Rongeurs
Travaux Pratiques Master 1ère année – Bases neurobiologiques des comportements et capacités d’apprentissage
- Enseignement supérieur
Pour un travaux pratiques de master, 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection d'éthanol dans l'abdomen puis passe deux tests comportementaux, non pour produire des connaissances mais pour familiariser des étudiants aux techniques d'expérimentation. Les animaux proviennent d'un autre projet et, après mise à mort, leurs cadavres sont conservés pour de futurs travaux pratiques de physiologie. Le porteur décrit un enseignement qui prépare les étudiants se destinant à la recherche recourant à l'expérimentation animale.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'acquérir des connaissances concernant de grands répertoires comportementaux tel que la mémoire dans le respect de la réglementation et l’éthique en matière d’expérimentation animale. Ces objectifs peuvent être atteints en pratiquant différentes techniques et procédures d’exploration du comportement chez l’animal, ce qui est d’ailleurs plébiscité souvent par les professionnels lorsque nos étudiants sont en stage en entreprise ou en laboratoire. Les étudiants de Master ont généralement suivi un parcours adapté à la pratique de l’étude des comportements, avec notamment en Licence, l’introduction aux notions d’éthique animal et réglementations, d’approches de remplacement (travaux pratiques virtuels) ; ce projet représente donc un aboutissement de parcours de formation.
Bénéfices attendus
Dans cette enseignement, ce projet permettra aux étudiants qui envisagent de poursuivre leurs études dans le domaine de l'expérimentation animale, de mobiliser les concepts fondamentaux et de se familiariser avec des approches typiques des sciences du comportement pour traiter une problématique du domaine, d'analyser et synthétiser des données en vue de leur exploitation pour développer une argumentation avec esprit critique. Ce projet permettra également de sensibiliser les étudiants au respect des principes d’éthique, de déontologie et de responsabilité en matière d’expérimentation avec des animaux vivants. De plus, de façon secondaire dans les objectifs, les effets de l’éthanol sur les individus représenteront un aspect pédagogique non négligeable.
Procédures
Contention brève (quelques secondes) suivie de l'injection dans l'abdomen avant évaluation des effets de la substance administrée sur le comportement des animaux. Passage de deux tests comportementaux qui durent chacun au maximum 5 minutes.
Impact sur les animaux
Le stress modéré lié à la manipulation des animaux lors des travaux pratiques d'étude du comportement. Douleurs liées à la piqûre lors de l’injection abdominale.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mrot et les cadavres conservés en vue d'une utilisation lors de travaux pratiques de physiologie futurs.
Remplacement
Cet enseignement de niveau master est pertinent pour les étudiants désirant poursuivre leurs études dans les domaines de la recherche scientifique en Biologie ayant recours à l’expérimentation animale. Il s’agit d’un enseignement original et unique dans le cursus qui permet aux étudiants de se former à l'expérimentation animale dès leurs années de licence en s’initiant à des pratiques couramment utilisées lors de procédures expérimentales (approches virtuelles de remplacement + démonstrations par les enseignants) puis de master avec ce projet mettant en oeuvre l'utilisation d’animaux dans une étude comportementale (mise en œuvre in vivo). Ainsi, lors de leur cursus de Licence, les étudiants ont déjà pu se familiariser avec les méthodes de remplacement telles que la simulation; aussi ce projet est très complémentaire avec une approche in-vivo.
Réduction
Les animaux utilisés dans ce projet proviendront d'un autre projet dispensé par ailleurs. Cet enseignement qui est proposé depuis plusieurs années connaît un succès réel et comporte au maximum 2 groupes de travaux pratiques de 16 étudiants chacun. Pour assurer le bon déroulement des séances pratiques et afin de mieux faire respecter le bien-être animal, chaque groupe est divisé en quatre sous-groupes de 4 étudiants chacun. Chaque groupe est encadré par 2 enseignants-chercheurs certifiés en vertu des recommandations de l‘inspection vétérinaire. En fonction des disponibilités d’animaux redirigés de précédentes études, 3 animaux seront utilisés par sous-groupe, soit un total de 12 souris par groupe de travaux pratiques, soit un total de 24 souris par année universitaire.
Raffinement
Pendant toute la durée du projet, les animaux seront traités selon la réglementation par du personnel compétent, ils seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs (enseignants intervenant dans le projet) ou le zootechnicien de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Les animaux seront hébergés avec un enrichissement des conditions d'hébergement avec des buchettes de bois pour satisfaire leur besoin de ronger et des tunnels en carton pour leur permettre de se cacher et d'explorer leur environnement. L’estimation de l’inconfort et la douleur sera mise en place avec une surveillance quotidienne et l'application des points limites lors de l’hébergement (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, déshydratation, yeux et abdomen creux, etc…). Tous ces paramètres concernent la phase d’hébergement à l’animalerie. Des points limites plus spécifiques sont adoptés lors de la procédure envisagée (prostration dans un secteur du labyrinthe, difficulté à se déplacer dans les dispositifs, difficulté pour se déplacer dans l’eau dans la piscine de Morris avec un risque d’épuisement, etc …).
Choix des espèces
La souris est une espèce animale couramment utilisée dans les projets de formation pour ses caractéristiques physiologiques et comportementales bien décrites. Ces animaux présentent donc toutes les qualités requises par rapport aux exigences qui sont ont imposées par ce type d’enseignement. D’autre part, les étudiants ont déjà pu suivre lors des années précédentes des démonstrations mettant en jeu des espèces rongeurs lors d'autres travaux pratiques. En fonction des disponibilités, des souris adultes âgés de plus de 10 semaines provenant d’autres projet seront utilisées.
Optimisation de la vaccination à ARNm : efficacité de transfection des nanoparticules lipidiques selon différentes voies d’injection
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Jusqu'à douze anesthésies à l'isoflurane et douze injections par animal pour l'imagerie: 3250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections d'ARN messager encapsulé dans des nanoparticules par différentes voies, puis des séances d'imagerie répétées, avec possible perte de poids et réaction immunitaire. Le projet teste de nouvelles formulations vaccinales à ARN messager avant un éventuel passage chez l'humain. Tous les animaux sont tués pour mesurer l'efficacité de transfection et d'immunisation.
Objectifs
Suite à l’émergence de vaccin à acides nucléiques, l’ARN messager (ARNm) ouvre de nouveaux horizons thérapeutiques dans le développement de vaccins pour diverses pathologies tels que les maladies infectieuses, les cancers, les maladies auto-immunes, les maladies génétiques… Ils sont d’autant plus importants que c’est une technologie rapide à déployer qui pourra nous aider à faire face aux menaces sanitaires émergentes. Le principe repose sur la délivrance de molécules d’acide nucléique (ARNm), codant pour une protéine ou un fragment protéique, dans une cellule cible et d’utiliser la machinerie cellulaire pour produire la protéine d’intérêt. Cet ARNm peut coder pour une protéine fluorescente, une enzyme, un antigène viral ou bactérien dans le cas de maladies infectieuses ou encore une protéine spécifique pour rétablir une voie modifiée lors de maladie génétique. Les avantages de cette technologie sont nombreux incluant une rapidité de développement, la modularité des cibles, l’efficacité immunitaire et la sécurité puisque l’ARNm ne s’intègre pas dans le génome. De plus, il n’y a aucun risque infectieux. En revanche, l’ARNm est une molécule fragile qui se dégrade facilement. S’il est injecté seul dans l’organisme, il sera éliminé par notre propre système avant d’avoir rempli sa mission. Il faut donc le protéger. De nombreux vecteurs peuvent être utilisés pour protéger et délivrer l’ARNm. Ils agissent comme des bulles protectrices pouvant transporter l’ARNm jusqu’à sa cible. Dans ce contexte, notre laboratoire a fait le choix de développer des nanoparticules non virales lipidiques et/ou polymériques. Notre projet s’inscrit dans une démarche globale pour notre unité, qui vise à développer et accélérer des projets d'innovation thérapeutique et fournir une expertise en technologies ARNm. Cela comprend la mise en place et le test de nouveaux vecteurs ainsi que l’évaluation de séquences d’ARNm spécifiques conçus au laboratoire. À cette fin, ces approches doivent être testées dans des modèles complexes ; nous avons donc choisi d’utiliser des modèles murins. Objectif 1 : Evaluer l’efficacité de vecteurs non viraux pour l’encapsulation. Objectif 2 : Evaluer l’immunogénicité des nanoparticules et des séquences d’ARNm dans un organisme complexe. L’enjeu est de maximiser l’efficacité de nos formulations tout en minimisant les effets indésirables possibles dans le but de passer par la suite à des études cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
Actuellement il existe moins d’une dizaine de formulations d’ARNm thérapeutique acceptées et validées par les instances chargées de la surveillance et de l’autorisation des produits pharmaceutiques. Ce projet vise à concevoir de nouvelles formulations innovantes et souveraines, à la fois sûres et efficaces, évaluées dans des modèles complexes représentatifs de conditions physiologiques réalistes. Le but à court terme est d’identifier des formulations efficaces et non immunogènes qui permettent de produire notre protéine d’intérêt et de perfectionner nos techniques de fabrication. Le but à long terme est de permettre l’émergence de nouvelles techniques de fabrication et des formulations adaptées à différents types de pathologies ou de maladies émergentes. Les demandes en traitement à base d’ARNm sont en pleine expansion, il y a donc un besoin croissant de trouver de nouvelles formulations.
Procédures
Procédure 1 : Chaque animal recevra au maximum : 2 injections d’ARNm avec une voie d’injection choisie (IM, ID, SC, IV, IN) 12 injections de substrat Luc en IP (1/jour pendant 5 jours puis 2x/semaine pendant 3 semaines) 12 Anesthésies générales à l’isoflurane de 15 min (1/jour pendant 5 jours puis 2x/semaine) 1 prélèvement sanguin sur la veine caudale sur animal vigile 1 prélèvement sanguin en rétro-orbital sous anesthésie isoflurane Procédure 2 : Chaque animal recevra au maximum : 2 injections d’ARNm avec une voie d’injection choisie (IM, ID, SC, IV, IN) 2 prélèvements sanguins sur la veine caudale sur animal vigile 1 prélèvement sanguin en rétro-orbital sous anesthésie isoflurane
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une formulation par type d’injection choisi (intraveineuse (IV), intramusculaire (IM), intranasale (IN), sous cutanée (SC) ou intra-dermique (ID)). Les séances d’imagerie, d’environ 15 min, seront répétées et limitées à une fois par jour, avec injection de substrat à la luciférase en intrapéritonéale (IP). A la suite des injections, les animaux pourront avoir une perte de poids transitoire dûe au stress que peuvent engendrer les gestes techniques, une légère douleur au point d’injection pendant quelques heures, et une réaction immunitaire pouvant entrainer une baisse d’activité, modification du pelage, perte de poids modérée suivant l’antigène testé.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses pour évaluer l’efficacité de transfection et d’immunisation post traitement.
