Rongeurs

Pour chercher dans le sang des marqueurs qui prédiraient l'efficacité d'un traitement contre le cancer du sein, 264 souris femelles immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des cellules de cancer du sein humain, dont certaines rendues résistantes aux traitements, puis des anticancéreux par voie orale ou par injection, et subissent quatre prises de sang. La tumeur peut réduire leur activité et altérer leur état général, les traitements leur faire perdre du poids. Chacune est tuée après un dernier prélèvement de sang et de tumeur, à une date prévue ou plus tôt si elle atteint un point limite, que le résumé ne définit pas.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment certaines tumeurs du sein réagissent aux traitements anticancéreux et pourquoi certaines ne répondent pas ou deviennent résistantes. Pour cela, des cellules de cancer du sein humain, dont certaines ont été rendues résistantes aux traitements après exposition prolongée in vitro, sont implantées chez la souris afin de reproduire le développement de la tumeur dans un organisme vivant. Les animaux sont ensuite traités avec des médicaments anticancéreux, et l’évolution des tumeurs est suivie au cours du temps. Des prélèvements de sang et de tumeurs sont réalisés à différents moments afin d’analyser des marqueurs biologiques. Ce projet vise à identifier des signes précoces permettant de prévoir si un traitement sera efficace ou non.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de réponse et de résistance des tumeurs du sein aux traitements. Les résultats obtenus pourraient aider à identifier des marqueurs mesurables dans le sang permettant de suivre l’évolution de la maladie et d’évaluer l’efficacité des traitements plus rapidement. À terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer la prise en charge des patientes en permettant d’adapter les traitements de manière plus précoce et plus personnalisée.

Procédures

Les animaux reçoivent une injection de cellules tumorales afin de provoquer le développement d’une tumeur ; cette injection dure moins d’une minute. Une fois la tumeur formée, les animaux sont traités avec des médicaments anticancéreux administrés régulièrement par voie orale ou par injection ; chaque administration dure environ une minute. Quatre prélèvements sanguins sont réalisés au cours de l’étude afin de suivre l’évolution des biomarqueurs circulants ; chaque prélèvement dure environ 3 minutes. À différents moments de l’étude, les animaux concernés sont anesthésiés pour un dernier prélèvement de sang, suivi de leur mise à mort et du prélèvement de la tumeur ; l’ensemble de cette intervention dure au maximum 10 à 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent présenter une gêne liée au développement de la tumeur, pouvant entraîner une diminution de l’activité ou une altération de l’état général. Les traitements administrés peuvent également entraîner des effets secondaires tels qu’une perte de poids ou une fatigue. Les manipulations répétées, comme les prélèvements sanguins, peuvent être sources de stress, bien que celles-ci soient réalisées sous anesthésie afin de limiter la douleur. Un suivi quotidien est mis en place afin de détecter rapidement tout signe de souffrance et d’adapter la prise en charge des animaux.

Devenir

À l’issue de l’étude, les animaux sont mis à mort lorsque les prélèvements biologiques nécessaires ont été réalisés, lors de l’atteinte des points limites définis dans le projet ou en fin de suivi expérimental. La mise à mort est réalisée sous anesthésie générale profonde conformément aux recommandations réglementaires afin d’éviter toute douleur ou détresse. Les prélèvements sanguins terminaux et tumoraux réalisés dans ce cadre sont indispensables aux analyses moléculaires prévues dans le projet.

Remplacement

Des approches in vitro ont été utilisées en amont afin de caractériser les lignées cellulaires et sélectionner les conditions expérimentales pertinentes. Cependant, l’étude de l’évolution tumorale dans un organisme vivant et l’analyse de biomarqueurs circulants nécessitent l’utilisation d’un modèle animal, aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire ces phénomènes de manière fiable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été strictement limité au minimum nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques, conformément au principe de réduction. Les effectifs ont été définis afin de permettre des comparaisons fiables entre les groupes d’animaux recevant différents traitements, tout en évitant l’utilisation d’animaux en excès. Cette estimation repose sur des données issues d’études préliminaires et de la littérature scientifique, qui ont permis d’anticiper la variabilité des réponses tumorales. Afin de limiter le nombre total d’animaux, les prélèvements biologiques sont réalisés à différents moments clés du suivi sur des sous-groupes distincts d’animaux, ce qui évite la répétition inutile des expériences. De plus, les pertes potentielles liées à l’absence de développement tumoral après injection ou à une croissance tumorale inadaptée sont anticipées dès la conception de l’étude, permettant d’obtenir les effectifs nécessaires sans recourir ultérieurement à des animaux supplémentaires.

Raffinement

Tout au long du projet, des mesures de raffinement sont mises en place afin de réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Les injections, traitements et prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale, associés à une prise en charge adaptée de la douleur avant, pendant et après les actes. Les animaux bénéficient d’une surveillance clinique quotidienne incluant l’observation du comportement, de l’état général, de la prise alimentaire et de l’hydratation. Le poids corporel est mesuré deux fois par semaine afin de détecter précocement toute altération de l’état de santé, indépendamment de la croissance tumorale. La progression tumorale est suivie de manière régulière afin d’anticiper toute gêne ou inconfort pour l’animal. Des critères précoces et prédictifs permettent d’interrompre l’expérimentation pour un animal donné dès qu’une altération de son bien-être est observée, sans attendre l’apparition de signes sévères. Des mesures de soutien, telles que l’administration d’antalgiques, une hydratation adaptée ou une alimentation plus appétente, sont mises en place dès que nécessaire. Les conditions d’hébergement sont enrichies afin de limiter le stress et de favoriser le bien-être des animaux tout au long de l’étude. Lorsque les objectifs scientifiques sont atteints, ou si l’état général d’un animal se dégrade, celui-ci est mis à mort selon une méthode réglementaire réalisée sous anesthésie profonde, afin d’éviter toute douleur ou détresse inutile.

Choix des espèces

Le projet utilise des souris immunodéficientes, permettant l’implantation et le développement de cellules tumorales humaines sans rejet par le système immunitaire. Ce modèle est largement utilisé en recherche sur le cancer du sein afin d’étudier l’évolution tumorale et la réponse aux traitements anticancéreux dans un organisme vivant. Seules des souris femelles adultes sont utilisées dans cette étude. Les animaux sont réceptionnés à l’âge de 7 semaines puis utilisés après une semaine d’acclimatation. Les injections de cellules tumorales sont donc réalisées sur des animaux âgés d’environ 8 semaines.

3 720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris reproductrices reçoivent l'un de cinq antiépileptiques dans leur eau de boisson, de deux semaines avant l'accouplement jusqu'à la fin de l'allaitement. Leurs descendants, suivis sur plusieurs générations, passent des tests d'anxiété et de motricité que le résumé ne nomme pas, et une partie subit une chirurgie sous anesthésie pour une échographie cérébrale d'une heure, sans réveil. Le porteur cite des études où l'acide valproïque a entraîné des "comportements autistiques" chez la souris sur trois générations, puis affirme que les caractéristiques de ses propres souris "ne sont pas jugées nocives ou préjudiciables pour leur bien-être".

