Rongeurs
Evaluation de l’effet du candidats-médicaments sur le métabolisme lipidique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour évaluer un candidat médicament sur le métabolisme des graisses. Certaines rendues obèses par un régime gras, elles subissent un hébergement individuel jusqu'à huit semaines, des cages à métabolisme quasi isolées, une chirurgie d'administration, des jeûnes et jusqu'à huit prélèvements de sang. Elles sont mises à mort pour prélever organes et sang, à un volume incompatible avec la survie. Le projet est une étape du développement d'un client, l'apport pour les animaux non-humains eux-mêmes se réduisant, selon le porteur, à de 'meilleures' méthodes de raffinement.
Objectifs
Le métabolisme des lipides est un processus essentiel dans le corps humain qui implique la synthèse et la dégradation des lipides. Ce processus est essentiel à la production d'énergie, à la formation de la membrane cellulaire et à la production d'hormones, entre bien d'autres fonctions. Le surpoids et l’obésité correspondent à un excédent de graisse dans le corps. Ils sont principalement dus à une alimentation trop riche et une activité physique faible. Cependant, des facteurs psychologiques ou génétiques, des maladies chroniques peuvent intervenir dans leur survenue. Des médicaments peuvent également entrainer une prise ou perte de poids. Un adulte sur deux est concerné. Chaque étude de ce projet a pour objectif d’étudier l’effet de candidats-médicaments sur le métabolisme lipidique chez le rongeur (animaux normaux ou obèses) grâce à l’analyse de différents paramètres comme la composition de la masse corporelle, la dépense énergétique, la consommation alimentaire, d'eau et de l'activité physique etc… dans un environnement stable et contrôlé (température, humidité et lumière). Les candidats-médicaments peuvent donc être testés pour : - Leur efficacité pour un médicament ayant une indication contre l’obésité, - Leur effet sur la prise ou la perte de poids pour un médicament ayant une indication sans lien avec l’obésité.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine (Obésité) qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s) dans ce projet. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour l’espèce utilisée grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Chaque souris pourra subir : - Des contentions vigiles pour induire une anesthésie et une analgésie, administrer le produit : 1-2 min/ geste. - Une contention pour le passage dans l'appareil de RMN : 2 min, 1 à 3 fois / étude. - Un hébergement individuel dans la salle d’hébergement sur au maximum 8 semaines et/ou un hébergement quasi isolé (accès visuel limité des congénères, pas d’accès aux odeurs) dans des cages à métabolisme pendant au maximum 2 semaines ou 3 fois 4 jours au cours des 8 semaines de l’étude. - Des administrations en aigu ou en chronique avec au maximum 1/jour sur 8 semaines. - Une chirurgie pour l’administration du candidat médicament (15-30 min, 1/étude). - Des prélèvements de sang : 1-2 min/prélèvement, maximum 5/24h et 8/étude.
Impact sur les animaux
Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l'initiation du projet. Ils font donc l'objet d'échange avec les responsables Bien-Être Animal pour adapter les outils d'observation des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie et l’analgésie, administrer le produit et faire des prélèvements de sang ou pour le passage dans l'appareil de RMN peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Un stress peut être engendré du fait de l’hébergement individuel des animaux sur plusieurs semaines et/ou du fait de l'isolement sur maximum 2 semaines. Les chirurgies peuvent induire des douleurs qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Les souris de ce projet pourront subir un stress lié à la privation de nourriture. Elles pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille ou une contrainte légère lors des administrations suivant le type d’administration utilisé ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, un premier tri des candidats-médicaments est réalisé in vitro sur des cellules en culture pour tester leur efficacité. Puis des tests in vivo, chez la souris, sont réalisés avec les candidats-médicaments sélectionnés car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets pharmacologiques d’une nouvelle molécule sur l’obésité, le diabète… sur un organisme complet. De plus, avant l’administration à l’homme, l’administration chez l’animal permet d’évaluer l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat-médicament. A ce jour, la souris est une des espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.
Réduction
De nombreuses études publiées dans ce domaine de recherche et utilisant des modèles animaux similaires, et plus particulièrement ces modèles rongeurs, décrivent l'utilisation de 8-12 animaux par groupe. Ce nombre est suffisant pour réaliser une analyse statistique et a également été confirmé et validé en interne. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état de santé des animaux utilisés sera assurée. Le poids des souris sera mesuré régulièrement (au moins une fois par semaine jusqu’à 5 fois par semaine). Lors de l’anesthésie pour les chirurgies, la température corporelles des animaux est maintenue constante grâce à une couverture chauffante ou un bloc chauffant. Lors du transport à l’extérieur, d'une durée inférieure à 30 min, les cages utilisées seront fermées avec un filtre permettant le maintien du statut sanitaire et éviter une contamination. Et la cage contiendra des éléments hydratants et nutritifs sous forme de gel, des croquettes ainsi que des éléments d’enrichissement. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Sur le site où sont réalisées les expérimentations tout est mis en œuvre pour limiter les risques de contamination des animaux. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués avec notamment une attention particulière à la prise ou à la perte de poids de l’animal. Dans le cas de développement de signes cliniques, de la nourriture humidifiée ou en gel sera mise directement dans les cages pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Des biberons avec des tétines longues pour faciliter l’accès à l’eau pourront être utilisés. Dans le cas d’animaux avec phénotype dommageable, selon le phénotype, des enrichissements, de la nourriture humidifiée ou en gel seront mis directement dans les cages pour faciliter l’alimentation et l’hydratation. Des biberons avec des tétines longues pour faciliter l’accès à l’eau pourront être utilisés. La SBEA pourra être consultée pour valider les actions mises en place.
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur le métabolisme lipidique. Généralement, les animaux âgés de 16 à 20 semaines seront utilisés au moment du début de l’étude, sachant qu’il faut un nourrissage hyper lipidique pendant 12 semaines pour obtenir des souris obèses. Les souris congéniques mutantes sont obèses dès leur naissance. Elles peuvent donc être utilisées dès 5-6 semaines. Les souris "normales" peuvent être utilisées dès 5-6 semaines.
Effets anti-stress d’un produit d’origine animale (contrôle de lots de production), administré en aigu par voie orale, dans le test d’enfouissement défensif conditionné (EDC) chez le rat mâle Wistar adulte. (Acronyme : EDC-LPL-2026-2031)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Pour contrôler les lots de production d'un produit anti-stress d'origine animale, 1 080 rats mâles vont être soumis à une administration orale unique puis à un test d'enfouissement défensif conditionné, dans des procédures classées modérées. Le porteur affirme qu'aucune procédure n'engendrera de douleur, alors que le test repose sur l'exposition à une source aversive et que la gravité déclarée reste modérée. Les rats sont ensuite réutilisés pour la formation aux gestes techniques, ceux qui ne le sont pas étant mis à mort. La finalité est un contrôle qualité commercial reconduit d'année en année.
Objectifs
Les troubles anxieux et liés au stress sont particulièrement fréquents dans les pays industrialisés. Il est estimé que 13 à 22% des habitants de ces pays développeront une pathologie anxieuse au cours de leur vie. Selon l'American Institute of Stress, ce problème est à l'origine de 75 à 90% des nouvelles consultations médicales et de 60 à 80% des accidents de travail. Les traitements disponibles concernant l’anxiété et le stress présentent de nombreuses limites dues aux effets secondaires importants et/ou à l’efficacité limitée. En effet, différents traitements médicamenteux peuvent être prescrits (anxiolytiques, anti-dépresseurs) mais l’indication de ces traitements n’est pas toujours prioritairement l’effet anti-stress et ils ne sont pas dénués d’effets secondaires. Dans ce contexte, la recherche de nouveaux produits plus efficaces représente donc un enjeu sociétal et économique majeur.
Bénéfices attendus
L'enjeu de ce projet est d'évaluer et de vérifier l'efficacité de traitements dans la lutte contre le stress et l'anxiété qui sont développés pour une utilisation chez l'Homme et chez l'animal.
Procédures
Dans cette étude, un traitement sera administré une fois par jour sur les 1080 animaux vigiles (éveillés) par voie orale et ce une seule fois. L’administration ndu traitement e prend pas plus de 15 secondes par animal et ne nécessitent pas une anesthésie. Un test comportemental sera réalisé une fois pendant 5 minutes sur ces 1080 animaux pour évaluer les effets des traitements sur le stress et l'anxiété. Aucune procédure n’engendrera de douleur.
Impact sur les animaux
Les traitements administrés par voie orale s’effectueront sur animal vigile. De plus, l’administration orale sur animaux vigiles limite le risque de fausses routes et aucune médication, analgésique ou anti-inflammatoire, n’est nécessaire et ne sera donc utilisée. Le test comportemental s’effectuera sur animal vigile sans aucune médication, analgésique ou antiinflammatoire, pour ne pas perturber l’activité des animaux. Le test comportemental (enfouissement défensif conditionné) réalisé s’appuie sur le comportement naturel des rongeurs qui consiste à projeter le matériel présent sur le sol de leur environement vers une source potentiel de danger aversif.
Devenir
Lorsque cela sera possible, les animaux seront réutilisés pour la formation aux gestes pratiques au sein de l’établissement. Tous les animaux non réutilisés seront mis à mort dans des conditions éthiques.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet, les études in silico (modélisation informatique) ou in vitro ne permettant pas de prédire ou d’évaluer les effets sur l’anxiété d’un traitement. Le modèle rongeur est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre ces pathologies. La complexité des mécanismes mis en jeux ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rongeur. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Les données historiques de notre laboratoire, une étude de puissance statistique en amont, et notre expérience du modèle, permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non des traitements testés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles et isolés de tous bruits extérieurs et auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Les animaux seront hébergés dans une pièce en cycle de lumière inversé avec une température qui sera maintenue à 22±2°C et une hygrométrie de 50±20%. Les animaux auront une semaine d’acclimatation aux conditions de laboratoires avant de procéder au test comportemental, soit moins de deux semaines en tout. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la phase de test comportementale. Les expérimentateurs sont formés et habitués aux évaluations comportementales et prendront toutes les dispositions nécessaires à la bonne réalisation de celle-ci. Les traitements seront effectués sur animaux vigiles par du personnel entrainé ayant les compétences requises pour effectuer ces gestes et une observation régulière des animaux sera effectuée après la réalisation de chaque traitement. Des points limites adaptés sont fixés, si nous constatons l'atteinte d'un de ces points limites, l'animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.