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux pour tester l’effet des composés dans un contexte physiologique. Les méthodes d’études in vitro sont limitées par des éléments importants tels que la complexité des différents organes, leur architecture qui organise les relations entre ces populations cellulaires, ou encore la distribution des formulations dans les organes qui peut être différente selon les voies d’injections testées. Il est donc nécessaire d’évaluer la mise en jeu des différents éléments dans un système complexe comme le modèle murin. Aucun modèle alternatif ne peut remplacer un organisme entier pour ce type de projet.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, des études in vitro sont réalisées en amont pour valider l’efficacité et l’innocuité des formulations. Seules les formulations les plus efficaces et biocompatibles sont testées in vivo. Le nombre d’animaux pour chaque procédure est fixé au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables, avec une puissance de 80 %, sur la base d’expériences antérieures. La première injection permet de suivre la cinétique d’expression chez le même animal, et la seconde sert au prélèvement des organes, réduisant ainsi le nombre total d’animaux. Pour l’objectif 2, le nombre de candidats est déjà limité et une seule voie d’injection sera choisie en se basant sur les résultats obtenus lors de la première procédure.
Raffinement
Une grille de score clinique, conçue spécifiquement pour cette procédure avec des points de contrôle spécifiques et pertinents, sera tenue à jour pour les animaux en cours d'expérimentation. Si des animaux présentent des signes de souffrance, un analgésique sera administré. Un analgésique local sera appliqué avant les injections intra-musculaires. De l’isoflurane sera utilisé comme anesthésiant pour limiter la douleur du geste réalisé lors des injections en intramusculaire, et permettre un meilleur contrôle de la respiration de la souris lors des injections intranasales. Lors de l’imagerie par bioluminescence, les animaux seront positionnés sur tapis chauffant pour limiter la perte de température corporelle. A chaque utilisation de l’isoflurane, les animaux seront observés jusqu’au réveil complet. Pour les injections intraveineuses, les souris seront mises en chambre chauffée pour augmenter légèrement leur température corporelle et permettre la dilatation des vaisseaux et limiter leur stress. A la suite des injections d’ARNm, de la nourriture humide sera déposée dans le fond des cages pour permettre un meilleur accès à la nourriture et garder une hydratation optimale.
Choix des espèces
La souris sera utilisée comme modèle d’études pour plusieurs raisons : - La génétique de la souris est bien connue, entièrement séquencée et proche de celle de l’être humain. Nous allons être amenés à tester différentes séquences d’ARNm et la machinerie cellulaire qui prend en charge l’ARNm est très similaire entre l’homme et la souris. - Les études menées sur les vaccins à ARNm sont basées sur des études murines. Nous pourrons donc comparer les résultats obtenus avec ceux de nos confrères. - Nous utiliserons des souris Ai9 capables de produire une protéine fluorescente uniquement dans les cellules qui exprimeront les vecteurs contenant une séquence ARNm codant pour la protéine Cre recombinase, ce qui n’existe pas dans d’autres modèles animaux. - La finalité de cette étude est de passer à un stade clinique. La souris est un mammifère qui présente une physiologie comparable à l’espèce humaine, il nous sera plus facile de comparer les réponses immunitaires obtenues et d’étudier la bio-distribution des vecteurs et séquences utilisées. Pour la procédure 1, Nous utiliserons des souris au stade adulte. Elles seront injectées à partir de 8 semaines et jusqu’à 16 semaines afin de garantir un système immunitaire mature et un processus de développement corporel terminé. Pour la procédure 2, les souris seront réceptionnées à l’âge de 5 à 6 semaines. Les injections se feront sur les souris âgées de 7 semaines. En effet, les procédures de vaccination avec deux doses espacées d’un mois sont longues, ce qui justifie de démarrer à un âge jeune, le vieillissement étant connu pour impacter la réponse immunitaire. Cependant, il est important d’attendre 6 semaines minimum pour avoir un système immunitaire mature.
Gestion de la production de 2 lignées de souris transgéniques (BRGSA2 DR2 et NBSGW ) utilisées comme modèle en thérapie génique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
2756 souris de deux lignées fortement immunodéprimées vont être élevées sur site, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger limitées à une biopsie de l'oreille pour génotypage. Leur déficit immunitaire les rend très sensibles aux infections, au stress et aux variations d'environnement. L'élevage vise à fournir des modèles dits humanisés pour des études de thérapie génique et de biosécurité, que le porteur présente comme "indispensables" et non remplaçables par une méthode in vitro. Sur le total, 2024 animaux sont destinés à d'autres projets et 96 gardés pour la reproduction, 636 étant tués comme "excédentaires".
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’assurer l’élevage sur site de deux lignées spécifiques de souris, nommées BRGSF A2-DR2 et NBS GW, largement utilisées en recherche biomédicale, notamment pour l’étude des greffes de cellules humaines et le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Au sein de la plateforme de recherche préclinique, ces modèles murins sont couramment employés dans des études de biodistribution et de biosécurité. Ces travaux visent à vérifier l’innocuité des thérapies et à évaluer la distribution du transgène dans l’organisme. Ces études réglementaires sont essentielles pour l’obtention de l’autorisation de passage vers le développement clinique. Notre plateforme a d’ores et déjà réalisé plusieurs études de ce type et a contribué au passage en essai clinique d’un traitement de la drépanocytose par thérapie génique. Le présent projet a pour objectif l’élevage sur site des lignées de souris nommés BRGSF A2-DR2 et NBSGW. En assurant un élevage éthique, contrôlé et scientifiquement justifié, il contribue à la fois à l’excellence de la recherche et au respect du bien-être animal.
Bénéfices attendus
L’élevage sur site des lignées de souris BRGSF A2-DR2 et NBSGW présente de nombreux avantages, tant pour la qualité de la recherche scientifique que pour l’organisation des projets et le respect du bien-être animal. Ces souris, génétiquement modifiées de façon très ciblée, sont indispensables à la création de modèles dits « humanisés », qui permettent d’étudier le fonctionnement du système immunitaire humain au sein d’un organisme vivant. Elles jouent un rôle clé dans les travaux portant sur la thérapie génique, l’immunothérapie et les greffes cellulaires. En raison de leur déficit immunitaire marqué, ces animaux sont particulièrement sensibles aux infections, au stress et aux variations de leur environnement, en particulier lors du transport. Leur approvisionnement via les circuits habituels est donc complexe, avec des délais souvent longs et imprévisibles, parfois incompatibles avec les contraintes des programmes de recherche. La mise en place d’un élevage local permet de sécuriser la disponibilité des animaux tout en améliorant leurs conditions de vie et leur adaptation à l’environnement d’hébergement. La production sur site garantit également une disponibilité continue, facilitant la planification et la conduite des projets dans de meilleures conditions. D’un point de vue éthique, cette organisation limite les transports, sources de stress et de pertes animales, et permet d’ajuster la production aux besoins réels, réduisant ainsi le gaspillage. Cette démarche s’inscrit pleinement dans le respect de la réglementation encadrant l’utilisation des animaux à des fins scientifiques, en contribuant à la réduction du nombre d’animaux utilisés et à l’amélioration de leurs conditions de vie. Enfin, en centralisant l’élevage au sein d’une structure spécialisée et rigoureusement encadrée, ce projet renforcera l’autonomie des équipes de recherche et soutiendra le développement de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Aucun prélèvement biologique (sang, tissu ou organe) n’est prévu chez les animaux BRGSF A2 DR2. Concernant les souris NBS GW, des biopsies réalisées en bordure du pavillon de l’oreille pourront être effectuées, de manière non systématique, exclusivement à des fins de génotypage : - Âge : entre 10 et 21 jours (avant le sevrage), conformément aux recommandations réglementaires - Méthode : biopsie de ≤ 2 mm à l’extrémité distale du pavillon de l’oreille, réalisée à l’aide d’une lame stérile ou de ciseaux adaptés, suivie de l’application d’un antiseptique local - Fréquence : une seule intervention par animal, et uniquement pour certains individus - Nombre d’animaux concernés : 1 378 souris NBS GW Aucun autre prélèvement sanguin ou tissulaire n’est prévu chez les souris NBS GW dans le cadre de cette procédure.
Impact sur les animaux
En raison de leur phénotype fortement immunodéficient, les souris BRGSF A2-DR2 et NBSGW présentent une sensibilité accrue aux agents pathogènes opportunistes, susceptible d’entraîner une morbidité plus élevée en cas de défaillance du confinement sanitaire.
Devenir
Au terme des 5 ans : - 2 024 souris (mâles et femelles) seront conservées pour être inclus dans les projets applicatifs - 96 animaux (36 mâles et 70 femelles) seront gardés pour le maintien des lignées. - 636 animaux excédentaires seront euthanasiés de manière éthique par du personnel formé, selon les méthodes conformes à la réglementation en vigueur.
Remplacement
Le recours à un modèle animal est indispensable au regard de la nature des études précliniques envisagées qui reposent sur l’interaction de cellules humaines avec un environnement immunitaire in vivo. À ce jour, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire de manière fiable et fonctionnelle la complexité de ces interactions. Les souris BRGSF A2-DR2 et NBSGW constituent des modèles hautement pertinents pour l’étude des réponses immunitaires humaines dans un cadre expérimental contrôlé. Néanmoins, chaque fois que cela est possible, des approches complémentaires in vitro (cultures cellulaires, co-cultures, organoïdes) ainsi que des outils de modélisation in silico seront mis en œuvre en amont ou en parallèle, afin de limiter le recours aux animaux conformément aux principes de remplacement et de réduction. À titre d’exemple, l’un des projets applicatifs rendus possibles par cet élevage concerne la réalisation d’études de biosécurité. Avant toute application clinique, il est indispensable d’évaluer la biodistribution du matériel génétique administré lors d’une thérapie génique et de vérifier notamment l’absence d’intégration dans des régions génomiques à risque oncogène ou dans les gonades. Seul un modèle in vivo permet actuellement de répondre à ces questions, aucun système expérimental alternatif ne reproduisant de manière suffisamment intégrée et fonctionnelle la complexité d’un organisme entier.