Objectifs

Le VPA (acide valproïque), un médicament utilisé pour traiter l'épilepsie, présente des risques importants lorsqu'il est administré pendant la grossesse : son utilisation est en effet liée à des effets néfastes sur le développement du cerveau du fœtus. Certaines études soulèvent également la possibilité d'effets transgénérationnels, comme cela a été démontré chez la souris avec l'expression de comportements autistiques sur 3 générations suivant le traitement de femelles gestantes. Dans un tel contexte, il est essentiel de déterminer la toxicité prénatale éventuelle des différents traitements anti-épileptiques. L'objectif de notre projet est donc de caractériser les effets délétères et transgénérationnels potentiels des 4 molécules anti-épileptiques les plus prescrites durant la grossesse, ainsi que du VPA considéré comme le traitement de référence pour les effets toxiques attendus. La compréhension de ces mécanismes sera utile pour la sélection et le développement de traitements anti-épileptiques chez la femme enceinte.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de notre projet sont une meilleure compréhension des effets délétères et transgénérationnels potentiels des molécules anti-épileptiques prescrites durant la grossesse. Ces connaissances favoriseront la sélection et le développement de traitements anti-épileptiques chez la femme enceinte, ainsi qu'une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, notamment neurodéveloppementales telles que retard mental et autisme, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure pour une durée totale de 6 semaines : traitement avec l'anti-épileptique dans l'eau de boisson, démarrage 2 semaines avant l'accouplement et jusqu'à la fin de l'allaitement. Pour l'échographie cérébrale une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie permettra de réaliser des mesures d’imagerie cérébrale : durée 1 heure. Ces animaux seront euthanasiés sans réveil : lot 2= 360 animaux (animaux tests et non les génétrices). Des animaux seront euthanasiés par surdosage d’anesthésiant. Une fois l’anesthésie confirmée (absence de réaction au pincement), les cerveaux sont prélevés en vue des analyses : lot 1 et 3 = 1248 animaux.

Impact sur les animaux

Modèle expérimental : Le traitement pharmacologique (Traitement, gestation *) démarre 14j avant le premier accouplement) : • représente un stress physique et psychologique léger. Lors des tests de comportement : • Le stress de manipulation et la séparation temporaire du groupe peuvent induire une anxiété passagère ou une agitation motrice. • Fatigue transitoire lors du test du niveau d’anxiété ou l’évaluation motrice Imagerie cérébrale et analyse génétiques : • Une injection d’anesthésiant sera réalisée pour permettre ces deux tests. Les animaux ne ressentiront aucune souffrance supplémentaire, car toutes les analyses seront effectuées après leur euthanasie. • Les prélèvements seront réalisés après la mise à mort Migration cellulaire : • Douleur lors de l'injection dans l'abdomen (intra-péritonéale) chez la femelle gestante

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Les cerveaux seront prélevés post-mortem pour les différentes analyses qui permettront d’étudier de manière approfondie le tissus cérébral.

Remplacement

L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur le cerveau issu de l'animal vivant. Il est en effet, à l'état actuel de nos connaissances, impossible de modéliser de manière réaliste le fonctionnement cognitif en laboratoire (in vitro) ou par des simulations informatiques (in silico). Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car elle présente le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation dont actes chirurgicaux, perfusion transcardiaque ou mise à mort en cas d'atteinte de point limite). Les modèles de cerveau en 3D cultivés en laboratoire (organoïdes cérébraux) offrent une approche tridimensionnelle plus proche de l’organisation du cerveau humain, mais ils ne permettent pas de modéliser des fonctions comportementales, les interactions sociales ou les réponses du cerveau à un traumatisme physique. Les modèles informatiques et les simulations sont utiles pour tester des hypothèses ou analyser des données, mais ils reposent sur des informations expérimentales obtenues sur des modèles animaux vivant et ne permettent pas de prédire de manière fiable l’impact d’un d'anti-épileptique sur le développement cérébral et comportemental.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Une difficulté notable dans le calcul a priori du nombre d'animaux nécessaire est que les variables étudiées sont nouvelles, et leurs paramètres statistiques par conséquent inconnus. Notre estimation du nombre d'animaux est basée sur la littérature du domaine. Le nombre d'animaux retenu dans notre protocole, nécessaire pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences réalisée avec un taux de succès de 50 pourcent. Toutefois, les générations seront analysés au fur et à mesure, ce qui permettra d'interrompre la procédure si aucun résultat n'est observé dès la première génération. Toutes les mesures seront mises en œuvre pour réduire au maximum l’utilisation d’animaux conformément aux principes éthiques de réduction. Grâce aux méthodes expérimentales régulièrement appliquées dans les laboratoires, nous disposons déjà de données préliminaires solides. Celles-ci nous permettent de calculer précisément le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs entre les groupes. Les comparaisons entre groupes seront réalisées à l’aide de tests statistiques. Enfin, le plan expérimental a été optimisé afin de garantir la robustesse et la reproductibilité des résultats, tout en respectant strictement le principe de réduction, le nombre d’animaux étant limité au strict nécessaire pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans les conditions réglementaires. Leur environnement sera enrichi avec du papier doux absorbant permettant la fabrication de nids, reproduisant ainsi un comportement naturel de nidification. Les animaux utilisés sont des souris exposées directement pendant la gestation (in utero) ou indirectement (de parents ou grands-parents exposés in utero) à un traitement antiépileptique. Ce modèle a pour but de reproduire les altérations développementales des circuits neuronaux potentiellement exprimées chez l'homme de façon transgénérationnelle suite à un traitement anti-épileptique pendant la grossesse. Toutefois, à notre connaissance, aucune étude ne prouve que les troubles liés au développement des circuits neuronaux dans les modèles animaux que nous utilisons provoquent des douleurs chez l'animal. De plus, les caractéristiques observables (comportements, traits physiques ou biologiques, appelés "phénotype") de ces animaux ne sont pas jugées nocives ou préjudiciables pour leur bien-être. L’état général des animaux sera suivi quotidiennement à l’aide d’un arbre décisionnel, permettant une observation attentive des géniteurs ainsi que les petits au sein de la portée sans perturber la relation mère-petits, essentielle à leur développement. Principe de l’arbre décisionnel : Un animal en difficulté est rapidement repéré grâce à des signes cliniques caractéristiques. En cas de détresse physiologique (troubles respiratoires, hypothermie sévère, variation importante de la fréquence cardiaque), la procédure sera immédiatement arrêtée et l’animal euthanasié.

Choix des espèces

Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. Le choix de la souris comme modèle expérimental est scientifiquement pertinent en raison de la reproductibilité des résultats, de la connaissance approfondie de sa biologie, et de son cycle de reproduction court, qui permet des études développementales efficaces, et l'observation générationnelle. Le modèle murin est ici particulièrement adapté : sa robustesse face aux manipulations, la richesse des données précliniques disponibles, et la possibilité d’explorer les effets des traitements anti-épileptiques sur plusieurs générations justifient pleinement son utilisation. En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de façon générale de jeunes adultes (1 mois et 20 jours), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire. Mais dans la mesure où les conséquences attendues des traitements sont potentiellement liées au développement du système nerveux, un groupe d'animaux en cours de développement cérébral (à des stades embryonnaires) sera inclus dans la procédures.