Choix des espèces
Le modèle rat est utilisé régulièrement par les industriels pour évaluer l’efficacité de produits contre le stress. De plus, ce modèle est déjà très utilisé et validé dans les tests défensifs visant à étudier les comportements de type anxieux. Des rats mâles adultes seront utilisés afin de pouvoir comparer les données de cette étude à l'ensemble des données déjà disponibles et validés pour le contrôle de production des lots de produits précédents.
Etude de la neurogenèse dans le système nerveux central de la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
2 244 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger visant à suivre la naissance des neurones. Les femelles gestantes reçoivent un composé par sonde gastrique, susceptible d'avoir un effet abortif au dernier tiers de gestation, et les souriceaux une injection pouvant léser ou infecter le point de piqûre. Les tissus sont prélevés après mise à mort aux stades voulus, les femelles reproductrices étant réutilisées puis tuées au plus tard à 45 semaines. Le porteur chiffre l'effectif à 2 244 sans autre justification que l'expérience passée du laboratoire et des tests statistiques.
Objectifs
L’objectif du projet est de caractériser le processus de génération des neurones dans différentes régions du système nerveux d’un mammifère, la souris. Pour cela, nous allons utiliser des modèles de souris génétiquement modifiées adaptés à notre étude qui expriment des marqueurs fluorescents permettant de marquer les cellules qui donnent naissance aux neurones, et d’identifier ainsi des groupes de neurones issus d’une même cellule mère. Nous emploierons cette stratégie n’impliquant pas de chirurgie pour suivre le devenir des cellules composant le tube neural embryonnaire et déterminer comment ces cellules contribuent individuellement à la construction du tissu neural dans différentes régions du cerveau impliquées dans la mémoire et la cognition, ainsi que dans la rétine (siège de la perception visuelle), en contexte normal ou pathologique. Nous utiliserons en fonction de la question biologique posée des lignées de souris exprimant des marqueurs fluorescents permettant de visualiser les neurones, ou bien d’étudier leur activité. Les tissus marqués seront analysés post-mortem par des techniques de microscopie de fluorescence permettant de reconstruire très précisément en 3D les régions étudiées, ou de caractériser l’activité des neurones.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet sera d’apporter une meilleure compréhension de la construction du cerveau et de la rétine en contexte normal et pathologique. Le but est d’une part d’augmenter nos connaissances sur le développement normal du cerveau et de la rétine, encore incomplètement compris, et d’autre part de caractériser comment ce processus peut être affecté par différents problèmes survenant dans les cellules neurales en prolifération qui entrainent des désordres neurodéveloppementaux, épilepsies ou cancers. Ceci permettra de mieux comprendre l’origine de ces pathologies et comment les cibler thérapeutiquement. Pour cela, nous devons avoir une vue précise de la construction du tissu neural et de la contribution des cellules souches neurales à ce processus. Ce projet permettra une telle caractérisation dans différentes régions du système nerveux central d’une espèce mammifère (souris) proche de l’homme. Ce projet procurera des données de référence intégrant anatomie et développement du système nerveux central en contexte normal et pathologique. Ces données constitueront une base pour le développement de futures thérapies ciblant spécifiquement certaines des pathologies mentionnées ci-dessus.
Procédures
Pour déclencher l’expression des marqueurs fluorescents dans les cellules neurales, nous administrerons un composé chimique aux animaux en suivant deux méthodes distinctes en fonction du stade ciblé : Pour déclencher le marquage à un stade embryonnaire, le composé chimique sera administré par voie orale en une fois à l’aide d’une sonde gastrique à des femelles adultes gestantes vigiles (acte durant moins d’une minute). Pour déclencher le marquage à un stade postnatal précoce, le composé chimique sera administré par injection en une fois à des souriceaux vigiles (acte durant moins d’une minute).
Impact sur les animaux
La contention des animaux nécessaire à l’administration du composé chimique cause un stress temporaire. L’administration par voie orale à l‘aide d’une sonde gastrique aux animaux vigiles cause un inconfort temporaire et présente des risques de « fausse-route » et de microlésions. L’administration du composé chimique par voie orale, réalisée durant la gestation, est susceptible d’avoir un effet abortif ou de causer des problèmes à la naissance des animaux, en particulier lorsqu’il est administré durant le dernier tiers de gestation. La procédure d’injection utilisée sur les jeunes animaux est quant à elle potentiellement source de douleur localisée au point d’injection, et présente un risque d’infection au site d’injection. Il existe également un risque d’altération de croissance.
Devenir
Les animaux chez lesquels le marquage est déclenché à un stade embryonnaire seront euthanasiés aux stades demandés pour l’analyse et les tissus collectés pour des études histologiques ou le monitoring de l’activité neuronale sur tissu frais. Les femelles utilisées pour produire ces animaux et ayant reçu le composé chimique par voie orale seront réutilisées si possible et euthanasiées au plus tard à 45 semaines d’âge. Les animaux chez lesquels le marquage est déclenché à un stade postnatal par injection du composé chimique seront euthanasiés aux stades demandés pour l’analyse et les tissus collectés pour des études histologiques ou de d’activité neuronale sur tissu frais. Les femelles utilisées pour produire ces animaux injectés seront si possible réutilisées et euthanasiées au plus tard à 45 semaines d’âge.
Remplacement
En application du principe de remplacement, des études préliminaires sur nos systèmes de marquages sont préalablement réalisées in vitro dans des systèmes de culture cellulaire, permettant de valider les modifications génétiques que nous utiliserons dans nos modèles animaux (souris). Cependant, l’utilisation de la souris reste indispensable dans ce projet du fait des particularités et de la complexité de l’organisation du tissu nerveux des mammifères.
Réduction
Ce projet impliquera au maximum 2244 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique de ce projet. Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Ce nombre est basé sur notre expérience passée au laboratoire sur des expériences similaires. Nous utilisons en parallèle un logiciel statistique adapté. De même, la significativité de nos résultats sera évaluée à l’aide d’outils statistiques adaptés à nos études.
Raffinement
En application du principe de raffinement, les souris seront examinées quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergées dans les conditions conformes à la règlementation. Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant les expérimentations. Les souris seront hébergées dans des cages ventilées en stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton, tunnel), avec nourriture et eau ad libitum. Le nombre d'animaux par cage est limité à 5. La température et l’hygrométrie des cages sont contrôlées conformément à la législation. Des points limites ont été définis et les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure chargée du bien-être animal. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin d’euthanasier l’animal en dernier recours. Les animaux bénéficieront quand nécessaire d’une anesthésie générale. Enfin, une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée qui indique les actes effectués, permettant une surveillance adaptée aux procédures afin de s’assurer de leur bien-être.
Choix des espèces
La souris est très similaire à l’Homme anatomiquement, physiologiquement et génétiquement (98 pour cent de conservation du génome). Sa petite taille et sa courte gestation favorisent ce modèle standard pour l’étude du système nerveux, qui permet d’établir des lignées ayant les caractéristiques nécessaires à nos études. Les études se feront à plusieurs stades de développement (embryonnaire, première semaine après la naissance, deuxième/troisième semaines après la naissance, entre 3 semaines et 3 mois après la naissance), nous permettant ainsi d’adresser nos questions biologiques d’intérêt durant les différentes étapes clefs du développement et de la maturation du système nerveux central (avant et durant la genèse des neurones, durant leur migration, pendant et après leur maturation fonctionnelle).
Etude par imagerie de l’impact de la neurostimulation pour améliorer les capacités ventilatoires suite à un trauma cervical sur un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
Opérées d'une lésion de la moelle épinière cervicale, 350 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, la moitié classée sévère, toutes tuées à l'issue. La lésion entraîne une perte sensorielle et une réduction de la capacité respiratoire d'un côté du corps, avant deux semaines de stimulation électrique des muscles sous anesthésie et un suivi par IRM. Elles sont ensuite mises à mort pour l'analyse des tissus, le porteur indiquant que les méthodes alternatives n'y répondent pas. Les retombées pour les patients tétraplégiques sont présentées comme un 'objectif ultime' et une preuve de concept, à distance de toute application.
Objectifs
Chaque année, près de 500 000 personnes dans le monde subissent des lésions de la moelle épinière, que ce soit à la suite d'un accident ou d'une autre cause. La plupart de ces blessures touchent la région cervicale, ce qui entraîne non seulement une paralysie des muscles, mais aussi une réduction importante de la capacité pulmonaire, ce qui peut entraîner des difficultés respiratoires graves. De nombreuses personnes tétraplégiques (paralysées des quatre membres) ont besoin d’une assistance respiratoire, parfois à vie, ce qui a un fort impact sur leur qualité de vie et sur la société en général. Nos recherches visent à trouver des solutions alternatives à l’utilisation permanente de la ventilation mécanique. Dans ce cadre, après une lésion de la moelle épinière, nous travaillons sur une stratégie de réparation des réseaux neuronaux et des fonctions musculaires basée sur une stimulation électrique neuromusculaire. L’objectif de l’étude est de voir si une simulation électrique neuromusculaire permet d'augmenter l'activité neuronale au niveau de la moelle et/ou de réduire la lésion, afin de mieux comprendre comment se déroule la récupération de fonction qui a été observée et d'avoir des pistes pour optimiser plus avant cette stimulation. Pour réaliser ces observations, nous allons d’une part mettre en place l’imagerie fonctionnelle IRM de la moelle épinière de la souris et d’autre part de caractériser par imagerie IRM, au niveau anatomique et fonctionnelle, les effets de la stimulation électrique neuromusculaire. Ces informations sur l'impact de la stimulation électrique neuromusculaire sont importantes pour pouvoir, à terme, porter cette technique chez l'homme.
