par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille (inférieur à 5 min). L’administration de composés par voie orale induira un stress léger inférieur à 5 min. Une session d’imagerie non invasives type IRM induira un stress léger (inférieur à 1 heure).

Impact sur les animaux

La chirurgie d’induction de l’endométriose par la greffe de fragment dans le péritoine pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. Au cours de l’étude, le développement de l’endométriose pourra engendrer chez les animaux des signes cliniques comme des pertes de poids transitoires et/ou des douleurs abdominales et une forme de léthargie. Le suivi rapproché des animaux permettra de limiter ces signes cliniques à un niveau modéré. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille. L’imagerie IRM ou bioluminescence induira un stress léger. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.

Devenir

Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur la maladie d’intérêt.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments dans ce type de pathologie, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et ne présentent pas dans le cas présent une alternative robuste et envisageable.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (poids, stade d’évolution de la maladie). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes (au minimum un groupe controle, non traité et un groupe avec induction de l’endométriose et un groupe induit et traité ; plusieurs groupes traités possibles pour évaluer différents traitements, doses etc). Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Jusqu’à 30% d’animaux excédentaires pourront être inclus initialement (avant sélection) afin de plus facilement constituer des groupes homogènes (possibilité de sélectionner les animaux par imagerie en fonction du développement de la maladie). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.

Raffinement

La chirurgie d’induction est réalisée après administration d’anesthésique local, sous anesthésie générale avec couverture analgésique durant 48h post chirurgie. La couverture analgésique pourra être prolongée de 24 à 48h si nécessaire. La chirurgie sera réalisée de façon aseptique, avec maintien de la température corporelle et surveillance jusqu’au réveil puis toutes les 2h sur 6h au total. Suite à la chirurgie les animaux seront suivis quotidiennement durant 4 jours (pesée et observation quotidienne). Si nécessaire des soins seront prodigués aux animaux par le vétérinaire. Les prélèvements seront effectués suivant les recommandations de la SBEA (anesthésie, volume, fréquence, antalgie). Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de souffrances et les points limites. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. De l’enrichissement sera utilisé. Des animaux adultes seront utilisés. Dans toutes les cages, un gel nutritif et de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée en pré et post chirurgie et en cas de perte de poids supérieur à 10% en cours d’étude. Les scores cliniques les plus élevés et les pertes de poids élevées ou prolongées constitueront des points limites.

Choix des espèces

Les modèles d’endométriose sont bien documentés chez la souris. Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules ou de tissus humaines dans le cadre de la recherche. De plus, l’évaluation de l’efficacité prè clinique des nouvelles molécules chimiques ou biologiques doivent être réalisées a minima sur une espèce rongeur (par exemple la souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur (par exemple la souris) est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte, ils pourront ainsi mieux supporter la chirurgie d’induction et les effets secondaires liés à la procédure et aux composés à tester.

Ce projet mesure comment un candidat médicament passe dans l'organisme puis en est éliminé, dernière étape avant les premiers essais chez l'être humain. Au total, 890 rongeurs, 630 souris et 260 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certains sont génétiquement modifiés pour ne pas produire une protéine de transport, d'autres reçoivent de l'Elacridar pour la bloquer quand les lignées modifiées sont indisponibles ou "trop coûteux", puis le produit leur est donné jusqu'à une fois par jour pendant un mois, avec jusqu'à sept microprélèvements de sang. Le porteur mentionne des "effets indésirables du produit" parmi les nuisances, sans dire lesquels.

Objectifs

Le projet a pour objectif de mieux comprendre comment un futur médicament est absorbé par l'organisme, distribué dans les différents organes, transformé, puis éliminé. Ces étapes sont essentielles pour s'assurer qu'un médicament est efficace et qu'il peut être utilisé en toute sécurité. Une attention particulière sera portée à certaines protéines présentes dans l'organisme qui agissent comme des « portes d'entrée » ou des « pompes » pour les médicaments. Elles contrôlent leur passage dans des organes tels que l'intestin, le foie, les reins ou le cerveau et peuvent influencer leur efficacité ou leurs effets indésirables. L'objectif est de déterminer le rôle de ces protéines dans le devenir des médicaments, d'identifier d'éventuelles interactions avec d'autres traitements et de mieux anticiper les situations où l'utilisation d'un médicament pourrait nécessiter des précautions particulières, par exemple chez des personnes souffrant de maladies du foie ou des reins. Pour cela, nous comparerons le comportement du médicament chez des animaux présentant naturellement ces protéines et chez des animaux spécialement développés pour ne pas produire l'une d'elles. Dans certains cas, lorsque ces modèles ne sont pas disponibles, une substance permettant de bloquer temporairement l'action de cette protéine sera utilisée. Après l'administration du médicament, une ou plusieurs fois selon les besoins de l'étude (jusqu'à une administration par jour pendant un mois maximum), des prélèvements de sang et d'autres tissus seront réalisés à différents moments afin de mesurer la quantité de médicament présente dans l'organisme. Ce projet s'inscrit dans les dernières étapes de la recherche avant les essais chez l'être humain. Les résultats permettront de compléter les études déjà réalisées en laboratoire et d'améliorer les connaissances sur l'utilisation future de ces médicaments chez les patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre comment les futurs médicaments se comportent dans l’organisme et quels facteurs peuvent influencer leur efficacité ou leur sécurité. Cette étude permettra notamment d’identifier le rôle de certaines protéines naturelles de l’organisme qui peuvent modifier le passage et l’élimination des médicaments. Ces informations aideront à prévoir d’éventuelles interactions avec d’autres traitements et à mieux adapter l’utilisation des médicaments chez certains patients, notamment ceux présentant des problèmes de fonctionnement du foie ou des reins. Les résultats obtenus apporteront des données scientifiques importantes pour préparer les futures étapes du développement des médicaments, avant leur évaluation chez l’être humain. Ces études chez l’animal permettent d’obtenir une vision globale du fonctionnement d’un organisme vivant, avec l’ensemble des interactions entre les différents organes, ce qui ne peut pas être reproduit totalement par des modèles réalisés uniquement en laboratoire sur des cellules. Enfin, les données recueillies permettront de comparer plusieurs molécules en développement afin d’identifier celles qui présentent le meilleur potentiel pour poursuivre leur développement en tant que futurs traitements.

