Rongeurs

Les souris reçoivent jusqu'à onze injections dans l'abdomen, ou une injection dans la veine située derrière le globe oculaire sous anesthésie gazeuse, et subissent jusqu'à douze prises de sang à la mâchoire. 600 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leurs organes, dont la rate, soient prélevés. Le porteur indique que la réaction immunitaire déclenchée entraîne une altération de leur état général, pour produire des lignées de cellules sécrétant des anticorps monoclonaux. Le résumé ne nomme aucune cible ni aucune application, et le porteur présente l'effectif comme "une estimation des projets à venir".

Objectifs

Depuis les années 1980, les anticorps ont profondément modifié la thérapeutique dans un grand nombre de pathologies, comme le cancer et les maladies inflammatoires chroniques. Bien que le développement des anticorps soit un processus complexe, et que certains d'entre eux peuvent entraîner des effets indésirables préoccupants, leur apport dans l'arsenal thérapeutique est majeur. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Après injection d'un élèment déchenchant une réaction immunitaire (c'est-à-dire une réaction de défense de l'organisme), l’objectif est de récupérer les cellules productrices d’anticorps (spécifiques de cet élèment) pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt. Ces dernières seront amplifiées à très petite échelle en plaques de culture. Les cellules seront ensuite éclatées pour développer les anticorps. L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif.

Bénéfices attendus

Les anticorps et leurs dérivés constituent la classe des principes actifs qui connaît le plus fort taux de développement actuel dans les domaines biotechnologique et pharmaceutique. En effet, ces anticorps sont des outils de recherche, des réactifs pour les tests d'analyses biologiques et des candidats potentiels à une utilisation thérapeutique. Ils offrent de nouvelles perspectives pour générer une réponse immunitaire protectrice et durable. Ainsi, ils sont aujourd’hui utilisés dans les traitements de cancers, de maladies inflammatoires, de migraine et plus récemment dans la lutte des formes graves de la Covid 19. Aujourd'hui, plus d'une cinquantaine d'anticorps sont disponibles dans des indications de plus en plus larges. Un grand nombre de nouveaux anticorps est actuellement en développement. Ce présent projet a pour but d’engendrer une réponse immunitaire spécifique chez l'animal. L’objectif principal est de récupérer les cellules productrices d’anticorps pour générer des lignées de cellules sécrétant les anticorps d’intérêt.

Procédures

[MODIFICATION] Les souris seront soumises à des injections et des prélèvements de sang. En effet, la réaction immunitaire sera réalisée par une injection dans l'abdomen puis par une autre injection dans l'abdomen (durée: 1 minute par injection, 11 INJECTIONS MAXIMUM SUR L'ENSEMBLE DU PROTOCOLE) ou dans une veine localisée derrière le globe oculaire (durée: 5min). Le volume administré sera choisi en respectant les volumes maximaux d’administration chez la souris. Des prélèvements de sang (12 AU MAXIMUM) pourront être réalisés à la veine de la mandibule afin de suivre le niveau de production d'anticorps des souris (durée: 2 min).

Impact sur les animaux

Les souris subiront des injections répétées dans l'abdomen ou une injection par voie intraveineuse. Ces administrations peuvent entraîner du stress chez l’animal lié à la contention, des douleurs, inflammations ou risques d'infections aux sites d'injection. Les injections réalisées dans la veine derrière le globe occulaire, peuvent produire des effets indésirables sur l’œil. Elles nécessitent une anesthésie par voie gazeuse des animaux pouvant générer une irritation des voies respiratoires. Les prélèvements de sang peuvent entraîner des risques de déshydratation ou de chute du volume sanguin et des hématomes aux sites de prélèvements. Le déclenchement d'une réaction immunitaire entraîne une altération de l'état général des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de prélever les organes pour extraire les anticorps.

Remplacement

L’utilisation des rongeurs reste indispensable pour créer de nouveaux anticorps contre des cibles car c’est uniquement la stimulation du système immunitaire qui va permettre d’atteindre l’objectif. Ces développements nécessitent l’utilisation d’animaux. En effet, ces tests doivent être réalisés sur un organisme entier afin de prélever les organes tels que la rate où sont retrouvés les cellules produisant les anticorps.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est une estimation des projets à venir et a été fixé à N = 10 animaux maximum par série expérimentale. Cela constitut le nombre maximal pour générer des anticorps. Le nombre d’animaux nécessaires par expérience sera calculé en se basant sur les données de la littérature de la cible d’intérêt afin d’évaluer la difficulté à obtenir les anticorps. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, des prélèvements sanguins répétés seront effectués sur les mêmes individus au cours du temps, permettant de suivre précisément l’évolution de la réponse immunitaire sans avoir recours à différents animaux pour chaque point temporel. De plus, dès que le nombre d’individus présentant une réponse supérieure au seuil minimal requis pour les analyses statistiques sera atteint, la série expérimentale pourra être arrêtée avant d’atteindre les 10 individus initialement prévus.