5 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à trois traitements par jour pendant deux mois, par voie orale ou par injection, après l'induction d'une tumeur sous anesthésie. La tumeur en grossissant distend la peau, une nécrose peut apparaître à sa surface, et la maladie peut entraîner une cachexie avec perte de poids. Toutes seront tuées à l'issue, au motif qu'elles portent des tumeurs. Le porteur se présente comme une société "prestataire de services en recherche préclinique", qui propose un "large panel de modèles in vivo" pour évaluer de nouveaux composés contre le cancer.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles déjà mis en place chez la souris, les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer. Cette évaluation chez l’animal permettra d’étudier ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie et suite au traitement thérapeutique, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Mise en place d’un système d’identification de l’animal, sous anesthésie générale (en conditions d’asepsie, réalisée entre 0 et 3 jours avant la greffe (1 fois,

Impact sur les animaux

L’évolution du volume tumoral entrainera une distension de la peau et une gêne légère à modérée. De plus, une nécrose en surface de la tumeur peut apparaitre. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. Les traitements pourront induire un stress léger. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. La contention des animaux vigiles lors des mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette réorganisation sociale pourra engendrer un stress léger à modéré de 1-2j.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe ainsi que le nombre de groupe (et de groupe contrôle) sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides tout en prenant en compte d’éventuelles variations inter-individuelles. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Une étude peut être composée de 2 à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 5 et 15 par dose de produit, selon l’effet attendu et l’homogénéité de pousse du modèle tumoral. Pour des études de screening de différents composés sur un même modèle, ou d’un même composé sur différents modèles, il sera proposé de réduire le nombre d’animaux par groupe et d’utiliser 1 à 3 animaux par groupe (Single Mouse Trial). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le vétérinaire. L’impact de ces procédures sera toujours analysé par la structure chargée du bien-être des animaux. Toutes les procédures invasives et faiblement invasives, sont réalisées sous anesthésie générale. La fréquence de mesure des volumes tumoraux seront adaptée à la vitesse de croissance du modèle. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Les animaux sont observés quotidiennement. Dès l’apparition des premiers signes cliniques qui pourront amener aux points limites des antalgiques pourront être prescrits sous l’autorité du vétérinaire. Les chirurgies pratiquées dans ce projet sont des procédures de gravité modérée, réalisée sous anesthésie. les animaux reçoivent de l’antalgiques, avec surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires. Un document de référence est à disposition des concepteurs et des techniciens. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de mal être des animaux. Les expérimentateurs et les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. En cas de suspicion de toxicité, un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal ou sur l’arrêt des traitements. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites (mais sans dépassement du point limite) est observé, l’animal est mis en observation et un traitement de soins est mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique.

Choix des espèces

La souris constitue des modèles de choix en pharmacologie car leur génome est connu et leurs principales fonctions physiologiques (fonction rénale, hépatique) sont comparables à l’Homme. Du point de vue scientifique, les modèles utilisant des souris restent les modèles de choix dans les études d’oncologie. En effet, les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéficient (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. La prise de tumeurs humaines chez ces animaux immunodéficientes présentant un fond génétique stable est homogène, permettant ainsi une bonne reproductibilité des résultats. De plus, diverses souches de rongeurs immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Enfin, les rongeurs autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en sur l’homme, facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 7 semaines) lors de leur première manipulation). Ils pourront être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant l’âge de 7 semaines. Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. De plus, les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés principalement chez les patients adultes. Il est donc justifié de traiter des animaux possédant les fonctions physiologiques correspondant au stade adulte.

Opérées sous anesthésie pendant 45 à 60 minutes, puis perfusées d'un fixateur par voie intracardiaque pour le prélèvement de leurs tissus, 64 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'équipe veut mesurer comment un récepteur à la sérotonine modifie la longueur du cil primaire, une petite structure présente à la surface des neurones. Elle affirme que ce récepteur est "une cible très prometteuse" contre les troubles de la mémoire liés à l'autisme ou à la maladie d'Alzheimer. Le résumé évoque des "molécules injectées" sans dire lesquelles ni où, et ne décrit ni trouble autistique chez ces souris ni aucun test comportemental, alors que l'autisme figure dans le titre.

Objectifs

Presque toutes les cellules de notre cerveau possèdent à leur surface une petite antenne appelée cil primaire. Cette structure est essentielle pour que les cellules puissent capter les signaux venant de l’environnement ou de leurs voisines. Nos travaux portent sur un récepteur spécifique situé sur cette antenne et activé par la sérotonine. La sérotonine est une molécule permettant aux neurones de communiquer, et elle est impliquée dans le stress, les émotions, les comportements sociaux et la mémoire. Ce récepteur est une cible très prometteuse pour soigner les troubles de la mémoire et de l'apprentissage que l'on retrouve dans les troubles du spectre autistique ou dans des maladies liées au vieillissement comme la maladie d'Alzheimer. Nous avons observé que dans ces troubles, le cil primaire change de taille : il devient trop court ou trop long, ce qui perturbe la communication entre les cellules. Nos premiers résultats suggèrent que notre récepteur d’intérêt contrôle la taille de cette antenne mais on ne connait pas encore par quels mécanismes. L'objectif de ce projet est d’étudier ces mécanismes, afin de comprendre comment "réparer" ces antennes cellulaires pour restaurer les capacités cognitives des patients.

Bénéfices attendus

Le projet présente des bénéfices majeurs tant sur le plan de la connaissance fondamentale que sur celui de la santé humaine : 1. Une avancée dans la compréhension du cerveau : Le cil primaire est présent sur presque toutes nos cellules cérébrales. Nous savons que sa taille est importante pour qu’il fonctionne correctement, mais nous ne savons pas comment cette taille est contrôlée. Ce projet permettra de comprendre comment notre récepteur d’interêt agit pour ajuster la longueur de cette antenne cellulaire et permettre son fonctionnement normal. 2. L'identification de nouvelles pistes thérapeutiques : De nombreux troubles du cerveau, comme la schizophrénie, l'autisme ou la maladie d'Alzheimer, sont associés à des anomalies de la taille de ces cils (antennes trop courtes ou trop longues), ce qui brouille la communication entre les neurones. Notre projet cherche à comprendre comment on pourrait redonner au cil primaire une taille normale grâce à notre récepteur d’intérêt, chez des patients souffrant de pathologies cérébrales. Notre récepteur est donc une cible prioritaire pour de futurs médicaments qui permettront de restaurer les fonctions de mémoire et d'apprentissage chez les patients atteints de ces pathologies. En étudiant plusieurs zones du cerveau, nous pourrons aussi déterminer si un futur traitement doit être global ou ciblé sur une région précise du cerveau pour être efficace, limitant ainsi les potentiels effets secondaires.