Procédures

Le médicament étudié pourra être administré soit par voie orale, soit par injection. L’administration sera réalisée sur une courte durée (environ 1 à 3 minutes). Dans le cas d’administrations répétées par voie orale, le traitement pourra être donné une fois par jour pendant une durée maximale d’un mois. Les administrations par voie intraveineuse seront effectuées sous anesthésie générale profonde, pour une durée limitée (maximum 5 minutes), afin de réduire l’inconfort de l’animal. Les animaux pourront faire l’objet de prélèvements sanguins de courte durée (environ 2 minutes). Lorsque plusieurs prélèvements seront nécessaires, ceux-ci seront espacés et réalisés dans une limite maximale de 7 microprélèvements par animal. À la fin de l’étude, les prélèvements nécessaires à l’analyse pourront être réalisés sous anesthésie générale profonde.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues lors de ce protocole sont celles liées à la contention, l'administration du produit à tester, aux prélèvements sanguins, à la mise en boite pour l'anesthésie gazeuse et dans la boite chauffante (avant les injections intravéneuses) pouvant induire un stress chez l'animal et aux effets indésirables du produit.

Devenir

Différent tissus étant récupérés pour analyse, chaque animal sera donc mis à mort.

Remplacement

Dans le cadre de la mise au point de nouveaux médicaments, ce projet nécessite l’utilisation de rongeurs (rats ou souris), car il n’existe actuellement pas de méthode alternative suffisamment fiable permettant de reproduire le fonctionnement complet d’un organisme vivant. Les études réalisées uniquement en laboratoire sur des cellules ne permettent pas de comprendre pleinement comment un médicament se comporte dans un organisme entier, avec les interactions entre les différents organes et et les mécanismes biologiques complexes qui peuvent influencer son efficacité, son absorption et son élimination. Avant une éventuelle utilisation chez l’être humain, les études chez l’animal constituent une étape importante pour évaluer le comportement du médicament dans l’organisme, notamment sa distribution dans les différents organes et son élimination. Les modèles de rats ou de souris utilisés dans ce projet sont actuellement les modèles les plus adaptés et bien décrits scientifiquement pour étudier le rôle de certaines protéines de transport impliquées dans le devenir des médicaments. Lorsque certains modèles génétiquement modifiés ne sont pas disponibles ou trop coûteux, une substance capable de bloquer temporairement l’action de ces protéines pourra être utilisée. Cette même substance sera également utilisé plus tard pour des tests chez l'homme afin d'évaluer l'implication de ce transporteur. Les molécules étudiées auront déjà fait l’objet de nombreuses évaluations en laboratoire avant cette étape afin de sélectionner les candidats les plus prometteurs et présentant le meilleur profil de sécurité. Ainsi, ce projet ne sera pas utilisé pour tester un grand nombre de nouvelles molécules au hasard, mais interviendra uniquement à une étape avancée du développement, après l’identification d’un ou des candidats médicaments présentant un potentiel thérapeutique intéressant pour l'homme. Les résultats obtenus permettront d’accompagner son développement avant les premières évaluations chez l'homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe sera limité au strict nécessaire afin d’obtenir des résultats fiables tout en évitant l’utilisation d’animaux supplémentaires. Le nombre d’animaux choisi permet de tenir compte des différences naturelles entre les individus et de réaliser des analyses scientifiques permettant de vérifier que les résultats obtenus sont fiables et interprétables. D’après l’expérience acquise au laboratoire sur plus de 20 ans, l’utilisation de 3 à 5 animaux par groupe permet généralement d’obtenir des résultats suffisamment précis et reproductibles. Plusieurs prélèvements à différents moments seront réalisés afin de suivre l’évolution du médicament dans l’organisme au cours du temps. Ces mesures permettent de mieux comprendre son absorption, sa diffusion dans le corps et son élimination. Les résultats obtenus feront l’objet d’analyses statistiques adaptées afin de comparer les différents groupes d’animaux et de déterminer si les différences observées sont liées au traitement étudié ou simplement aux variations naturelles entre les individus.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie et sont acclimatés au minimum 5 jours avant l'expérimentation pour s'habituer à leur nouvel environnement et diminuer le stress. Chaque cage dispose d'un bloc de lanières de papier pour aider à la nidation et d'un enrichissement (tunnel pour se cacher). Tout mal être identifié aboutira à une surveillance accrue de l'animal et à des soins si besoin. Le personnel zootechnicien est sensibilisé pour remonter tout comportement suspect d'un animal soit durant le temps d'acclimatation, soit durant l'expérimentation. Les traitements se feront par du personnel formé et avec du matériel adéquat pour chaque espèce (canule pour gavage, taille cage, nombre d'animaux dans chaque cage,...). Des récompenses (ex : graînes de tournesol) pourront également être proposés lors des traitements répétés.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet seront uniquement des rongeurs adultes de petite taille (rats ou souris) présentant les caractéristiques recherchées pour l’étude. Ces modèles sont privilégiés car ils permettent d’obtenir des résultats fiables avec un nombre limité d’animaux et de réduire les quantités de médicament nécessaires. Ces animaux sont également des modèles bien étudiés et présentent des similitudes avec l’être humain, ce qui permet de mieux comprendre le comportement des futurs médicaments avant leur éventuelle utilisation chez les patients. Les résultats obtenus pourront être comparés à ceux issus d’autres études réalisées chez des animaux ne présentant pas cette modification génétique, afin de mieux identifier l’influence du transporteur étudié sur le devenir du médicament dans l’organisme. Lorsque l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’est pas possible, une substance appelée Elacridar pourra être utilisée pour bloquer temporairement l’action d’une protéine de transport spécifique. L’utilisation de cette approche est bien documentée dans la littérature scientifique chez le rat et la souris depuis plusieurs années.

Sur un tapis de course dont la vitesse augmente progressivement, des souris courent jusqu'à montrer des signes de fatigue, 166 d'entre elles ayant été nourries d'un régime riche en graisse. 286 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : tests de préhension, tests de tolérance au glucose avec mise à jeun et queue incisée, échocardiographie sans anesthésie. Le porteur parle d'une "activité volontaire", alors que la vitesse est imposée et que le test s'arrête aux signes de fatigue. Les souris, âgées de 6 à 21 mois, sont mises à mort pour prélever leurs organes, et le porteur dit avoir aussi retenu l'espèce parce que sa petite taille permet de "réduire les coûts".