Raffinement

A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation clinique. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Les injections au niveau du sinus retro-orbitaire sont réalisées après anesthésie gazeuse de l'animal et analgésie locale de l’œil.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux pour créer et produire des anticorps reste nécessaire car aucun modèle bio-informatique ne permet à l’heure actuelle de recréer la réponse du système immunitaire de l’animal en présence d'un organisme étranger. La maturité sexuelle des souris se situant aux alentours des 6 à 8 semaines selon le sexe, il convient d’utiliser des animaux jeunes âgés d’au moins 8 semaines pour les programmes de stimulation de système immunitaire. Généralement, les jeunes animaux sont de meilleurs producteurs d’anticorps que les animaux plus âgés parce que la fonction immunitaire atteint son apogée à la puberté et diminue lentement par la suite.

Une partie des souris porte un déficit immunitaire, le déficit en DOCK8, qui les expose selon le porteur à des manifestations allergiques plus fréquentes et plus sévères, et à des infections par des virus et des champignons. 1 056 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour déclencher un eczéma, leur peau rasée est arrachée en surface au ruban adhésif ou enduite de calcipotriol, puis couverte d'un patch de staphylocoque, six fois en douze jours, ce qui provoque démangeaisons, lésions de grattage et œdème. Des souriceaux sont aussi rasés et enduits chaque jour dès deux semaines d'un émollient enrichi en sucre du lait maternel avant de subir ce protocole. Toutes les souris sont tuées à l'issue pour que leurs organes et fluides soient analysés.

Objectifs

La dermatite atopique est une allergie, touchant 15 % des enfants en Europe. Elle est associée à une barrière et un microbiote cutané altéré et à un dysfonctionnement du système immunitaire. 70 % des enfants guérissent naturellement et 30 % souffrent de symptômes persistants avec un risque accru d’autres allergies (asthme, rhinite ou allergies alimentaires : marche atopique). Il n’existe pas de stratégies préventives efficaces . Plusieurs essais cliniques ont appliqué des émollients sur la peau des bébés pour renforcer la barrière cutanée Ils ont observé que les émollients trilipidiques ne prévenaient pas la dermatite atopique mais amélioraient l'intégrité de la barrière cutanée en réduisant la perte d'eau à travers la peau. Même si les émollients renforcent la barrière cutanée, cette approche seule semble insuffisante pour prévenir la dermatite atopique. Les stratégies thérapeutiques qui ciblent la barrière cutanée, mais aussi le microbiote et le système immunitaire pourraient offrir des approches plus efficaces pour prévenir la dermatite atopique. Certains sucres du lait maternel (oligosaccharides), peuvent moduler le microbiote intestinal en favorisant l'émergence de bactéries bénéfiques et en réduisant l'abondance des bactéries nocives. Ils peuvent renforcer la barrière intestinale et induire un environnement immunitaire tolérogène. Nous avons démontré chez la souris gestante l’efficacité d’une supplémentation anténatale avec un sucre du lait maternel sur la disparition complète des symptômes de l'allergie alimentaire chez les petits. Notre hypothèse est que l'ajout de sucres du lait maternel aux émollients pourrait constituer une stratégie efficace pour cibler le microbiote cutané, le système immunitaire et la barrière cutanée et, par conséquent, pour prévenir l'apparition de la dermatite atopique . Enfin nous étudierons la survenue de la dermatite atopique et de l’allergie alimentaire sur un modèle de souris avec un déficit immunitaire (déficit en DOCK8). En effet ce déficit immunitaire induit la survenue encore plus fréquente et plus sévère de manifestations allergiques et est un modèle de choix pour l’étude de la marche atopique.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’étudier un modèle de dermatite atpique induit par une combinaison d’altération de la barrière cutanée (mécanique par tape stripping ou inflammatoire par le calcipotriol) et de modification du microbiome par ajour de staphylocoque doré ou epidermidis, d’étudier l’efficacité d’un traitement préventif par l’application d’un émollient enrichi avec un oligosaccharides du lait maternel, et enfin d’étudier l’impact d’un déficit immunitaire sur la survenue de la dermatite atpique dans ce modèle.