Bénéfices attendus
Notre objectif ultime est d’apporter des preuves de concept de la récupération de l’activité ventilatoire partielle ou totale après une lésion de la moelle épinière. Les résultats de cette étude serviront à montrer qu’il est possible de réactiver et de soutenir la plasticité de la moelle épinière, même dans les conditions les plus toxiques et néfastes d'une lésion de la moelle épinière, tout en apportant des nouvelles données scientifiques sur les mécanismes de récupération respiratoire et des indications pour une utilisation chez l’humain. Certains patients restent dépendants à vie d’une assistance respiratoire, un équipement qui les coupe d’une vie sociale et des centres de rééducation, et diminue par conséquent leur espérance de vie. Trouver une solution est indispensable.
Procédures
Tous les animaux subiront une chirurgie qui consiste en une lésion ou une incision pour les animaux contrôles (durée inférieure à 40 min), chirurgie réalisée sous anesthésie et analgésie. Par la suite, les animaux seront impliqués dans un traitement basé sur la stimulation des muscles (30 min, 5 fois par semaine pendant 2 semaines, réalisé sous anesthésie). Tous les animaux seront également impliqués dans un suivi par imagerie IRM (3 sessions en 3 semaines).
Impact sur les animaux
Les nuisances principales attendues sur les animaux sont celles induites par la chirurgie de lésion de la moelle épinière. Lors de l’anesthésie, il y a un risque d’hypothermie et de douleur au réveil. La lésion entraine également un inconfort dû à la perte sensorielle des pattes postérieures et antérieures correspondant au côté lésé, ainsi qu’une réduction de la capacité respiratoire liée à l’atteinte de la conduction nerveuse vers la partie du diaphragme qui correspond au côté lésé de la moelle épinière. Ces atteintes ne sont cependant que d'un côté, et elles permettent donc à l’animal de se mouvoir, de se nourrir et de respirer mais cela peut entrainer un inconfort du fait de ne pas se mouvoir complètement librement. Une diminution du volume d'air inspiré à chaque respiration est possible les premiers jours mais elle est compensée naturellement par une augmentation de la fréquence respiratoire. Les animaux sont sous analgésie injectée par voie sous-cutanée trois fois par jour pendant 2 jours (le jour de la chirurgie + 2 jours suivants). Cela peut entrainer un stress. Il peut aussi exister un risque de soif et de dénutrition si les animaux n’arrivent pas à se nourrir et boire suffisamment les jours après la chirurgie. Un stress pourra également être ressenti par les animaux lors des tests fonctionnels, notamment lorsqu’ils seront dans le tube permettant de mesurer le volume respiratoire (durée 20 min) où ils peuvent ressentir une limite de leur liberté d’expression physique.
Devenir
Chaque animal sera euthanasié à l’issue des expériences, afin de réaliser des études des tissus à l'échelle cellulaire sur les prélèvements post-mortem. Ces analyses constituent une part importante des projets sur lesquels nous travaillons, auxquelles les méthodes alternatives ne répondent pas.
Remplacement
À l'heure actuelle, il n'y a pas de modèle expérimental clinique autre que les sujets humains ou animaux pour étudier les réponses physiologiques intégrées. Ce projet a pour but de développer des preuves de concept de réparation d’une neuropathologie pour laquelle aucune thérapie n’est proposée aux patients. Nous ne serions pas en mesure d'effectuer les manipulations nécessaires chez l'homme (par exemple, une intervention pharmacologique dans les systèmes de neurotransmetteurs, des observations à l'échelle cellulaire, des prélèvements de moelle épinière), et nous devons donc recourir à l'expérimentation sur les espèces de mammifères non humains. Les connectivités neuronales de ces systèmes intégrés nécessaires pour mener "des études de modélisation" ne sont pas disponibles, ou encore, aucun comportement suite à un traitement innovant ne peut être prédit, et il n'existe actuellement aucun substitut à l'expérimentation animale. Les concepts qui ont guidé cette recherche sont nouveaux dans le domaine et, à ce titre, doivent être soigneusement étudiés dans des situations biologiquement pertinentes.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Nous réaliserons un suivi par imagerie IRM, ce qui permet de suivre un même animal à plusieurs temps et ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Une semaine d'acclimatation est prévue à l'arrivée des animaux avant toute expérience. Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies, selon le protocole mis en place à l'animalerie. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur (critères pris en compte : prostration, renfoncement des yeux, arrêt du nettoyage du pelage). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). Une couverture analgésique et anesthésique est prévue pour chaque intervention pouvant générer de la douleur (par exemple chirurgie) ou du stress (par exemple imagerie). En cas d'anesthésie, les animaux sont placés sur une couverture chauffante pour maintenir leur température corporelle et leurs yeux sont couverts d'un gel oculaire pour éviter le déssèchement. En situation où l'animal serait affaibli (par exemple juste après une chirurgie), une nourriture hypercalorique et hydratée sera fournie.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux d’expérimentation très utilisés dans la recherche préclinique sur le traumatisme du système nerveux, afin d’améliorer la connaissance de la pathologie et de développer des stratégies thérapeutiques adaptées. Malgré des différences entre l’homme et les rongeurs, les changements pathologiques, la réponse inflammatoire et l’expression des gènes précoces après une lésion sont les mêmes. L’induction de la lésion est très reproductible et standardisée chez le rongeur et de nombreux tests comportementaux ont été très bien établis. Les outils disponibles sont multiples et permettent de caractériser l’évolution d’une lésion (par exemple microscopie optique ou imagerie IRM). L’ensemble des animaux utilisés seront adultes afin de travailler sur un système nerveux mature et stable.
Etude de la thermorégulation et prise en charge pharmacologique du coup de chaleur
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Maintenues sous anesthésie deux heures et poussées jusqu'à 41 °C de température corporelle, 246 souris vont être utilisées pour étudier la thermorégulation, 230 d'entre elles opérées sous anesthésie et tuées sans réveil. Injectées d'agonistes et d'antagonistes, elles basculent dans des états hypothermiques ou hyperthermiques, selon qu'elles portent ou non une mutation du gène TRPV1. Le projet est présenté comme le premier modèle animal du coup de chaleur, avec une perspective d'imagerie transférable à la clinique. Sur le remplacement, le porteur se borne à indiquer que la mesure de la température corporelle ne peut se faire que sur animal vivant.
Objectifs
Le coup de chaleur se caractérise par une augmentation soudaine de la température corporelle au-dessus de 40 °C, entrainant un dysfonctionnement du système nerveux central. La mortalité est élevée et les survivants d'un coup de chaleur peuvent souffrir de séquelles à long terme. Il est essentiel d'améliorer nos connaissances et notre capacité à mesurer les mécanismes biologiques impliqués dans la thermorégulation. Chez les mammifères, la production de chaleur est un processus indispensable pour maintenir la température à environ 37 °C. Cette production de chaleur repose sur la mitochondrie, qui « brûle » la plupart des nutriments pour produire de l’énergie et de la chaleur. Récemment, un thermostat mitochondrial a été découvert et la stimulation de ce gène d’intérêt induit une hypothermie chez les animaux et chez l'Homme. Ce projet vise à explorer in vivo la fonction de thermostat moléculaire en caractérisant les changements de température dans le cerveau et les muscles de souris lors de défis environnementaux ou pharmacologiques qui favorisent ou limitent la dissipation thermique cellulaire et organique chez des souris exprimant ou non une variante défectueuse de ce thermostat. Ce projet vise également à développer les outils IRM qui nous permettront de caractériser cette faible production et dissipation de chaleur en mesurant de manière non invasive la température.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de caractériser de manière non invasive le premier modèle animal pour étudier le coup de chaleur et d'explorer le rôle du TRPV1 dans la thermorégulation en évaluant l'impact des défis thermiques sur le thermostat mitochondrial. Ce projet nous permettra de caractériser de manière non invasive le premier modèle animal pour étudier le coup de chaleur et d'explorer le rôle du TRPV1 dans la thermorégulation en évaluant l'impact des défis thermiques sur le thermostat mitochondrial. Enfin, ce modèle est également particulièrement pertinent d'un point de vue physiologique et mécanistique pour comprendre la fonction du canal TRPV1. Bien que le TRPV1 soit désormais une cible thérapeutique validée pour le traitement de certains types de douleurs aiguës et chroniques, l'industrie pharmaceutique a eu du mal à développer des analgésiques en raison des effets secondaires liés à la température. Nous pensons pouvoir tirer parti de ces observations, avec des perspectives thérapeutiques pour lutter contre les coups de chaleur, précisément en utilisant des agents qui réduisent considérablement la température corporelle. Il convient de noter que, en cas de succès, le transfert des méthodes vers une étude clinique incluant la méthodologie de thermométrie par IRM est possible et serait d'une importance capitale.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés sur une période de 2 heures et seront soit dans un environnement dont la température permettra un maintien de la température corporelle en normothermie ou en hyperthermie. Les animaux recevront également des injections d'anesthésiques et d'agents pharmacologiques en bolus.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances pour les animaux seront liées à la durée d’anesthésie (2 heures) pour pouvoir atteindre la valeur de température corporelle cible (41°C) par challenge thermique environnemental mais également aux températures corporelles cibles associées à l’hyperthermie. Les animaux seront également soumis à l’injection d’agonistes et d’antagonistes pouvant entraîner des phénotypes hypothermiques ou hyperthermiques.
Devenir
Les souris de la première procédure visant à mettre au point l'anesthésie seront conservées et seront intégrées aux lots d'animaux de la procédure 2. Les animaux utilisés lors des procédures 2, 3 , 4, 5 et 6 seront mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
L'expérimentation ayant pour objet l'évaluation de la température corporelle, elle ne peut être conduite que sur animal vivant.