Objectifs

Dans un contexte de vieillissement de la population mondiale, vieillir en bonne santé est un enjeu majeur de santé publique. Parmi les pathologies gériatriques, la sarcopénie, caractérisée par une diminution de la masse et de la fonction musculaires, est particulièrement associée aux risques de chutes et de fractures, à une perte d’autonomie et à une plus grande vulnérabilité. En parallèle du vieillissement de la population, la prévalence de l’obésité accélère le vieillissement et exacerbe la sarcopénie (obésité sarcopénique) par des mécanismes biologiques encore mal connus. Ce projet vise donc à développer de nouvelles voies thérapeutiques permettant de prévenir, de freiner ou d’améliorer la sarcopénie et l‘obésité sarcopénique; il s’inscrit donc dans une stratégie globale d’amélioration de l‘autonomie et de la qualité de vie des personnes âgées. La sarcopénie est une pathologie multifactorielle, impliquant de nombreux mécanismes biologiques. Des études préliminaires sur des modèles in vitro et chez le ver C. elegans ont montré que l’inhibition de l’expression de certains gènes améliore la structure et la fonction musculaire. Dans le cadre d’une approche de recherche scientifique translationnelle, il est désormais question de tester et de valider ces résultats dans un modèle murin plus proche de l’humain.

Bénéfices attendus

Prévenir et/ou réduire la sarcopénie et l’obésité sarcopénique augmenterait le bien-être et l’autonomie des personnes âgées. Des études déjà réalisées in vitro et sur le ver C. elegans ont permis d’identifier des pistes thérapeutiques prometteuses. Dans une démarche de recherche translationnelle, il est désormais question de tester ces pistes chez la souris car elles pourraient ouvrir la voie vers de nouvelles thérapies envisageables chez l’homme.

Procédures

Intervention nutritionnelle : le régime enrichi en graisse entraîne une prise de poids et peut conduire à des troubles métaboliques. Une surveillance régulière permettra d’intervenir si nécessaire. 166 animaux concernés. Injections (1/souris) : aucun effet indésirable majeur n’est attendu à la suite des injections qui seront réalisées sous anesthésie de courte durée. L’intervention a déjà été testée in vitro et chez le ver C elegans et des effets bénéfiques pour la santé musculaire ont été observés. Les mêmes bénéfices sont attendus chez la souris. 286 animaux concernés. Mesures physiologiques Grip tests (2/souris) : Test de préhension non-invasif qui permet d’évaluer la force musculaire. Pas d’effet indésirable attendu hormis un stress léger de contention de courte durée. 240 animaux concernés. Exercice sur tapis de course (1/souris) : Après acclimatation, on procède à une augmentation progressive de la vitesse et on mesure le temps de course maximal. Le test est arrêté lorsque l‘animal montre des signes de fatigue. Il s’agit donc d’une activité volontaire donc pas d‘effet délétère envisagé. 240 animaux concernés. Mesures métaboliques Test de tolérance au glucose (2/souris) : sur les souris mises à jeun, on réalise une injection de glucose et on suit la glycémie à T=0, 15min, 30 min, 60 min, 90 min et 120 min après prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue incisée. Aucun effet indésirable n’est attendu hormis un stress de courte durée lors des prélèvements. 240 animaux concernés. Echocardiographie : réalisée par un opérateur expérimenté ; nécéssite une contention minimale, donc un stress minimal, 1 à 2 min maximum, sans anesthésie car cela impacte directement le rythme cardiaque. 240 animaux concernés.

Impact sur les animaux

Les animaux sont alimentés avec un régime riche en graisse pour imiter l'obésité humaine. Aucun effet douloureux n’est prévu. Nous vérifions quotidiennement leur santé et leur bien-être (poids, comportement). Lors des suivis métaboliques et physiologiques, le moindre signe de malaise (ex. polyurie associée à un diabète sévère) entraîne un arrêt immédiat de l'analyse et exclut l'animal du protocole. Aucun effet délétère n‘est attendu des tests physiologiques, métaboliques et échographiques. Les injections visant à améliorer la fonction musculaire ont déjà montré des effets bénéfiques in vitro et chez le ver C. elegans. Les mêmes bénéfices sont attendus chez la souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement post mortem de plusieurs organes nécessaires à l’analyse des effets du traitement thérapeutique.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche scientifique translationnelle, en continuité avec des études exploratrices déjà réalisées in vitro et chez le ver C. elegans. L’objectif est de pouvoir proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques applicables chez l’homme. Il est donc indispensable de passer à un modèle mammifère murin, physiologiquement plus proche de l’homme, afin d’étudier des processus biologiques qui reposent sur l’interaction entre de nombreux organes, tissus et types cellulaires. Même si les stratégies thérapeutiques ont déjà été étudiées in vitro et chez C. elegans, on ne peut préfigurer des effets physiologiques qu'en les testant dans un mammifère vivant.

Réduction

Dans un but de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés et de données préliminaires. 8 à 10 animaux par groupe, est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique afin de réaliser l’ensemble des analyses nécessaires, ainsi que de tests statistiques permettant de tirer des conclusions solides et fiables.

Raffinement

Des points limites ont été définis pour chacune des procédures. Tout signe témoignant d’une mauvaise tolérance du régime hypercalorique (par exemple perte de poids, souffrance, apathie) conduira à l’interruption de la procédure. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux leur permettant d’exprimer leurs comportements naturels avec leurs congénères et les cages seront enrichies (par exemple : maison en carton, papier kraft) pour leur permettre de nicher. Un examen clinique des animaux sera effectué quotidiennement. De plus, les procédures que nous utiliserons ont été optimisées et standardisées, ce qui permet de limiter la répétition des procédures.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour de multiples raisons. D’abord, la souris est un animal de petite taille, ce qui permet de réduire les coûts et son élevage est simple et rapide. Nous disposons également de nombreux outils moléculaires pour faciliter les études biologiques dans le muscle squelettique post-mortem. Par ailleurs, ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche scientifique translationnelle, en continuité avec des études déjà réalisées in vitro et chez C. elegans. Comme l’humain, la souris est aussi un mammifère. Donc si l’intervention thérapeutique testée a un effet bénéfique in vitro, chez C. elegans (déjà étudié) puis chez la souris, il est probable que les bénéfices seront maintenus chez l’humain. Nous étudierons à la fois un stade juvénile (6-7 mois), un stade adulte (11-13 mois) et un stade âgé (18-21 mois) pour pouvoir mesurer l’efficacité du silençage (knock down) respectivement dans la prévention et l’amélioration de la sarcopénie (pathologie gériatrique).

104 souris vont être utilisées, chacune portant une tumeur greffée sous la peau du flanc ou une arthrite induite par injection de collagène, puis recevant un traceur radioactif et passant cinq séances d'imagerie sous anesthésie avec cinq prises de sang. Toutes sont tuées et disséquées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'arthrite provoque des douleurs articulaires qui peuvent limiter les déplacements, et les anti-inflammatoires ne sont donnés que si le porteur le juge "indispensable", car ils modifieraient l'inflammation étudiée. Le traceur doit servir à suivre des cellules thérapeutiques modifiées génétiquement, et le porteur dit vouloir d'abord démontrer "la faisabilité et la pertinence" de cette imagerie, des études chez des patients étant prévues à terme.