Procédures

- pour la validation de nos modèles de dermatite atopique, tous les gestes seront réalisés sous anesthésie : rasage ( 2 minutes) , tape stripping (3 minutes), application du calcipotriol et patch staphylocoque ( 5 minutes). Cela sera réalisé tous les 2 jours pendant 12 jours, soit 6 fois par souris. La mesure de la perte en eau transcutanée sera réalisée au début et à la fin du protocole (1 minute), soit 2 fois par souris. - Pour l’étude de la prévention de la dermatite atopique : prise de poids tous les 4 jours pour les femelles gestantes (30 secondes par souris,5 fois par souris), pour les souriceaux : anesthésie puis rasage et application journalière d’un traitement topique dorsale (30 secondes) pendant 14 jours, soit 14 fois par souriceaux. Le protocole d’induction de la dermatite atopique sera ensuite réalisé comme décrit ci-dessus.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont la gêne liée à la présence d’un patch sur le dos qui peut induire des grattages les symptômes liées à la mise en place de la dermatite atopique (démangeaisons, rougeurs, lésions de grattage, œdème), inflammation liée au staphylocoque les anesthésies gazeuses peuvent induire une baisse de temperature, une baisse de tension, une baisse de la fréquence respiratoire, ou une baisse de la concentration en oxygene. Les souris atteintes du déficit immunitaire sont susceptibles d’avoir plus de manifestations allergiques, et sont plus à risques d’infections notamment induites par les virus et les champignons.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l’expérimentation. Leurs organes et fluides biologiques seront analysés pour mesurer les biomarqueurs de l'eczema atopique ou de l’allergie alimentaire et ainsi valider nos modèles.

Remplacement

Dans le cadre de l’étude de la dermatite atopique , il est impossible de reproduire efficacement in vitro les symptômes cutanés mais aussi les interactions très complexes entre les systèmes biologiques notamment lorsqu’il s’agit des interactions entre le microbiote cutané, le système immunitaire et les barrières épithéliales (peau, intestin, poumon).

Réduction

En effectuant un test de puissance sur un logiciel en ligne de statistiques, nous avons besoin de 12 animaux par groupes afin d’obtenir un score de sévérité de l'eczema atopique (three item severity score (TIS) statistique et avoir assez de matériel biologique pour effectuer des coupes histologiques et des mesures des biomarqueurs immuns de la dermatite atopique dans la peau et dans le serum. De plus, ce nombre d'animaux permettra d'obtenir des résultats exploitables pour la réalisation d'analyses statistiques

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux permet de minimiser l'inconfort et la douleur en détectant rapidement les signe de souffrance et les points limites afin de mettre en place les mesures adaptées. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront hebergées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 3-4 souris par cage dans un environnement avec au moins 2 enrichissements (dôme, tube ou coton) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences pour des raisons pratiques de logistique.

Choix des espèces

Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur la dermatite atopique en raison de leur capacité à reproduire plusieurs caractéristiques clés de la maladie humaine, notamment les altérations de la barrière cutanée, les réponses inflammatoires de type 2, et les déséquilibres du microbiote cutané. Ces modèles permettent d’explorer les mécanismes immunologiques et moléculaires impliqués dans le développement et l’aggravation de la dermatite atpique, tout en offrant un système contrôlé pour tester l’efficacité et la sécurité de nouvelles approches thérapeutiques. De plus, les souris permettent d’étudier les liens complexes entre les facteurs environnementaux, la génétique, et les réponses immunitaires. Nous souhaitons valider ce modèle murin de dermatite atopique sur deux lignées différentes (une lignée de souris noires C57BL/6 et une lignée de souris blanches Balb/C ) car ces deux lignées ont des propriétés différentes notamment concernant les réponses inflammatoires de type 2. De plus les souris avec un deficit en DOCK8 sont issues de la lignée C57BL/6 Les souris seront âgées de 4 semaines pour les procédures 1 et 3 comme décrit dans les modèles de la littérature. Cela correspond à un âge jeune de la souris, similaire à la dermatite atpique chez l’enfant qui peut apparaitre dès les premiers mois de vie. Pour la procédure 2, Les souris blanches femelles reproductrices seront âgées de 6 semaines et les mâles reproducteurs seront âgés de 10 semaines car c’est à ces âges là que nous avons observé la meilleure efficacité de reproduction. L’application topique des émollients se fera chez le souriceau de 2 semaines pour reproduire les applications topiques d’émollients chez les bébés dès le plus jeune âge. La dermatite atpique sera induite chez les souriceaux âgés de 4 semaines comme décrit dans les modèles de la littérature

Pour savoir si un élément issu d'anciens virus intégrés au génome freine la croissance des tumeurs, 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une implantation de cellules tumorales, puis, pendant six semaines au plus, deux mesures de la tumeur et deux séances d'imagerie sous anesthésie par semaine, avec épilation de la zone. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une tension de la peau, une baisse de mobilité et une dissémination à d'autres tissus. Les souris sont mises à mort plus tôt en cas de tumeur trop volumineuse, d'ulcération, de perte de poids ou de douleur.

