Rongeurs

9 000 souris et rats vont être utilisés pour des tests de sécurité réglementaires exigés avant les essais cliniques de médicaments, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des molécules candidates, subissent des prélèvements, sont isolés jusqu'à douze heures pour mesurer leur respiration, et une partie porte un émetteur cardiaque implanté par chirurgie. Le porteur présente l'établissement comme spécialisé dans ces études commandées par des clients, et affirme qu'aucun modèle ne remplace l'animal pour prédire la toxicité. La plupart sont tués à l'issue, une partie des rats réutilisée dans des procédures sans réveil, quelques témoins adoptés.

Objectifs

L’établissement utilisateur est spécialisé dans la conduite d’études de toxicologie/pharmacologie réglementaires, lesquelles sont indispensables pour initier l’évaluation clinique d’un xénobiotique. La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique d’un futur médicament. Préalablement aux études cliniques, les effets d’une molécule sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. Du fait de la complexité des organismes vivants, il n’existe actuellement aucun modèle de remplacement pour prédire les effets pharmacologiques d’une molécule. Seule l’expérimentation animale permet de définir leur innocuité afin de sécuriser les premiers essais chez l’humain. Pour atteindre cet objectif, et en accord avec les recommandations internationales, la présente autorisation de projet permettra de caractériser les effets adverses de molécules sur les systèmes respiratoire, nerveux central et cardiovasculaire chez le rongeur. L’évaluation de la fonction respiratoire (rat/souris) se fera par pléthysmographie corporelle. Cette méthode permettra de déterminer les fréquences et volumes respiratoires.L'évaluation de la fonction neurologique (rat/souris) se fera par évaluation neurocomportementale. L'évaluation cardiologique (rat uniquement) se fera par électrocardiographie implantée ou externe (non invasive). La conduite de ces études de pharmacologie de sécurité conduira à la production d’un rapport décrivant les effets adverses du composé testé.

Bénéfices attendus

Actuellement dans le monde, les maladies cardiovasculaires font 17,9 millions (M) de morts par an, les cancers 10 M/an, les maladies neurologiques 9 M/an, les maladies infectieuses 7,7 M/an, les maladies respiratoires chroniques 3,9 M/an, le diabète 1,5 M/an. Pour un grand nombre de ces pathologies, il n’existe aucune solution thérapeutique satisfaisante. Cette demande d’autorisation de projet permettra de couvrir une étape importante, et indispensable sur le plan réglementaire, du développement de composés innovants. La pharmacologie de sécurité est un élément réglementaire indispensable dans le développement préclinique d’une molécule. Préalablement aux études cliniques, les effets d’un composé thérapeutique sur les fonctions vitales (respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires) doivent être caractérisés chez l’animal en respectant les Bonnes Pratiques de Laboratoire. La conduite d’études de pharmacologie de sécurité permettra : 1. d’améliorer la qualité de vie des patients, en permettant à de nouvelles molécules d’entrer en clinique 2. d’améliorer la sécurité des patients, en identifiant et caractérisant les effets indésirables d’une molécule 3. d’optimiser les doses thérapeutiques en identifiant précocement les doses efficaces optimales et les effets secondaires 4. de contribuer à la recherche scientifique. Les résultats de ces projets enrichiront les connaissances scientifiques sur les mécanismes d'action et les profils de sécurité de nouvelles familles de molécules 5. de réduire les coûts de santé en améliorant la sécurité et l'efficacité des traitements 6. de répondre aux exigences réglementaires en matière de sécurité afin d’obtenir l’autorisation d’essais cliniques Donc, à court terme, le bénéfice premier de la mise en œuvre de ce projet sera l’établissement du profil toxicologique/pharmacologique d’une molécule. A plus long terme, les données obtenues au travers des études de pharmacologie de sécurité feront partie intégrante des dossiers règlementaires qui permettront de motiver une demande d’essai clinique qui débouchera potentiellement sur la commercialisation d’un nouveau médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à l'administration d'un composé thérapeutique par différentes voies selon les caractéristiques du composé testé ainsi que des prélèvements saugins. Les volumes et fréquences d'administration et de prélèvements sont établies en fonction des caractéristiques de chaque composé testé, dans le respect des recommandations des instances pharmacologiques et médicales internationales. Les animaux sont généralement anesthésiés pour ces prélèvements, mais peuvent être vigiable pour les administrations. Chaque geste dure généralement quelques minutes. Pour évaluer la fonction respiratoire, les animaux sont isolés dans un plesthymographe après une période d'habituation, au moins 30 minutes, généralement 6h et jusqu'à 12h maximum. Pour évaluer la fonction neurologique, des contentions et tests neurologiques sont effectués vigiles, pendant 10 minutes environ. Pour évaluer la fonction cardiovasculaire, les animaux utilisés auront un émétteur télémétrique implanté par chirurgie avec la procédure décrite dans cette autorisation, ou bien auront un gilet (système non invasif) pouvant être porté en continue pusieurs jours d'affilée.