Réduction
Le choix de réaliser une étude pilote va nous permettre de tester par palier les différentes conditions expérimentales, en particulier les dosages et donc potentiellement de ne pas réaliser tous les groupes prévus à partir du moment où l’objectif sera atteint. En complément de cette approche permettant potentiellement de réduire le nombre d’animaux, des individus des deux sexes seront intégrés à l’étude.
Raffinement
Les animaux recevront les soins classiques de la structure avec régulation de température, accès sans limite à la nourriture et à l'eau, enrichissement des cages (frisotti papier, carré bois et cabanes). Les animaux auront une phase d’acclimatation de 5 jours et ne seront pas manipulés afin de limiter leur stress Pendant la l’anesthésie, un dépôt de gel ophtalmique sur la cornée sera effectué et le suivi de la qualité de l’anesthésie sera évalué par mesure de la fréquence respiratoire. Lorsque les points limites seront atteint, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicales.
Choix des espèces
Le modèle génétique altéré étant un modèle murin, cette étude doit être menée sur ce modèle animal donc sur des souris porteuses ou non d’une mutation du gène TRPV1. Il s’agira d’animaux âgés de 8 à 12 semaines ayant atteint la maturité sexuelle et immunitaire.
MODIFICATION Codage synaptique de l’entrée sensorielle dans le cortex insulaire postérieur (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses d'électrophysiologie ou d'anatomie, 1 942 souris vont être utilisées dans des travaux d'un niveau de souffrance modéré sur le cortex insulaire. Elles subissent une ou deux chirurgies crâniennes, l'implantation d'une fenêtre crânienne, une fixation de la tête répétée et un hébergement individuel de 21 jours, avec une injection de chlorure de lithium provoquant une nausée. Le projet vise à décrire comment ce territoire du cerveau traite le goût, le toucher, le son et la température, des connaissances que le porteur qualifie de 'très limitées'. Les bénéfices restent formulés comme l'espoir d'ouvrir 'la voie' à une meilleure compréhension, sans application annoncée à court terme.
Objectifs
L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.
Bénéfices attendus
Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.
Procédures
- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H. L'habituation à la fixation de la tête devrait durer entre 5 et 60 minutes par jour sur 2 à 5 jours. L'habituation à la stimulation sensorielle devrait durer de 2 à 5 jours. Les manipulations opto- ou chimiogénétiques des assemblages neuronaux sont réalisées sur un animal éveillé. L'ensemble de la procédure dure environ 1 à 2 heures. Du chlorure de lithium sera injecté une fois aux souris lors d'une procédure de test d'aversion gustative conditionnée, lequel durera au total 11 jours. MODIFICATION LES ANIMAUX SERONT MAINTENUS EN HEBERGEMENT INDIVIDUEL PENDANT 21 JOURS
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie stéréotaxique bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...). La fixation des souris par la tête peut générer une gêne qui sera minimisée par une habituation lente à l’aide de plusieurs sessions. En ce qui concerne la restriction hydrique, nous nous attendons à une perte de poids qui sera surveillé quotidiennement. L'injection de chlorure de lithium induit une nausée transitoire.
Devenir
Tous lea animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure pour des études d'électrophysiologie ou d'anatomie.
Remplacement
La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.
Réduction
La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Évaluation de l’effet in vivo de combinaisons de traitements agissant sur la multiplication des cellules du cancer du sang. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour tester des combinaisons de médicaments contre une leucémie aiguë myéloïde, 798 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 160 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont irradiées puis greffées avec des cellules cancéreuses de souris ou humaines, avec des prélèvements de sang hebdomadaires et des ponctions de moelle osseuse au fémur répétées jusqu'à trois fois. La maladie peut provoquer une forte perte de poids, une déshydratation et une hypothermie, les animaux étant mis à mort au cumul de plusieurs points limites ou au plus tard trois mois après le traitement. Le porteur situe deux étapes in vitro en amont mais affirme qu'une preuve d'efficacité chez la souris reste 'indispensable' avant l'essai clinique.
Objectifs
Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des cancers du sang de mauvais pronostic. De nouvelles options thérapeutiques sont donc nécessaires. Afin d’identifier de nouvelles combinaisons de médicaments limitant la multiplication de cellules leucémiques, nous avons procédé à une première étape in vitro (sans utilisation d’animaux) sur 3 types de cellules leucémiques différentes, ce qui nous a permis d’identifier plusieurs combinaisons de traitements intéressantes. La deuxième étape in vitro à partir d’échantillons de patients, nous a permis de confirmer l’effet combiné pour deux combinaisons innovantes. Parallèlement, le projet intègre une étude sur une nouvelle formulation d’un médicament qui est capable de détruire les cellules cancéreuses en utilisant le fer présent dans l’organisme. Notre projet a pour but de tester ces combinaisons et cette nouvelle formulation de médicament sur des modèles de souris afin de les valider et de pouvoir envisager leur utilisation dans des essais cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
Nos travaux pré-cliniques, qui évaluent la pertinence d’un traitement sur les cellules et dans des modèles de souris avant de le donner à l’homme, devraient permettre de mettre en évidence une nouvelle stratégie thérapeutique dans les LAM, grâce au développement d'une thérapie basée sur l’administration de deux médicaments en simultané et d’une nouvelle formulation d’un autre médicament . Ces nouveaux traitements ont pour ambition d'être à la fois efficaces et bien tolérés pour améliorer le pronostic des patients atteints de LAM.
Procédures
Dans un premier temps, pour déterminer la toxicité des traitements, il sera administré sur un premier lot d’animaux une molécule thérapeutique par injection au niveau de l’abdomen 1 fois tous les 2 jours pendant 14 jours. Un deuxième lot recevra une deuxième molécule par voie orale 2 fois par jour pendant cinq jours avec une pause de 3 jours, un troisième lot une troisième molécule au niveau de l’abdomen 1 fois par jour pendant 14 jours, un quatrième lot une combinaison de la première molécule combinée avec la deuxième et un cinquième lot une combinaison de la première molécule combinée avec la troisième molécule. En parallèle, pour l’étude de formulation d’un nouveau médicament, un groupe d’animaux (souris vigiles) recevront ce traitement par injection au niveau de l’abdomen et une autre groupe par voie orale 1 fois par jour à des temps déterminés ou 2 fois par jour pendant 4 jours à 8h d’intervalle. Pour suivre l’efficacité du médicament nous effectuerons un prélèvement de sang juste avant l'euthanasie sous anesthésie générale (durée: 2 min). Chaque injection dans l'abdomen dure 30s, l'administration par voie orale dure 1 min. Dans cette même étude, pour suivre la maladie, les souris malades bénéficieront d’un suivi par imagerie (caméra spéciale) sous anesthésie générale pour visualiser l’évolution de la maladie de manière non invasive (durée: 20 min). Dans un second temps, un groupe d’animaux vigiles sera irradié (2 min) au préalable pour favoriser une prise de greffe. 3 à 6h après, il sera injecté (souris vigile), au niveau de la veine de la queue, des cellules cancéreuses de souris (30s). Des prélèvements de sang d’une durée de quelques secondes seront réalisés une fois par semaine au niveau de la joue pour établir le développement de la maladie et à deux semaines un prélèvement de moelle osseuse au niveau du femur sur animal anesthésié (5min) renouvelé 2 semaines plus tard (3 fois maximum). Une fois la maladie établie, les traitements vus précédemment seront administrés. Et enfin, un autre groupe de souris sera soumis aux mêmes interventions que le groupe précédent en remplaçant les cellules cancéreuses de souris par des cellules cancéreuses humaines.
Impact sur les animaux
Le développement de la maladie peut entrainer une importante perte de poids, un changement de comportement, de mobilité, une déshydratation et/ou une hypothermie. L’administration orale d’un traitement peut entrainer une possible irritation du tube digestif. Les différents prélèvements et injections peuvent générer un stress et une éventuelle gêne temporaire surtout après le prélèvement de moëlle osseuse.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélever la moelle osseuse et la rate afin de caractériser l’effet du traitement sur l’expansion des cellules cancéreuses. Dans le cas où le traitement testé améliore la survie des animaux, alors ceux-ci seront gardés en vie post-traitements et ils ne seront euthanasiés que lorsqu’ils présenteront plusieurs points limites cumulés ou au plus tard 3 mois après la fin du traitement.
Remplacement
Bien que certains modèles cellulaires manipulés in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de caractérisation de réponse aux traitements, ils ne sont pas suffisants car ils ne permettent pas de récapituler toutes les conditions pathologiques de croissance de la leucémie observée chez l’homme. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité dans des modèles pré-cliniques murins.
Réduction
Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établi grâce aux études antérieures du laboratoire et à l’utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les protocoles seront étudiés afin de limiter au maximum le stress ainsi que la douleur subis par l'animal. Les animaux seront anesthésiés et une analgésie sera effectuée lors des ponctions osseuses car il y a un risque plus important de gêne ou de douleur liée à cette procédure. De plus, les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Une surveillance, une pesée et un suivi clinique quotidien des animaux à l’aide d’une grille d’observation permettront de déterminer des points limites précoces qui conduiront à un renforcement du suivi et/ou à l’euthanasie de l’animal
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à identifier le traitement qui sera le plus efficace et le plus adapté pour être transféré et testé en clinique chez l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’au moins 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.
Manipulations et utilisations d’animaux vertébrés à des fins d’enseignement
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 1280
Pour entraîner des étudiants et des professionnels aux gestes de l'expérimentation, 375 souris et 1 280 rats vont être utilisés dans des travaux pratiques d'un niveau de souffrance allant de léger à modéré. Une partie subit une chirurgie de plus d'une heure, des gavages et jusqu'à six injections, d'autres deux tests comportementaux sous l'effet d'un médicament psychoactif. Les animaux opérés ne sont pas réveillés quand des organes ont été prélevés ou l'intervention jugée trop délabrante, ceux soumis aux contraintes légères étant réutilisés ou adoptés. Le porteur présente le recours aux animaux non-humains comme 'une réalité de la recherche' à laquelle les futurs professionnels doivent être formés.