Objectifs

Certains éléments présents dans notre génome proviennent d’anciens virus intégrés au cours de l’évolution. Ces éléments sont généralement inactifs, mais certains peuvent encore produire des molécules capables d’influencer le comportement des cellules. Nos travaux suggèrent que l’un de ces éléments pourrait jouer un rôle protecteur en limitant certaines propriétés des cellules tumorales. L’objectif de ce projet est de déterminer si la restauration de cet élément dans des cellules tumorales modifie leur capacité à former une tumeur et à progresser dans un organisme vivant. Pour cela, des cellules tumorales de souris seront modifiées en laboratoire, puis implantées chez des souris. La croissance des tumeurs sera suivie au cours du temps par des mesures externes et par une méthode d’imagerie permettant de suivre les mêmes animaux de manière répétée. Ce projet permettra de mieux comprendre comment certains éléments anciens d’origine virale présents dans le génome peuvent influencer la progression tumorale et les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre certains mécanismes biologiques qui influencent la croissance et la progression des tumeurs. En particulier, il vise à déterminer si certains éléments anciens d’origine virale présents dans le génome peuvent contribuer à limiter le développement tumoral. Les résultats attendus pourraient apporter de nouvelles connaissances sur les interactions entre les cellules tumorales et leur environnement dans l’organisme. À plus long terme, ces connaissances pourraient contribuer à identifier de nouvelles pistes de recherche pour mieux comprendre les mécanismes qui freinent ou favorisent la progression des cancers.

Procédures

Tous les animaux recevront une seule implantation de cellules tumorales, réalisée sous anesthésie brève. Cet acte durera environ 5 à 10 minutes par animal, incluant l’anesthésie, l’implantation des cellules et la surveillance immédiate du réveil. La croissance des tumeurs sera ensuite suivie deux fois par semaine pendant 6 semaines maximum. Ce suivi comprendra une mesure externe de la tumeur, d’une durée d’environ 1 à 2 minutes par animal. Les animaux seront également suivis par imagerie deux fois par semaine. Pour cette imagerie, ils recevront un agent permettant de visualiser les cellules tumorales, puis seront placés sous anesthésie brève pendant l’acquisition des images. La durée totale d’une session d’imagerie sera d’environ 30 minutes par animal, incluant l’administration de l’agent d’imagerie, l’anesthésie, l’acquisition des images et la surveillance du réveil. Une épilation locale pourra être réalisée afin d’améliorer la qualité de l’imagerie. Elle sera limitée à la zone nécessaire et ne sera renouvelée qu’en cas de repousse gênant l’acquisition du signal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à l’implantation des cellules tumorales, aux manipulations répétées nécessaires au suivi, aux anesthésies brèves réalisées pour l’imagerie, ainsi qu’au développement de la tumeur. Les animaux pourront présenter une gêne transitoire au moment de l’implantation des cellules ou lors des manipulations. Le suivi par imagerie pourra entraîner un stress modéré lié à la contention, à l’anesthésie et aux manipulations répétées. Une irritation locale de la peau pourra également survenir après l’épilation limitée à la zone à imager. La croissance de la tumeur pourra provoquer une gêne locale, une tension de la peau, une masse palpable, une diminution de la mobilité selon la taille et la localisation de la tumeur, ou plus rarement une altération de l’état général. En cas de progression tumorale importante, une dissémination à d’autres tissus pourrait également contribuer à une dégradation de l’état général. Des critères d’arrêt précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance excessive.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation. Cette mise à mort est nécessaire car le projet repose soit sur le suivi complet de la croissance tumorale, soit sur le prélèvement des tumeurs et de certains tissus pour réaliser des analyses biologiques. Ces prélèvements permettront d’étudier les caractéristiques des tumeurs, leur organisation, leur activité moléculaire et leurs interactions avec leur environnement dans l’organisme. Les animaux ne pourront donc pas être réutilisés dans un autre projet. Les animaux seront mis à mort au plus tard 6 semaines après l’implantation des cellules tumorales, ou plus tôt pour les groupes destinés à des prélèvements à des temps définis. Ils seront également mis à mort avant la fin prévue de l’étude si des critères d’arrêt sont atteints, notamment en cas de tumeur trop volumineuse, d’ulcération, de perte de poids, de douleur, de gêne locomotrice ou d’altération importante de l’état général.