Objectifs

Les thérapies par cellules modifiées représentent une nouvelle approche très prometteuse pour traiter certaines maladies graves, notamment le cancer. Elles consistent à prélever des cellules immunitaires ou réparatrices chez un patient, puis à les modifier génétiquement afin qu’elles agissent plus efficacement contre la maladie. Les cellules modifiées, déjà utilisées avec succès contre certains cancers du sang, sont aujourd’hui étudiées pour traiter d’autres maladies, notamment les maladies auto-immunes. Dans ces maladies, le système immunitaire attaque par erreur les propres tissus de l’organisme. Les cellules modifiées pourraient permettre de mieux contrôler cette réponse anormale lorsque les traitements classiques sont inefficaces. Parallèlement, le laboratoire de recherche développe une autre approche basée sur des cellules réparatrices modifiées. Contrairement aux cellules modifiées précédentes qui détruisent leurs cibles, ces cellules réparatrices modifiées ont pour objectif de réguler et d’apaiser le système immunitaire afin de limiter l’activité des cellules responsables de la maladie, sans les éliminer directement. Malgré leur potentiel thérapeutique, il reste essentiel de mieux comprendre le comportement de ces cellules une fois administrées : où elles se déplacent dans l’organisme, combien de temps elles survivent, quand elles s’activent et si elles présentent des risques pour les patients. Pour répondre à ces questions, nous développons un traceur innovant permettant de suivre ces cellules dans l’organisme de manière non invasive et sur une longue durée en imagerie médicale. L’objectif de nos travaux est de créer un outil d’imagerie universel, applicable à différents types de cellules modifiées, permettant d’évaluer leur répartition dans l’organisme, leur activité, leur efficacité et leur sécurité. Des études chez l’animal puis, à terme, chez les patients sont prévues. Cette approche contribuera à accélérer le développement de nouvelles thérapies cellulaires pour les cancers et les maladies auto-immunes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer une nouvelle méthode d’imagerie permettant de suivre dans l’organisme des cellules génétiquement modifiées utilisées comme traitement. Pour cela, nous avons conçu un traceur capable de reconnaître spécifiquement les cellules modifiées. En l’associant à un marqueur radioactif utilisé en imagerie médicale, il deviendrait possible de visualiser et de suivre ces cellules directement dans le corps. Une telle innovation pourrait transformer le suivi des thérapies cellulaires en permettant d’observer où les cellules se déplacent, combien de temps elles restent présentes dans l’organisme et comment elles se comportent après leur administration. L’objectif principal du projet est de démontrer la faisabilité et la pertinence de cette approche d’imagerie. Les études réalisées chez l’animal permettront d’évaluer la capacité du traceur à détecter les cellules modifiées et d’améliorer la compréhension de leur fonctionnement dans l’organisme. À terme, ce traceur pourrait constituer un outil d’imagerie innovant et largement applicable à différents types de cellules modifiées. Il contribuerait ainsi à améliorer l’évaluation de l’efficacité et de la sécurité de ces thérapies, aussi bien dans la recherche que dans leur future utilisation chez les patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions expérimentales visant à évaluer la distribution et la cinétique du radiopharmaceutique étudié. Au préalable, pour le modèle tumoral, une greffe tumorale sera réalisée afin d’établir le modèle tumoral nécessaire à l’étude. Cette greffe consistera en l’injection sous-cutanée de cellules tumorales dans le flanc de l’animal, réalisée sous conditions d’asepsie. Concernant le modèle d’arthrite, une injection de collagène en sous-cutanée dans la base de la queue de l’animal sera réalisé sous conditions d’asepsie pour développer chez la souris une arthrite. Les procédures sont rapides (quelques minutes) et l’apparition des premiers signes cliniques de tumeur ou d’arthrite (gonflement des pattes) surviennent en 2 à 3 semaines après injection. Chaque animal recevra ensuite soit une administration unique du radiopharmaceutique, soit une injection de cellules modifiées radiomarquées ou non et suivi d’une ou plusieurs administrations du radiopharmaceutique, toutes par voie intraveineuse. Ces administrations seront réalisées sur animaux vigiles, maintenus par contention douce, et dure généralement moins d’une minute par animal. Après administration, les animaux seront soumis à 5 sessions d’imagerie afin de suivre la distribution du radiopharmaceutique. Pour ces acquisitions, les animaux seront anesthésiés afin d’assurer leur immobilité et de limiter le stress pendant l’examen. Chaque imagerie dure en moyenne entre 30 et 40 minutes, incluant l’anesthésie et la phase de réveil. Cinq prélèvements sanguins de 0,02 ml seront également réalisés pendant l’anesthésie avant le passage sous caméra, pour limiter la douleur et le stress, au niveau de la veine caudale afin d’évaluer la cinétique sanguine du radiopharmaceutique et les paramètres hématologiques. Les volumes prélevés respecteront les recommandations afin de ne pas compromettre l’état physiologique des animaux. Après chaque intervention (imagerie et prélèvement), les animaux seront replacés dans leurs cages et feront l’objet d’une surveillance régulière de leur état général et de leur comportement par le personnel animalier. À l’issue du dernier point temporel, les animaux seront euthanasiés en s’assurant d’une perte de conscience rapide et de minimiser toute souffrance. Une dissection sera ensuite réalisée afin de prélever les organes d’intérêt (foie, rate, reins, cœur, poumons, cerveau et autres tissus pertinents).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus au cours de ces études concernent principalement la présence de la tumeur ou de l’arthrite induite, l'injection de cellules modifiées, l'utilisation de faibles quantités de substances radioactives pour l'imagerie médicale et les différentes manipulations réalisées sur les animaux. La croissance de la tumeur peut entraîner une dégradation de l'état général, une perte de poids, une douleur ou une gêne au niveau de la tumeur. Dans certains cas, une partie de la tumeur peut se détériorer (nécrose). Le modèle d'arthrite utilisé dans cette étude provoque également des douleurs au niveau des articulations, ce qui peut limiter les déplacements et le confort des animaux. Les cellules modifiées injectées peuvent provoquer une réaction inflammatoire temporaire, pouvant se traduire par une baisse d'activité, un hérissement des poils ou une légère variation de la température corporelle. Cette réaction est toutefois généralement absente chez les souris utilisées dans cette étude. Les substances radioactives utilisées servent uniquement à réaliser des images médicales et sont administrées à très faible dose. Aucune toxicité particulière n'est donc attendue. En revanche, des injections répétées peuvent entraîner une faible exposition cumulative aux rayonnements, susceptible de provoquer une fatigue modérée et une légère diminution de certains globules blancs. Les différentes manipulations (injections, anesthésie pour les examens d'imagerie et prises de sang) peuvent également être une source de stress ou provoquer une légère inflammation au point d'injection. Les animaux seront suivis régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou de dégradation de leur état de santé. Si des signes importants apparaissent, comme une perte de poids importante, une grande faiblesse ou une douleur persistante, l'étude sera arrêtée pour l'animal concerné afin de préserver son bien-être.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés puis disséqués afin d’étudier la répartition du traceur dans leur organisme. Leur euthanasie est nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques de l’étude, qui consistent à déterminer dans quels organes et tissus le produit se retrouve et en quelle quantité (foie, rate, reins, cœur, poumons, cerveau, etc…). L’analyse directe des organes après euthanasie permet d’obtenir des mesures précises qui ne peuvent pas être obtenues de manière suffisamment fiable par les seules méthodes d’imagerie réalisées sur l’animal vivant. La dissection permettra également d’analyser plusieurs organes et paramètres à partir d’un même animal et ainsi d’obtenir le maximum d’informations à partir de chaque animal utilisé. Elle contribue ainsi à limiter le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, conformément au principe de réduction. Les animaux ne pourront donc pas être maintenus en vie ou réutilisés à l’issue de la procédure, la poursuite de leur utilisation n’étant pas compatible avec les prélèvements nécessaires à l’étude. L’euthanasie sera réalisée selon une méthode réglementaire appropriée, suivie des prélèvements prévus au protocole.