Objectifs
Le recours à l’animal est une réalité de la recherche : les personnes qui doivent expérimenter avec des animaux doivent être formées : licences professionnelles, master, formation continue… Dans le cadre de cette formation professionnelle, nous voulons qu’une part de cette formation soit faite de façon centralisée avec des bonnes pratiques, en complément du compagnonnage qui, utilisé exclusivement, cloisonne le savoir et fait perdurer localement les habitudes – bonnes ou mauvaises. En licence et master non professionnels, le confinement dû à la COVID19 a mis en évidence l’intérêt fondamental de l’enseignement présentiel en effectifs réduit. Dans les TD, « celui qui sait » formalise le concept à transmettre à l’apprenant qui reste passif. Les TP apportent une démarche active, la confrontation à la réalité et un aspect méthodologique ; ils sollicitent chez l’apprenant d’autres vecteurs que le son ou l’image. Nos TP comportent également, selon leur niveau, la sensibilisation aux règles d’éthique en expérimentation animale, au bien-être animal, aux conditions d’hébergement et de manipulation des animaux, aux choix des modèles, aux méthodes alternatives et à la rationalisation des groupes expérimentaux.
Bénéfices attendus
1) Pour les formations réglementaires initiales en expérimentation animales : les étudiants vont apprendre comment avoir confiance dans les animaux, à les observer dans leur comportement, les méthodes de contention les plus confortables pour les rongeurs, les techniques pour les injections, et les prises de sang de petits volumes. 2) Pour les formations à la chirurgie expérimentale, les étudiants vont apprendre les bases de la chirurgie, dont les sutures, l'aseptie en condition réelle, le suivi d'une opération et deux voies d'abord classiques. 3) Pour les licences professionelles, il s’agit de futurs techniciens en déjà titulaires d’un niveau applicateur d’expérimentation animale et d’un certificat de chirurgie expérimentale qui suivent une formation spécifique pour acquérir les compétences techniques de leur métier. 4) Les étudiants de master 2 sont un public international en 5e année de formation à la recherche dans les domaines de la biologie et de la santé et qui seront amenés, dans leur futur milieu professionnel, à concevoir, réaliser et superviser des recherches mettant en jeu des aspects liés à l’expérimentation animale. 5) Les étudiants de licence 3° années de biologie, durant les TP de Physiologie, appréhendent de façon concète la complexité du vivant et de son étude.
Procédures
TP Chirurgie : les rat ou souris auront une injection d'un antalgique puis une administration d'un anesthésique et une chirurgie qui peut durer plus d'une heure. TP" LPro télémétrie" : les rats subissent une contention inhabituelle de quelques minutes pour leur faire enfiler un gilet qui est non contraignant ensuite. TP "FC Contention et glycémie" : les rats subissent des contentions douces non contraignantes pendant 4 fois une heure, et un autre jour quatre gavages et 4 prises de sang de faible volume. TP "Manipulation et comportement de souris" : les souris subissent des contentions répétées de moins de 3 minutes minutes et au maximum 6 injections et 4 gavages, le tout réparti sur plusieurs jours. Ils participent aussi, un autre jour, à deux tests de comportement légers de quelques minutes sous l'effet d'un médicament psychoactif. Autres TP : les animaux auront une contention de moins d'une minute et une injection d'un antalgique puis une deuxième contention de moins d'une minute et une administration d'un anesthésique et ne seront pas réveillés.
Impact sur les animaux
TP Chir : les animaux ne seront réveillés que si l'opération s'est bien passée et ils seront désorientés pendant la période réveil, il peut rester une légère douleur malgré une double antalgie. TP" LPro télémétrie" : le gilet est peu contraignant. TP "FC Contention et glycémie" : les animaux peuvent être stressés par des contentions maladroites, ils peuvent souffrir pendant quelques minutes d'une injection mal faite après quoi les points limites seront appliqués (évènement possible mais rare). TP "FC Manipulation et comportement de souris" : les animaux subissent des contentions répétées de moins de 3 minutes et peuvent ressentir une légère douleur suite aux 6 injections et 4 gavages répartie sur plusieurs jours. Ils participent aussi, un autre jour, à deux tests de comportement légers de quelques minutes sous l'effet d'un médicament psychoactif. Les animaux peuvent être stressés par des contentions maladroites, ils peuvent souffrir pendant quelques minutes d'une injection mal faite (évènement possible mais rare). Tous les TP : les animaux pourraient commencer à se réveiller pendant une anesthésie (évènement théorique encore jamais observé, en raison d'observations intermédiaires de points limites et des mesures prévues).
Devenir
Tous les animaux impliqués dans des anesthésies sans réveil ne sont pas réveillés : soit des organes vitaux ont été prélevés pour des expériences ex vivo, soit l'intervention est délabrante et non compatible avec la survie. Pour les apprentissages de chirurgie les animaux ne sont réveillés que si l'opération s'est bien passée et pour 16h maximum car le risque d'une dégradation de leur état ensuite n'est pas nul. Les animaux qui subissent des contraintes légères de contention et d'injections sont gardés en vie et peuvent être réutilisés, ou adoptés.
Remplacement
Le recours à l’animal est une réalité de la recherche : les personnes qui doivent, dans leur démarche scientifique ou professionnelle, expérimenter avec des animaux doivent être formées : licences professionnelles, master, formations réglementaires. Dans le cadre de ces formations professionnelles, nous voulons qu’une part de cette formation soit faite de façon centralisée avec des bonnes pratiques, en complément du compagnonnage qui, utilisé exclusivement, cloisonnerait le savoir et ferait perdurer localement les habitudes – bonnes ou mauvaises. Les TP de chirurgie sont précédés de 4h de TP sur matériaux non vivants et sur des cadavres. L’usage de maquette ne nous permet pas d’amener les étudiants en filières professionnelles à un niveau de compétence suffisant en chirurgie. En licence et master non professionnels, le confinement dû à la COVID19 a mis en évidence l’intérêt fondamental de l’enseignement présentiel en effectifs réduits. Dans les cours et les TD, « celui qui sait » formalise le concept à transmettre à l’apprenant qui reste passif. Les TP apportent une démarche active, la confrontation à la réalité, un aspect méthodologique et sollicitent chez l’apprenant d’autres vecteurs que le son ou l’image. C’est pourquoi nous avons quelques TP en plus des habituels TD et cours.
Réduction
Les travaux pratiques sont très réduits en nombre durant les années de licence. 2 TP de physiologie en L3 pour des étudiants qui ont choisi la biologie comme horizon professionnel. Les TP ne sont plus nombreux que pour ceux qui se sont engagés dans un parcours professionnel impliquant l’usage des animaux : licence professionnelle ou formations réglementaires à l’expérimentation animale. Pour tous les TP sauf en filière professionnelle, n=1 et la répétabilité est abordée en comparant les résultats des différents apprenants. Nous favorisons au maximum l'utilisation d'animaux de réforme. La gestion de l'emploi du temps permet en plus de réutiliser la plupart des animaux qui ont eu des contraintes légères. S'il ne s'agit pas d’animaux de réformes dans les TP avec des contraintes légères, le nombre sera réduit de moitié, à 1 pour deux étudiants et non un pour un : moins d'animaux, manipulés par les deux groupes. Si ce sont des animaux de réformes, c’est le principe du raffiner qui sera appliqué.
Raffinement
Nous avons des points limites adaptés à chaque intervention ou manipulation. Au cours des TP, nous veillons à sensibiliser les étudiants et stagiaires aux effets du stress chez les animaux et à imposer l’ambiance de travail la plus calme possible. Plusieurs salles de travaux pratiques sont réquisitionnées lors des TP sur rongeurs vigiles afin de répartir animaux et stagiaires : cela évite que le stress d’un animal soit communiqué à l’ensemble de ses congénères. Les doses à injecter sont affinées en amont par une étude bibliographique, une seule dose est utilisée ce qui réduit le nombre d’animaux tout en permettant l’observation. Enfin, les drogues, les autres substances injectées et les tests comportementaux, ont été choisis pour être les plus bénins possibles tout en permettant d’observer le phénomène recherché. Les interventions se font sous anesthésie générale avec antalgie, maitrise de la température par tapis chauffant, réhydratation, et protection des yeux contre le dessèchement. Le réveil et le suivi post opératoire (de 16h maximum, soit jusqu'au lendemain matin) se font en cage individuelle, avec un élément de la cage d'origine comme enrichissement. La surveillance de signes cliniques, le taux d’encadrement, et l’application des points limites font qu’aucun animal ne peut se réveiller durant une anesthésie. Les effectifs d’animaux pour les TP avec des contraintes légères, permettent, lorsque nous avons des animaux de réformes, de diminuer par deux les contraintes subies par les animaux. Si ce ne sont pas des animaux de réforme, c’est le principe du réduire qui est appliqué. Certains de ces TP sont spécifiquement dédiés à l'enseignement des méthodes non invasives de mesures et des contentions les moins stressantes.
Choix des espèces
Des modèles mammifères sont nécessaires afin de pouvoir extrapoler à l’homme. Le rat et la souris sont les espèces de mammifères les plus fréquemment rencontrées dans la recherche fondamentale ou en R&D en industrie pharmaceutique, domaines futurs d’activité de nos étudiants en formation professionnelle. Nos autres TP de physiologie font appel au rat en raison de l’abondance littérature scientifique consacré à cette espèce. Les animaux achetés pour ces TP sont des jeunes adultes, pour des raisons de taille. Pour les animaux de réforme, sauf exceptions mentionnées dans le document complet, l’âge importe peu.
Modèle murin de consommation chronique d’alcool : Mise en place et étude d’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune hébergée seule jusqu'à dix-sept semaines pour mesurer sa consommation d'alcool. Rendues dépendantes, elles reçoivent des candidats médicaments par voie orale, intraveineuse ou intrapéritonéale, avec des prélèvements sanguins répétés puis, à la demande du client, une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le projet est présenté comme une prestation proposée à des laboratoires privés ou académiques, la finalité commerciale précédant l'apport scientifique. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun test ne rend compte du comportement sur un 'organisme vivant entier' et conclut au recours 'nécessaire' à la souris.