Impact sur les animaux

Quatres catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. 1) Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress modéré. 2) Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de sang et l’administration de la molécule testée peut provoquer des lésions locales et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. 3) Liés à l'isolement physique pendant les enregistrements cardiovasculaires (24 à 72h maximum, généralement moins de 30 heures ; 4) Liées à une toxicité de la molécule testée : ce projet vise à évaluer les effets pharmacologiques, y compris délétères, d’une molécule. Cependant, les recommandations internationnales des agences de santé qui sont appliqué par l'établissement sont de choisir une dose ne produisant que des effets indésirables au maximum modérés, il n’est donc pas attendu d’effets toxiques majeurs dans les études de pharmacologie.

Devenir

Afin d'éviter tout risque pour l'animal ou la santé publique, les animaux sont en 1er intention euthanasiés en fin de procédure. Une partie des animaux, généralement les rats disposant d'un émétteur télémétrique, peuvent être réutilisé dans des procédures sans réveil (ex : prélèvement d'organes). Dans certains cas, les animaux des groupes témoins peuvent être adopté, après avis vétérinaire et validation de la SBEA. La décision est prise au cas par cas, en fonction du protocole expérimentale de l'étude et du composé utilisé dans le groupe témoin.

Remplacement

La pharmacologie de sécurité étudie les interactions entre une molécule extérieur au corps et une ou plusieurs cibles en lien avec les systèmes respiratoires, neurologiques et cardiovasculaires. Ces interactions recouvrent les effets potentiels de la molécules, ou de ses produits de dégradation sur les fonctions étudiées. Une bonne compréhension des mécanismes de toxicité est donc indissociable d’une bonne connaissance des mécanismes physiologiques, développementaux, cellulaires et moléculaires. Actuellement, l’ensemble des cibles potentielles et les mécanismes conduisant à une toxicité ne sont pas complètement élucidés et ne peuvent donc pas être modélisés. Il n’existe donc pas de modèle de remplacement. C’est pour cela que la règlementation impose d’évaluer la toxicité potentielle d’un composé thérapeutique avant tout essais chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dans les études de pharmacologie de sécurité : • nous nous assurerons de la validité et de la prédictivité des données acquises avant de démarrer toute expérimentation, pour ne pas évaluer des composés non pertinents • si nécessaire, des études pilotes seront réalisées. Elles auront pour objectif d’évaluer graduellement la toxicité des composés et de rechercher les doses les plus prometteuses sur un nombre limité d’animaux Concernant les études de pharmacologie de sécurité : le nombre d’animaux est fixé au minimum permettant de détecter statistiquement des effets adverses.

Raffinement

Le raffinement de nos procédures inclue : • la gestion du stress et de l’angoisse : les animaux seront acclimatés (animalerie, nouveaux congénères, environnements de test) pendant 5 à 15 jours selon le protocole, et habitués à la manipulation et à la contention. Ils seront également hébergés à au moins par cage, pour augmenter les interactions sociales, dans un environnement enrichi • la prise en charge précoce de la douleur : un même opérateur observera matin et soir chaque animal. La douleur sera objectivée en fonction de modifications de l'apparence, de la posture et du comportement. En parallèle, une échelle de douleur sera employée et un analgésique sera mis en place si nécessaire, après validation par un vétérinaire. • des soins vétérinaires adaptés seront mis en place si nécessaires : compléments alimentaires, sérum physiologique, antibiotique, analgésique • l’intégration de points limites stricts : une grille précise d’évaluation sera utilisée afin d’anticiper la mise à mort si nécessaire. Dans tous les cas, l’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, exception faite des animaux implantés avec un boitier de télémétrie. Spécifiquement pour les études de cardiologie, la méthode validée nécessite l'implantation chirurgicale d'un module de télémétrie. Afin de rendre cette technique moins invasive, l'utilisation d'un module externe avec des électrodes de surface placé dans un gilet est en cours d'évaluation. MODIFICATION : en cas d'isolement pour des mesures télémétriques de plus de 24h, l'enrichissement est doublé et des friandises apétentes sont rajoutées aux copeaux.

Choix des espèces

Les études de pharmacologie réglementaire in vivo sont régies par des textes internationnaux. Ces études peuvent être réalisées sur des espèces rongeur et non rongeur. Le rat et la souris sont 2 espèces retenues pour ces études du fait de leur prédictivité et font l’objet de cette DAP. Les animaux sont utilisés à partir de 5 semaines. Les données récuillies sur les études de la fonction neurologique et la fonction respiratoire sont plus robuste sur des animaux de 5-8 semaines et 8-12 semaines respectivement.