Remplacement

Des méthodes permettant d’éviter ou de limiter l’utilisation d’animaux ont été prises en compte dès la conception du projet. Les différentes étapes de développement et de validation du traceur ont d’abord été réalisées en laboratoire, sur des cellules. Ces études ont permis notamment de vérifier que le traceur reconnaît bien sa cible, qu’il reste stable et qu’il conserve son activité biologique. Des cellules murines et humaines, exprimant ou non les cibles étudiées, ont été utilisées pour comparer ces différentes propriétés. Le marquage des cellules modifiées sera également étudié en laboratoire afin de vérifier qu’il n’altère ni leur survie ni leur fonctionnement. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de reproduire l’ensemble des phénomènes qui se produisent dans un organisme vivant. Il est notamment nécessaire d’étudier la répartition du traceur dans l’organisme, son accumulation dans la tumeur et son évolution au cours du temps. Le comportement des cellules modifiées dans leur environnement tumoral ne peut pas non plus être reproduit de manière suffisamment fiable en laboratoire. L’utilisation d’animaux reste donc nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

Réduction

Les effectifs ont été définis sur la base de données préliminaires, de la littérature et d’analyses statistiques afin d’utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire à la démonstration des hypothèses. L’utilisation de techniques d’imagerie non invasive permet un suivi longitudinal des mêmes animaux, réduisant ainsi le nombre total de souris requises. Lorsque cela est possible, plusieurs paramètres biologiques (imagerie, prélèvements sanguins, distribution ex vivo) sont collectés sur un même animal. De plus, les modèles expérimentaux sont conçus pour mutualiser les groupes témoins entre les quatre études lorsque cela est scientifiquement pertinent, contribuant ainsi à une réduction globale du nombre d’animaux utilisés. Ces techniques d’imagerie permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans les protocoles expérimentaux puisqu’il n’y a pas d’euthanasie à chaque temps d’imagerie.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées et contrôlées afin de préserver leur santé. Elles seront maintenues dans des cages spécialement équipées permettant de limiter leur exposition aux microbes et aux infections. Des contrôles réguliers de l’environnement seront réalisés afin de garantir des conditions d’hébergement sûres et adaptées à leur fragilité. Un suivi attentif des animaux sera réalisé tout au long de l’étude. Leur état général, leur poids, leur comportement et l’apparition éventuelle de signes de douleur ou de malaise seront surveillés régulièrement. Des critères précis sont définis pour arrêter l’expérimentation avant son terme si un animal présente des signes de souffrance trop importants. Si nécessaire, des traitements contre la douleur ou l’inflammation pourront être administrés afin d’améliorer le confort des animaux, après évaluation par les personnes responsables du bien-être animal et le vétérinaire. Dans le modèle d’arthrite utilisé, les traitements anti-inflammatoires seront utilisés uniquement si cela est indispensable, car ils peuvent modifier l’inflammation étudiée. Leur objectif sera alors de limiter une inflammation excessive et d’améliorer le bien-être de l’animal, sans chercher à supprimer complètement la maladie étudiée. Les différentes manipulations (injections, prélèvements sanguins et examens d’imagerie) seront réalisées avec des méthodes adaptées à la taille et au poids des souris afin de limiter leur inconfort. Les examens d’imagerie seront effectués sous anesthésie, avec une surveillance continue de l’animal et un maintien de sa température corporelle. Après l’examen, les souris seront placées dans un espace de réveil adapté avant de retourner dans leur cage.

Choix des espèces

Des souris sont utilisées dans cette étude car il n'existe pas aujourd'hui de méthode permettant de remplacer complètement un organisme vivant. Les expériences réalisées sur des cellules en laboratoire ou les simulations informatiques ne permettent pas de reproduire toutes les interactions qui se produisent dans le corps, notamment la façon dont un médicament se répartit dans les différents organes, interagit avec les cellules immunitaires et la tumeur, puis est éliminé par l'organisme. Des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines seront utilisées, car leur organisme et leur système immunitaire sont pleinement développés. Cet âge est celui le plus couramment utilisé dans ce type de recherche. Il permet d'obtenir des résultats fiables et comparables entre les animaux, tout en respectant les principes visant à remplacer, réduire et améliorer l'utilisation des animaux en recherche (principe des 3R).

Les souris utilisées appartiennent à une souche "fortement immunodéprimée", choisie pour que leur organisme ne rejette pas des cellules tumorales humaines. 206 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit par chirurgie sous anesthésie générale un fragment de tumeur du sein sous la peau, puis 25 gavages en cinq semaines et des mesures de la tumeur deux fois par semaine pendant huit semaines, pour tester une combinaison de deux traitements. Le porteur annonce des douleurs post-chirurgicales et une gêne à la marche quand la tumeur atteint le point limite, dont il ne donne pas la taille.