Objectifs
Selon l’OMS, le trouble lié à la consommation d'alcool touche environ 283 millions de personnes, à l’échelle mondiale. En France, il est estimé à 1.5 millions de personnes et environ 70 000 personnes meurent des conséquences directes ou indirectes de l’alcool. L’alcoolisme est donc un problème de santé majeur pour lequel aucun traitement satisfaisant n’existe actuellement. Le projet présenté ici a pour objectif de mettre en place un modèle murin de consommation d’alcool et d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments dans le cadre d’une prestation proposée à des laboratoires privés ou académiques. L’alcoolisme chronique, appelée alcoolodépendance, est le fait de présenter une addiction à l’alcool sous la forme d’une alcoolisation quotidienne et régulière tout au long de la journée pour maintenir un taux constant d’alcool dans le sang. Tout comme la drogue, la dépendance à l’alcool est définie comme le besoin d’en consommer pour maintenir un état auquel l’organisme s’est habitué. Cette dépendance s’installe souvent sur le long terme et de manière insidieuse. L’objectif de ce projet sera : 1) de mettre en place un test murin de consommation chronique d’alcool. 2) d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments, ayant déjà démontré leur pertinence sur la dépendance liée à la consommation d’alcool grâce à d’autres tests réalisés en amont de ce projet (in vitro, organoïdes ou autres). Actuellement, il existe plusieurs traitements de première intention, utilisables dès que possible après l'arrêt de la consommation d'alcool dans l'objectif de réduire l'appétence pour l'alcool et ainsi les risques de rechute. S’ils ont une efficacité démontrée, ils ont un effet d’une amplitude modérée et présentent de nombreux effets indésirables (nausées et/ou vomissements, céphalées, sédation ou insomnie, anxiété, nervosité...). Ce projet est donc pertinent pour le développement de nouveaux candidats médicaments pouvant améliorer la qualité de vie des personnes dépendantes de l’alcool.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mettre en évidence l’efficacité de potentiels nouveaux candidats médicaments dans un modèle murin d’alcoolisme. Les résultats obtenus, s’ils sont positifs, permettront la poursuite du développement de ces candidats médicaments dans la lutte contre l’alcoolisme.
Procédures
Chaque étude aura pour durée maximale 17 semaines. Des administrations seront réalisées sur animaux vigiles (1 à 2 minutes selon le type d’administration). La fréquence d'administration dépendra des caractéristiques pharmacologiques des candidats médicaments, au maximum 2 administrations par semaine pour la voie intraveineuse sur 9 semaines, 2 administrations par jours pour la voie orale sur 4 semaines ou 1 administration par jour pour les voies orales, intrapéritonéales, ou sous cutanées sur 9 semaines. Dans le cas d’une demande précise du donneur d’ordre, les animaux (à la fin de l’étude) peuvent être soumis à une perfusion intracardiaque (entre 5 et 20 min selon le débit de perfusion) sous anesthésie générale précédée d’une analgésie. Des prélèvements sanguins submandibulaires sur animaux vigiles (1 fois toutes les deux semaines maximum) ou intracardiaque sur animaux anesthésié (1 seule fois en fin d’étude) pourront être réalisés.
Impact sur les animaux
Les animaux sont stabulés individuellement dès leur arrivée dans nos locaux et jusqu’à la fin de l’étude soit au maximum 17 semaines. Ce mode d’hébergement est nécessaire à la mesure précise de la consommation individuelle d’alcool. La consommation d’alcool peut engendrer des signes comportementaux d'intoxication (non attendu dans le projet, les animaux ayant en permanence de l’eau à disposition). Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. Avant de réaliser des études dans le cadre de ce projet, nous nous assurerons auprès du demandeur que des études in vitro et/ou vivo auront été préalablement réalisées afin que les candidats médicaments soient administrés à des doses ne présentant pas de toxicité. Les futurs candidats médicaments peuvent avoir différents modes d’administration. Une administration (per os, sous-cutanée, intrapéritonéale) d’un candidat médicament entraîne une contention de l’animal qui peut induire un stress. Pour une administration Intraveineuse effectuée dans la veine caudale, les souris seront placées dans un tube de contention induisant un stress pour l'animal. Les animaux pourront être soumis à un prélèvement de sang submandibulaire réalisé sous anesthésie générale. Si le donneur d'ordre souhaite réaliser des études complémentaires sur les organes des animaux (ex : histologique), une perfusion intracardiaque sera réalisée sur des animaux anesthésiés et ayant reçu au préalable un analgésique.
Devenir
Afin d’effectuer des analyses complémentaires, l'ensemble des animaux sont soumis à la fin de l’expérience à des prélèvements sanguins ou d’organes.
Remplacement
L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier la consommation d’alcool. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, permettant de conclure de manière fiable. Etant donné la variabilité de la consommation d’alcool chez la souris, 12 animaux par groupe sont prévus afin d'assurer une analyse statistique pertinente. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.
Raffinement
Une attention particulière sera portée aux enrichissements du milieu pour réduire au maximum les effets de l’isolement. De plus, les animaux sont stabulés sur des portoirs conventionnels en cages transparentes, de cette façon les animaux peuvent voir les congénères des cages adjacentes et ne sont pas isolé olfactivement. Toutes les expériences seront réalisées après une période d’acclimatation de 14 jours. Une observation quotidienne sur des caractéristiques spécifiques (physiologie clinique, aspect général, comportement...) sera effectuée durant la période d’expérimentation par du personnel formé au soin. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs critères prédéterminés (repérés le plus précocement possible grâce à l'observation et à l'appui d'une grille du bien-être animal) sera mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est largement utilisée pour évaluer les effets de candidats médicaments et les données obtenues permettent de calculer de façon fiable les doses administrables à l'homme dans le cadre d’essais cliniques ultérieurs. Le choix de la souris C57bl/6 a été fait suite à une étude bibliographique approfondie qui démontre que cette lignée de souris à une appétence naturelle pour l’alcool. Elles consomment spontanément l’alcool qui leur est proposé contrairement à d’autres lignées (comme DBA/2 ou BALB/C) qui le rejettent. Cette préférence stable permet de modéliser la consommation volontaire, un aspect essentiel pour reproduire le comportement humain vis-à-vis de l’alcool. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux âgés de plus de 3 semaines et de 24 mois maximum. Les modèles sont susceptibles d’être utilisés pour l’étude de produits potentiellement actifs chez le jeune, l’adulte ou la personne âgée.
Impacts d’une exposition chronique périnatale à deux additifs alimentaires inorganiques riches en aluminium sur les fonctions intestinales, immunitaires, métabolique chez la souris de la vie in utéro à l’âge adulte.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
3 504 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées à l'aluminium dès la gestation à travers leur mère, elles subissent des gavages, des prises de sang et, pour une partie, une colite provoquée par un produit chimique entraînant diarrhées sanglantes et perte de poids. Le projet évalue l'effet d'additifs alimentaires sur l'intestin et le risque de maladies chroniques. Le porteur annonce une fourchette large, de 1 200 à 3 504 animaux, sans préciser ce qui fixe le nombre réellement utilisé.
Objectifs
Les études montrent que l’aluminium (Al) peut être neurotoxique et immunotoxique. L’alimentation constitue la principale source d’exposition : si les denrées brutes contiennent de l’Al d’origine naturelle, les aliments ultra‑transformés en apportent les plus fortes quantités via des additifs renfermant de l’Al comme composé principal ou impureté. L’autorité européenne de sécurité des aliments estime que les consommateurs les plus exposés à ces additifs dépassent la dose hebdomadaire tolérable de 1 mg d’Al/kg pc/semaine, tout en soulignant le manque de données toxicologiques spécifiques pour l’Al qu’ils contiennent, notamment en cas d’expositions précoces susceptibles d’engendrer des effets à long terme. Des particules d’Al ont été observées dans le placenta humain et le méconium, démontrant une exposition dès la vie fœtale. Après ingestion, l’Al s’accumule dans divers organes, dont le foie, acteur clé du métabolisme. Au niveau intestinal, des particules d’Al ont été détecté dans la barrière intestinale. Celle‑ci, constituée de l’épithélium, du microbiote et du système immunitaire intestinal, dépend de l’équilibre entre ces trois composantes pour maintenir l’homéostasie. Toute altération d’un de ces acteurs est associée au développement de maladies chroniques, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin et le diabète de type 2. Compte tenu de l’immunotoxicité de l’Al, nous posons l’hypothèse qu’une exposition dès la gestation à des additifs riches en Al pourrait perturber la barrière intestinale et favoriser l’émergence de ces pathologies. Ce projet vise à explorer chez la souris exposée dès la gestation à deux additifs riches en Al, i) la biodistribution de l’Al et ii) les impacts sur les fonctions métaboliques et intestinales des descendants. Des femelles seront exposées à ces additifs via l’alimentation pendant la gestation et la lactation. Après le sevrage, une partie des descendants poursuivra le même régime jusqu’à l’âge adulte afin d’analyser l’impact sur le métabolisme, la barrière intestinale et la susceptibilité à la colite.
Bénéfices attendus
Ce projet chez la souris nous permettra d’approfondir nos connaissances sur l’impact d’une exposition orale chronique à deux additifs contenant de l’Al sur la barrière intestinale et ses conséquences sur le développement de maladies chroniques comme les maladies inflammatoires chronique de l’intestin et le diabète de type 2. Les données obtenues dans ce projet réalisé à des doses d’exposition humaine permettront également d’aider les agences de sécurité alimentaire et les responsables des politiques publiques à formuler des recommandations sur les limites de teneur en Al des additifs alimentaires pour une utilisation sans danger pour la femme enceinte, le nouveau-né, l’enfant et l’adulte.