Entraînés à s'auto-administrer de la cocaïne par voie intraveineuse jusqu'à deux heures par jour pendant plusieurs mois, avec chocs électriques et stress de contention répétés, 1 024 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. Une partie subit une chirurgie d'implantation d'un cathéter et d'une fibre intracérébrale pouvant durer deux heures trente, ainsi qu'une restriction alimentaire. Le porteur décrit des chocs électriques "légers" et une frustration "transitoire" au moment de replacer les animaux dans les boîtes à drogue. Le projet cherche des marqueurs de vulnérabilité à l'addiction liés à un récepteur présent chez 40 % des Européens.

Objectifs

La dépendance à la cocaïne, un problème majeur de santé publique, se caractérise par le passage d’une consommation récréative à une recherche compulsive et incontrôlée de la drogue. Cette transition s’accompagne de changements dans l’activité de certains neurones. Ces altérations impliquent une molécule présente chez 40 % des Européens, et qui pourrait influencer la vulnérabilité à l’addiction. L’objectif global du projet est de préciser son rôle dans la vulnérabilité à développer une dépendance à la cocaïne ainsi que les mécanismes sous-jacents qui ne sont pas encore élucidés. Plus précisément, les objectifs sont i) de mieux caractériser le rôle de cette molécule dans l’usage compulsif de cocaïne, ii) d’identifier des marqueurs de vulnérabilité au développement d’une consommation compulsive de cocaïne, iii) de tester l’impact d’agents pharmacologiques sur cet usage compulsif dans une perspective thérapeutique.

Bénéfices attendus

La dépendance aux drogues d’abus est un problème majeur de santé publique et leur prévalence s’accroit sans aucun traitement suffisamment efficace à ce jour. Ce projet permettra d’identifier des marqueurs de vulnérabilité au développement d’addictions et en particulier à l’addiction à la cocaïne. A court terme, il permettra d’identifier des marqueurs neurobiologiques ou comportementaux associés à des conduites addictives, grâce à des approches précliniques impossibles à mettre en œuvre en recherche clinique. Ces marqueurs pourraient ensuite permettre d’identifier de potentiels individus à risque afin de mettre en place une meilleure prévention. De plus, tester dans nos modèles comportementaux des composés pharmacologiques capables de cibler l’aspect compulsif de l’addiction pourrait permettre d’établir de nouvelles pistes thérapeutiques pour lequel des données suggèrent un rôle clé dans la vulnérabilité au développement d’un usage compulsif.

Procédures

Les animaux seront soumis à des sessions d’auto-administration intraveineuse de cocaïne de 2 heures maximum par jour, pendant plusieurs mois, au cours desquelles ils recevront parfois un choc électrique d’intensité légère pouvant entrainer un inconfort pendant quelques secondes maximum. Ils seront également soumis une fois et pour 30 minutes maximum, à des tests d’exposition à la nouveauté et à la sensibilité à un stimulus aversif, susceptibles d’entraîner un stress passager. Certains animaux seront soumis à des tests comportementaux quotidiens d’1h maximum par jour, pendant plusieurs mois. Les animaux ne seront pas soumis à plus d’un test de comportement par jour. Les animaux seront soumis à une très légère restriction de nourriture pendant la durée de l’expérience. En outre, certains animaux seront soumis à une ou deux procédures chirurgicales au cours desquelles un cathéter sera implanté dans la veine jugulaire et/ou une injection et implantation intracérébrale sera réalisée. La chirurgie dure environ 30 minutes (pose du cathéter) à 2h30 (injection et implantation d’une fibre optique) puis l’animal aura une semaine minimum pour récupérer. Certains animaux recevront des injections intrapéritonéales de composés pharmacologiques, répétées maximum 9 fois par animal, avec au moins 3 jours d’écart entre chaque injection. Certains animaux recevront des injections intrapéritonéales de cocaïne, répétées maximum 5 fois par animal, avec au moins 1 jour d’écart entre chaque injection. Enfin, certains animaux seront exposés à un stress aigu de contention pendant 1 heure, jusqu’à 4 fois espacées d’une semaine minimum.

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à voir l’apparition d’états d’inconfort, de douleur ou de stress passagers chez certains animaux soumis à une privation alimentaire légère, à des chocs électriques d’intensité légère à modérée, ou à un stimulus aversif comme de la chaleur (mais qu’ils peuvent éviter immédiatement en déplaçant leur patte) ou un stress de contention aigu, ou à une chirurgie qui peut se trouver associée à une douleur et inconfort modérés. La frustration transitoire que les animaux pourraient ressentir apparaîtra lors de leur remise dans les boîtes d’auto-administration de drogue.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car les cerveaux seront prélevés pour des expériences ex vivo.