Objectifs

Certains gènes peuvent être impliqués dans des fusions génétiques qui représentent 0,2 % des tumeurs solides. Les protéines qui en découlent viennent se lier à des récepteurs qui favorisent la survie et la croissance des cellules. Les patients atteints d'un cancer et concernés par cette fusion reçoivent des traitements avec une efficacité limitée. L’immunothérapie n’est pas une option pour eux, et les chimiothérapies sont rapidement inefficaces. Les thérapies ciblées n’atteignent pas des taux de réponses satisfaisants et les tumeurs développent rapidement des résistances, prouvant que la compréhension des tumeurs avec fusion est encore incomplète. Pour étudier les mécanismes de réponse aux thérapies ciblées, nous avons utilisé un modèle cellulaire de cancer du sein avec une fusion génétique. Les traiter avec certaines thérapies ciblées leur fait exprimer une nouvelle protéine. Nous voulons donc explorer le rôle de cette protéine dans les réponses aux traitements aux thérapies ciblées. L’objectif de notre projet in vivo ici présenté est d’évaluer l’efficacité du ciblage de cette protéine d'intérêt par un traitement novateur en combinaison avec une thérapie ciblée classique, afin d’améliorer la réponse.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé des patients atteints de cancer du sein. Ce projet permettra de tester l’efficacité antitumorale de la combinaison d’un traitement classique et d’un traitement novateur qui cible une protéine spécifique de la tumeur. Il servira de preuve de concept montrant une réduction de la progression tumorale, grâce à cette nouvelle combinaison de traitements.

Procédures

Pour chaque souris : une injection sous cutané d’un anti-douleur 30 mn avant la chirurgie, une injection d’un anesthésique local 5 mn avant la chirurgie, une implantation de la tumeur par chirurgie sous anesthésie générale, 5 gavages/semaine pendant 5 semaines (durée 30s), mesures de la tumeur et pesées (durée < 2 minutes) 2x/semaine pendant 8 semaines. Pour certaines souris, 2 injections intra-veineuse (durée < 2mn).

Impact sur les animaux

- Douleurs post-chirurgicales après implantation de fragments de tumeurs sous-cutanée et suture. - Douleur de courte durée lors des gavages ou de l’injection en intra-veineux (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour réaliser le prélèvement des tumeurs.

Remplacement

Avant le passage sur l’animal, la sensibilité des cellules aux traitements a déjà été évalué in vitro en cultures 2D. Des tests de ces traitements sont nécessaires sur un organisme entier plus complexe pour évaluer au mieux leur efficacité. La sensibilité des cellules tumorales aux traitements anti-cancéreux dépend fortement du microenvironnement, ce qui nous manque en in vitro.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre d’animaux nécessaire par groupe d'étude grâce à un logiciel de biostatistiques, ce qui nous permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en restant statistiquement significatifs.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x)manipulateur(s) pendant 7 jours. L’état général, le comportement (activité, isolement …), les critères physiques (poils hérissés, dos vouté) ou le moindre signe de douleur sera évalué et annoté sur une fiche de suivi, et comparé à la grille de score de référence (scoring de 0 à 8) pour prendre les mesures nécessaires afin que le bien-être animal soit respecté. Un analgésique sera administré au minimum 30 mn avant l’intervention chirurgicale afin de palier à la douleur, et chaque fois qu’un score de 3 sera atteint lors du suivi des animaux. Les souris seront anesthésiées avant la chirurgie et avant la mise à mort pour minimiser leur stress. Les animaux seront hébergés en groupe de 6 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, tunnels pour jeux) régulièrement renouvelés. Les copeaux de litière seront remplacés par de la cellulose afin d’être moins irritants pour les souris présentant des tumeurs et éviter les nécroses. Un test de prise de traitement spontanée sera réalisé pour remplacer la technique de gavage.

Choix des espèces

Les souches murines sont particulièrement adaptées pour l’étude de tumeurs. Afin d’éviter le rejet de la greffe des cellules tumorales humaines, l’utilisation d’une souche murine fortement immunodéprimée est requise. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Tous tués pour que leur cerveau soit disséqué, 2 040 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent jusqu'à neuf injections de cocaïne, de morphine, de MDPV ou de sérum physiologique, puis passent un test de préférence de place conditionnée, un labyrinthe en Y, une croix surélevée, et un test de préférence au sucrose qui les isole 48 heures. Mâles et femelles sont comparés dans leur réponse à ces drogues et dans la rechute. Le porteur justifie le choix du rat par sa docilité, une espèce "bien adaptée aux manipulations répétées", et par un cerveau plus gros que celui de la souris, qui facilite les dissections.