Remplacement

Avant d’envisager cette étude chez l’animal, les cellules tumorales sont étudiées en laboratoire afin de caractériser leurs propriétés et de sélectionner les conditions les plus pertinentes. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas d’étudier correctement la croissance d’une tumeur dans un tissu, ses échanges avec les cellules environnantes, son accès aux nutriments, ni ses interactions avec le système immunitaire. Ces éléments sont pourtant essentiels pour comprendre comment une tumeur se développe et progresse dans l’organisme. Il n’existe donc pas, pour cette question, de méthode alternative permettant de remplacer complètement l’utilisation d’animaux. Le recours à la souris est nécessaire pour valider les observations obtenues en laboratoire dans un contexte biologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats interprétables, tout en évitant l’utilisation d’effectifs excessifs. Les groupes ont été dimensionnés afin de comparer plusieurs types de cellules tumorales et de tenir compte de la variabilité naturelle de la croissance des tumeurs. La croissance tumorale sera suivie plusieurs fois chez les mêmes animaux, grâce à des mesures externes et à une méthode d’imagerie répétée au cours du temps. Cette approche permet de réduire le nombre d’animaux, car elle évite de constituer de nouveaux groupes uniquement pour suivre l’évolution des tumeurs à chaque étape. Une première série d’animaux permettra de définir les moments les plus pertinents pour les prélèvements biologiques. Cette stratégie évite de multiplier inutilement les temps d’analyse dans la seconde série et limite ainsi le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début de l’expérience afin de réduire leur stress. Les actes susceptibles d’être inconfortables seront réalisés sous anesthésie brève, avec protection systématique des yeux pendant l’anesthésie. Après chaque anesthésie, les animaux seront surveillés jusqu’à récupération d’un comportement normal, puis replacés dans leur cage d’origine. La croissance tumorale sera suivie régulièrement pendant 6 semaines maximum, ou jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt. L’état général des animaux, leur poids, leur mobilité, leur alimentation, l’aspect de leur pelage et l’aspect de la tumeur seront contrôlés tout au long de l’étude. Des critères d’arrêt précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance excessive. En cas de perte de poids modérée ou de diminution de l’alimentation, une aide alimentaire sera mise en place. Si l’état de l’animal se dégrade ou si un critère d’arrêt est atteint, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle permet d’étudier le développement d’une tumeur dans un organisme vivant complet. Ce modèle permet de prendre en compte des éléments qui ne peuvent pas être correctement reproduits en culture cellulaire, comme l’organisation des tissus, les interactions entre la tumeur et les cellules environnantes, l’accès aux nutriments et les interactions avec le système immunitaire. Les cellules utilisées dans ce projet sont des cellules de souris. Les implanter chez des souris permet donc d’étudier leur comportement dans un environnement biologique adapté, sans introduire de différence d’espèce qui pourrait fausser l’interprétation des résultats. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune, à partir de 6 semaines. À cet âge, les souris sont sevrées, suffisamment développées pour permettre des manipulations reproductibles et disposent d’un système immunitaire fonctionnel. L’utilisation d’animaux plus jeunes serait moins adaptée en raison de leur développement encore en cours, de leur plus petite taille et de la difficulté accrue des manipulations répétées. Les animaux seront suivis pendant 6 semaines maximum après l’implantation des cellules tumorales, ou jusqu’à l’atteinte d’un critère d’arrêt.