Procédures

Les souris seront soumises à une chirurgie avec anesthésie et analgésie (45-60 minutes) puis à une chirurgie permettant un prélèvement des tissus post-mortem, après injection de fixateur par perfusion intracardiaque.

Impact sur les animaux

La séparation courte d’avec les congénères peut générer un stress léger, les injections d’anesthésiques peuvent entraîner une légère douleur de courte durée. Un inconfort au niveau du site d’intervention et de légères douleurs locales peuvent survenir après la chirurgie, normalement résolues sous 24 heures.

Devenir

Tous les animaux utilisés seront mis à mort pour permettre d’analyser leurs tissus. Cela nous permettra de mesurer et de comprendre l’impact des molécules injectées sur la taille du cil primaire .

Remplacement

Lors de projets précédents, nous avons prouvé qu’en cas de pathologie, la taille du cil primaire est altérée (trop courte ou trop longue). Nous avons mené des expériences in vitro en amont de ce projet, qui nous ont permis de montrer que notre récepteur d’intérêt et certains de ses partenaires sont capables de changer la longueur du cil primaire et pourraient donc participer au développement de nombreuses pathologies cérébrales. Il est maintenant nécessaire de confirmer in vivo les résultats obtenus précédemment afin de pouvoir envisager d’utiliser les nouvelles connaissances générées grâce à ce projet pour développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Chaque animal sera utilisé comme son propre contrôle, permettant d’utiliser deux fois moins d’animaux pour obtenir un même volume d’informations. Sur la base de nos expériences précédentes, un nombre d’animaux = 8 par groupe expérimental est suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Nous raffinerons nos expériences en soulageant l’inconfort ou le stress potentiels subis par les animaux tout au long du protocole expérimental, en logeant les souris par groupe de 4, en mettant à disposition le nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant les animaux par le même expérimentateur. Nous utiliserons les animaux des deux sexes. L'injection de petits volumes est largement documentée, et maitrisée dans notre équipe. Cette opération est conduite sous anesthésie générale de l'animal, et est suivie d'une observation accrue pendant la phase de réveil. La souris aura accès à une nourriture hydratée et un anti-inflammatoire non-stéroïdien sera utilisé pendant les 24 heures suivant l’acte chirurgical.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux modèles pour l’étude des pathologies neurologiques et psychiatriques. Les altérations de la longueur du cil primaire observées chez des patients humains ont été retrouvées chez la souris. La souris est donc un modèle pertinent pour ces études morphologiques. Les maladies ciblées touchent aussi bien des hommes que des femmes, nous réaliserons donc notre étude sur des souris mâles et femelles indifféremment Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8-12 semaines), lorsque le développement neuronal est terminé et que le récepteur que nous étudions est exprimé dans le cil primaire.

Deux examens d'IRM de trois heures chacun sous anesthésie encadrent le protocole de chaque souris : 298 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après le second examen pour prélever les muscles des pattes arrière. Entre les deux, chacune subit une seule de ces procédures : section totale ou partielle du nerf sciatique, patte immobilisée une ou deux semaines, huit à douze semaines d'entraînement intensif sur tapis roulant, ou injections répétées d'une molécule de croissance musculaire. Le porteur présente l'IRM comme une contribution au remplacement, tout en indiquant que la validation par histologie implique un "plus grand nombre" de souris dans un premier temps. Il réserve l'étude aux mâles, chez qui certaines réponses seraient "plus marquées", au nom de la réduction.

Objectifs

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est à l’origine des techniques d’imagerie médicale comme l’IRM, utilisées depuis de nombreuses années pour observer l’intérieur du corps sans intervention chirurgicale. Ces techniques sont aujourd’hui très utiles pour étudier les maladies des muscles et du cœur. Elles permettent notamment de suivre l’apparition de graisse dans les muscles, l’inflammation, les œdèmes ou encore certaines anomalies du fonctionnement musculaire. Au sein du laboratoire, de nouvelles méthodes d’imagerie sont développées afin d’améliorer l’étude des muscles chez les animaux de laboratoire, avec l’objectif de pouvoir ensuite appliquer ces méthodes chez les patients. Pour vérifier la fiabilité des images obtenues, les chercheurs les comparent à l’histologie, une technique qui consiste à analyser les tissus musculaires au microscope. Cette méthode est très précise, mais elle nécessite un prélèvement de muscle et ne peut donc pas être utilisée facilement chez l’être humain, en particulier lorsque les muscles sont déjà très fragilisés. Le projet a pour objectif de créer une base de données reliant les résultats obtenus par imagerie RMN et par histologie pour différents types d’atteintes musculaires. Cette comparaison permettra de mieux interpréter les images obtenues par IRM et de développer de nouveaux indicateurs fiables, appelés biomarqueurs. Dans un premier temps, les chercheurs étudieront des modèles provoquant une augmentation (hypertrophie) ou une diminution (atrophie) de la taille des muscles. Ces modèles ont été choisis car ils modifient principalement la taille des fibres musculaires, sans entraîner beaucoup d’autres changements, ce qui facilite la comparaison entre les images RMN et les observations au microscope. L’objectif est d’identifier des biomarqueurs capables de détecter précisément l’atrophie ou l’hypertrophie musculaire grâce à l’IRM. À terme, ces outils pourront être utilisés dans des maladies neuromusculaires plus complexes afin de distinguer différents types d’atteintes musculaires sans avoir recours à des prélèvements invasifs. Enfin, lors d’une future utilisation en clinique, les médecins pourront comparer les résultats obtenus chez les patients avec cette base de données de référence associant imagerie et histologie, afin d’améliorer le diagnostic et le suivi des maladies musculaires.

Bénéfices attendus

Sur le plan des connaissances scientifiques, ce projet permettra de mieux caractériser les phénomènes d’hypertrophie (augmentation de la taille des muscles) et d’atrophie musculaire (diminution de la masse musculaire) grâce à deux approches complémentaires : l’histologie, qui permet d’observer les tissus au microscope, et la RMN (résonance magnétique nucléaire), utilisée en imagerie médicale. Sur le plan de la recherche préclinique, ce travail contribuera au développement de nouveaux biomarqueurs obtenus par RMN et validés par l’histologie. Ces biomarqueurs pourront ensuite être utilisés dans de futurs travaux de recherche sur les maladies neuromusculaires, avant une application potentielle chez les patients afin d’améliorer le diagnostic et le suivi des atteintes musculaires.