Objectifs

L’addiction aux drogues représente un problème important de santé publique. Certaines substances, comme la cocaïne ou la morphine, peuvent entraîner une dépendance et avoir des conséquences graves sur la santé, la vie sociale et le bien-être des personnes concernées. Malgré les traitements existants, de nombreuses personnes rechutent après avoir arrêté leur consommation. Les drogues modifient durablement le fonctionnement du cerveau, en particulier dans les régions impliquées dans le plaisir, la motivation, l’apprentissage et la mémoire. Ces modifications favorisent la poursuite de la consommation et augmentent le risque de rechute. Des différences ont également été observées entre les hommes et les femmes dans leur sensibilité aux effets des drogues et dans leur risque de rechute, mais les mécanismes responsables de ces différences restent encore mal connus. Afin de mieux comprendre ces phénomènes, ce projet utilisera un modèle animal largement reconnu dans la recherche sur l’addiction. Sur une durée de cinq ans, il permettra d’étudier chez le rat comment la cocaïne, la morphine et la MDPV modifient le comportement et le fonctionnement du cerveau, d’identifier les mécanismes impliqués dans la rechute après l’arrêt de la consommation, et de mieux comprendre les différences observées entre mâles et femelles face aux drogues.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet concernent une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l’addiction aux drogues. Les substances étudiées, notamment la cocaïne, la MDPV et la morphine, sont associées à des conséquences importantes sur la santé et à un risque élevé de rechute après l’arrêt de la consommation. À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment ces substances modifient le fonctionnement du cerveau et influencent les comportements liés à la recherche et à la consommation de drogue. Il permettra également d’étudier les conséquences de ces substances sur certaines fonctions telles que la mémoire, les émotions et les comportements associés à l’anxiété, ainsi que les différences observées entre mâles et femelles. À plus long terme, les connaissances acquises pourraient contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes responsables du développement et du maintien des addictions chez l’être humain. Ces résultats pourraient participer à l’identification de nouvelles pistes thérapeutiques et au développement de stratégies visant à prévenir les rechutes et à améliorer la prise en charge des personnes souffrant de troubles liés à l’usage de substances psychoactives.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations répétées de substances. Les interventions prévues sont : 8 injections de sérum physiologique ou de drogue au cours de la phase de conditionnement ; 1 injection supplémentaire pour les animaux participant à la phase de rechute ; test de préférence de place conditionnée : prétest, test, séances de retrait et test de rechute (18 à 30 minutes par session) ; tests comportementaux complémentaires : labyrinthe en Y (10 minutes ou 2 × 5 minutes), croix surélevée (5 minutes) ; test de préférence au sucrose avec hébergement individuel temporaire pendant 48 heures.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dans ce projet sont principalement liées aux injections répétées de substances psychoactives ainsi qu’aux procédures comportementales réalisées chez les animaux vigiles. Les injections peuvent entraîner un stress léger ainsi qu’une douleur légère et transitoire de quelques secondes au moment de l’injection. L’administration des psychostimulants peut induire une augmentation transitoire de l’activité locomotrice, de la température corporelle ainsi qu’une augmentation du rythme cardiaque. L’administration de morphine peut entraîner une diminution transitoire de l’activité locomotrice, une légère hypothermie ainsi qu’une faible dépression respiratoire. L’intensité et la durée de ces effets varient selon la substance administrée et la sensibilité des animaux. Pour une partie des animaux, une phase de retrait puis une phase de rappel seront réalisées après arrêt du traitement. La phase de retrait peut être associée à un stress léger lié à l’arrêt de l’exposition à la substance. La phase de rappel nécessitera une administration supplémentaire de drogue ou de sérum physiologique pouvant entraîner un stress léger et une douleur transitoire liée à l’injection. Les tests comportementaux sont non invasifs et peuvent induire un stress léger à modéré lié à la manipulation des animaux, à leur exposition à un nouvel environnement ainsi qu’à un isolement temporaire lors de certaines évaluations comportementales. Dans le cadre des procédures terminales, les animaux seront anesthésiés profondément avant la mise à mort conformément à la réglementation en vigueur. L’administration des anesthésiques entraînera une perte progressive de conscience et l’abolition des réflexes nociceptifs avant la mise à mort.

Devenir

La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de certaines régions cérébrales.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans l’addiction reposent sur des interactions complexes entre le comportement, l’environnement et le fonctionnement du cerveau. Ces phénomènes ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante uniquement à l’aide de cellules cultivées en laboratoire ou de modèles informatiques. Ces méthodes permettent d’étudier certains mécanismes biologiques, mais elles ne permettent pas d’observer des comportements complexes tels que la recherche de drogue, la motivation à consommer ou la rechute. L’utilisation d’un animal vivant est donc nécessaire pour étudier simultanément les effets des drogues sur le comportement, la mémoire, les émotions et le fonctionnement du cerveau. Le rat est un modèle couramment utilisé dans la recherche sur les addictions car certains circuits cérébraux impliqués dans la récompense et la motivation fonctionnent de manière comparable à ceux de l’être humain. Les rats Sprague-Dawley ont été choisis car ils sont largement utilisés dans ce type d’étude, sont faciles à manipuler et présentent une bonne adaptation aux tests comportementaux. Leur utilisation fréquente dans la littérature permet également de comparer plus facilement les résultats obtenus avec ceux d’autres études.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant le principe de réduction des 3R. Les effectifs expérimentaux ont été déterminés à partir des données de la littérature scientifique, des expériences précédemment réalisées au sein du laboratoire ainsi que de calculs de puissance statistique lorsque cela était nécessaire. Pour les différents tests comportementaux et prélèvements à réaliser dans les procédures expérimentales, les effectifs ont été déterminés et les résultats analysés à l’aide de tests statistiques adaptés. De plus, certaines évaluations comportementales ne seront pas reproduites pour l'étude comportementale, des données équivalentes ayant déjà été obtenues précédemment au laboratoire, permettant ainsi de réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans le but d’appliquer le principe de raffinement, une surveillance régulière des animaux ainsi que des visites quotidiennes au sein de l’animalerie seront mises en place afin d’identifier rapidement toute situation de douleur, de souffrance ou d’altération du bien-être animal. Des points limites adaptés seront appliqués tout au long des procédures expérimentales. Afin de limiter le stress lié aux manipulations et aux conditions expérimentales, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation à l’animalerie ainsi que d’une habituation progressive à l’expérimentateur. Les rats, espèce sociale, seront hébergés par deux afin de limiter le stress lié à l’isolement. Les cages comprendront une litière adaptée à base de copeaux de bois assurant le confort des animaux. Dans le cadre de ce projet portant sur les comportements addictifs, les conditions d’hébergement seront standardisées entre les groupes expérimentaux afin de limiter l’influence de facteurs environnementaux sur les paramètres comportementaux étudiés.

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle de référence dans le domaine des neurosciences et de l’étude des troubles psychiatriques, notamment des addictions. En tant que mammifère vertébré, il possède des circuits cérébraux impliqués dans la récompense, la motivation et les comportements liés à la recherche de drogue présentant une forte proximité fonctionnelle avec ceux de l’humain. Le rat est également une espèce docile et sociable, bien adaptée aux manipulations répétées et aux études comportementales. Les modèles d’addiction chez le rat, notamment les paradigmes de préférence de place conditionnée, sont largement validés et utilisés dans la littérature scientifique. Enfin, comparativement à d’autres modèles comme la souris, le rat possède un volume cérébral plus important facilitant les dissections de structures cérébrales spécifiques et les analyses moléculaires prévues dans ce projet. Nous utiliserons des rats jeunes adultes, âgés de 8 à 9 semaines au début des expérimentations. Ce stade de développement a été choisi car il correspond à une période de maturation cérébrale et comportementale stable, largement utilisée dans les études précliniques portant sur les drogues d’abus et les comportements addictifs. L’utilisation de jeunes adultes permet de limiter les variations physiologiques liées au développement ou au vieillissement pouvant influencer les réponses comportementales et neurobiologiques étudiées. Ce choix est également fondé sur les données de la littérature scientifique ainsi que sur les expériences précédemment réalisées au sein du laboratoire dans des paradigmes similaires de préférence de place conditionnée et d’étude des phénomènes de rechute. L’utilisation d’animaux du même âge permet ainsi de garantir la comparabilité, la reproductibilité et la robustesse des résultats obtenus. Par ailleurs, les rats jeunes adultes présentent une bonne tolérance aux manipulations expérimentales répétées et sont particulièrement adaptés aux études comportementales réalisées dans ce projet.