Tous tués à l'issue, 1 500 rongeurs, 1 200 souris et 300 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des anticancéreux sur des tumeurs greffées dans le pancréas. Une partie subit une irradiation totale du corps avant la chirurgie qui implante la tumeur, puis jusqu'à quatre administrations par jour et des prises de sang répétées à la jugulaire, à la saphène ou à la queue. La tumeur peut provoquer une occlusion intestinale, un envahissement de l'abdomen et de l'ascite, et le gavage, rarement, une détresse respiratoire jusqu'à la mort. Le porteur juge le statut immunodéprimé de ces rongeurs "indispensable" à la greffe de cellules tumorales humaines, et ne donne aucune raison à leur mise à mort, annoncée en une phrase de quatre mots.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. Le cancer du pancréas, bien que ne représentant que 2.6% des diagnostics chaque année, est le sixième plus mortel et présente un très fort taux de mortalité (plus de 490 786 décès en 2024 pour environ 531 318 nouveaux cas) selon l’organisation mondiale de la santé (WHO). L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer pancréatiques, les plus prédictifs possible, en condition orthotopique (présentant l’avantage d’inclure le microenvironnement tumoral aux études) afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs pancréatiques chez l’humain. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme afin d’arriver, avant les essais cliniques chez l’humain, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’Homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Le cancer du pancréas est le onzième cancer le plus diagnostiqué mais il est le sixième en termes de mortalité. Cette maladie très meurtrière nécessite donc un développement important de nouvelles stratégies pour la prise en charge des patients. Cela nécessite l’établissement de nouveaux modèles précliniques plus prédictifs afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme. Environ 90% des tumeurs pancréatiques présente une mutation dans le gène KRAS. L’essor récent des inhibiteurs de KRAS en clinique ouvre de nouveaux espoirs dans la prise en charge de cette maladie. Cependant, des mécanismes de résistance se développent et nécessitent d’être compris afin d’adopter des stratégies pour surpasser ces phénomènes de résistance. Dans ce contexte, le développement de nouveaux modèles précliniques, tout particulièrement orthotopiques, est incontournable pour le développement de futures molécules en préclinique puis en clinique chez les patients. L’animal représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettant d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Les études précliniques sur l’animal permettront d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique et de développer de nouvelles stratégies pour contourner ces phénomènes de résistance. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie dans le but de stimuler le système immunitaire contre le cancer. Cela pourrait permettre d’évaluer des immunothérapies dans le cancer du pancréas ce qui n’est pour le moment pas une pratique clinique approuvée.

Procédures

Différents types d’interventions sont prévus: • Irradiation totale avant induction tumorale: nécessite le transport des animaux et leur déplacement temporaire (1 à 2 fois par étude ; inférieur à 4h) • Induction tumorale : sous anesthésie générale (1 fois, chirurgie inférieure à 30 min). • Imagerie non invasive (sous anesthésie pour une durée maximale d’1 heure. • Traitements par différentes voies d’administration (limité à 4 administrations par jour) : o Orale sur animaux vigiles (moins d’1 min) o Sous-cutanée sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) o Intramusculaire sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) o Intrapéritonéale sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) o Intraveineuse sur animal anesthésié (moins de 5 min) ou vigile (moins d’1 min) • Prélèvements sanguins effectués par voies : o Jugulaire (3 prélèvements par jugulaire/jours) (moins d’1 min) o Saphène (3 prélèvements par coté sur 24h) (moins d’3 min) o Caudale (2 prélèvements / 24h), (moins d’1 min) • Volume tumoral évalué par palpation des tumeurs nécessitant la contention des animaux (inférieur à 30 secondes) • Prélèvements d’urine réalisés en hébergeant individuellement les animaux moins d’une heure ou par légère pression sur le ventre sous contention.

Impact sur les animaux

En cas d’irradiation, le transport peut engendrer un stress modéré pendant quelques heures (moins de 4h). La greffe tumorale peut engendrer une douleur et un stress modérés sur 1-2j. Lors de l’induction tumorale, un risque de phase septique à la réalisation des sutures est possible pouvant entrainer des douleurs abdominales et un stress pendant 3-4 jours. L’évolution de la tumeur peut entraîner une douleur généralement modérée (d’intensité variable selon chaque individu), une gêne, une occlusion intestinale, un envahissement de la cavité abdominale, de l’ascite et une perte de poids. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral peuvent entraîner un faible stress qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela peut engendrer un stress de 1-2j. Des effets locaux liés aux voies d’administration des traitements par piqûre peuvent survenir. Selon la voie utilisée, ce peut être : irritation / inflammation / œdème / rougeur / sensibilité / douleur transitoire / hématome ou plus rarement nécrose / une ulcération. Lors d’un gavage oral, une irritation de la cavité buccale, de l’œsophage ou de l’estomac, peut être observée. L’intensité de ces effets dépend de la dose administrée, du composé et de la fréquence. Les administrations répétées peuvent entraîner un stress cumulatif, généralement limité à la durée de la phase expérimentale. Le gavage oral peut provoquer un stress aigu temporaire et, rarement, une détresse respiratoire voir le décès de l’animal. Les administrations répétées peuvent majorer ce stress sur plusieurs jours à plusieurs semaines. Les prélèvements sanguins, peuvent induire une gêne ou une douleur légère de courte durée au point de prélèvement. Des prélèvements répétés peuvent entraîner un stress cumulatif et un impact physiologique limité. Les prélèvements d’urine et de fèces sont considérés comme peu invasifs et associés à un stress modéré lié à l’isolement temporaire. Les prélèvements terminaux réalisés sous anesthésie comportent un risque anesthésique ponctuel limité à la durée de l’intervention. Les procédures seront réalisées dans des conditions contrôlées, avec une surveillance adaptée, l’application de points limites précoces et des mesures visant à réduire la douleur, la détresse et toute souffrance inutile.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament, pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global, ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais ne sont pas suffisantes.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individuelles. Il est estimé que 40 études seront réalisées sur 5 ans. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 10 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux seront pesés minimum 2 fois par semaine. Le volume tumoral sera estimé, minimum 2 fois par semaine par palpation ou 1 fois par semaine par imagerie. Ces fréquences seront adaptées en fonction de l’état général des animaux. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès que la perte de poids sera supérieure à 10%. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages. La greffe de tumeur sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse avec administration préalable d’un analgésique opiacé. L’implantation de la greffe nécessitera l’incision de la peau, la chirurgie sera réalisée de façon aseptique et les animaux recevront une injection d’anti inflammatoire non stéroïdien en préopératoire ainsi que le lendemain, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Toutes les procédures invasives et la plupart des procédures peu invasives, seront réalisées sous anesthésie générale par des techniciens formés dont les compétences ont été validées. Les administrations/prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (intramusculaire et intradermique) seront réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Ces administrations/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires et du comité d’éthique. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal sera mis en observation et un traitement sera mis en place si possible. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, (souris et rats) ont été choisis en raison de leurs caractéristiques physiologiques bien documentées et de leur utilisation largement reconnue en recherche préclinique. De plus ce sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. Également, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique chez l’humain. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront des animaux adultes ou ayant atteint un stade de développement compatible avec les procédures expérimentales, avec une première manipulation réalisée à partir de 7 semaines d’âge. Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’induction tumorale. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets de la chirurgie, les effets secondaires des composés à tester et les effets du développement tumoral.