Procédures

Le présent projet comprend quatre procédures expérimentales distinctes et chaque animal participera à une seule de ces séries d'actes. Avant le début des expériences, les animaux bénéficieront d’un examen d'imagerie réalisé sous anesthésie générale. Cet examen permettra d’obtenir des images de référence des muscles avant traitement. Sa durée maximale sera de 3 heures. Chaque animal sera soumis à une seule des quatre séries d'actes suivantes : 1 - Dénervation de la patte. Cette intervention consiste à interrompre totalement ou partiellement l’activité d’un nerf contrôlant les muscles de la patte. Elle sera réalisée sous anesthésie générale et durera environ 10 minutes. Des traitements antidouleur seront administrés avant et après l’intervention. 2 - Immobilisation de la jambe. Une seule patte sera immobilisée pendant 1 ou 2 semaines afin d’étudier les effets du manque d’utilisation du muscle. La mise en place de l’immobilisation sera réalisée sous anesthésie générale et durera environ 5 minutes. Malgré cette immobilisation, les animaux pourront continuer à se déplacer librement dans leur cage puisque seule une patte sera concernée. 3 - Des animaux suivront un programme d’entraînement physique de type HIIT (High Intensity Interval Training), 8 ou 12 semaines ,à raison de 3 à 4 fois par semaine pendant 20 minutes par séance. 4 - Injections répétées (2 à 4 fois par semaine pendant 4 semaines) d’une molécule stimulant la croissance musculaire. Les injections sont réalisées par voie sous-cutanée sur animal anesthésié. À la fin des procédures expérimentales, un second examen d'imagerie sera réalisé sous anesthésie générale afin d’évaluer les modifications musculaires provoquées par les traitements. Cet examen durera au maximum 3 heures. À l’issue du dernier examen d'imagerie, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde afin de permettre l’analyse des tissus musculaires.

Impact sur les animaux

L’immobilisation d’une jambe n’empêchera pas les animaux de se déplacer normalement et d’interagir entre eux de manière normale. Les doigts resteront visibles dans le but de voir d'éventuelles lésions, dans ce cas le dispositif sera immédiatement retiré. La dénervation partielle ou définitive du nerf sciatique entrainera un inconfort plus important, les animaux pourront toujours se déplacer car la dénervation sera effectuée de manière unilatérale. D’autre part les animaux subissant une dénervation seront soumis à des actes chirurgicaux aseptiques, et à la pose de sutures chirugicales pour éviter tout risque d'infection. Le geste chirurgical peut induire une inflammation et éventuellement une infection locale. Le geste chirurgical est associé à une douleur locale. L’hypertrophie musculaire sera obtenue par des protocoles d’entrainement des animaux sur tapis roulant, ce qui entrainera seulement un léger inconfort. L’hypertrophie obtenue par l’entrainement devrait être modérée. Dans le but d’obtenir une hypertrophie musculaire plus importante, l’hypertrophie sera induite pharmacologiquement. Les injections sous cutanées répétées pourront également provoquer un léger inconfort. Une des nuisances attendues du projet sont liés aux anesthésies pouvant induire une détresse respiratoire et une hypothermie si le système de maintien de la température corporelle présente un défaut.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés après l’examen RMN en fin de procédure, l’euthanasie permettra le prélèvement de tissus musculaires des membres postérieurs en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

La résonance magnétique nucléaire (RMN) contribue au principe de Remplacement des 3R en permettant d’étudier de nombreux paramètres du tissu musculaire directement chez l’animal vivant. Cette approche réduit le recours à des méthodes plus invasives, comme l’histologie ou les analyses biochimiques, qui nécessitent généralement un prélèvement de tissu et donc l’euthanasie de l’animal. Dans le cadre de ce projet, des analyses histologiques restent toutefois nécessaires afin de valider les biomarqueurs obtenus par RMN. Cette étape implique l’utilisation d’un plus grand nombre d’animaux dans un premier temps. Cependant, les résultats attendus permettront ensuite de développer des biomarqueurs fiables capables de limiter, voire d’éviter, le recours à l’histologie dans les études futures. À ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro capable de reproduire fidèlement la complexité du muscle, notamment son organisation, son fonctionnement mécanique et son métabolisme énergétique. L’utilisation de modèles animaux reste donc indispensable pour étudier les muscles squelettiques et cardiaques dans des conditions proches de la réalité physiologique. Plusieurs modèles animaux de maladies neuromusculaires existent, notamment chez les rongeurs, les chiens ou les chats. Les modèles murins sont particulièrement utilisés en recherche fondamentale et préclinique car ils sont faciles à manipuler, nécessitent moins de ressources et permettent de reproduire de nombreuses caractéristiques observées dans les maladies humaines.

Réduction

La mise en place des modèles expérimentaux nécessitera également l’utilisation d’animaux. Dans cette première étape, le nombre d’animaux sera volontairement limité à 4 par groupe expérimental. Cette phase permettra de vérifier que les procédures sont fiables, reproductibles et adaptées, tout en testant les nouvelles techniques de RMN développées dans le cadre du projet. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, les groupes de la phase comparative comprendront entre 10 et 12 animaux selon les procédures étudiées. Ce nombre a été choisi pour être suffisamment élevé afin de garantir la fiabilité des analyses statistiques, tout en restant aussi réduit que possible conformément aux principes de réduction du nombre d’animaux utilisés en recherche. Au total, 298 animaux seront inclus dans le projet.

Raffinement

La RMN contribue également au troisième principe de la règle des 3R, appelé Raffinement, qui vise à améliorer les conditions expérimentales afin de réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les progrès technologiques constants en imagerie RMN permettent aujourd’hui d’obtenir, en recherche préclinique, des images extrêmement précises, avec une résolution bien supérieure à celle utilisée en pratique clinique chez l’être humain. Ces avancées permettent d’obtenir davantage d’informations tout en limitant le recours à des méthodes invasives. Le raffinement concerne également les conditions d’hébergement des animaux. Les animaux seront maintenus en groupe dans des cages adaptées et ventilées, avec un environnement enrichi comprenant notamment des tubes en carton et des matériaux permettant la fabrication de nids, afin de favoriser leur bien-être. Tous les examens RMN seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin d’éviter les mouvements pendant l’acquisition des images et de limiter le stress des animaux durant les examens. Les procédures de dénervation seront réalisées uniquement par du personnel qualifié et formé aux techniques chirurgicales. Des traitements antidouleur seront administrés avant et après l’intervention afin de réduire la douleur liée à la chirurgie. Si des signes de douleur apparaissent au cours de l’étude, des traitements complémentaires seront immédiatement mis en place. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, conformément à la réglementation en vigueur. Les animaux seront également pesés régulièrement afin de détecter rapidement toute perte de poids anormale ou tout signe de souffrance. Enfin, des critères d’arrêt précis seront appliqués tout au long du projet. Ceux-ci prendront en compte l’état général des animaux, leur âge ainsi que le nombre d’examens réalisés, afin de garantir leur bien-être pendant toute la durée de l’étude.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle expérimental de référence en recherche biomédicale, en raison de leur petite taille, de la maîtrise de leurs conditions d’hébergement et de la disponibilité de nombreux outils expérimentaux validés. Le présent projet sera conduit exclusivement sur des animaux sans pathologie préexistante. Les modèles murins sont largement utilisés pour l’étude de nombreuses pathologies humaines, notamment dans le domaine des maladies neuromusculaires, pour lesquelles ils présentent une forte pertinence translationnelle. Le laboratoire dispose d’une expertise établie dans le développement et l’utilisation de techniques d’imagerie et de spectroscopie par résonance magnétique nucléaire appliquées à l’étude du muscle squelettique chez la souris. Afin d’assurer la robustesse, la comparabilité et la reproductibilité des données, ce modèle animal sera maintenu. À terme, ces approches ont vocation à être transposées à des modèles de pathologies musculaires plus complexes, reposant fréquemment sur l’utilisation de lignées transgéniques majoritairement développées chez la souris. Le développement et la validation de ces méthodes dans ce modèle sont donc nécessaires en amont. Toutes les procédures expérimentales seront réalisées sur des animaux ayant atteint l’âge adulte, défini comme un âge minimal de deux mois. Les souris incluses dans l’étude seront âgées de 8 à 14 semaines, afin de garantir une homogénéité des groupes expérimentaux. Cette stratégie vise à limiter les variations interindividuelles liées à la croissance, susceptibles d’altérer la répétabilité et la reproductibilité des mesures. Les modèles murins d’atrophie et d’hypertrophie du muscle squelettique, ainsi que les procédures de validation de nouveaux biomarqueurs par imagerie par résonance magnétique nucléaire et analyses histologiques associées, peuvent être réalisés indifféremment chez des animaux mâles ou femelles. Toutefois, certaines réponses physiologiques, en particulier dans les modèles d’hypertrophie musculaire, sont rapportées comme étant plus marquées chez les mâles. Dans un objectif de réduction du nombre total d’animaux utilisés, conformément au principe des 3R, il a été décidé de limiter cette étude à l’utilisation exclusive de souris mâles.