Remplacement

Pour étudier les aspects compulsifs de l’usage de cocaïne, et identifier les mécanismes neurobiologiques mis en jeu, il est essentiel de faire des mesures sur des modèles animaux ayant un système nerveux entier et fonctionnel. Il est crucial d’étudier les comportements et les états émotionnels associés à une prise volontaire de drogue et les états psychologiques associés à ses effets addictifs au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’humain. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique intègre entre les différentes régions du cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisant pour en faire des modèles d’étude pertinents.

Réduction

Dans nos études et la plupart des travaux sur l’usage compulsif de cocaïne chez le rat en général, seule une fraction des animaux (environ 15%) vont développer des signes d’addiction à la cocaïne. Il est donc nécessaire de tester au moins 40 animaux pour obtenir un minimum d’environ 6 individus compulsifs, respectivement, par groupe expérimental, sexe et conditions pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Un groupe contrôle adapté d’animaux sera systématiquement prévu pour chaque jeu d’expériences et sera spécifique de chaque condition expérimentale testée. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et des modèles et souches d’animaux qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle les mêmes souches de rats sont couramment utilisées. Notre expérience en chirurgie intracérébrale, études comportementales et marquages cellulaires nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre groupes, sexes et conditions pour comparer les groupes. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car leurs cerveaux seront systématiquement prélevés à l’issue des expériences pour effectuer des vérifications et mesures de marqueurs neurophysiologiques. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.

Raffinement

Avant chaque expérience nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Pendant toutes les expériences de comportement les animaux seront manipulés très régulièrement (presque tous les jours), ce qui les rend très peu réactifs émotionnellement à la manipulation, et ce qui permet de détecter le moindre changement d’attitude ou l’apparition de signes externes inquiétants. Pour les autres expériences, ils seront laissés tranquille dans leurs cages au maximum et surveillés plusieurs fois par semaine. Concernant les chirurgies, des antidouleurs seront appliqués au moins 30 min avant la chirurgie, durant et après. L’état général et les signes de douleur des animaux seront évalués régulièrement, selon la grille d’évaluation du comité responsable du bien-être animal. Au moins une fois par jour en post-chirurgie pendant 5 jours les animaux sont examinés pour des signes de détresse (changements de posture, yeux plissés, manque de toilettage) et l’incision est examinée pour signes d’infection. Si nécessaire, des doses supplémentaires d’analgésique seront données, du gel nutritif sera donné, de la litière douce sera utilisée, l’enrichissement sera renforcé par trois enrichissements (bloc de bois, tunnel en carton et brique en T), et une réhydratation sous-cutanée sera réalisée. Si au bout de 24h le traitement s’avère inefficace et les points limites atteints les animaux seront mis à mort. Pour l’ensemble du projet une pesée quotidienne et l’utilisation des traitements décrits ci-dessus seront appliqués en cas de dégradation de l’état de l’animal avant atteinte des points limites. Pour les animaux en hébergement individuel, il y aura renforcement de l’enrichissement (bloc de bois, tunnel en carton et brique en T), et un contact humain impliquant une manipulation douce quasiment quotidienne, et contacts auditifs, visuels et olfactifs avec les autres rats, car les cages sont transparentes et l’hébergement individuel n’est pas complètement hermétique. Les points limites correspondant au score 1 selon la grille d’évaluation conduiront à la mise au repos avec surveillance quotidienne de l’état et du poids, et mise à disposition de gel nutritif dans la cage si dénutrition. Les points limites correspondant au score 2 selon la grille d’évaluation conduiront à la mise à mort par dose létale de CO2.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre ce projet). Le rat est, en outre, un modèle particulièrement intéressant lorsqu'on souhaite étudier des fonctions cognitives complexes et particulièrement pour des tests cognitifs basés sur nos technologies sur une longue période qui présentent une forte valeur translationnelle. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mâture pour la réussite et la reproductibilité des interventions, et l’homogénéité de leur comportement.

Deuxième volet mené dans un autre établissement, ce projet utilise 1 491 souris supplémentaires, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Comme dans son jumeau, elles sont irradiées, greffées de moelle osseuse, puis soumises à des prélèvements de sang répétés et à des gavages, pour étudier les mégacaryocytes dans des cancers du sang. Le porteur reprend la même justification, l'absence de modèle in vitro reproduisant la fibrose de la moelle. Les pistes thérapeutiques annoncées pour les patients restent lointaines.