196 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes celles opérées sont tuées pour prélever leur cerveau. Avant quatre jours de vie, les souriceaux reçoivent une injection de virus dans le cerveau, séparés de leur mère jusqu'à deux heures, puis une seconde injection cérébrale de trente à quarante-cinq minutes entre 24 et 28 jours. Le projet vise à démontrer chez un mammifère un mode de transport des vésicules dans les neurones, surnommé "Sushi-go-round", et ses retombées sur les maladies du système nerveux restent au conditionnel. Le porteur désigne le "cannibalisme maternel" comme le "plus gros problème" de ses procédures, et le résumé ne dit pas ce que deviennent les mères.

Objectifs

Comment les cellules du cerveau (les neurones) peuvent-elles réagir si rapidement aux signaux, alors qu'il faut parfois des minutes, voire des heures, pour que les molécules voyagent d’une cellule à l’autre? Grâce à l’utilisation de techniques in vitro et à la modélisation mathématique, nous avons découvert un nouveau mode de transport cellulaire expliquant comment le signal se transmet de façon rapide et efficace le long des connections cérébrales. Ces résultats, obtenus in vitro sur culture cellulaire de neurones, nécessitent maintenant d’être validés in vivo afin de démontrer la pertinence physiologique de ce nouveau mécanisme dans le cerveau de mammifère. Pour cela, nous proposons d’exprimer une molécule fluorescente dans le cerveau de souris adultes qui sera transportée le long des connections cérébrales. Nous bloquerons ensuite le mécanisme de transport en injectant un inhibiteur que nous avons identifié. Nous analyserons ensuite la localisation de la molécule fluorescente après fixation des tranches de cerveau. Si le nouveau mode de transport que nous avons découvert existe in vivo, nous devrions observer une accumulation de la molécule fluorescente au niveau des points de contact avec les neurones cibles. Ces travaux permettront ainsi de démontrer comment les neurones gèrent leur communication pour la transmission rapide et efficace du signal à travers le cerveau.

Bénéfices attendus

Le transport des vésicules dans les neurones est un processus essentiel qui permet de déplacer des protéines importantes du corps cellulaire vers les zones de communication entre les neurones, appelées synapses. Dans une étude précédente, nous avons découvert un nouveau mode de transport que nous avons surnommé "Sushi-go-round", qui joue un rôle dans la régulation de ces communications. Ce projet va nous permettre de prouver l'exitence de ce mode de transport chez les mammifères, ce qui nous aidera à mieux comprendre comment les neurones communiquent et s'adaptent. Ces découvertes pourraient avoir des implications majeures en neurosciences, en nous aidant à mieux saisir le fonctionnement du cerveau et en ouvrant de nouvelles voies pour comprendre les maladies qui affectent le système nerveux.