1 404 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin de chaque procédure pour des analyses post mortem. Chacun subit une chirurgie du cerveau d'une heure trente à deux heures trente, garde parfois un dispositif fixé sur la tête, puis passe des tests de mémoire : un environnement associé à jusqu'à cinq stimulations "désagréablement ressentie", de nature non précisée, un apprentissage spatial en six à huit sessions, des tests d'interactions sociales et d'odeurs alimentaires, avec un rationnement pour les tests à récompense. Le but est de comprendre comment une région profonde du cerveau relaie les souvenirs entre deux autres zones. Le porteur écrit que "toute souffrance sera évitée", au motif que le "bien-être animal" est "essentiel pour garantir des données comportementales fiables".

Objectifs

Les recherches actuelles suggèrent que les souvenirs durables sont progressivement stockés dans différentes zones du cerveau. Cependant, on comprend encore mal comment un souvenir est attribué à des groupes précis de cellules nerveuses lors de son enregistrement. Des travaux récents montrent qu’une région profonde du cerveau sert de relais entre une zone impliquée dans la mémorisation des expériences récentes et une autre région participant au stockage des souvenirs à long terme. Dans ce projet, nous souhaitons mieux comprendre comment ces différentes régions cérébrales communiquent entre elles pendant la création des souvenirs chez le rat. Dans un premier temps, nous étudierons les connexions entre cette région relais et plusieurs zones du cerveau impliquées dans la mémoire. Ensuite, nous analyserons leur rôle en enregistrant leur activité ou en modifiant temporairement certaines communications entre ces régions. L’objectif est de déterminer plus précisément leur fonction chez le rat adulte soumis à différents tests de mémoire faisant appel à des odeurs, à l’environnement ou à l’orientation dans l’espace. Ces tests permettront d’étudier la formation des souvenirs à différents moments après l’apprentissage.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra, à court terme, de mieux caractériser les connexions entre certaines régions du cerveau ainsi que leur rôle dans différents aspects de la formation des souvenirs. À moyen terme, ces résultats contribueront à mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans les troubles de la mémoire. À long terme, ce projet fondamental présente une perspective translationnelle en pouvant aider à identifier l’origine des amnésies et de l’oubli accéléré observés dans certaines maladies psychiatriques et neurodégénératives, et ainsi orienter de futures stratégies diagnostiques ou thérapeutiques.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être soumis à différentes interventions expérimentales. Intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale : 1 intervention par animal, durée de 1 h 30 à 2 h 30. Administration de substances nécessaires au protocole expérimental : une seule injection intrapéritonéale sera administrée par animal. Test de mémoire lié à l’environnement : 1 session de 8 minutes pouvant inclure jusqu’à 5 stimulations désagréablement ressentie ; puis 1 session de rappel d’environ 10 minutes. Test de mémoire spatiale : plusieurs sessions d’apprentissage (6 – 8 sessions) et de rappel (1 session), de 5 à 60 minutes selon les étapes. Test de mémoire lié aux interactions sociales et aux odeurs alimentaires : 1 à 2 sessions de 5 à 30 minutes. Mesure ou modulation temporaire de l’activité cérébrale pendant les tests comportementaux : 1 à 8, d’une durée identique à celle du test concerné (5 à 60 minutes).

Impact sur les animaux

Les opérations réalisées sous anesthésie générale, impliquant une intervention au niveau du cerveau et la pose de petits dispositifs, peuvent entraîner un impact négatif temporaire sur le bien-être des animaux pendant les heures ou les jours suivant l’intervention. Après certaines opérations, les animaux porteront un petit dispositif fixé sur la tête pour maintenir le matériel en place ; malgré sa petite taille, il peut occasionner une légère gêne. Certains tests comportementaux peuvent entraîner un inconfort ou un stress passager chez les animaux, sans conséquence durable sur leur bien-être. Pour certains tests fondés sur une récompense alimentaire, un rationnement alimentaire sera mis en place afin de maintenir la motivation des animaux, avec un impact limité sur leur bien-être. Certaines procédures nécessitent des injections de substances. Celles-ci peuvent entraîner un risque de douleur transitoire au site d’injection, bien que les produits utilisés ne soient pas considérés comme douloureux. La manipulation nécessaire pour maintenir l’animal peut également provoquer un stress modéré et une gêne passagère.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder aux études post mortem.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’homme n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De même, les approches basées sur la modélisation du fonctionnement du cerveau sont utiles, mais restent complémentaires des approches expérimentales in vivo, qui permettent de tester et de valider les prédictions des modèles.

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des données fiables et exploitables. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour comparer rigoureusement les résultats, tout en tenant compte des pertes éventuelles au cours de l’étude. Le recours à des méthodes temporaires permettant d’activer ou d’inhiber certaines zones du cerveau de manière réversible permet également de diminuer le nombre d’animaux nécessaires. De plus, les différentes procédures seront réalisées dans un ordre logique afin de ne poursuivre les expérimentations que sur les voies présentant un intérêt confirmé par les étapes précédentes, ce qui contribuera à réduire encore le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales fiables, toute souffrance sera évitée. Les protocoles chirurgicaux ont été optimisés afin de limiter au maximum l’inconfort et la douleur. Les animaux seront observés quotidiennement ; dès qu’un problème est détecté, l’expérimentateur interviendra pour prodiguer les soins nécessaires ou, si besoin, mettre fin à la procédure. Des critères d’arrêt et des mesures de prise en charge adaptés ont été définis afin de garantir une gestion optimale de la douleur et de l’inconfort. Les tests comportementaux susceptibles de provoquer un inconfort temporaire seront réalisés selon des conditions strictement encadrées et limitées au minimum nécessaire pour obtenir les observations attendues. L’objectif recherché est une réaction passagère, sans effet durable sur l’animal.