Objectifs

Introduction : Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des cancers du sang où la moelle osseuse fabrique trop de cellules, notamment trop de globules rouges et de plaquettes. Avec le temps, cette surproduction abîme la moelle et crée des cicatrices (myélofibrose), ce qui empêche de produire correctement le sang. Cela peut provoquer de la fatigue, un risque d’infections plus élevé, et parfois même une évolution d’autres types plus graves de cancers du sang. Les mégacaryocytes, les cellules qui fabriquent les plaquettes, jouent un rôle clé dans cette dégradation de la moelle. Pourtant, les traitements actuels n’agissent pas spécifiquement sur ces cellules, ce qui limite leur efficacité. Trouver des traitements capables de cibler directement les mégacaryocytes pourrait permettre d’améliorer la santé et la qualité de vie des patients atteints de NMP. Objectif général : Identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblant spécifiquement les mégacaryocytes, en étudiant leur fonctionnement dans les NMP. Le projet sera réalisé dans deux établissements.

Bénéfices attendus

En plus d’améliorer nos connaissances sur le rôle des mégacaryocytes dans les NMP, l’objectif final de cette étude est d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques capables de freiner la progression de la myélofibrose et, à terme, d’améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés chez des souris vigiles, à raison d’un maximum de dix prélèvements par animal sur une durée totale de 36 à 40 semaines (soit un prélèvement toutes les quatre semaines). Chaque prélèvement aura une durée inférieure à cinq minutes. Certaines souris recevront des traitements administrés par injection et/ou par gavage, à raison d’un maximum de deux injections et de deux gavages par jour, sur une durée maximale de huit semaines consécutives. Ces gestes seront réalisés chez des animaux vigiles et auront une durée inférieure à une minute chacun. Certaines souris vigiles seront préalablement irradiées et transplantées (moelle osseuse). Le geste, réalisé sur animal vigile, dure au maximum 10 minutes. Enfin, un prélèvement sanguin terminal sera effectué chez certains animaux, sous anesthésie profonde sans réveil, pour une durée totale estimée à environ dix minutes

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des souris, nécessaires pour la réalisation des gestes ci-après, entraînent un léger stress de courte durée : - Injections: la piqûre entraîne une douleur légère et passagère. - Prélèvement sanguin à la queue : l’entaille d’une veine va provoquer une douleur aigue et passagère. - Irradiation des souris : l’irradiation entraîne une destruction transitoire de la moelle osseuse, provoquant une fatigue passagère et une activité réduite pendant quelques jours. Les symptômes seront corrigés par une transplantation de moelle osseuse. Le transport vers l’irradiateur et l’espace restreint dans les boîtes d’irradiation peut induire un stress léger et temporaire. - Gavage oral : le passage de la sonde peut provoquer une irritation légère et transitoire de l’œsophage. - Modèles de souris NMP : Pas de nuisance lors du développement de la maladie, qui est indolore.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour pouvoir collecter les principaux échantillons nécessaires aux différentes analyses mises en œuvre dans ce projet (os, rate, poumons…).

Remplacement

Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des cancers du sang dans lesquelles certaines cellules deviennent anormales et perturbent le fonctionnement de la moelle osseuse, le lieu de production de toutes les cellules sanguines. Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle in vitro en laboratoire capable de reproduire correctement ce qui se passe dans l’organisme, notamment l’apparition progressive de la fibrose (cicatrisation) dans la moelle. L’utilisation de modèles de souris est donc indispensable pour permettre de mieux comprendre l’évolution de ces maladies et, à terme, d’identifier de nouvelles pistes de traitement plus efficaces pour les patients.

Réduction

Les effectifs ont été définis en amont grâce à une approche statistique, afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux tout en garantissant des résultats fiables. Cette estimation tient compte de la variabilité attendue et des objectifs scientifiques du projet.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et leur utilisation sera respectée (valable uniquement pour les souris achetées). Une habituation à la manipulation et à la contention sera réalisée 5 jours avant le début des expérimentations. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : - Par l’hébergement dans des cages en groupes sociaux. - Par un enrichissement dans la cage de nids, coton compressé et de frisure de papier kraft afin de permettre aux animaux de construire un nid et augmenter la diversité de leur comportement. - Par l’utilisation de boites de transport dédiées en conservant la composition des cages d’origine, et contenant une litière propre, du matériel d’enrichissement comme des nids ainsi que de la nourriture liquide et du gel d’hydratation, afin de limiter le stress et de garantir leur confort pendant le déplacement vers et au retour de l’irradiateur. - Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de gestes invasifs. - Par l’installation de l’animal dans une enceinte thermostatée après administration de l’anesthésie, puis sur une plaque chauffée, afin lutter contre l’hypothermie pendant les gestes invasifs. - Par l’injection d’analgésique avant les gestes invasifs.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée car la formation du sang et le fonctionnement de la moelle osseuse y sont bien connus et très proches de ceux de l’être humain. C’est également la seule espèce pour laquelle il existe des modèles génétiquement modifiés reproduisant les NMP. Ces modèles permettent d’observer l’ensemble des caractéristiques de la maladie telles qu’elles apparaissent chez les patients, y compris la fibrose de la moelle osseuse et les réponses aux traitements utilisés en clinique. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (entre 6 et 40 semaines), période durant laquelle il est possible d’étudier à la fois l’apparition de la maladie et son évolution vers des formes plus sévères.