Procédures
Dans le cadre des mesures d'intolérance au glucose et de la perméabilité intestinale, les animaux recevront une administration orale de glucose ou d'un marqueur de perméabilité intestinale (geste rapide d'environ 15 secondes) et des prélèvements sanguins seront également réalisés au niveau de la queue, après application d'une crème anesthésiante locale (10 secondes/prélèvement). Des prélèvements de fèces seront aussi effectués deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans sciure pour permettre de récolter les fèces. Dans le modèle de colite, la dilution à 2% d'un composé chimique pendant 7 jours permettra d'induire progressivement une inflammation intestinale.
Impact sur les animaux
La réalisation des mesures d'intolérance au glucose ou de mesure de perméabilité seront génératrices d'inconfort notamment lié à la mise à jeun des animaux ainsi qu’à l'administration orale par gavage avec un risque possible de fausse route. L’administration de glucose entrainera une hyperglycémie transitoire nécessaire pour évaluer la tolérance au glucose des animaux. Les prélèvements de sang engendreront un stress lié à la contention et la piqure. Une fois les mesures terminées, une légère inflammation des tissus de la zone prélevée pourra se mettre en place. Enfin la procédure visant à provoquer une inflammation intestinale, entrainera une perte de poids plus importante que dans les autres procédures ainsi que des troubles intestinaux, avec apparition de selles molles ou de diarrhée, avec ou non présence de sang. Dans l’ensemble des procédures, les animaux seront exposés à des doses d’additifs correspondant aux niveaux d’exposition humaine pour lesquels aucun effet clinique n’a été rapporté à ce jour. Dans un contexte d’inflammation intestinale, les propriétés immunotoxiques et adjuvantes de l’aluminium laissent supposer que l’exposition aux additifs riches en Al pourrait aggraver la colite avec une perte de poids et une diarrhée plus importante. Enfin le prélèvement de fèces pourra générer un stress lié à l’isolement.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort et des prélèvements seront effectués post mortem pour des analyses biochimiques, histologiques et de biologie moléculaire pour évaluer l’impact d’une exposition orale chronique à deux additifs contenant de l’Al sur la barrière intestinale et ses conséquences sur le développement de maladies chroniques comme les maladies inflammatoires chronique de l’intestin, le diabète.
Remplacement
Les impacts directs des additifs alimentaires riches en aluminium sur l’épithélium intestinal, le microbiote et les cellules immunitaire peuvent être évalués par des approches in vitro ou ex-vivo à l’aide respectivement d’organoïdes intestinaux, de lignées cellulaires immunitaires ou de digesteurs artificiels. Ces approches sont actuellement mises en place pour ce projet et nous permettra d’obtenir des informations sur l’expression des gènes impliqués dans les fonctions de la barrières intestinales ou encore sur la composition et l’activité du microbiote. Toutefois elles ne permettent pas aujourd'hui de reproduire les échanges entre la mère et le fœtus ou la complexité des dialogues microbiote-intestin-foie-système immunitaire, ni même d’évaluer la distribution des particules d’Aluminium dans l’organisme.
Réduction
Nous avons conçu nos expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé à l’aide de test statistiques adapté. Sur l’ensemble du projet, au minimum 1200 animaux et au maximum 3504 animaux seront nécessaires.
Raffinement
Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue une heure avant les prélèvements sanguin comme préconisé par le fabricant. Lors du modèle d’inflammation intestinale une grille d'évaluation sera utilisée pour évaluer le degré de l’inflammation avec des points limites spécifiques appliqués. L’accès à l’alimentation et l’eau sera facilité en disposant un aliment hydraté dans une boite de petri directement sur la sciure de la cage. Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance, il sera retiré de l'étude et des soins adaptés pratiqués. Le cas échéant une euthanasie sera pratiquée par le responsable du projet sur les conseils du vétérinaire référent.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote, l’intestin, le foie. Les souris mâles et femelles seront utilisées à l’âge adulte afin qu'elles soient capables de procréer et les descendants seront utilisés avant la mise bas (fœtus), au sevrage ou à l’âge de 5 mois selon les procédures. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition périnatale ou à long terme sur les fonctions intestinales et métaboliques en prenant en compte un potentiel effet sexe.
Mistime :conséquences métaboliques et cognitives d’une désynchronisation des rythmes métaboliques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Nourries huit semaines d'un régime gras et sucré à des horaires décalés, elles passent des tests métaboliques et cognitifs, avec un prélèvement de sang derrière l'œil sous anesthésie locale. Le projet veut montrer qu'un désalignement des rythmes jour-nuit dérègle le métabolisme et la mémoire. Cette "preuve de concept" reste annoncée au conditionnel, quand les prélèvements et le régime imposé sont, eux, bien réels.
Objectifs
Les mammifères présentent un rythme circadien de 24 heures, permettant de synchroniser les fonctions biologiques aux variations environnementales, notamment l’alternance jour/nuit. Cette synchronisation repose sur l’interaction entre l’horloge centrale et les horloges périphériques, et est principalement régulée par la lumière. La régulation du métabolisme est fortement dépendante de cette coordination pour maintenir l’homéostasie énergétique. Cependant, la pollution lumineuse et/ou des rythmes alimentaires irréguliers peuvent perturber cette synchronisation, induisant un désalignement entre horloges centrale et périphériques. La lumière artificielle nocturne inhibe la sécrétion de mélatonine, perturbant le rythme veille/sommeil et les horloges métaboliques (foie, muscles). Ces désynchronisations augmentent le risque de troubles métaboliques, surtout lorsqu’elles sont combinées à une prise alimentaire durant la phase de repos. L’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien (HHT), régulateur des hormones thyroïdiennes (HT), joue un rôle central dans le fonctionnement du cerveau, le métabolisme et les rythmes circadiens. Les HT influencent la neurogenèse, le métabolisme énergétique et interagissent avec les horloges biologiques. Leur production est essentielle pour maintenir la rythmicité des horloges métaboliques. Des dérèglements métaboliques peuvent entraîner une inflammation chronique favorisant la neuroinflammation. Celle-ci altère la plasticité neuronale, affecte les fonctions cognitives et augmente le risque de neurodégénérescence. La flexibilité métabolique apparaît comme un facteur clé de prévention des déséquilibres métaboliques. Elle dépend des horloges circadiennes, qui optimisent les processus métaboliques selon le cycle jour/nuit. La flexibilité métabolique pourrait être améliorée en synchronisant la prise alimentaire avec le rythme circadien naturel d’utilisation des nutriments. Ainsi, des approches comme le Time-Restricted Feeding (TRF), ou alimentation à horaires restreints, limitant la prise alimentaire à certaines plages horaires, ont montré des effets bénéfiques sur la régulation métabolique, bien que les mécanismes impliqués restent à élucider. Grâce au TRF, nous étudierons à l’aide d’une souche de souris sensible à l’obésité induite, les effets métaboliques, neuroinflammatoires et cognitifs d’une désynchronisation, ainsi que le potentiel de la resynchronisation alimentaire avec le cycle jour/nuit à restaurer l’équilibre métabolique et cognitif.
Bénéfices attendus
Notre projet pourrait apporter la preuve de concept des effets néfastes des perturbations circadiennes sur la régulation du métabolisme et de leurs conséquences sur la cognition. La désynchronisation devrait exacerber les perturbations métaboliques et promouvoir la prise de poids et une augmentation de la neuroinflammation, associée à une diminution de la neurogenèse, pouvant conduire à des altérations cognitives. Toutefois, ces effets devraient être réversibles grâce à la resynchronisation. Ces résultats devraient appuyer l’hypothèse selon laquelle les désalignements circadiens affectent à la fois le métabolisme et la santé cérébrale, augmentant les risques de vieillissement précoce et de neurodégénérescence.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu’à une seule procédure, qui sera constituée de 4 actes : - alimentation riche en gras et en sucre (45 % des calories apportées par la graisse et 17% des calories apportées par du sucrose) restreinte dans le temps (soit à volonté, soit durant le jour, soit durant la nuit) pendant 8 semaines - caractérisation métabolique : prise de poids hebdomadaire, test de tolérance au glucose avec mesure de la glycémie après gavage à partir d'une goutte de sang prise à la queue+prise de sang pour dosages hormonaux, mesure de composition corporelle par bioimpédance, mesure de la production de chaleur par caméra thermique - évaluation de capacités cognitives avec différents tests de comportements - prélèvement sanguin avant euthanasie
Impact sur les animaux
Les animaux ne devraient pas subir d’effets indésirables majeurs, le régime HFHS étant équivalent à une nourriture occidentale. On attend une prise de poids variable entre les individus, mais qui selon notre expérience ne devrait pas dépasser un gain de poids supérieur à 7% par rapport au poids initial.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de procéder aux prélèvements des différents tissus nécessaires à nos analyses.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer le recours aux animaux car les études physiologiques portant sur des influences métaboliques ne peuvent être réalisées que chez des animaux vivants, dans un système intégré. Par conséquent, l’impact du régime HFHS et de la synchronisation/désynchronisation de la prise alimentaire avec le cycle circadien de l’animal sur ses capacités cognitives ne sera observable qu’en réalisant des tests de mémoire sur animaux vivants. De même, nous ne pouvons pas mimer la flexibilité métabolique in vitro ou ex vivo, il est donc nécessaire d’utiliser l’animal entier.