Réduction
Ces deux lignées figurent parmi les modèles les plus utilisés et reconnus dans la recherche en thérapie génique. Leurs modalités de production sont bien établies et largement documentées. Forts de notre expérience et de l’historique de production du laboratoire, nous mettrons en œuvre des stratégies d’accouplement raisonnées et ajustées aux besoins expérimentaux. Les souris femelles sont privilégiées pour les études de développement en thérapie génique car, d’après nos données historiques, elles se montrent plus permissives à la greffe de cellules humaines (humanisation) et permettent une meilleure reconstitution des sous-populations de cellules hématopoïétiques. Toutefois, afin de limiter le nombre d’animaux surnuméraires, les souris mâles comme femelles pourront être intégrées dans d’autres projets autorisés lorsque cela est scientifiquement pertinent.
Raffinement
L’ensemble des pratiques d’élevage et de manipulation est spécifiquement conçu afin de limiter le stress, la douleur et toute forme de souffrance potentielle, en tenant compte des particularités liées à l’immunodéficience des souches BRGSF A2-DR2 et NBSGW. Les effets indésirables potentiels associés à cette immunodéficience sont anticipés et maîtrisés grâce à un environnement d’élevage strictement contrôlé (isolateurs) et à des pratiques fondées sur notre longue expérience dans la gestion de ces deux lignées. Dans les conditions prévues par ce projet, aucun phénotype dommageable ne devrait s’exprimer.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence en biologie et en médecine expérimentale, en raison de sa taille, de son cycle de reproduction court, de sa facilité de manipulation et, surtout, de la disponibilité de nombreuses lignées génétiquement modifiées. Les lignées BRGSF A2-DR2 et NBSGW ont été spécifiquement développées pour étudier le système immunitaire humain chez la souris. En effet, ces animaux sont fortement immunodéficients, ce qui permet une excellente prise de greffe de cellules humaines (humanisation) ainsi qu’une reconstitution efficace des sous-populations hématopoïétiques humaines. Ces caractéristiques en font des modèles particulièrement adaptés aux études de biodistribution et de biosécurité. Ces lignées ont également été conçues pour permettre l’étude des interactions et des réponses immunitaires humaines dans le cadre de la thérapie génique. Elles intègrent des transgènes humains — notamment HLA-A2 et TCR DR2 pour les souris BRGSF A2-DR2 — indispensables pour reproduire certaines réponses immunitaires spécifiques in vivo, non modélisables chez d’autres espèces. L’utilisation de ces deux souches est validée et largement reconnue par la communauté scientifique pour les applications précliniques, ainsi que par les agences réglementaires telles que l’ANSM. Dans notre laboratoire, leur emploi dans des études de biosécurité a déjà contribué au passage en phase clinique de plusieurs thérapies géniques, notamment dans le traitement de la drépanocytose.
Evaluation de nouvelles approches thérapeutiques contre le virus de l’hépatite B
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
8500 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, soit environ 146 composés testés chaque année. Chaque animal peut recevoir une injection du virus de l'hépatite B, des administrations quotidiennes de composés pendant 28 jours par voies orale, veineuse ou rétro-orbitale, et des prélèvements sanguins répétés jusqu'à une ponction terminale du cœur. L'injection hydrodynamique peut provoquer une distension abdominale et une baisse de mobilité, et le porteur reconnaît que des effets imprévisibles peuvent survenir à ce stade précoce. Une partie des souris sont "humanisées" par greffe pour reproduire le cycle du virus, et toutes sont tuées, leur état infecté interdisant toute réutilisation.
Objectifs
Malgré l’existence d’un vaccin pour lutter contre le virus de l’hépatite B (Hepatitis B virus ; HBV), cette infection virale reste un problème majeur de santé publique mondial. Il est important de développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant l’élimination complète du virus. Ce projet, vise à évaluer l’activité de composés sur la prévention et l’élimination du HBV, en ciblant le virus à différents stades de son cycle, que ce soit dans ses phases de réplication active, d’infection chronique ou sous sa forme de cccDNA nucléaire pouvant persister chez les patients. Nous pourrons également étudier l’immunité de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale et potentiellement chercher si ces composés ont la capacité de la moduler et ainsi d’accélérer l’élimination complète du virus (disparition des HBsAg et du cccDNA).
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet vise à tester de futurs traitements contre l’hépatite B afin de vérifier leur efficacité. Pour cela, nous utiliseront différents modèles de souris spécialement conçus pour reproduire l’infection humaine par le virus : certains modèles permettent d’étudier comment le virus se réplique, d’autres comment il interagit avec le système immunitaire, et d’autres encore comment les cellules infectées du foie réagissent aux traitements. Ces modèles permettent de tester plusieurs types de candidats médicamenteux comme des anticorps, protéines, petites molécules, vaccins ou encore siRNA. Ils aident aussi à déterminer les meilleurs moments pour traiter, et à repérer les éventuels effets toxiques. Les souris « humanisées » sont particulièrement utiles car elles imitent très fidèlement le cycle du virus chez l’humain. A long terme, ce travail permettra d’accélérer l’arrivée de nouveaux traitements contre l’hépatite B. Les données obtenues aideront à comprendre comment le virus et le système immunitaire interagissent et comment éliminer plus efficacement l’infection. L’objectif est de développer des thérapies plus ciblées, notamment en visant différentes protéines virales, capables de réduire la persistance du virus dans l’organisme et de limiter les complications graves liées à l’hépatite B, au bénéfice de la santé publique. Le projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité d'environ 146 composés par an en 24 études maximum.
Procédures
Selon les procédures appliquées : - Infection par l’hépatite B des souris: Injection rétro-orbitale : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes OU Administration intraveineuse à haut débit (Injection hydrodynamique par la veine caudale) : vigile, 1 fois par animal, 1 minute OU Injection sous cutanée de cellules : sous anesthésie générale, 1 fois par animal, 1 minute - Administration de composés thérapeutiques sur une durée max de 28 jours. Par voie orale, vigile, 1 à 4 fois par jour par animal, durée 1 minute Ou Par voie sous-cutanée : vigile, 2 fois par jour maximum, durée 1 minute ou par voie intramusculaire : sous anesthésie, 1 fois par jour maximum, durée 1 minute ou par voie intrapéritonéale : vigile,1 fois par jour maximum, durée 1minute ou par voie intraveineuse : sous anesthésie, 1 fois par jour par voie caudale ou par voie rétro-orbitale, avec une alternance de l’œil droit et gauche avec un minimum de 48h entre 2 injections au même œil et un maximum de 4 injections seulement sur toute la durée de l’étude, durée 3 minute - Suivi clinique et pondéral : pesée et bilan clinique 1 fois par semaine minimum par animal sur la durée de l’étude, vigile, 2 minutes - Prélèvements sanguin : Par la veine submandibulaire : vigile, 1 fois tous les 15 jours, pour une durée maximale de 8 semaines, durée 2 minutes. Par micro-sampling à la queue : vigile, exclusivement au cours des semaines sans prélèvement submandibulaire, 1 fois par semaine, durée 2minutes. Dans le cadre spécifique des études de pharmacocinétique (PK) : par micro-sampling répétés à la queue, sans aucun prélèvement submandibulaire, 7 prélèvements sur 24h, vigile, durée 2minutes. Par prélèvement terminal, sous anesthésie profonde, par ponction intracardiaque, 1 fois en fin de procédure, pour une durée estimée à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, des souris seront utilisées pour étudier l’infection par l’hépatite B et tester de futurs traitements antiviraux. Les interventions prévues peuvent entraîner des gênes légères à modérées, selon la technique employée. Lors de l’injection du virus (AAV/HBV), les souris peuvent ressentir un stress momentané lié à la manipulation, ainsi qu’une légère douleur ou une petite inflammation au point d’injection, qui disparaît généralement rapidement. Les injections hydrodynamiques peuvent provoquer une gêne plus marquée juste après la procédure, comme une sensation de ventre distendu et une baisse temporaire de la mobilité, mais ces effets s’estompent en quelques heures. Dans les modèles transgéniques, humanisés ou ceux impliquant l’implantation de cellules, les interventions consistent surtout en des injections ou des prélèvements sanguins, ce qui peut entraîner un stress bref ou une réaction légère au point d’injection. Aucun effet grave n’est attendu avec les candidats médicaments testés, mais comme il s’agit d’étapes précoces de recherche, certains effets imprévisibles peuvent parfois survenir, tels qu’une perte de poids, des variations de température ou un comportement inhabituel. Pour préserver le bien-être des animaux, une surveillance quotidienne sera assurée afin de repérer tout signe de douleur, de stress ou d’inactivité anormale. Leur poids sera contrôlé au moins une fois par semaine et plus fréquemment si nécessaire. En cas de problème, des mesures adaptées seront mises en place avec l’aide d’un vétérinaire pour réduire au maximum l’inconfort des animaux.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin d’étude, car les procédures expérimentales nécessitent le prélèvement d’organes et d’échantillons biologiques incompatibles avec le maintien en vie des animaux. De plus, l’état physiologique des animaux (infectés par HBV) ne permet pas leur réutilisation.
Remplacement
Avant d’avoir recours aux animaux, toutes les solutions permettant de les remplacer seront examinées. Des tests in vitro permettront d’évaluer d’abord si les traitements envisagés sont efficaces contre le virus, ce qui évitera d’utiliser des animaux pour des molécules qui ne fonctionneraient pas. Lorsque des tests sur animaux sont indispensables, des modèles de souris spécialement développés pour reproduire l’infection par l’hépatite B seront utilisés, car ils offrent des résultats plus fiables tout en limitant le recours à d’autres espèces. L’ensemble de ces démarches assure que les animaux ne sont utilisés que lorsque cela est réellement nécessaire pour faire avancer la recherche..
Réduction
Dans ce projet, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum grâce à plusieurs actions. Les quatre méthodes de recherche prévues sont complémentaires : elles permettront de choisir, pour chaque question scientifique, le modèle le plus adapté, évitant ainsi de répéter inutilement les expériences. Chaque souris servira également à recueillir plusieurs types d’informations (comme le suivi du virus, la mesure de différents marqueurs dans le sang ou les tissus, ou encore l’analyse de la réponse immunitaire), ce qui permet d’obtenir un maximum de données sans augmenter le nombre d’animaux. De plus, les traitements potentiels seront d’abord testés in vitro, sans animaux, afin de ne retenir que les candidats les plus prometteurs. Le nombre final d’animaux sera déterminé à partir de calculs statistiques rigoureux pour s’assurer que les groupes ne sont ni trop grands ni trop petits. Sur l’ensemble des cinq années du projet, au maximum 8500 souris seront utilisées pour toutes les études prévues. Ce total se répartit de la façon suivante : environ 3 200 souris pour les modèles AAV/HBV, 2 000 pour la technique dite d’hydrodynamie, 2 400 pour les modèles utilisant des cellules tumorales exprimant le virus ou des particules virales, et environ 900 pour les souris humanisées. Chaque procédure correspond à un certain nombre d’études par an et à une taille d’échantillon adaptée à chaque méthode scientifique.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera une priorité tout au long du projet. Les expériences seront conçues pour être les moins douloureuses et les moins stressantes possible, et les animaux ne seront manipulés que lorsque cela est réellement nécessaire. Chaque fois que c’est possible, les interventions seront réalisées sous anesthésie afin de réduire l’inconfort. Un suivi attentif et régulier permettra de repérer rapidement tout signe de douleur ou de détresse, grâce à une grille d’observation adaptée, et des mesures appropriées seront prises en concertation avec le vétérinaire. Les interventions seront organisées pour limiter leur durée et éviter la répétition de procédures invasives. Les prélèvements seront effectués avec des méthodes qui réduisent au maximum la souffrance, et, lorsque c’est possible, avec des techniques non létales permettant d’utiliser le même animal pour plusieurs mesures sans augmenter son stress. Enfin, toutes les personnes impliquées dans les expérimentations seront formées et qualifiées, garantissant des pratiques soigneuses et respectueuses du bien-être animal.