Irradiées pour détruire leur moelle osseuse puis greffées, 1 491 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent jusqu'à dix prélèvements de sang sur près de dix mois, des injections et des gavages, avant un prélèvement terminal sous anesthésie sans réveil. Le projet étudie le rôle des mégacaryocytes dans des cancers du sang, pour ouvrir des pistes de traitement. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la fibrose de la moelle, ce qui rendrait la souris "indispensable".

Objectifs

Introduction : Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des cancers du sang où la moelle osseuse fabrique trop de cellules, notamment trop de globules rouges et de plaquettes. Avec le temps, cette surproduction abîme la moelle et crée des cicatrices (myélofibrose), ce qui empêche de produire correctement le sang. Cela peut provoquer de la fatigue, un risque d’infections plus élevé, et parfois même une évolution d’autres types plus graves de cancers du sang. Les mégacaryocytes, les cellules qui fabriquent les plaquettes, jouent un rôle clé dans cette dégradation de la moelle. Pourtant, les traitements actuels n’agissent pas spécifiquement sur ces cellules, ce qui limite leur efficacité. Trouver des traitements capables de cibler directement les mégacaryocytes pourrait permettre d’améliorer la santé et la qualité de vie des patients atteints de NMP. Objectif général : Identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblant spécifiquement les mégacaryocytes, en étudiant leur fonctionnement dans les NMP. Le projet sera réalisé dans deux établissements.

Bénéfices attendus

En plus d’améliorer nos connaissances sur le rôle des mégacaryocytes dans les NMP, l’objectif final de cette étude est d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques capables de freiner la progression de la myélofibrose et, à terme, d’améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés chez des souris vigiles, à raison d’un maximum de dix prélèvements par animal sur une durée totale de 36 à 40 semaines (soit un prélèvement toutes les quatre semaines). Chaque prélèvement aura une durée inférieure à cinq minutes. Certaines souris recevront des traitements administrés par injection et/ou par gavage, à raison d’un maximum de deux injections et de deux gavages par jour, sur une durée maximale de huit semaines consécutives. Ces gestes seront réalisés chez des animaux vigiles et auront une durée inférieure à une minute chacun. Certaines souris vigiles seront préalablement irradiées et transplantées (moelle osseuse). Le geste, réalisé sur animal vigile, dure au maximum 10 minutes. Enfin, un prélèvement sanguin terminal sera effectué chez certains animaux, sous anesthésie profonde sans réveil, pour une durée totale estimée à environ dix minutes

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des souris, nécessaires pour la réalisation des gestes ci-après, entraînent un léger stress de courte durée : - Injections: la piqûre entraîne une douleur légère et passagère. - Prélèvement sanguin à la queue : l’entaille d’une veine va provoquer une douleur aigue et passagère. - Irradiation des souris : l’irradiation entraîne une destruction transitoire de la moelle osseuse, provoquant une fatigue passagère et une activité réduite pendant quelques jours. Les symptômes seront corrigés par une transplantation de moelle osseuse. Le transport vers l’irradiateur et l’espace restreint dans les boîtes d’irradiation peut induire un stress léger et temporaire. - Gavage oral : le passage de la sonde peut provoquer une irritation légère et transitoire de l’œsophage. - Modèles de souris NMP : Pas de nuisance lors du développement de la maladie, qui est indolore.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour pouvoir collecter les principaux échantillons nécessaires aux différentes analyses mises en œuvre dans ce projet (os, rate, poumons…).

Remplacement

Les néoplasmes myéloprolifératifs (NMP) sont des cancers du sang dans lesquelles certaines cellules deviennent anormales et perturbent le fonctionnement de la moelle osseuse, le lieu de production de toutes les cellules sanguines. Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle in vitro en laboratoire capable de reproduire correctement ce qui se passe dans l’organisme, notamment l’apparition progressive de la fibrose (cicatrisation) dans la moelle. L’utilisation de modèles de souris est donc indispensable pour permettre de mieux comprendre l’évolution de ces maladies et, à terme, d’identifier de nouvelles pistes de traitement plus efficaces pour les patients.