Réduction
Dix animaux par groupe seront utilisés (6 pour les prélèvements de tissus et 4 pour les analyses immunohistochimiques), un nombre estimé à partir de nos expériences passées avec ce type d’analyses et qui est le minimum pour garantir une exploitation et une puissance statistique des résultats obtenus. Un nombre d'animaux plus faible serait dommageable dans l'exploitation de nos données et contribuerait à utiliser des animaux inutilement. Ainsi, nous évaluons le nombre d’animaux à 30 souris pour ce projet. Pour ne pas perdre en puissance statistique, l’analyse des résultats obtenus sera effectuée à l’aide d’un test non paramétrique avec permutation qui utilise une méthode de calcul exact avec une estimation par Monte Carlo
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (gel lidocaïne (gel ophtalmique à 2 %) pour anesthésie locale pendant la prise de sang en rétro-orbital). Les animaux disposent de nourriture selon le rythme décrit (mais leur permettant d’avoir l’apport calorique nécessaire sur 24h) et de l’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de nid en plastique. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de celles-ci grâce à une surveillance attentive (points limites, énoncés ci-après) et des soins adaptés. Même si nous n’attendons pas d’effets délétères marqués suite à notre procédure qui est légère, les indicateurs habituels comme la prostration, détectée par les animaliers ou par l’expérimentateur, l’absence d’alimentation (la diminution des quantités de nourriture disponible entre deux nourrissages est vérifiée par pesée), des symptômes apparents de gêne ou de douleur (irritations, grattement, léchage) ou enfin des troubles du comportement (agressivité, sur-léchage, agitation anormale ou hyperréactivité) seront particulièrement suivis. Dans le cas où un ou plusieurs des symptômes cités varient de manière significative, l’animal sera dans un premier temps sorti de la procédure, et/ou euthanasié dans les cas les plus extrêmes. Une bonne maîtrise de la procédure et un suivi assidu des groupes expérimentaux doit prémunir de la survenue d’incidents de ce type. Tout signe d'atteinte du système nerveux central (inclinaison de la tête, spasmes, convulsions, troubles de l'équilibre) entraînera systématiquement le retrait de l'animal de la procédure et son euthanasie.
Choix des espèces
Le modèle biologique choisi est la souris. Les connaissances accumulées par la communauté scientifique sur les souris, et particulièrement sur les C57Bl6/J dans les modèles d’obésité, ont permis d’identifier de nombreux mécanismes physiologiques impliqués dans le maintien de la balance énergétique et de valider des tests comportementaux permettant de mesurer les capacités mnésiques des souris. Tous les protocoles utilisés dans ce projet de recherche ont été optimisés et validés pour la souris, avec un contrôle maximum des paramètres vitaux. Nous utiliserons des animaux adultes (âgés de plus de 8 semaines au début de l’expérience), afin que les résultats ne soient pas faussés par la prise de poids induite par la croissance des animaux s’ils sont trop jeunes.
Évaluation de l’efficacité thérapeutique de différentes stratégies de thérapie génique dans le modèle murin de la maladie de Pelizaeus Merzbacher.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Génétiquement modifiées pour reproduire une maladie de la myéline, une partie des 376 souris développe tremblements, troubles moteurs puis convulsions et meurt vers l'âge de trois mois. Elles vont être utilisées dans des procédures allant jusqu'à un niveau de souffrance sévère pour 96 d'entre elles, toutes tuées à l'issue. Après une injection de thérapie génique sous anesthésie, elles passent des tests moteurs et une IRM de deux heures. Le porteur définit des points limites, mais garde une partie des animaux au-delà de deux mois pour suivre la survie, jusqu'à l'aggravation de la maladie.
Objectifs
La maladie de Pelizaeus Merzbacher est un défaut héréditaire de formation de la myéline (membrane isolante permettant le transport du message nerveux dans les neurones) du système nerveux central. Cette maladie se caractérise chez les patients de sexe masculin par une altération précoce du développement psychomoteur (inférieur à 6 mois de vie). Au cours des premières années de myélinisation active, le manque de force musculaire est associé à des signes neurologiques progressivement modifiés par la maturation du système nerveux. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement pour cette pathologie. L’objectif de ce projet sera de tester sur un modèle animal de la pathologie (souris génétiquement modifiées) différentes stratégies thérapeutiques basées sur une approche de thérapie génique.
Bénéfices attendus
La maladie de Pelizaeus-Merzbacher est une maladie génétique rare de la famille des leucodystrophies. Sa fréquence est de 1 pour 100 000 naissances. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour cette pathologie. Ce projet pourrait permettre d’établir la preuve de concept de l’efficacité d’une des approches de thérapie génique proposées, de valider la dose optimale pour un traitement afin de mener un projet de plus grande envergure à plus long terme. Ainsi ce projet pourrait contribuer à proposer un essai thérapeutique chez les enfants souffrant de la maladie de Pelizaeus Merzbacher et pouvoir ainsi proposer un traitement chez l’Homme.
Procédures
Sur un total de 376 animaux, 312 animaux recevront une injection sous anesthésie générale (durée 5 min au total, une fois) et 64 serviront de contrôles non injectés Une partie d’entre eux (280) participera ensuite à 3 tests comportementaux afin d’évaluer les déficits locomoteurs. 2 sessions de tests seront réalisées (à 1 mois puis 2 mois) et pour chaque session les tests seront répartis sur 3 jours. Nous aurons un jour avec un test évaluant la motricité (3 essais, 4 minutes maximum par essai), puis un jour avec un test évaluant la mobilité générale (2 minutes par test, 1 essai) et enfin un jour avec un test d’évaluation de la force musculaire (2 minutes par test environ, 1 essai). Une partie de ces animaux aura ensuite un examen d’imagerie par résonance magnétique sous anesthésie générale (une fois, 2h maximum). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les prélèvements d’intérêt.
Impact sur les animaux
La lignée de souris génétiquement modifiée utilisée dans le projet présentera un phénotype dommageable chez certains animaux se traduisant par l’apparition de tremblements dès 12 jours, de troubles moteurs dès 4-5 semaines et des crises de convulsion à partir de 2 mois entrainant leur décès vers l’âge de 3 mois. Les troubles moteurs pourront engendrer un stress et de potentielles pertes de poids pour l’animal. Les anesthésies générales réalisées pour administrer la thérapie génique et pour l’imagerie par résonance magnétique pourront engendrer des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de difficultés cardiaque et respiratoire. L’injection de la thérapie génique sera associée à des risques d’inconfort au niveau de la zone d’injection, de saignement après injection et un risque rare de lésion oculaire. Les tests comportementaux pourront générer un stress en lien avec le changement d’environnement et le test en lui-même.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont réalisés post-mortem pour pouvoir répondre à notre objectif scientifique
Remplacement
À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la maladie de Pelizaeus Merzbacher. Nous avons donc besoin de modèles animaux vivants permettant de reproduire la maladie pour l’étudier et surtout pour évaluer l’effet bénéfique d’approches thérapeutiques telles que la thérapie génique. Un modèle animal de choix existe déjà pour étudier cette maladie, il s’agit d’une lignée de souris génétiquement modifiée qui reproduit avec une bonne fiabilité la majorité des symptômes décrits chez les patients.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire. De ce fait un nombre de 20 à 24 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de prendre en compte la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 376 souris sera nécessaire pour ce projet. De plus nous réaliserons ce projet par étape nous permettant de n’utiliser que le nombre strictement nécessaire d’animaux, notamment si la première étape ne permet pas d’obtenir des résultats concluants les étapes suivantes en seront pas initiées. L’ensemble des résultats sera analysé à l’aide des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’eau et de croquettes à volonté, ainsi que d’un enrichissement de leur environnement composé à minima d’un carré de coton pour nidifier et d’un bâtonnet de bois à ronger. Ils seront observés quotidiennement. En cas d’anomalie celle-ci sera transmise à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à notre équipe afin de mettre en place une prise en charge rapide et adaptée pour l‘animal. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux. Une partie des animaux utilisés dans le projet présentera un phénotype dommageable, pour sa prise en charge nous faciliterons leur accès à la nourriture dès le sevrage en leur mettant à disposition des croquettes directement en fond de cage voir de l’eau gélifiée en supplément si nécessaire. Tous les animaux seront pesés à minima une fois par semaine, puis 2 fois par semaine pour ceux conservés au-delà de 2 mois. A partir de cet âge de 2 mois un suivi quotidien pour chaque animal avec un test de retournement permettra de valider son autonomie à pouvoir se déplacer et s’alimenter. L’administration de la thérapie génique et l’imagerie par résonance magnétique seront réalisées sous anesthésie générale afin de réduire le stress et bénéficier d’une bonne immobilité de l’animal. Nous prendrons en charge les risques associés à ces anesthésies en maintenant la température des animaux tout au long de leur anesthésie (chambres d’induction et de réveil chauffées, tapis chauffant), en appliquant un gel oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire ou inconfort post-injection de la thérapie (appliqué après l’administration de la thérapie), et en surveillant visuellement la profondeur de l’anesthésie pour adapter si nécessaire le pourcentage d’anesthésique à chaque animal. Pour les tests comportementaux les animaux bénéficieront d’une période d’habituation de 30 minutes à la pièce d’expérimentation avant chaque test. Les tests seront répartis sur 3 jours afin de laisser un temps de repos aux animaux entre chaque test. Pour le tests nécessitant 3 essais les animaux bénéficieront d’une période de repos de 30 minutes entre chaque essai.
Choix des espèces
La souris est une espèce largement utilisée pour modéliser les pathologies humaines. Son génome est bien connu et des outils sont disponibles pour le modifier. Ainsi, une lignée de souris génétiquement modifiées existe déjà pour modéliser la maladie de Pelizaeus Merzbacher. Celle-ci permet de reproduire la majorité des symptômes rencontrés chez les patients et nous permettra donc d’évaluer l’efficacité thérapeutique de notre stratégie de thérapie génique. Les souris seront utilisées juste après leur sevrage et analysées jusqu’à l’âge de 2 mois pour la majorité avant l’apparition des symptômes invalidants. Seul un groupe de souris permettant d’apprécier la survie sur le meilleur de nos traitements sera gardé au-delà de l’âge des 2 mois avec suivi attentif. Le choix de l’âge d’injection est justifié du fait de la présence des premiers signes de la maladie sans pour autant que celle-ci soit trop avancée. Le choix de l’âge de l’euthanasie à deux mois permet d’une part de pouvoir voire un effet moléculaire optimal de la thérapie génique administrée mais également de constater ces effets avant la progression de la maladie. En effet prélever les animaux en fin de vie, quel que soit leur âge ne nous montrerait que l’état final de l’animal avant la mort lié à la progression de la maladie, c’est-à-dire que tous les animaux en fin de vie devraient avoir les mêmes caractéristiques finales.