Choix des espèces

De manière générale, les rongeurs constituent un modèle pertinent pour l’étude du système nerveux. Les grands principes d’organisation et de fonctionnement des circuits neuronaux sont largement conservés au cours de l’évolution. De plus, de nombreuses épreuves comportementales validées permettent d’évaluer chez le rat des fonctions cognitives complexes. Enfin, les processus de développement cérébral et les mécanismes neurobiologiques sous-jacents présentent de fortes similitudes avec ceux des autres mammifères, ce qui permet d’extrapoler les résultats obtenus à la compréhension du fonctionnement cérébral humain. Les animaux utilisés pour ce projet seront des rats jeunes adultes âgés d’environ 8-9 semaines (250-275 g) au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille et garantir une bonne reproductibilité des positions utilisées lors des chirurgies cérébrales.

Les souris subissent une ou deux chirurgies de trente minutes pour des injections dans le cerveau, et 72 d'entre elles reçoivent en plus, éveillées et sous contention, une injection dans l'abdomen. 538 souris, dont des souris génétiquement modifiées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour que leur cerveau soit analysé. Le projet porte sur des neurones d'une région cérébrale liée à la mémoire et aux émotions, avec des retombées médicales renvoyées au plus long terme. Le résumé ne nomme ni cette région, ni ce qui est injecté dans le cerveau, ni ce que vivent les souris entre la chirurgie et leur mise à mort.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre les propriétés et le rôle de certains neurones, des cellules du cerveau, situés dans une région essentielle à la mémoire et à la régulation des émotions.

Bénéfices attendus

À court terme, le projet permettra de mieux comprendre les caractéristiques de ces neurones. À moyen terme , ces résultats permettront de mieux comprendre comment ces cellules participent à la mémoire, aux apprentissages et aux émotions. À plus long terme, ces connaissances pourront contribuer à mieux comprendre certaines maladies qui affectent ces fonctions cérébrales et guider de futures recherches médicales.

Procédures

Les animaux seront soumis soit à une chirurgie (sous anesthésie, 30 minutes ; 256 animaux), soit à une chirurgie (sous anesthésie, 30 minutes) suivie d’une injection dans la cavité abdominale associée à une contention de l'animal (animaux vigiles, environ 30 secondes) (72 animaux), soit à deux chirugies (sous anesthésie, 2 × 30 minutes ; 210 animaux).

Impact sur les animaux

La principale nuisance susceptible d’être subie par les souris est la douleur associée à la chirurgie réalisée lors des injections intracérébrales. Une douleur légère et de courte durée pourra également être induite par les injections réalisées dans la cavité abdominale.

Devenir

Tous les animaux injectés seront mis à mort car leurs cerveaux sont récupérés pour les analyses.

Remplacement

Il n'existe actuellement aucune méthode utilisant uniquement des cellules en laboratoire ou des simulations informatiques permettant de reproduire la complexité de cette région du cerveau. Cette étude ne peut donc être réalisée que chez l'animal.

Réduction

Nous utiliserons le plus petit nombre de souris possible afin d’obtenir des résultats fiables. Le nombre d’animaux a été calculé pour répondre aux objectifs scientifiques tout en évitant toute utilisation inutile. Les méthodes expérimentales ont été optimisées grâce à notre expérience afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Des souris mâles et femelles seront incluses dans l’étude. Enfin, l’élevage des souris génétiquement modifiées sera planifié en fonction des besoins de chaque expérience afin d’éviter la production d’animaux en excès.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Les souris seront surveillées afin de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de souffrance. Des mesures adaptées seront mises en place si nécessaire, comme l’administration de traitements contre la douleur, l’adaptation des soins ou une surveillance renforcée, et ce en accord avec le vétérinaire. Les interventions chirurgicales seront réalisées avec des méthodes d’anesthésie et de prise en charge de la douleur appropriées, ainsi qu’un suivi attentif après l’intervention. Des outils d’évaluation objective de l’état général des animaux (poids, apparence et comportement) permettront d’adapter les soins à chaque situation. Si l’état d’un animal ne s’améliore pas malgré ces mesures, il sera retiré de l’étude afin d’éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris, car cette étude fait suite à un précédent projet réalisé chez cette même espèce. La région cérébrale étudiée produit des neurones depuis la période embryonnaire jusqu’à l’âge adulte. Les analyses seront réalisées chez des souris âgées de 12 ou 24 semaines, permettant d’étudier respectivement des neurones formés au cours de la vie embryonnaire ou à l’âge adulte lorsqu’ils ont atteint un stade de maturation. Ces âges ont été choisis afin de permettre une comparaison directe avec les résultats obtenus dans le projet précédent.

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Éveillées et maintenues dans un système de contention, elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans la veine de la queue, puis développent des nodules dans les poumons, que le porteur dit susceptibles de provoquer difficultés respiratoires, amaigrissement et "une douleur modérée". Le projet sert à vérifier si cette méthode d'induction fait apparaître des structures immunitaires dans les tumeurs, et le porteur prévoit qu'en cas d'échec les recherches s'orienteront vers d'autres méthodes. Il affirme qu'un "modèle animal immunocompétent est indispensable", les organoïdes et cultures en 3D ne reproduisant pas selon lui le tissu tumoral.

Objectifs

Le projet vise à étudier la formation et les caractéristiques de structures fonctionnelles induites dans les tumeurs pulmonaires, appelées les structures lymphoïdes tertiaires (TLS). Ces structures permettent de mettre en place localement une réponse immunitaire antitumorale. Pour cela, un modèle murin d’adénocarcinome pulmonaire sera établi par injection intraveineuse de cellules tumorales pulmonaires. Ce modèle permettra d’induire le développement de nodules tumoraux pulmonaires reproduisant certains aspects du cancer pulmonaire humain. Les tumeurs seront ensuite analysées afin d’identifier la présence, l’organisation et la composition cellulaire des TLS, ainsi que leur association avec la progression tumorale et les réponses immunitaires locales. Les objectifs sont les suivants: - Établir et valider un modèle murin d’adénocarcinome pulmonaire par injection intraveineuse de cellules tumorales. - Déterminer si ce modèle induit la formation de structures lymphoïdes tertiaires dans la tumeur. - Caractériser la composition cellulaire et l’organisation des TLS (cellules immunitaires). Explorer le rôle potentiel des TLS dans la réponse immunitaire antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la formation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans le cancer du poumon. Ces structures immunitaires sont associées à une meilleure réponse aux immunothérapies dans plusieurs cancers, mais leurs mécanismes de formation restent encore mal connus. Ce travail permettra d’établir et de valider un modèle murin pertinent pour étudier les TLS dans le microenvironnement tumoral pulmonaire. Les résultats obtenus permettront de déterminer si ce modèle reproduit la formation de TLS observée chez l’Homme. Si ce modèle est validé, il pourra être utilisé dans de futurs projets visant à mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires dans la formation et la fonction des TLS. À l’inverse, si aucune formation de TLS n’est observée, ces résultats permettront d’orienter les recherches vers d’autres modèles expérimentaux plus adaptés. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer à l’identification de nouveaux biomarqueurs et au développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie dans le cancer du poumon.