Procédures

Dans cette étude, des souris, qui n'ont même pas encore quatre jours de vie, vont recevoir une injection de virus dans une zone du cerveau. Cette opération dure entre 10 et 20 minutes. Pendant ce temps, les souriceaux seront séparés de leur mère pour un maximum de deux heures. Ensuite, quand ils seront âgés entre 24 et 28 jours (après sevrage), ils subiront une autre injection dans une autre partie précise de leur cerveau. Cette deuxième opération prendra un peu plus de temps, entre 30 et 45 minutes. Après un temps défini dans l’étape 0 du projet, les animaux seront mis à mort pour récupérer les cerveaux pour analyse.

Impact sur les animaux

- stress : Les souris nouveau-nés (P0-P4) et leurs mères seront séparés momentanément (120min maximum) donc cela engendrera du stress. -anesthésie : risque de déshydratation, dépression cardio-vasculaire et respiratoire, hypothermie. Après l’injection des nouveaux nés, un suivi de l’animal sera mis en place tous les jours pendant une semaine pour vérifier l’apparition de signes de souffrance (peau de couleur bleutée, vocalisation, changement de la respiration abdominale). Concernant les animaux sous chirurgie, un suivi postopératoire sera également mis en place pendant les 4h de traitement (Agité ou très immobile, vocalisation ou automutilation, Augmentation de la fréquence et de la respiration abdominale), jusqu’à leur mise à mort. Un traitement analgésique en sous cutané sera utilisé en présence de signes de souffrance.

Devenir

Tous les animaux ayant subis une chirurgie seront mis à mort pour les prélèvements.

Remplacement

Ce projet s'inscrit dans la continuité d'une recherche précédente qui a été réalisée dans notre laboratoire, où nous avons découvert un nouveau moyen par lequel les cellules nerveuses peuvent communiquer rapidement entre elles. . Ces résultats proviennent d’analyse à partir de culture de cellules de souris. Maintenant, nous devons vérifier si ce même processus se produit dans un organisme vivant, la souris. C'est pourquoi nous ne pouvons pas nous passer de ce modèle animal pour nos prochaines étapes de recherche.

Réduction

Pour réaliser nos expériences, nous devons déterminer combien de souris nous avons besoin. Cette décision est basée sur des études précédentes, ce qui nous aide à garantir que nos résultats seront fiables et reproductibles. Nous avons prévu d'utiliser 15 souris par groupe pour certaines analyses, en incluant à la fois des mâles et des femelles. Pour une autre partie de notre étude, qui concerne l'activité électrique des neurones, nous utiliserons 10 souris par groupe. De plus, afin de réduire le nombre de souris nécessaires tout en assurant que nos résultats soient cohérents, nous allons d'abord tester les paramètres d'injection des virus. Cela nous permettra d'optimiser nos méthodes avant de commencer les expériences principales.

Raffinement

Lors de la chirurgie, les souriceaux sont anesthésiés et ils reçoivent une injection d'analgésique. Nous veillons à ce que les animaux soient en contact avec de la litière provenant de leur cage d'origine afin qu'ils soient en présence d'odeurs familières. Le plus gros problème rencontré dans nos procédures est le cannibalisme maternel. Afin de diminuer au maximum ce phénomène, nous mettons en place plusieurs actions : 1- seules les femelles qui ne présentent pas de signes de stress sont utilisées 2- nous favorisons l'utilisation de femelles non primipares 3- une grande quantité de matériel de nidification est fournie 4- les femelles ne sont manipulées qu'avec des tunnels 5- deux à trois fois par semaine pendant la gestation, nous fournissons quelques friandises ou du gel nourrissant aux femelles afin qu'elles associent notre intervention à quelque chose de positif. La croissance pondérale est le principal marqueur de bonne santé chez les nouveau-nés puisqu'elle indique que l'individu arrive à se nourrir et que la mère s'occupe bien de lui. Ainsi tout individu qui présente une croissance pondérale altérée est, selon le degré, suivi de plus près (point limite) ou euthanasié (point d'arrêt).

Choix des espèces

Compte tenu du degré de similarité anatomique et cellulaire important entre le cerveau de souris et le cerveau humain, la souris est un modèle de choix pour étudier le rôle du transport axonal. Nous utiliserons des souris C57/BL6J. Les injections seront réalisées à deux stades de développements : 1/ Cerveau immature : injection de virus avant les 4 jours de vie du souriceaux 2/ Cerveau mature : injection après 21 à 24 jours de latence (après expression du virus) d'un inhibiteur du transport, pour visualiser l'accumulation de vésicules ( petites sacs) au niveau des prolongements des cellules nerveuses qui se trouve dans la zone du cerveau qui relie les deux hémisphères.