Ovariectomisées, opérées deux à quatre fois, soumises à jusqu'à trois distensions vaginales de quatre heures sous anesthésie, 720 rates et 720 souris seront toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le laboratoire teste pour des clients des candidats médicaments contre les symptômes de la ménopause, dont il dit ne connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles", à raison de trois études par an et par espèce. Les 1 440 rongeurs passent aussi jusqu'à deux sessions de 24 heures par semaine seuls en cage à métabolisme, pendant six mois au plus. Le porteur qualifie la distension vaginale de geste non douloureux, sans analgésique, alors qu'elle sert à provoquer des traumatismes des tissus pelviens et peut laisser une incontinence. Il fixe huit rongeurs par groupe sans aucun test statistique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets fonctionnels et morphologiques de candidats médicament sur l’appareil urinaire dans un modèle mimant la ménopause. Nous pensons réaliser 3 études par an et par espèce, soit sur 5 ans 30 études.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les symptômes de la ménopause.

Procédures

Les animaux vont recevoir des traitements pharmacologiques ou hormonaux (fréquence dépendante de chaque protocole expérimental pouvant aller de quelques jours à 6 mois selon les procédures) donc vont être manipulés régulièrement. Chaque administration classique durera 30 sec – 1 min en moyenne. DES ADMINISTRATIONS PARTICULIERES SOUS ANESTHESIE POURRONT DURER JUSQU’A 3H MAXIMUM. Ils pourront également subir plusieurs chirurgies allant de 10 à 30 minutes environ. Au maximum, les animaux auront 4 chirurgies et 2 au minimum. LES ANIMAUX SUBIRONT 3 DISTENSIONS VAGINALES MAXIMUM DE 4H AU MAXIMUM AVEC AU MOINS 1 SEMAINE ENTRE CHAQUE (SOUS ANESTHESIE). Les animaux iront dans des cages à métabolisme pour la collecte d’urine où ils seront en cage individuelle pendant 24H. Selon le protocole expérimental, plusieurs sessions de cages à métabolisme pourront être réalisées mais pas plus de deux par semaine sur une période de 6 mois maximum. Des prélèvements sanguins sur animal vigile pourront être réalisés à la queue ou à la veine saphène (1 prélèvement maximum par semaine sur un suivi total de 6 mois d’expérimentation). Sur animal anesthésié, des prélèvements terminaux pourront être réalisés. La fréquence des prélèvements est dépendante de chaque protocole expérimental et peut aller de 1 à 24 (1 prélèvement par semaine pendant 6 mois). Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront rapides (5 min max).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Cependant, nos clients ont déjà des données sur l’innocuité des doses utilisées et les doses testées n’engendrent pas d’effets toxiques. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Les animaux auront des chirurgies pour mimer la ménopause ou pour les traitements hormonaux, par conséquent, les animaux pourront avoir les mêmes symptômes cliniques que chez l’homme (humeur et comportement changeants notamment avec les hormones). De plus, toute chirurgie peut provoquer des douleurs, des saignements, un certain mal-être. L’AJOUT D’UNE DISTENSION VAGINALE POUR INDUIRE DES TRAUMATISMES TISSULAIRES PELVIENS IMPLIQUE UNE PROCEDURE EXPERIMENTALE NON DOULOUREUSE MAIS LONGUE SOUS ANESTHESIE, CE QUI PEUT PROVOQUER UN MAL-ETRE A L’ANIMAL ET DES TROUBLES URINAIRES PAR LA SUITE (AUGMENTATION DE LA FREQUENCE DES MICTIONS, INCONTINENCE). L’AJOUT D’UNE VOIE D’ADMINISTRATION NON DOULOUREUSE SOUS ANESTHESIE PEUT PROVOQUER UN MAL-ETRE A L’ANIMAL, NOTAMMENT LORS DE SON REVEIL. De plus, les animaux vont être mis dans des cages à métabolisme donc isolés de leurs congénères pendant un certain temps pouvant induire un état de stress. Le modèle utilisé ici est un modèle mimant « la ménopause » et plus particulièrement son influence sur la fonction vésicale. Les animaux pourront avoir les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l’Homme à savoir une augmentation des mictions par jour avec de faible volume urinaire voir une incontinence.

Devenir

Tous les animaux de l’expérience seront mis à mort car la dernière intervention de cette procédure se réalise sous anesthésie sans réveil et des organes seront collectés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des symptômes de la ménopause. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer les symptômes dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments ou nouvelles hormonothérapies.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres. Pour mesurer certains paramètres, nous utilisons des méthodes non invasives telles que des cages métaboliques. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. La méthode nous permettant d’analyser la fonction vésicale et principalement la fuite urinaire se réalise sur des animaux anesthésiés (anesthésie sans réveil), ne provoquant pas de douleur aux animaux. Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus et notre expérience sur ce modèle) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, carré de coton) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes tels que prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure avant d’atteindre des points limites… En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée afin d’éviter toute hypothermie. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Des antalgiques seront administrés lors des chirurgies afin de limiter la douleur des animaux. LES ACTES EXPERIMENTAUX AJOUTES SE FERONT SOUS ANESTHESIE EN UTILISANT DES PLAQUES CHAUFFANTES THERMOREGULEES POUR EVITER TOUTE HYPOTHERMIE ET UTILISATION DE GEL OCCULAIRE POUR EVITER LA DESHYDRATATION DES YEUX LORS DE L’ANESTHESIE. LES ACTES EXPERIMENTAUX AJOUTES NE NECESSITENT PAS L’UTILISATION D’ANALGESIQUE (GESTES NON DOULOUREUX).

Choix des espèces

Ces procédures seront effectuées chez l’animal sauvage et chez des animaux transgéniques avec inactivation du récepteur aux œstrogènes. Le modèle d’ovariectomie et d’effet sur l’appareil urinaire est bien décrit dans la littérature chez le rongeur. Les femelles seront ovariectomisées à 4 semaines afin d’éviter une ‘imprégnation hormonale’ MAIS POURRONT EGALEMENT AVOIR 10-12 SEMAINES LORS DE CETTE CHIRURGIE SELON LES DEMANDES CLIENTS (DEMANDE D’UN DE NOS CLIENT).. Le traitement hormonal sera administré vers semaines et ce pendant 6 mois maximum. Les expérimentations de mesure de point de fuite et les administrations de candidats médicaments seront de ce fait réalisées sur des animaux matures afin de miner la condition humaine.