Choix des espèces
Les tests réalisés uniquement en laboratoire (in vitro) ne permettent pas de reproduire toute la complexité d’une infection réelle. Pour étudier le virus de l’hépatite B et développer des traitements capables de l’éliminer complètement, il est donc nécessaire d’utiliser des animaux. La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce type de recherche : elle dispose de nombreux modèles bien établis qui reproduisent les différentes étapes de l’infection et permettent d’évaluer à la fois l’action du traitement sur le virus et la réponse du système immunitaire. Sur le plan pratique et éthique, la souris est un petit animal facile à héberger et à suivre, ce qui réduit le stress et les souffrances. Son utilisation respecte les principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) : elle évite de recourir à des espèces plus sensibles, limite le nombre d’animaux nécessaires et permet d’adapter les protocoles pour améliorer leur bien-être. Enfin, la souris est déjà largement utilisée dans la recherche sur l’hépatite B, ce qui garantit des résultats fiables et comparables pour la suite du développement des traitements. Les souris sont âgées de 5-7 semaines à la livraison avec un poids autour de 20 grammes afin de permettre des infections et des traitements homogènes des lots d'animaux. Les souris humanisées auront quant à elles 6-7 mois à réception pour permettre une bonne humanisation de leur foie (et de leur système immunitaire le cas échéant). Il s’agit donc de rongeurs matures et adultes.
Recueil de cellules du foie et de la vésicule biliaire pour l’étude de l’homéostasie hépatobiliaire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Anesthésiées puis perfusées pour prélever le foie, 100 souris sont tuées sans reprise de conscience, dans des procédures classées sans réveil. La perfusion, d'une durée de dix à vingt minutes, sert à isoler les cellules du foie et de la vésicule biliaire chez des souris modifiées pour ne plus produire une protéine appelée EBP50. Le bénéfice avancé se limite à mieux comprendre le rôle de cette protéine. Le porteur indique vouloir comparer les cellules isolées sur animal vivant et sur animal mort, et s'engage à ne procéder qu'après la mort si la qualité s'avère identique.
Objectifs
EBP50 est une protéine très présente dans le foie. À l’échelle des cellules, elle joue un rôle important en contrôlant l’activité de certains transporteurs impliqués dans la sécrétion des substances produites par les cellules épithéliales. Cependant, EBP50 pourrait aussi avoir des fonctions dans d’autres types de cellules du foie qui participent aux défenses immunitaires et à la réparation des tissus. Le rôle d’EBP50 dans ces différents types cellulaires reste encore mal connu. Pour mieux comprendre les fonctions d'EBP50 dans l’ensemble des cellules du foie et de la vésicule biliaire, nous allons isoler les différentes sous-populations cellulaires de ces organes chez des souris génétiquement modifiées pour ne plus exprimer EBP50. Cela nous permettra de mieux cerner la contribution spécifique de cette protéine à la fonction hépatique et biliaire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice réside en une meilleure compréhension du rôle de la protéine d’échafaudage EBP50 dans les différents types cellulaires du foie.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et une perfusion du foie afin d’isoler les différents types cellulaires du foie seront réalisés (durée des intervention 10-20 min).
Impact sur les animaux
En condition physiologique, l’absence de la protéine EBP50 n'a pas d'effet délétère sur l'animal, n'induisant pas d'anomalies embryonnaires, les souris à leur naissance sont viables. Les nuisances sont celles liées à l’anesthésie et à la chirurgie: détresse respiratoire, hypothermie profonde et hémorragie.
Devenir
Le prélèvement du foie entier ou pour isolement cellulaire ne permet pas la survie des animaux. Les animaux seront donc tous euthanasiés à la fin de la procédure P1 et P2 pour perfusion ou explantation du foie qui est requis pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Il existe des lignées de cellules hépatiques murines, mais celles-ci ne sont pas représentatives des populations cellulaires auxquelles nous faisons référence dans ce projet. Aussi ces cellules ne peuvent être étudiées qu'en culture primaire et à partir de plusieurs animaux compte tenu de leur faible proportion dans le foie. La spécificité des cellules en culture primaire est d'être isolé à partir d'un organe entier dans le but de développer des modèles de culture ex vivo représentatif du tissu, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés.
Réduction
Nous avons calculé le nombre minimal d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités entre animaux et entre procédures d’isolement cellulaire, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Le test statistique sera Two-Way ANOVA.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été optimisé afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). Afin de rafiner d'avantage la procédure, nous réaliserons des isolements cellulaires par perfusion du foie sur animal vigile (ante-mortem) et non vigile (post-mortem), dans le but de comparer la qualité des cellules isolées. Si la qualité des cellules s'avérait identique en ante-et post-mortem, nous nous engageons à procéder par la suite à des isolements exclusivements post-mortem.
Choix des espèces
Les animaux sont indispensables pour mettre en place nos cultures primaires et éviter les tests sur les animaux. Les souris seront utilisées à l'âge adulte: - 2 - 6 mois. Description de l’identification : Pour les animaux transgéniques qui nécessitent une identification individuelle et un génotypage, le choix de la méthode d'identification est le tatouage aux phalanges avec une biopsie de bout de la queue pour le génotypage selon la DAP générique de l'animalerie numéro #54314.
Etude de la réponse thérapeutique aux chimiothérapies dans les cancers du sang chez la souris. MODIFICATION.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris atteignant un point limite clinique sont mises à mort, les autres tuées au plus tard quatre mois après l'injection. 2228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. On leur injecte des cellules de leucémie humaine dans la veine de la queue, avec des ponctions de moelle osseuse au fémur sous anesthésie, la maladie provoquant une hypertrophie de la rate qui gêne les déplacements et peut faire souffrir. La rate et la moelle sont prélevées après la mort pour analyse cellulaire, l'objectif affiché restant de comprendre le mécanisme d'action de la chimiothérapie.
Objectifs
Les agents de chimiothérapie utilisés pour soigner les patients atteints de leucémie (cancer du sang) ont des mécanismes d’action variés, mais leur action précise et majoritaire est encore incertaine. Le projet a pour objectif de mieux comprendre les effets de la chimiothérapie classiquement utilisée pour soigner les leucémies. Nous étudierons en particulier l’importance d’un gène qui participe à la mort des cellules cancéreuses lorsque les patients sont traités avec la chimiothérapie. L’objectif est de comprendre par quels mécanismes la protéine issue de ce gène peut entrainer la mort des cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
Chez les patients atteints de leucémies, les rechutes sont très fréquentes après les traitements par chimiothérapie, en particulier chez les personnes âgées de plus de 60 ans. Les progrès à faire passeront par une meilleure compréhension des mécanismes d’action précis des chimiothérapies, qui pourront alors être améliorées. Ce projet permettra d’approfondir les connaissances sur la chimiothérapie et son mode d’action. Comprendre la manière dont la chimiothérapie conduit à la mort des cellules cancéreuses permet de travailler sur l’amélioration des traitements à plus long terme.
Procédures
Pour mettre en place le modèle de leucémie, les animaux seront soumis à une injection des cellules leucémiques par intraveineuse dans la queue. Cette procédure dure environ 20 secondes et se fait sans anesthésie. L’apparition de la maladie sera suivie par ponction de moelle osseuse (qui est le site d’expansion de ces cellules cancéreuses). Ce prélèvement sera fait au niveau du fémur, dans une patte arrière. Il se fait sous anesthésie et dure environ 2 à 3 minutes. Quand les souris commenceront à être malades, elles seront traitées avec une molécule administrée par injection dans l'abdomen (environ 5 à 10 secondes) et une molécule administrée en intra-veineuse dans la queue (environ 20 à 30 secondes). Ces procédures sont faites sans anesthésie. Pour une partie des souris, des séances d'imagerie seront réalisées (suivi des cellules cancéreuses dans l'animal vivant). Après injection d'une solution permettant de visualiser les cellules d'intérêt (injection dans l'abdomen; durée de 20 secondes), les souris sont anesthésiées puis placées dans un équipement d'imagerie avec maintien de l'anesthésie. Des images sont enregistrées sur une durée de 10 minutes maximum, avant l'arrêt de l'anesthésie et le réveil de l'animal.
Impact sur les animaux
La manipulation des souris pour le traitement engendre un stress, le souris pouvant être traitées quotidiennement pendant maximum 5 jours. Quand la leucémie se développe, la rate des souris grossit (splénomégalie). Cela peut gêner leur mobilité normale. On peut aussi penser qu’elle cause des douleurs même si des signes visibles de douleur ne sont que rarement présents en cas de splénomégalie faible ou modérée. Quand les souris sont traitées avec la chimiothérapie, elles peuvent perdre du poids à partir du troisième jour du traitement. Elles ont alors le poil moins régulier et parfois le dos voûté. Ces effets ont une durée de 2 à 3 jours.
Devenir
Tous les animaux seront systématiquement euthanasiés au maximum 4 mois post-injection si pas d’atteinte du point limite. Les organes cibles de la prolifération des cellules cancéreuses (rate, moelle osseuse) seront prélevés en post-mortem pour une analyse au niveau cellulaire.
Remplacement
Nous avons au préalable testé la chimiothérapie sur des modèles de cellules cancéreuses en culture. Le passage dans l’animal est maintenant nécessaire pour reproduire les conditions physiologiques d’un organisme proche de l’homme, pour confirmer et approfondir les hypothèses.
Réduction
Nous utilisons un nombre suffisant et optimal d’animaux par groupe pour avoir des différences statistiquement significatives entre les groupes. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, différents temps de traitement seront testés en même temps afin de comparer les différents groupes testés à un seul et unique groupe contrôle.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes pour respecter leur comportement naturel. Ils seront surveillés quotidiennement, et une grille d’évaluation, tenant compte de leur apparence de leur comportement et d’un suivi clinique, sera tenue chaque semaine de façon à définir des points limites de douleur/souffrance suffisamment précoces pour déclencher le recours à l’euthanasie si ces points limites étaient atteints. Ce suivi sera quotidien lors de la phase de traitement. En cas de perte de mobilité, l’accès à la nourriture sera facilité. Les cages seront enrichies pour améliorer le bien-être des animaux. La ponction de moelle osseuse ainsi que l'imagerie seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle (utilisation de support à 37°C).
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère suffisamment proche de l’Homme pour les expériences menées dans ce projet. Le gène étudié ainsi que la fonction de la protéine qui en découle sont très proches entre l’homme et la souris. Les molécules testées sont à administrer par différentes voies, toutes disponibles sur l’espèce animale choisie. De plus, le contrôle de leur bien-être au quotidien est facilité car les signes de souffrance/douleur ont été bien caractérisés chez cette espèce. Les leucémies touchent des cellules à un stade précoce de leur développement, ce qui nous conduit à utiliser des souris jeunes adultes de 6 à 8 semaines pour nos expérimentations.
ANTIBIORESISTANCE ET RECALCITRANCE DE SOUCHES CLINIQUES: UTILISATION DE MODELES MURINS DANS L’ETUDE DE NOUVELLES MOLECULES ANTIMICROBIENNES.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Pour tester quatre peptides antimicrobiens sur des bactéries résistantes, 2700 souris vont être utilisées, dont 2220 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles sont infectées par des bactéries injectées, ce qui peut provoquer douleur, perte de poids et affaiblissement, avec suivi de la température par voie rectale. Les organes sont prélevés après mise à mort pour mesurer l'effet et la toxicité des molécules. Le porteur qualifie l'étape animale d'"indispensable" et affirme qu'"aucune méthode alternative n'est disponible", après avoir reconnu l'efficacité déjà obtenue in vitro.
Objectifs
Chaque année, en France et dans le monde, des milliers de patients présentent une infection à bactérie multi ou hautement résistante aux antibiotiques et les patients se trouvent souvent dans une impasse thérapeutique. Deux phénomènes ont été identifiés comme responsables de l’échec de traitement : la résistance et la récalcitrance aux antibiotiques. La résistance se définit par l’acquisition bactérienne de nouveaux mécanismes permettant leur croissance en présence d’antibiotiques. L'Organisation mondiale de la Santé (OMS) a publié un rapport stipulant que plus de 40 % des antibiotiques surveillés montrent une résistance accrue sur plusieurs types de bactéries . La résistance aux antimicrobiens est donc devenue un problème majeur de santé publique. Plusieurs études réalisées dans notre laboratoire ont prouvé l'efficacité in vitro de 4 nouveaux peptides anti-microbiens sur ces bactéries. Point majeur : aucune résistance bactérienne n’a pu être mise en évidence. Démontrer maintenant leur efficacité in vivo, dans un modèle murin d’infection représente une étape indispensable dans leur validation thérapeutique. La récalcitrance se définit par la capacité d’une population bactérienne, sensible à un antibiotique donné, à entrer en dormance, survivre au traitement et se remultiplier une fois le traitement arrêté, causant des rechutes infectieuses. Nous sommes capables au laboratoire d’induire de la récalcitrance et nous avons à notre disposition 10 couples isogéniques. Ces souches sont isolées de patients ayant développé une infection (souche initiale) puis une rechute (souche de rechute) après traitement antibiotique. De nouvelles données sur les changements phénotypiques transistoires dans la population bactérienne pourront être ainsi collectées et nous renseigneront sur les niches qui pendant l’infection, permettent à certaines bactéries normalement sensibles de survivre aux traitements antibiotiques, découlant sur des phénomènes de rechute et de récurrences infectieuses à l’arrêt du traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche représente une étape indispensable dans la validation de nouvelles molécules antibiotiques. L’antibiorésistance et la récalcitrance sont des phénomènes qui concernent à la fois la santé animale et la santé humaine. En France, chaque année 125 000 infections et 5 500 décès sont attribuables aux échecs de traitement des infections. Ce projet implique des bactéries pathogènes du groupe ESKAPE qui constituent un ensemble de bactéries conduisant à des infections nosocomiales qui, selon l’organisation mondiale de la santé (OMS), représente une menace planétaire du fait de leurs multiples résistances aux antibiotiques et leur diffusion au sein des hôpitaux. Une étude chez l’animal permettra d’analyser et d’envisager, dans un second temps, une étude d’évaluation de différents protocoles thérapeuthiques chez l’Homme. La recherche préclinique sur l'animal est en effet une étape indispensable, permettant de s'assurer que les médicaments ou les protocoles de soin sont sûrs et efficaces, avant de les proposer aux malades.
Procédures
Les gestes techniques pratiqués sur animal vigile sont : injection par voie peritoneale, injection par voie intraveineuse ou injection en sous-cutané, pesée ds animaux et prise de température rectale. Ces gestes ne durent que quelques secondes chacun, les injections sont limitées à un seul par animal et par jour.
Impact sur les animaux
L'injection de bactéries chez la souris peut provoquer de la douleur et de la souffrance. Elle peut engendrer également une baisse d'activité, une perte de poids et un affaiblissement général. Les doses de bactéries injectées seront calibrées pour minimiser ces effets. Les antibiotiques que nous utilisons dans le modèle de récalcitrance ont déjà été testés sur l’animal et ne provoquent pas d’effets secondaires
Devenir
Afin de caractériser l'effet de nos traîtements, notemment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les organes des animaux traîtés et non traîtés. Nous devons pour cela procéder à l'euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire des tissus des organes est indispensable pour évaluer les effets de nos nouvelles molécules ainsi que leur toxicité.
Remplacement
Les modèles ex vivo apportent des informations intéressantes puisqu’ils renseignent sur la capacité de ces molécules à être actives sur des bactéries cultivées in vitro. Mais ils ne permettent pas de renseigner sur l’évolution in vivo, donnée essentielle pour mesurer leur efficacité réelle. Dans cette étude, l’utilisation d’animaux est nécessaire en raison de la complexité du sepsis, qui affecte plusieurs organes en même temps. Pour bien comprendre cette maladie, il est indispensable d’étudier ses effets sur un organisme entier. Par ailleurs, les résultats obtenus chez les rongeurs, lorsqu’ils sont cohérents entre différents modèles, reflètent généralement bien ce qui se passe chez l’Homme. Aucune méthode alternative n'est disponible actuellement.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, nous nous sommes basés sur les travaux précédents menés dans notre laboratoire, ainsi que sur une analyse approfondie de la littérature scientifique sur cette maladie. Nous avons optimisé les prélèvements de tissus après l’euthanasie de chaque animal. De plus, nous avons effectué un test statistique appelé calcul de puissance (avec une puissance de 90 % et un seuil d’erreur de 5 %) pour déterminer précisément le nombre d’animaux nécessaires par groupe.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées: locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum avec un maximum de 5 animaux par cage (Chaque animal est identifié à l’aide d'une bague numérotée). Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage sauf en cas d’agressivité ou si des soins particuliers sont nécessaires. De l'eau gélifié, du coton pour faire leur nid, des jouets type tunnel pourront être ajoutés dans la cage. Une attention particulière sera porté au bien-être des animaux tout au long de l'étude. Nous surveillerons régulièrement les rongeurs pour détecter toute douleur excessive. L’état physique, le comportement seront vérifiés visuellement. Le poids sera suivi à l’aide d’une balance. La température corporelle sera mesurée avec un thermomètre rectal adapté aux rongeurs. Le suivi quotidien, pendant 7 jours permettra d'avoir un contrôle continu sur leur état de santé.
Choix des espèces
L’utilisation du modèle souris dans l’évaluation thérapeutique de nouvelles molécules est largement détaillée dans la littérature scientifique. Ce modèle simple est facilement reproductible. Les animaux seront âgés de 4 à 8 semaines. A ce stade de développement, les animaux sont de jeunes adultes avec un système immunitaire mature et une stabilisation de la croissance et du poids. Ce qui permet d'exclure des paramètres susceptibles d'interférer avec les résultats de l'expérimentation. Depuis plusieurs années un grand nombre d'études ont été publiées sur le sepsis en utilisant des rongeurs comme modèle animal. Leur utilisation nous permet de mieux situer nos résultats dans un contexte scientifique global. Ces modèles de rongeurs ont été largement étudiés, et l’on connaît bien leur cycle de vie ainsi que leurs éventuels impacts sur les expérimentations. Les rongeurs sont compatibles avec un large éventail de techniques pour analyser différents paramètres et mécanismes, y compris ceux que nous utiliserons dans cette étude. L’utilisation de souris est donc recommandée.
Exploration fonctionnelle du rôle du microbiote et des interactions neuro-immunes dans les douleurs oro-faciales
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Soumises à une constriction chirurgicale du nerf sous l'orbite ou à une injection d'agent inflammatoire dans la joue, 996 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance allant de léger à sévère. L'intervention peut entraîner une douleur postopératoire, un œdème et une hypersensibilité de la face persistant jusqu'à 60 jours, évaluée par des stimulations répétées au filament et au jet d'air lors de séances de 30 à 45 minutes sur animaux conscients. Le projet cherche à établir si un microbiote intestinal perturbé aggrave la douleur oro-faciale chronique, les retombées thérapeutiques restant annoncées à long terme. À l'issue du suivi, tous les animaux sont tués, une partie des prélèvements servant à l'entraînement technique du personnel.
Objectifs
La douleur chronique oro-faciale constitue un enjeu clinique majeur, en particulier en raison de la difficulté à en comprendre les mécanismes de transition depuis une douleur aiguë vers une forme persistante. Des travaux récents de notre équipe ont montré qu’un microbiote intestinal perturbé (ensemble des micro-organismes présents dans l’intestin) favorise l’apparition de douleurs chroniques après chirurgie de la patte. Nos résultats suggèrent que cette influence du microbiote s’exerce en modifiant l’activité des certaines cellules immunitaires localisées à proximité des neurones qui transmettent l’information douloureuse. Ces cellules immunitaires peuvent entretenir un état inflammatoire local, qui maintient l’activation excessive des neurones impliqués dans la transmission de la douleur, favorisant ainsi sa persistance. L’objectif principal de ce projet est de déterminer si un mécanisme comparable intervient dans la chronicisation de la douleur oro-faciale. Nous chercherons à comprendre comment le microbiote intestinal influence le dialogue entre cellules immunitaires et les neurones de la douleur faciale.
Bénéfices attendus
La douleur oro-faciale chronique est une pathologie fréquente et invalidante, pour laquelle les options thérapeutiques restent limitées en raison d’une compréhension encore incomplète des mécanismes responsables de sa persistance. Ces travaux permettront d’approfondir nos connaissances sur le dialogue entre les cellules nerveuses responsables de la transmission de la douleur et les cellules du système immunitaire qui peuvent moduler leur activité. À plus long terme, ces recherches pourraient contribuer au développement de nouveaux traitements de la douleur chronique oro-faciale.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à une intervention chirurgicale faciale, d’une durée de 5 à 10 minutes. D’autres animaux recevront une injection sous-cutanée à proximité de la joue, d’une substance provoquant une inflammation locale, procédure d’une durée d’environ 2 minutes. Toutes ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale administrée par injection unique. Une prise en charge de la douleur sera mise en place avant les interventions chirurgicales par injection afin de prévenir la douleur, et sera renouvelée si évalué comme nécessaire, après l’intervention. L’ensemble des animaux participera à des tests comportementaux visant à mesurer leur sensibilité mécanique au niveau de la face. Ces tests sont réalisés sur animaux conscients, préalablement habitués à la manipulation et au dispositif expérimental. Chaque séance dure en moyenne 30 à 45 minutes, et sera répétée plusieurs fois au cours du suivi expérimental. Les évaluations comportementales après chirurgie seront réalisées aux jours 1, 3, 7, 14, 21, 28, 35, 45 et 60. Les évaluations comportementales après injection d'agent inflammatoire seront réalisées aux jours 1, 2, 10, 14, 21, 28, 35 et 45. À l’issue du suivi comportemental, les animaux recevront une analgésie suivie d'une anesthésie profonde. Une perfusion sera ensuite réalisée (durée 5 minutes) afin de permettre le prélèvement des tissus nécessaires aux analyses scientifiques.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures seront réalisées après anesthésie générale des animaux, administrée une fois par injection. Une partie des animaux subiront une intervention chirurgicale au niveau du nerf infra-orbitaire, réalisée une seule fois par animal et d’une durée d’environ 10 minutes, consistant soit en une constriction du nerf, soit en un abord simple sans constriction (environ 5 minutes). Cette intervention implique une incision cutanée et une exposition nerveuse et peut entraîner une douleur post-opératoire, une inflammation locale, un œdème, un risque d’infection ainsi qu’une hypersensibilité mécanique faciale pouvant persister jusqu’à 60 jours dans le modèle avec constriction. D’autres animaux recevront une injection sous-cutanée unique d’un agent inflammatoire dans le coussinet de moustache, d’une durée d’environ 2 minutes. Cette injection peut induire une douleur locale, une inflammation et une hypersensibilité mécanique durant plusieurs jours. Une analgésie sera administrée par injection, avant les chirurgies. L’analgésie sera renouvelée à une fréquence maximale de deux injections par jour lorsque jugé comme nécessaire durant le suivi post-opératoire. Si pas d’amélioration au lendemain de l’administration de l’analgésie, les animaux seront euthanasiés (atteinte point limite). Les tests de sensibilité mécanique seront réalisés sur animaux conscients, à l’aide de stimulations par filaments mécaniques et par jet d’air, d’une durée de 30 à 45 minutes par session, ce qui peut induire un stress lié à la contention et aux stimulations répétées. Une perte de poids transitoire peut survenir dans les jours suivant la chirurgie.
Devenir
À l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés. Les prélèvements tissulaires réalisés auront deux finalités : une partie sera utilisée pour l’entraînement technique (tutorat) du personnel; les autres lots seront destinés aux analyses expérimentales finales.
Remplacement
La thématique principale du laboratoire étant l’étude de la physiologie de la douleur, le recours à un modèle animal est indispensable et aucune méthode de remplacement ne permet de répondre aux objectifs scientifiques du projet. En effet, la douleur correspond à un processus physiologique intégré impliquant l’ensemble de l’organisme et ne peut être dissociée de son contexte systémique. L’évaluation comportementale, qui constitue le point de départ de cette étude, résulte d’une intégration complexe des informations sensorielles depuis la périphérie jusqu’au système nerveux central. L’utilisation de la souris comme modèle expérimental permet par ailleurs d’étudier le rôle des interactions entre le microbiote intestinal et les compartiments neuro-immuns dans la physiologie de la douleur, notamment grâce à l’accès à des modèles murins génétiquement modifiés. Les approches in vitro, ex vivo ou in silico ont été envisagées mais ne permettent pas de reproduire cette intégration fonctionnelle globale ni d’évaluer les réponses comportementales associées à la douleur.
Réduction
Le plan expérimental a été conçu afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la fiabilité et la reproductibilité des résultats. Le nombre d’animaux a été estimé en tenant compte principalement de la variabilité attendue des réponses comportementales ainsi que de la nécessité d’intégrer des variables biologiques pertinentes telles que le sexe et le génotype. L’organisation des groupes expérimentaux permet d’obtenir des comparaisons fiables tout en évitant toute utilisation excessive d’animaux. Lorsque cela est possible, plusieurs types d’analyses seront réalisés à partir des mêmes individus, afin d’éviter la duplication des procédures expérimentales.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages enrichies comprenant du matériel de nidification et des abris, afin de favoriser les comportements naturels et de réduire le stress. Les conditions environnementales (température, luminosité, bruit) seront stables et contrôlées. Les procédures expérimentales seront planifiées afin de limiter le stress, notamment par une habituation quotidienne de 5 jours aux manipulations, aux dispositifs expérimentaux et à l’expérimentateur. Les tests comportementaux seront réalisés dans des pièces dédiées, calmes et adaptées. Les expérimentateurs sont formés à la manipulation douce des animaux et à la détection des signes de douleur ou de détresse. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale, avec une analgésie préemptive et post-opératoire adaptée. Une alimentation liquide sera fournie durant les 3 jours suivant la chirurgie afin de limiter la douleur liée à la mastication et prévenir la perte de poids. Un arbre décisionnel accompagne chaque procédure expérimentale. Des points limites ont été définis à l’aide d’une grille d’observation . En cas de dépassement de ces critères, les animaux seront immédiatement retirés de l’étude et euthanasiés selon les procédures réglementaires en vigueur. Les stimulations mécaniques seront réalisées dans des dispositifs adaptés, sans dépasser les seuils recommandés. Les animaux feront l’objet d’une surveillance continue afin de détecter tout signe de détresse ou de comportement anormal persistant.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones impliquées dans l’intégration des stimuli douloureux présentent de fortes similarités avec celles décrites chez l’Homme. De nombreux modèles de douleur neuropathique et inflammatoire sont bien établis et reproductibles chez cette espèce, permettant des comparaisons fiables avec les données publiées et une intégration cohérente dans la littérature internationale. L’utilisation de la souris permet en outre l’accès à un large panel de lignées génétiquement modifiées, indispensable pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la physiologie de la douleur. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, à partir de 8 semaines, correspondant à un stade où le système trigéminal est pleinement mature et où les réponses comportementales à la stimulation mécanique sont stables et interprétables. Ce stade est également optimal pour la réalisation des analyses cellulaires et moléculaires prévues, sans interférence liée aux processus de développement ou de vieillissement.
Approches thérapeutiques des tumeurs osseuses primitives chez la souris immunodéprimée (ostéosarcome et sarcome d’Ewing) EU2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Choisies pour leur absence de défenses immunitaires et leur jeune âge, censé reproduire les tumeurs osseuses de l'enfant et de l'adolescent, 2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales humaines près du tibia, puis jusqu'à 80 gavages et 80 injections dans l'abdomen sur seize semaines, avec des séances d'IRM sous anesthésie. Le développement tumoral peut provoquer une cachexie et une perte de mobilité, le volume de la tumeur servant de seuil de mise à mort. Les cellules tumorales et la chimiothérapie interdisant toute réutilisation, tous les animaux sont tués pour analyse.
Objectifs
L’objectif scientifique est de vérifier que les résultats obtenus in vitro dans les cellules d’ostéosarcome et de sarcome d’Ewing sont applicables aux modèles de xénogreffe (greffe de cellules humaines chez des rongeurs) d’ostéosarcome ou de sarcome d’Ewing chez la souris immunodéficiente dans un contexte environnemental complexe (vascularisation, effets secondaires, microenvironnement osseux …) avant toute application clinique. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Le projet porte sur l’étude de molécules capables d’inhiber le développement et la progression des tumeurs osseuses primitives et/ou le développement des lésions osseuses associées. Des études préliminaires ont été réalisées in vitro sur différents types de cellules d’ostéosarcome (humaines et murines) et de sarcome d’Ewing. Suite aux résultats les plus significatifs, des modèles animaux seront utilisés pour tester l’efficacité de ces molécules thérapeutiques dans un environnement in vivo complexe (os, tumeur…) pour une application thérapeutique potentielle chez l’homme.
Procédures
EU 1/2 : 960 souris recevront maximum 5 gavages/semaine pendant 16 semaines maximum soit 80 gavages, durée du geste : 1 minute. 960 souris recevront maximum 5 injections IP/semaine pendant 16 semaines maximum soirt 80 injections IP, durée du geste : 1 minute. 960 souris recevront maximum 5 injections IP et 5 gavages/semaine pendant 16 semaines maximum soirt 80 injections IP et 80 gavages, durée du geste : 1 minute. L'ensemble des animaux recevra une injection intamusculaire de cellules tumorales (1 minute). EU 2/2 : la procédure d'imagerie IRM nécessitera une injection IV d'une minute et 20 minutes d'acquisition. 6 IRM maximum seront réalisées.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour ce projet sont un stress lié à la contention et à l'anesthésie des animaux. Une douleur modérée associée à l'injection en paratibiale (injection intramusculaire proche de l'os). Le développement tumoral chez la souris pourra à terme, être associé à des effets délétères (cachexie). Le volume tumoral, bien que contrôlé 2 à 3 fois par semaine pourra entraîner une légère perte de mobilité. Une attention particulière sera portée à la mesure du volume tumorale qui constitue un critère d'arrêt décrit dans les points limites. L'imagerie, réalisée à l'aide d'un microscanner ou d’un IRM sous anesthésie isoflurane, peut également être source de stress pour les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront injectés avec des cellules tumorales et recevront des traitements de chimiothérapie qui ne sont pas compatibles avec une éventuelle réutilisation.
Remplacement
Dans le cadre du développement clinique de nouvelles molécules à activité anti-tumorale et impliquée dans la résorption, des études préliminaires in vitro ont déjà été réalisées avec succès. Une évaluation pré clinique est cependant indispensable pour étudier les effets de ces molécules in vivo. Le modèle murin reste le plus adapté à ce type d'étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe est utilisé afin d'analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d'effectuer des analyses statistiques. Compte-tenu d’études comparables déjà publiées, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique (n=8).
Raffinement
Afin de raffiner les procédures expérimentales, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter le plus précocement possible tout signe de douleur. La manipulation des animaux se fera sous anesthésie générale gazeuse, sur un tapis chauffant lors de la réalisation des gestes techniques. Une analgésie sera appliquée pour l'implantation des cellules tumorales et des points limites strictes et spécifiques du projet seront établis (détaillés dans le descriptif de la procédure). Les animaux seront hébergés en groupe, à raison de 4 par cage. Le transport à pieds sera effectué dans des cages adaptées (durée : 5 minutes, distance : 300 mètres). L'environnement sera adapté afin que les animaux puissent avoir un comportement aussi naturel que possible (litière adaptée à l'espèce, frisottis, maisonnette en carton...). L'alimentation et l'eau seront fournis ad libitum.
Choix des espèces
L’utilisation de souris immunodéprimées est choisie afin d’étudier le développement de nouvelles thérapies sur des tumeurs humaines dans un environnement in vivo complexe (os et tumeur). Nous utilisons de jeunes souris afin de mimer au mieux les tumeurs osseuses qui se développent chez l’enfant, l’adolescent ou le jeune adulte chez les patients. Réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 semaines).
Propriétés optiques des tissus tumoraux de cancer pancréatiques humains développé dans un modèle murin.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
15 souris privées de système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du pancréas humain sous la peau, des pesées et des contentions répétées, puis sont tuées pour prélever la tumeur et en mesurer les propriétés optiques. L'objectif immédiat n'est pas de soigner mais d'alimenter un outil numérique de simulation de l'éclairage des tumeurs, les retombées pour les patients étant renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne peut fournir ces mesures et qu'un tissu proche de la tumeur humaine ne peut être obtenu que sur animal vivant.
Objectifs
Le cancer du pancréas est l'un des plus agressifs et son traitement n'a pas beaucoup progressé depuis 50 ans. La thérapie photodynamique, déjà utilisée en dermatologie, pourrait être une solution. Elle consiste à injecter un médicament photosensibilisateur qui, sous l'effet d'une lumière spécifique, produit des molécules toxiques pour les cellules cancéreuses tout en stimulant le système immunitaire. Des recherches préliminaires ont confirmé son efficacité contre le cancer du pancréas, en détruisant les tumeurs et en renforçant l'immunité. Pour améliorer cette technique, il faut développer des agents photosensibilisateurs de 3e génération, ciblant uniquement les cellules cancéreuses afin de réduire les effets secondaires. Cela nécessite de mieux comprendre comment la lumière interagit avec les tissus pancréatiques. Ce projet vise donc à créer des tumeurs pancréatiques chez la souris pour étudier ensuite, après leur prélèvement, leurs propriétés optiques.
Bénéfices attendus
Nous allons étudier comment la lumière interagit avec les tumeurs du pancréas. Grâce à ces données, nous pourrons : Créer un outil numérique pour simuler et optimiser l'éclairage des tumeurs. Développeur de systèmes de mesure précis pour adapter le traitement à chaque patient. L'objectif est de rendre la thérapie photodynamique plus efficace et personnalisée contre le cancer du pancréas.
Procédures
1 injection sous cutanée, durant quelques secondes des pesées réguliers les jours ouvrés, une dizaine de seconde par pesée des contentions les jours ouvrées pour la mesure des tumeurs : quelque secondes
Impact sur les animaux
Pendant nos expériences, certains effets indésirables légers peuvent survenir : Injections, pesées, 1 anesthésie gazeuse : Les animaux doivent être maintenus temporairement, ce qui peut causer un stress léger et temporaire. Croissance de la tumeur : Les cellules cancéreuses sont injectées à un endroit précis pour ne pas gêner l'animal. Un léger inconfort pourrait survenir dans les 4 semaines.
Devenir
Nous devons procéder à la récupération de la tumeur pour déterminer ces propriétés optiques. Ceci justifie la mise à mort des animaux en fin de procédure.
Remplacement
L’objectif est de générer de nouvelles données expérimentales pour mettre en place de futures simulations. Il n’est pas possible d’utiliser des systèmes in-vitro pour obtenir ces paramètres nécessaires aux simulateurs. Un tissu au plus proche de la tumeur humaine est nécessaire et ne peut être généré que sur animal vivant.
Réduction
Grâce à l'expertise des laboratoires partenaires, nous savons exactement combien de cellules injecter et combien de temps attendre pour obtenir des tumeurs adaptées. De plus, l'expérience du laboratoire où seront effectués les mesures optiques nous permet d'obtenir suffisamment de données avec un nombre minimal d'échantillons. Ainsi, nous utiliserons le strict minimum d'animaux.
Raffinement
Pour garantir le confort des animaux : Hébergement des souris avec abris et coton, dans un environnement stable (température, lumière). Acclimatation : 10 jours avant toute manipulation et habituation à la prise en main pour réduire le stress. Expérience courte : suivi limité à 4 semaines. Greffe tumorale : placée sous la peau au flanc arrière pour ne pas gêner leur vie quotidienne. Mesures sans stress : contrôles externes sans anesthésie, avec un outil de précision.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris sans système immunitaire pour greffer des cellules tumorales humaines. Ces souris âgées de 7 semaines sont robustes pour supporter les injections et la croissance des tumeurs.
Création d’un modèle de souris humanisée à partir de cellules souches pluripotentes induites
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris qui perdent 20 % de leur poids ou atteignent un score clinique de 9 sont mises à mort. 30 souris immunodéficientes NSG sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Chacune reçoit une injection de cellules souches humaines pour lui reconstruire un système immunitaire humain, puis des prélèvements sanguins rétro-orbitaires toutes les deux semaines, alternés d'un œil à l'autre. Le porteur signale un risque de réaction du greffon contre l'hôte et retient ce modèle pour éviter le recours au sang de cordon.
Objectifs
Les cellules souches pluripotentes induites sont des cellules souches qui ont la capacité, selon les conditions de leur environnement, de s’orienter vers différents types de lignées cellulaires et notamment vers la voie immunitaire. Ce projet a pour objectif d’utiliser ces capacités, afin de recréer un système immunitaire humain chez des souris (= humanisation) immuno-déficientes (sans système immunitaire) à partir de cellules souches pluripotentes provenant de cellules humaines. L’utilisation de ces cellules va permettre de standardiser un protocole pour la création d’un modèle murin humanisé sans recourir à des cellules issues de sang de cordon humain, couramment utilisées pour l’humanisation, d’avoir un stock conséquent de cellules pour l’humanisation et de pouvoir recréer chez la souris un système immunitaire personnalisé (à partir de cellules reprogrammées issues de cellules de patients).
Bénéfices attendus
Pour comprendre le développement du système immunitaire humain et essayer d’analyser son comportement par rapport à différentes situations, beaucoup de travaux ont été effectués in vitro sur différents modèles cellulaires. Mais les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble notamment dans le cas de la recherche sur les rejets de greffe, l’impact d’un médicament ou autre. C’est pourquoi, pour observer le développement de ces cellules et leurs fonctionnalités, des modèles de souris et de rats humanisés (qui ont un système immunitaire humain) ont été développés. Ces modèles murins humanisés se font aujourd’hui essentiellement par l’injection de cellules issues de sang de cordon ombilicale qui est du matériel cher et précieux dû aux stocks limités. Aussi il est nécessaire souvent d’avoir recours à plusieurs donneurs pour un même protocole pouvant entrainer une variabilité dans les résultats. Ainsi ce projet permettrait d’avoir un modèle de souris humanisé standardisé par des cellules ayant la même origine dans un stade de développement contrôlé. Le stock important permettra également d’en réduire le coût et d’avoir un n plus important pour nos projets. Un autre axe de développement peut être l’étude de maladies génétiques impactant le système immunitaire. Effectivement, des iPSC peuvent être générées à partir de cellules d’un patient touché par une maladie génétique. Alors on pourrait orienter ces cellules vers le stade hématopoïétique avec notre protocole de culture cellulaire et les injecter chez l’animal. Ainsi nous aurions un modèle murin avec un système immunitaire humain comportant la mutation ou le fond génétique spécifique d’une maladie. Par ailleurs, on peut envisager également une modification génétique directement in vitro sur nos iPSC d’individus sains (nos iPSC de travail) afin d’avoir des modèles murins avec des cellules humaines ayant une mutation génétique spécifique.
Procédures
L'humanisation des animaux se fera via l'injection en intraveineux de cellules iPSC. Des prélèvements sanguins auront lieu au bout de 3 mois après l'humanisation sur animal endormi au niveau du sinus retro-orbital. Les prélèvements auront lieu toutes les 2 semaines alternativement à l'oeil gauche puis à l'oeil droit jusqu'à la fin du protocole.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons des souris NSG qui sont des animaux immunodéficients et par ce fait, sont très sensibles aux infections. Pour ce protocole, les souris pourront avoir une douleur localisée et momentanée au niveau du site d’injection de la greffe. Elles pourront ressentir un stress dû aux manipulations et prélèvements répétés (pesée, prélèvement de sang) ainsi qu’à l’irradiation. L’injection des cellules en soi, peut être rejetée ou bien provoquer la maladie du greffon contre l’hôte (GVHD). Ainsi, les souris seront examinées quotidiennement pour évaluer la présence de symptômes.
Devenir
A l'issu de la procédure tout les animaux seront mis mort afin de faire des prélèvements
Remplacement
Beaucoup d’étude sur le système immunitaire ont été réalisées in vitro mais de par sa complexité il est essentiel de l’étudier in vivo dans son ensemble. Et pour cela, un des moyens d’étudier le système immunitaire humain est d’utiliser des modèles murins humanisés, c’est-à-dire, ayant un système immunitaire humain. C’est donc dans ces perspectives d’étude du système immunitaire que nous souhaitons créer ce modèle murin à partir de cellules issues d’iPSC. Mais avant cela, notre laboratoire a réalisé beaucoup d’études uniquement in vitro pour ce projet afin de trouver le bon protocole de culture cellulaire et le passage chez l’animal se fait uniquement avec des cellules dont les propriétés sont celles souhaitées par notre équipe pour le développement du système immun humain chez la souris. Aucun autre test sera réalisé avec des cellules n’ayant pas ces propriétés pour ne pas utiliser d’animaux inutilement.
Réduction
L’efficacité de notre modèle de souris humanisées sera étudiée par le biais de tests statistiques. Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement analysables et de sorte d’avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus. Ce nombre prend aussi en compte le risque de GVHD et de rejet de greffe. Ce nombre de groupes de souris a été défini par la loi normale. Pour juger de l’efficacité de notre protocole, des prélèvements sanguins seront faits afin d’analyser, via la cytométrie en flux, les différentes populations immunitaires chez les animaux. Afin de comparer les groupes entre eux l’analyse des populations se fera via le test one way RM ANOVA
Raffinement
Les souris NSG seront distribuées par 5 maximum par cage avec des moyens d’enrichissement propre à l’espèce (frisottis, dôme et tunnel). Les souris étant immunodéficientes, les cages seront entreposées sur un portoir ventilé et les animaux manipulés sous hottes avec des équipements de protection adaptés pour éviter toute infection. Une surveillance quotidienne des animaux en protocole sera réalisée pour déceler un éventuel problème chez une souris (blessure, forte souffrance non observée auparavant) par les expérimentateurs ou les animaliers. De plus pour déceler les signes éventuels d’une GVHD ou de rejet de greffe, une observation plus attentive sera effectuée une fois par semaine selon une liste de symptômes permettant d’évaluer ces processus avec une grille de score (voir tableau annexe). Le même jour, les animaux seront pesés (pesée une fois par semaine) afin de constater une éventuelle perte de poids. Une souris avec l’un des symptômes suivants : perte de 20% du poids par rapport à J0, un refus d’alimentation, une incapacité de mouvement, une voussure sévère du dos ou une diarrhée sanguinolente, aura atteint un point limite et sera mise à mort. L’atteinte d’un score clinique de 9 points ou plus est également considéré comme un point limite. Les animaux souffrants seront séparés des autres pour leur offrir une facilité d’accès à la nourriture et l’eau. Concernant les injections, un système de contention adapté sera utilisé et une pommade anesthésiante sera appliquée avant l’introduction de la seringue. Après le prélèvement, du collyre à la lidocaïne sera déposé sur les yeux. Un change de litière (minimum 1 fois par semaine) sera réalisé. Un contrôle de l’alimentation et des boissons sera effectué à chaque passage, soit par l’utilisateur, soit par les animaliers. La salle d’hébergement est soumise au rythme jour/nuit et à une isolation efficace afin de limiter les bruits. L’accès à l’animalerie est strictement limité au personnel autorisé. Les personnels habilités à accéder à l’animalerie doivent revêtir une tenue adaptée avec charlotte, masque, sabot et gant.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris immuno-déficiente pour deux raisons principales : *La souris présente une facilité d'hébergement et de manipulation. *Ces souris immuno-déficientes permettent l'acceptation d’une greffe des cellules immunes humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules humaines seraient rejetées par le système immunitaire murin. Les animaux utilisés auront 5 semaines en début de protocole. C’est l’âge idéale décrit dans la littérature et selon l’expérience de notre laboratoire pour injecter des cellules humaines chez des souris.
Validation d’un nouvel imageur par bioluminescence et fluorescence (Cy5) dans un modèle tumoral murin syngénique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour valider un nouvel appareil d'imagerie de la plateforme, 18 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Chaque animal porte une tumeur implantée, reçoit des injections dont une par voie rétro-orbitaire et subit cinq séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur reconnaît une finalité strictement technique, sans bénéfice thérapeutique pour les animaux utilisés. Il annonce que cette validation réduira à terme le nombre d'animaux des projets ultérieurs.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de valider le bon fonctionnement, la sensibilité et les limites d’un nouvel imageur récemment installé sur la plateforme. De plus, nous comparerons les résultats obtenus avec l’appareil déjà en place pour valider la continuité de nos résultats. Pour ce faire, nous utiliserons un modèle standardisé et déjà décrit. Ces appareils permettent de réaliser des mesures en bioluminescence et en fluorescence. La validation reposera sur : 1- une lignée cellulaire de cancer du sein exprimant la luciférase pour la technologie de bioluminescence 2- le suivi d’un marqueur fluorescent de référence 3- une démonstration in vitro puis in vivo (preuve de concept). Ce projet a pour objectif une finalité technique et méthodologique.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est la validation technique et méthodologique d’un nouvel imageur destiné à l’imagerie optique par bioluminescence et fluorescence. Cette validation permettra de garantir la fiabilité, la sensibilité et les limites d’utilisation de l’équipement avant son emploi dans des projets de recherche impliquant des modèles animaux. Les résultats obtenus fourniront un cadre de référence standardisé pour les futurs utilisateurs de la plateforme, facilitant le choix des marqueurs, des paramètres d’acquisition et des conditions expérimentales adaptées, et contribuant ainsi à une meilleure qualité et reproductibilité des données générées. Sur le plan de l’éthique animale, ce projet permettra, à moyen terme, une optimisation des protocoles d’imagerie, conduisant à une réduction du nombre d’animaux nécessaires dans les projets ultérieurs grâce à une meilleure anticipation des limites techniques et à l’utilisation de modalités d’imagerie adaptées. Enfin, ce travail renforcera les capacités technologiques de la plateforme et favorisera le développement de projets de recherche translationnelle reposant sur des approches d’imagerie non invasives, sans finalité thérapeutique directe pour les animaux inclus dans ce projet.
Procédures
Avant la procédure, afin de garantir les résultats d'imagerie, les animaux seront rasés et dépilés sur la zone d’injection et à imager. Cette opération dure une dizaine de minute. Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée unique. Cette procédure dure une minute. Un tiers des animaux peuvent être soumis à une injection intra-veineuse au niveau de la queue avec maintien en contention dans une boite prévue à cet effet durant une période de 3 à 5 minutes selon la difficulté de l'injection. Un autre tiers des animaux seront maintenu en contention et auront une injection unique en rétro orbital (moins d'une minute/souris). Tous les animaux seront soumis à 5 séances d'imagerie sous anesthésie générale (durée de 5 minutes/souris). Trois prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux avant, pendant et à la fin des tests. Ce geste dure environ une minute. Afin de réaliser le suivi et de collecter les données, 3 fois par semaine, les animaux seront pesés et tenus en contention afin de mesurer la tumeur au pied à coulisse. Cette procédure dure environ 2 minutes/souris/
Impact sur les animaux
Les procédures prévues dans le cadre de ce projet sont limitées à des interventions standardisées et couramment utilisées en expérimentation animale, incluant l’injection de cellules tumorales, l’administration de traceurs, l’anesthésie gazeuse transitoire et des séances d’imagerie non invasive. Les nuisances attendues sont principalement liées aux manipulations et aux anesthésies répétées de courte durée, susceptibles d’entraîner un stress transitoire chez les animaux. L’implantation tumorale peut conduire à une gêne progressive liée à la croissance de la masse tumorale sous-cutanée ; toutefois, cette évolution est bien maîtrisée et strictement surveillée. Aucun effet indésirable spécifique n’est attendu suite à l’administration de la D-luciférine ou du fluorophore Cy5 aux doses utilisées, ces produits étant largement décrits comme bien tolérés. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier, incluant l’évaluation de l’état général et la mesure du volume tumoral. Des critères d’arrêt anticipé seront appliqués afin de prévenir toute souffrance excessive, notamment en cas de croissance tumorale rapide, de signes de nécrose, de perte d’état général ou de comportement anormal. Les animaux vont ressentir un stress lors de la contention pour la prise de sang et une douleur légère lors de l’insertion de l’aiguille pour le prélèvement.
Devenir
Les animaux sont maintenus en vie après les interventions intermédiaires (injection cellulaire, pesées, mesures tumorales, prélèvements sanguins, séances d’imagerie) afin de permettre l’évaluation longitudinale des signaux bioluminescents et fluorescents. À l’issue de l’expérimentation, ou dès l’atteinte des points limites prédéfinis (volume tumoral maximal autorisé, altération de l’état général, ulcération tumorale, détresse), les animaux seront mis à mort pour prélèvement de tumeurs, conformément à la réglementation en vigueur.
Remplacement
Le recours au modèle animal est précédé d’une phase de validation in vitro, permettant de vérifier le bon fonctionnement de l’imageur, la détectabilité des signaux et les paramètres d’acquisition dans des conditions contrôlées. Cette étape permet de limiter le recours aux animaux et d’écarter les conditions non adaptées avant toute expérimentation in vivo. Aucune alternative non animale ne permet cependant de reproduire les conditions physiologiques nécessaires à la validation complète de l’imagerie in vivo (comme l’interaction du signal avec la peau ou les organes).
Réduction
Le nombre d’animaux sera strictement limité au minimum nécessaire pour évaluer les performances du nouvel imageur et démontrer que les données produites par celui-ci sont compatibles avec les données obtenues par le service auparavant. Les mêmes animaux seront utilisés pour les acquisitions de bioluminescences et de fluorescences. La maîtrise préalable du modèle tumoral utilisé permet en outre d’optimiser les conditions expérimentales et d’éviter toute surconsommation d’animaux.
Raffinement
Les procédures appliquées sont non invasives ou faiblement invasives et réalisées selon des protocoles standardisés. Les acquisitions d’imagerie seront effectuées sous anesthésie gazeuse de courte durée afin de réduire le stress et la douleur. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier, incluant la surveillance de l’état général et de la croissance tumorale. Des critères d’arrêt anticipé stricts seront appliqués afin de prévenir toute souffrance excessive. L’euthanasie sera réalisée avant l’atteinte des points limites réglementaires.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme espèce animale pour ce projet en raison de sa large utilisation et de sa pertinence reconnue dans les études d’imagerie optique in vivo. Sa taille, sa physiologie et sa compatibilité avec les systèmes d’imagerie par bioluminescence et fluorescence permettent une acquisition fiable et reproductible des signaux dans des conditions standardisées. Le modèle tumoral murin utilisé, implanté chez des souris C57BL/6 immunocompétentes, permet de préserver un environnement physiologique et immunologique intact, condition essentielle pour une validation réaliste des performances de l’imageur. Ce modèle est particulièrement adapté à une approche méthodologique, car il est bien caractérisé, reproductible et maîtrisé par l’équipe expérimentale. Aucune autre espèce animale ne permettrait de répondre aux objectifs du projet avec un niveau équivalent de pertinence scientifique et technique, notamment pour l’évaluation de la pénétration tissulaire, du bruit de fond et des limites de détection des signaux optiques in vivo. Le recours à la souris est ainsi pleinement justifié au regard des objectifs strictement techniques et de validation de ce projet. Le choix de l’âge de 6 à 8 semaines en début d’étude, soit le stade de jeunes adultes, est pertinent pour cette étude. Il permet d’avoir des individus pleinement développés à un stade fréquent pour ce type d’étude.