Procédures

Les animaux vigiles dans un système de contention adapté recevront une administration unique de cellules tumorales (durée de l’acte technique : 2 minutes). À la fin de l’expérimentation, une procédure chirurgicale sans réveil sera réalisée sous analgésie et anesthésie générale (durée de l’acte : environ 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter une gêne transitoire liée à l’injection intraveineuse, incluant un stress léger lors de la contention ainsi qu’une douleur légère ou un petit hématome localisé au niveau de la queue en cas d’irritation liée à l’injection. Le développement des tumeurs pulmonaires pourra entraîner une perte de poids progressive, des signes respiratoires tels qu’une augmentation de la fréquence respiratoire (polypnée), une difficulté respiratoire (dyspnée) ou une respiration abdominale, ainsi qu’une diminution de l’activité générale. Les animaux pourront présenter une douleur modérée liée au développement tumoral pulmonaire, pouvant s’accompagner d’une altération de l’état général, incluant hypoactivité, posture anormale, poil hérissé, diminution de la prise alimentaire ou isolement. Les nuisances potentielles liées à l’anesthésie comprennent notamment une hypothermie et une dépression respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement des poumons et la réalisation des analyses histologiques et immunologiques nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet, notamment l’identification, la quantification et la caractérisation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) au sein du microenvironnement tumoral. Le maintien en vie des animaux n’est pas envisageable, car les données expérimentales reposent sur l’analyse ex vivo des tissus tumoraux pulmonaires. Par ailleurs, cette stratégie permet d’obtenir un maximum d’informations à partir de chaque animal grâce à la réalisation d’analyses multiples (histologie, immunohistochimie, analyses cellulaires), contribuant ainsi à limiter le nombre total d’animaux utilisés dans le cadre du projet et des études futures.

Remplacement

À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthodes alternatives non animales permettant de reproduire de manière satisfaisante la complexité du microenvironnement tumoral pulmonaire et la formation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS). Ces structures résultent d’interactions dynamiques entre cellules tumorales, cellules immunitaires et stroma, au sein d’un tissu organisé et vascularisé, ce qui ne peut être modélisé de façon adéquate par des approches in vitro (cultures cellulaires 2D/3D, organoïdes) ou in silico. Bien que certaines approches ex vivo ou de modélisation puissent apporter des informations partielles, elles ne permettent pas d’étudier l’initiation, l’organisation spatiale et la maturation des TLS dans un contexte physiologique intégré, ni les interactions systémiques impliquées dans la réponse immunitaire antitumorale. Ainsi, l’utilisation d’un modèle animal immunocompétent est indispensable pour atteindre les objectifs du projet. Ce projet constitue par ailleurs une étape préalable visant à valider la pertinence du modèle, permettant d’éviter le recours à des animaux dans des études ultérieures si celui-ci s’avérait inadapté.

Réduction

Le nombre d’animaux (45), a été déterminé de manière à obtenir des résultats scientifiquement robustes tout en respectant le principe de réduction. Chaque expérience comportera 15 animaux recevant une injection intraveineuse de cellules tumorales. Ce nombre a été choisi comme le minimum nécessaire pour permettre l’observation fiable du développement tumoral et de la formation éventuelle de structures lymphoïdes tertiaires, en tenant compte de la variabilité biologique interindividuelle. Afin de garantir la reproductibilité des résultats et de permettre une analyse statistique appropriée, l’expérience sera répétée trois fois de manière indépendante, portant le nombre total d’animaux à 45. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance, et sur la base de nos conncaissances en terme d'hétérogénité du système immunitaire chez la souris. Aucun groupe contrôle supplémentaire n’est nécessaire, l’objectif étant de valider l’établissement du modèle tumoral et la présence ou l’absence de TLS. Les effectifs ont été déterminés sur la base des données de la littérature, afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. La stratégie expérimentale repose sur une étude pilote visant à valider la pertinence du modèle, ce qui permet d’éviter l’utilisation d’un nombre plus important d’animaux dans des projets ultérieurs si le modèle s’avérait non adapté. De plus, les analyses seront optimisées afin de maximiser les données obtenues à partir de chaque animal (analyses histologiques et immunologiques multiples sur les mêmes tissus), limitant ainsi le recours à des animaux supplémentaires. Enfin, les données obtenues seront exploitées de manière rigoureuse à l’aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les procédures expérimentales ont été conçues afin de minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux à chaque étape du projet. Les animaux bénéficieront d’un temps d'acclimatation de 8 jours avant le début des procédures. Ils seront hébergés en groupes de 5 animaux par cage dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur, avec un environnement enrichi favorisant leur bien-être et offrant un espace adapté à leurs déplacements. Les injections seront réalisées par du personnel expérimenté afin de limiter les échecs et les manipulations répétées. Une attention particulière sera portée à l’accès à l’alimentation, avec la mise à disposition, si nécessaire (en cas d’amaigrissement ou de difficulté d’alimentation), de nourriture enrichie sous forme de gelée et l’ajout de croquettes. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique régulière, comprenant une surveillance quotidienne par le personnel animalier ainsi qu’un suivi régulier par les expérimentateurs (2 à 3 fois par semaine). Ce suivi inclura le contrôle du poids, du comportement et des signes respiratoires, permettant une détection précoce de toute altération de l’état général. Dès l’apparition des tumeurs, la fréquence de surveillance sera renforcée, avec notamment des pesées régulières (2 à 3 pesées hebdomadaires) et une évaluation attentive des signes cliniques (amaigrissement, posture anormale, difficultés respiratoires) pour rechercher des signes d’altération de l’état général. Des points limites stricts et précoces seront appliqués afin d’éviter toute souffrance prolongée. Les conditions d’hébergement respecteront les standards en vigueur, avec enrichissement du milieu pour favoriser le bien-être des animaux. L’ensemble du personnel impliqué est formé aux bonnes pratiques en expérimentation animale, garantissant une prise en charge adaptée et respectueuse des animaux tout au long de l’étude.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie comme modèle expérimental en raison de sa large utilisation et de sa pertinence pour l’étude du cancer du poumon et du système immunitaire. Elle permet le développement de modèles syngéniques immunocompétents indispensables à l’étude des interactions entre cellules tumorales et système immunitaire, notamment dans le cadre de la formation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS), structures formées dans les tumeurs et permettant la génération d'une réponse antitumorale locale. De plus, la souris offre un large éventail d’outils génétiques permettant, dans des projets ultérieurs, d’étudier de manière ciblée le rôle de gènes d’intérêt dans des cellules telles que les lymphocytes B. Enfin, aucune autre espèce ou méthode alternative ne permet actuellement d’étudier de manière intégrée la tumorigenèse pulmonaire et la formation des TLS dans un organisme entier, justifiant le recours à ce modèle animal. Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris adultes jeunes, âgées de 7 à 9 semaines au moment du début des procédures expérimentales. A ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature, indispensable pour l’étude des interactions entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires, notamment dans le cadre de la formation des TLS.