Réduction

Les effectifs ont été définis en amont grâce à une approche statistique, afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux tout en garantissant des résultats fiables. Cette estimation tient compte de la variabilité attendue et des objectifs scientifiques du projet.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et leur utilisation sera respectée (valable uniquement pour les souris achetées). Une habituation à la manipulation et à la contention sera réalisée 5 jours avant le début des expérimentations. Le stress et la douleur des animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : - Par l’hébergement dans des cages en groupes sociaux. - Par un enrichissement dans la cage de nids, coton compressé et de frisure de papier kraft afin de permettre aux animaux de construire un nid et augmenter la diversité de leur comportement. - Par l’utilisation de boites de transport dédiées en conservant la composition des cages d’origine, et contenant une litière propre, du matériel d’enrichissement comme des nids ainsi que de la nourriture liquide et du gel d’hydratation, afin de limiter le stress et de garantir leur confort pendant le déplacement vers et au retour de l’irradiateur. - Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de gestes invasifs. - Par l’installation de l’animal dans une enceinte thermostatée après administration de l’anesthésie, puis sur une plaque chauffée, afin lutter contre l’hypothermie pendant les gestes invasifs. - Par l’injection d’analgésique avant les gestes invasifs.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée car la formation du sang et le fonctionnement de la moelle osseuse y sont bien connus et très proches de ceux de l’être humain. C’est également la seule espèce pour laquelle il existe des modèles génétiquement modifiés reproduisant les NMP. Ces modèles permettent d’observer l’ensemble des caractéristiques de la maladie telles qu’elles apparaissent chez les patients, y compris la fibrose de la moelle osseuse et les réponses aux traitements utilisés en clinique. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (entre 6 et 40 semaines), période durant laquelle il est possible d’étudier à la fois l’apparition de la maladie et son évolution vers des formes plus sévères.

Ouvertes par laparotomie sous anesthésie pour recevoir une injection de cellules cancéreuses dans le pancréas, 2 380 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles subissent ensuite des prélèvements de sang, deux cycles de gavage et des injections répétées, sous une grille clinique qui déclenche la mise à mort au score de 4. Le projet teste un inhibiteur du cycle cellulaire, le palbociclib, seul ou en association, contre l'adénocarcinome du pancréas. Le porteur situe le bénéfice, pour les 40 à 50 % de patients porteurs de la délétion ciblée, au long terme.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier de nouvelles approches thérapeutiques ciblant la voie de signalisation du gène CDKN2A, impliqué dans le contrôle du cycle cellulaire ainsi que dans plusieurs aspects de la réponse immunitaire dans l’adénocarcinome pancréatique. Dans les tumeurs présentant une délétion de CDKN2A, les protéines CDK4/6 sont particulièrement activées. Le palbociclib, un inhibiteur de CDK4/6, a montré une activité antitumorale : il réduit la prolifération cellulaire et augmente l’infiltration tumorale par les cellules immunitaires, notamment les lymphocytes T. Depuis plusieurs années, nous avons développé et caractérisé des modèles murins de tumeur pancréatique orthotopique, et acquis une expertise dans l’analyse de la croissance tumorale et de l’immunité antitumorale via des techniques d’immunohistochimie, de biologie moléculaire et de cytométrie en flux. • La première procédure vise à évaluer l’effet du palbociclib en monothérapie dans des tumeurs pancréatiques. • La seconde procédure a pour objectif de déterminer si l’association du palbociclib à d’autres traitements immunomodulateurs permet d’améliorer la réponse thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont la mise en place des traitements antitumoraux spécifiques des tumeurs du pancréas qui portent la délétion du gène CDKN2A. Ces modèles tumoraux murins ont une relevance pré-clinique de l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC). Les bénéfices à long terme sont pour les patients avec délétion CDKN2A qui correspondent à 40-50% des patients PDAC.

Procédures

Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale, d’une durée d’environ 5 minutes, est réalisée. Elle consiste en une laparotomie suivie d’une injection intra pancréatique. Au cours de la cinétique expérimentale, les animaux seront soumis à : deux prélèvements sanguins, réalisés lors des séances d’échographie sous anesthésie générale ; deux cycles de gavage de 5 jours chacun ; trois injections intrapéritonéales (IP).

Impact sur les animaux

La durée expérimentale est d’environ 20 jours à partir de l’injection tumorale. Durant la première phase de croissance tumorale, les souris ne présentent généralement pas de signes cliniques de souffrance. À partir de 18 à 20 jours, certains animaux peuvent toutefois développer des signes liés au développement tumoral, tels qu’une altération progressive de l’état général, une diminution de la mobilité, une perte de poids pouvant évoluer vers un état de cachexie, ainsi qu’un aspect du pelage dégradé. Les manipulations nécessaires au suivi expérimental (capture, contention, pesées, injections répétées selon protocole) peuvent entraîner un stress ponctuel et une gêne transitoire. Les traitements administrés (palbociclib seul ou en association) sont susceptibles d’induire une baisse temporaire de l’activité ou de l’appétit, déjà décrite pour ces molécules. Afin d’assurer un suivi optimal et de prévenir l’installation d’une souffrance prolongée, une grille d’observation quotidienne (jointe en annexe) est utilisée pour évaluer l’ensemble des paramètres cliniques pertinents : état général, mobilité, prise alimentaire, hydratation, perte de poids, aspect du pelage et comportement. Toute dégradation des critères définis conduit à l’application stricte des points limites.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour le prelevement du pancreas et les analyses histologiques et par cytometrie en flux de la tumeur

Remplacement

Des approches alternatives ont été mises en œuvre afin de limiter au maximum le recours aux animaux dans ce projet. Analyses in silico pour l’identification des cibles immunothérapeutiques : Une étude in silico a été réalisée à partir des données de patients atteints de PDAC. Cette analyse a permis d’établir une liste de gènes dont l’expression est modulée par la délétion de CDKN2A. Cette stratégie permet de remplacer des expérimentations animales initiales, habituellement nécessaires pour la recherche et la sélection de nouvelles cibles immunitaires. Mise au point d’essais in vitro : Des tests d’activation des lymphocytes T par des cellules tumorales ont été développés en culture in vitro. Ces méthodes permettent d’évaluer la réponse immunitaire antitumorale sans recourir à des cohortes animales lors des phases exploratoires. Limites actuelles du remplacement : Malgré ces approches substitutives, l’utilisation d’animaux reste indispensable pour étudier : le comportement de la tumeur dans son microenvironnement pancréatique spécifique ; les interactions complexes avec le système immunitaire de l’hôte ; le recrutement intratumoral des cellules immunitaires pro et antitumorales. Aucune méthode alternative fiable ne permet actuellement de reproduire ces interactions in vivo de manière pertinente, ce qui rend l’emploi d’animaux nécessaire pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Nous utilisons une méthode d’imagerie par l’échographie qui permet de détecter la prise de tumeur et de la mesurer au cours du temps pour un suivi longitudinal de la croissance tumorale, évitant l’utilisation de plusieurs cohortes d’animaux à différentes périodes. A partir des expériences passées nous utilisons un calcul du nombre d’animaux par groupe à l’aide d’une formule d’estimation détaillé dans les procédures expérimentales qui permet de réduire le nombre d’animaux sur des bases statistiques. Le calcul statistique utilisé est fondé sur une estimation classique recommandée par le Comité d’éthique, basée sur la différence attendue de volume tumoral entre groupe contrôle et groupe traité. Le calcul de la taille d’effet repose sur la formule d = (μ0 – μ1) / δ, où μ représente le volume tumoral moyen et δ sa variance. Le nombre d’animaux minimal est ensuite estimé selon la formule n = 16 / d², permettant d’assurer une puissance statistique suffisante pour détecter une différence significative.

Raffinement

Des mesures de raffinement rigoureuses sont mises en œuvre afin d’assurer le bien être des animaux tout au long des procédures expérimentales. L’environnement d’hébergement est enrichi par l’ajout systématique de nestlets dans chaque cage, permettant de réduire le stress, favoriser les comportements naturels de nidification et améliorer le confort thermique. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été optimisés afin de minimiser toute douleur ou détresse liée aux interventions. Toutes les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale, un agent permettant un ajustement précis de la profondeur anesthésique et un réveil rapide et contrôlé. Une analgésie préopératoire et postopératoire est administrée systématiquement. Afin de détecter précocement d’éventuels signes de souffrance, une grille d’évaluation clinique standardisée est utilisée quotidiennement. Elle regroupe un ensemble de critères physiologiques et comportementaux, chacun noté par un score numérique. La somme de ces scores permet une évaluation objective et reproductible de l’état de l’animal. Le point limite expérimental est fixé à un score total de 4. À la date prévue de fin d’expérimentation (J20), les scores cliniques n’atteignent généralement pas cette valeur, sauf cas exceptionnels. Dès qu’un animal atteint ce seuil, son suivi expérimental est immédiatement interrompu et une mise à mort est réalisée conformément aux procédures réglementaires. La grille clinique repose sur sept critères correspondant à des altérations significatives : distension abdominale liée à la présence d’une masse tumorale importante, amaigrissement marqué avec diminution de la masse au niveau du bassin, dépilation localisée ou généralisée, arrêt du toilettage, apathie et absence d’interaction, apparition d’un comportement agressif inhabituel, et signes de cachexie. Ce système de scoring assure un suivi précis, standardisé et non subjectif des animaux. Il n’a jamais été observé de situation nécessitant l’isolement d’un animal, les symptômes apparaissant selon une cinétique similaire entre individus d’un même groupe.

Choix des espèces

La souris est l’espèce majoritairement utilisée pour les modèles du cancer du pancréas décrit dans la littérature, et ces modèles se prêtent généralement aisément à un transfert de technologie chez l’homme. De plus les modèles murins ont cet avantage d’avoir un catalogue de modifications génétiques et de lignées cellulaires important qui permettent un meilleur décryptage des voies de signalisation impliquées. Les souris sont âgées de 8-10 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux