Rongeurs

4 000 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à 32 instillations dans l'œil, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon la cohorte, la cornée est râpée de son épithélium sous anesthésie, une toxine bactérienne est instillée, ou les glandes lacrymales sont retirées chirurgicalement pour installer une sécheresse oculaire durable. Le porteur annonce comme effets attendus une inflammation de la cornée, des irritations, des brûlures et une sécheresse oculaire d'intensité variable, y compris avec les agents censés soulager. Les tests comportementaux sont nommés, exploration et sensibilité mécanique et chimique de la cornée, et les retombées pour les patients restent au stade de l'identification de composés "prometteurs" quand l'atteinte oculaire des souris, elle, est le point de départ du protocole.

Objectifs

La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant les différentes parties de l’œil. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. Les douleurs chroniques de la surface oculaire, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, entraînent une altération de la qualité de vie. On estime que près de plus d’un patient sur 2 est gêné lors de ses activités quotidiennes. Ces douleurs peuvent être liées à diverses pathologies, telles que des maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. La cornée, tissu le plus innervé de l’organisme, est l’un des générateurs de douleur les plus puissants. Parmi les pathologies oculaires, la sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes ou à une altération de leur composition, entraînant des lésions de la surface oculaire et des nerfs cornéens. Les symptômes sont variés et incluent une sensibilité accrue à la lumière (photophobie), des douleurs, des picotements, une sensation de brûlure oculaire. Ces manifestations s’accompagnent d’une atteinte de la vie quotidienne : troubles du sommeil, anxiété et dépression. La sécheresse oculaire et les douleurs de la surface oculaire représentent aujourd’hui l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie soulignant l’urgence d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes physiopathologiques. C’est dans cette perspective que nous avons entrepris d’en étudier les bases biologiques et les pistes thérapeutiques potentielles. Cette étude vise à évaluer les effets analgésique et anxiolytique de divers agents pharmacologiques à visée antalgique, administrés par instillation oculaire sur différents modèles de douleur oculaire développés chez la souris. La douleur oculaire, en particulier dans sa forme chronique, demeure aujourd’hui largement dépourvue de traitements efficaces. Ce projet permettra de comparer plusieurs agents pharmacologiques, à différentes concentrations, afin d’identifier les composés les plus prometteurs pour le développement de nouvelles thérapies ciblées contre la douleur oculaire chronique.

Bénéfices attendus

Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent des symptômes variés et incluent une sensibilité accrue à la lumière (photophobie), des douleurs, des picotements, une sensation de brûlure oculaire. Au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une altération de la qualité de vie (troubles du sommeil, anxiété et dépression). On estime que plus d’un patient sur deux est gêné dans ses activités quotidiennes. La sécheresse oculaire et les douleurs de la surface oculaire représentent aujourd’hui l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie soulignant l’urgence d’une meilleure compréhension de leurs mécanismes physiopathologiques. C’est dans cette perspective que nous avons entrepris d’en étudier les bases biologiques et les pistes thérapeutiques potentielles. Ce projet permettra d’identifier des agents pharmacologiques au travers de modèles précliniques et d’applications topiques, ciblant directement la surface de l’œil, afin de soulager ou de traiter la douleur oculaire. En effet, les mécanismes cellulaires et moléculaires sous tendant la douleur oculaire sont encore peu connus et sont considérés comme des pistes d’exploration thérapeutiques.

Procédures

Une première cohorte des animaux vigile recevra une instillation biquotidienne pendant 7 jours d’un conservateur de collyre et d’un agent pharmacologique (deux administrations par jour, espacées de 4 heures). Une seconde cohorte d’animaux sera soumise à une desépithélialisation cornéenne unique (1min), réalisée sous anesthésie et analgésie (1 fois pendant 10 minutes). Une instillation (quelques secondes) de toxine bactérienne sera effectuée lors de la chirurgie, puis une seconde 2 jours plus tard sur animal vigile. Parallèlement les animaux auront des instillations biquotidiennes d’un agent pharmacologique, (soit 2 fois par jour espacées de 4h, sur 5 jours). Une troisième cohorte sera dédiée au modèle d’exérèse des glandes lacrymales. Les animaux seront sous anesthésie générale et analgésie (anti-douleur) 1 fois pendant 15 minutes. Ils recevront des instillations biquotidiennes répétées d’un agent pharmacologique (2 fois par jour, sur 14 jours) sur animal vigile. Tous les animaux seront soumis à des contentions manuelles brèves (quelques secondes) nécessaires pour l’instillation des composés et à la réalisation des tests comportementaux suivants : test d’exploration (2 fois, 10min par animal pour les 3 modèles), test de sensibilité mécanique cornéenne (4 fois, 30 sec par animal : pour le 1er et le 3ème modèle et 2 fois, 30 sec par animal pour le 2ème modèle), test de sensibilité chimique cornéenne (1 instillation, 1 fois, 30 secondes par animal pour le 1er et le 2nd modèle et 4 instillations 4 fois, pendant 30 secondes par animal pour le 3ème modèle). Le nombre total d’instillations par animal s’élève à 29 pour le premier modèle (1ère cohorte), à 13 pour le second modèle (2nde cohorte) et à 32 pour le troisième modèle (3ème cohorte). L’imagerie de la surface oculaire sera réalisée sous anesthésie générale (5 minutes et 4 fois au total pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Certaines administrations d’anesthésiques ou d’analgésiques peuvent aussi induire un stress transitoire de courte durée (maximum 30 sec, lié à l’insertion de l’aiguille et à la contention de l’animal), ainsi qu’une légère douleur. L'anesthésie peut entraîner un risque cardio-respiratoire, d’hypothermie, et dans de rare cas une mortalité. Les chirurgies peuvent entraîner une perte de sang durant l’opération, une perte de poids, des infections et des douleurs oculaires durant la période postopératoire. Les instillations des agents non thérapeutiques biquotidiennes induisent un stress de courte durée liée à la contention manuelle et à l'instillation (30 sec). La chirurgie et les instillations biquotidiennes des agents non thérapeutiques pour la mise en place des modèles étudiés, entraîneront une inflammation de la cornée, des irritations ou brûlures, une sècheresse oculaire voire une inflammation d’intensité variable. Les instillations des agents thérapeutiques et des solvants peuvent induire un stress de courte durée liée à la contention manuelle et à l'instillation (30 sec), mais également peuvent entraîner une inflammation de la cornée, des brûlures, une sècheresse oculaire voire une inflammation d'intensité variable.

Devenir

Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure. Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés.

Remplacement

L’induction et l’étude de la douleur oculaire nécessite un organisme entier. A ce jour, il n’existe aucun système ex vivo ou in vitro permettant d’évaluer la douleur qui est une expérience sensorielle et émotionnelle. En outre, ce projet vise à évaluer les effets antalgiques de composés, nécessitant des expériences comportementales et également des évaluations ex vivo de certains marqueurs biologiques qui nécessitent l’analyse de tissus préalablement prélevés sur animaux euthanasiés. Ce projet ne peut donc être réalisé que chez l’animal. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques mis en jeu au cours de cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun modèle in silico n’existe pour répondre à ces questions.

Réduction

Dans le respect du principe de réduction, le projet a été conçu pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, avec un effectif total n’excédant pas 4 000 sur 5 ans. Plusieurs structures seront prélevées sur chaque animal (cornée, ganglion trigéminal, cerveau) afin d’optimiser les données obtenues par animal. L’estimation du nombre d’animaux à inclure repose sur des études antérieures de l’équipe utilisant des approches expérimentales comparables, ainsi que sur des calculs de puissance statistique, indispensables pour garantir une interprétation fiable et robuste des résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions optimisées pour réduire leur stress et conformes à la réglementation en vigueur. Ils seront pris en charge uniquement par du personnel formé et expérimenté, et des professionnels s’occuperont de leur hébergement, de leur manipulation et des éventuelles interventions chirurgicales. La proximité entre les lieux d’hébergement et le laboratoire permet de réagir rapidement si un animal a un problème de santé. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement grâce à un système d’identification et à un suivi informatisé partagé entre les équipes. Ils seront observés tous les jours, y compris les week-ends et les jours fériés, et leur santé et leur niveau de douleur seront régulièrement évalués selon des critères validés par des experts en bien-être animal. Toutes les interventions pouvant provoquer inconfort ou stress seront réalisées sous anesthésie, avec un traitement contre la douleur avant, pendant et après la procédure. Si un animal présente un problème grave, l’intervention sera immédiatement arrêtée et des mesures appropriées seront prises pour éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Les souris sont couramment utilisées dans les études précliniques, notamment pour mieux comprendre la douleur oculaire. Dans ce projet, la souris constitue le modèle animal de choix car les yeux et leur cerveau sont assez similaires à ceux de l’humain, et il existe des outils génétiques avancés spécialement adaptés à cette espèce. Des souris adultes, mâles et femelles, seront utilisées. Certaines sont des souris « classiques » tandis que d’autres ont été élevées pour permettre le suivi de certaines cellules inflammatoires. Ces modifications n’entraînent pas de troubles connus et n’affectent pas le bien-être des animaux. Les animaux seront accueillis à l’animalerie à l’âge adulte et bénéficieront d’une période d’adaptation avant le début des procédures. Toutes les expérimentations dureront peu de temps, entre une et trois semaines maximums, ce qui signifie que les animaux n’auront pas plus de 11 semaines à la fin des procédures.

Tous tués en fin de protocole pour le prélèvement du cœur et des tissus, 488 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hypertension leur est induite par une mini-pompe implantée sous la peau sous anesthésie générale, puis leur fonction cardiaque est suivie par deux échocardiographies. Dans certains groupes, une mort encéphalique est provoquée sous anesthésie profonde, avec des perturbations physiologiques importantes attendues en péri-mortem. L'objectif est d'élargir les critères de sélection des donneurs de greffons cardiaques humains, et le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre état hypertendu, conservation du greffon et reperfusion, ce qui rend selon lui le recours au rat "nécessaire".

Objectifs

La transplantation du cœur est souvent limitée par le nombre de cœurs disponibles. Pour pallier cette pénurie, les médecins utilisent parfois des cœurs dits « à risque », provenant de donneurs plus âgés ou ayant certaines maladies, comme l’hypertension artérielle. L’hypertension artérielle peut provoquer un épaississement de la paroi du cœur, rendant le tissu plus fragile lors de la transplantation. En effet, le cœur subit deux étapes critiques : le prélèvement, lorsqu’il est privé d’oxygène, et la réimplantation, lorsqu’il est à nouveau oxygéné. Ces phases peuvent provoquer des dommages aux cellules cardiaques, surtout si le cœur est déjà affaibli. Au niveau cellulaire, certaines protéines, comme YAP1, aident le cœur à résister au stress et à survivre aux contraintes. Des recherches récentes montrent que réguler cette protéine pourrait protéger les cellules cardiaques et améliorer le fonctionnement des cœurs transplantés.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’évaluer, dans un modèle préclinique de rat hypertendu représentant des cœurs à critères élargis, comment une conservation contrôlée à température modérée (15–20 °C pendant 20 h), associée à une modulation ciblée d’une voie de signalisation spécifique, peut préserver la structure et la fonction du muscle cardiaque. L’ambition est de limiter les dommages cellulaires et tissulaires provoqués par la privation temporaire de sang (ischémie) et son rétablissement oxygéné (reperfusion) lors de la transplantation. L’hypertension chronique rend le cœur particulièrement vulnérable à ces lésions, aggravant la dysfonction du greffon et réduisant à la fois sa durée et la qualité de conservation. Les bénéfices attendus comprennent : • L’identification de nouvelles stratégies pharmacologiques ou combinatoires capables d’améliorer la tolérance des greffons cardiaques aux contraintes de la transplantation ; • La limitation de la perte fonctionnelle après greffe ; • L’élargissement potentiel des critères de sélection des donneurs, augmentant ainsi le nombre de cœurs disponibles. Enfin, ces résultats pourraient servir de base pour l’optimisation des solutions de conservation et le développement de traitements ciblés pour les greffons à critères élargis. Cette approche combinée devrait, à terme, améliorer la qualité des greffons, réduire les complications liées à l’ischémie-reperfusion et renforcer les résultats cliniques des transplantations cardiaques.

Procédures

Le protocole s’étendra sur 4 semaines. Les animaux seront soumis à différentes interventions selon les groupes expérimentaux. L’hypertension artérielle sera induite par implantation sous-cutanée d’une mini-pompe, réalisée sous anesthésie générale (30–45 min). La fonction cardiaque sera suivie par deux échocardiographies non invasives (10–15 min), réalisées à 2 semaines d’intervalle sous anesthésie légère. Dans certains groupes, une mort encéphalique sera induite sous anesthésie générale profonde (30–60 min).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus concernent principalement : - Induction de l’hypertension : inconfort local et douleur transitoire au site opératoire, avec une mortalité péri-opératoire faible mais possible, liée à des complications anesthésiques ou chirurgicales. - Examens échographiques : stress léger et de courte durée lors de l’induction et du réveil. - Induction de la mort encéphalique sous anesthésiée : des perturbations physiologiques importantes sont attendues en peri-mortem.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérimentation afin de permettre la récupération des organes et tissus pour les analyses fonctionnelles, cellulaires et moléculaires. L’euthanasie sera réalisée sous anesthésie générale profonde, conformément aux recommandations vétérinaires et aux normes éthiques, garantissant l’absence de douleur ou de souffrance.

Remplacement

Avant de recourir au modèle animal, la solution et la température optimale de conservation ont été testées sur des modèles cellulaires dans notre laboratoire, avec des résultats concluants. Cependant, aucun modèle in vitro ou alternative non animale ne permet de reproduire l’interaction dynamique entre l’état hypertendu, la conservation du greffon et la reperfusion, incluant les réponses systémiques, cellulaires et mitochondriales. Le rat est donc choisi comme modèle car il permet de reproduire de manière fiable et contrôlée l’hypertension induite par infusion d’Angiotensine II, ainsi que la physiopathologie complexe de la mort encéphalique. Cette approche est nécessaire pour répondre aux objectifs précliniques du projet et garantir la pertinence translationnelle.

Réduction

Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables. Par ailleurs, les animaux de la première étape du projet seront intégrés aux groupes contrôles de la suite du projet. Le projet est organisé par étape de validation successives et seuls les paramètres optimaux sont appliqués d’une étape à l’autre.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur ou souffrance, les injections et prélèvements seront effectués sous prémédication analgésique associée à une anesthésie locale. Les examens échographiques seront réalisés sous anesthésie générale afin de garantir l’absence de stress ou d’inconfort. Les interventions chirurgicales seront menées sous anesthésie générale, précédée d’une prémédication analgésique administrée par voie sous-cutanée. Des points limites spécifiques et adaptés à chaque type de procédure ont été définis, afin de garantir une prise en charge rapide en cas de signes de douleur, de détresse ou de complication.

Choix des espèces

Le rat est utilisé car ses cœurs isolés perfusés ont été largement étudiés et les voies de signalisation ciblées dans cette étude sont conservées chez l’homme. Les jeunes adultes (250–450 g) permettent de reproduire les altérations cardiovasculaires observées chez les patients hypertendus, offrant un modèle pertinent pour évaluer l’effet de la modulation des voies étudiées sur la fonction cardiaque et l’intégrité du tissu après conservation et reperfusion.

Ni réutilisées ni replacées parce que la colite qu'on leur inflige modifie durablement leur état biologique, 686 souris sont tuées à l'issue pour prélever intestin, sang et organes lymphoïdes. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'inflammation du côlon est provoquée par le DSS ou par instillation intrarectale de TNBS sous anesthésie, avec perte de poids allant jusqu'à 15 à 20 %, diarrhée parfois sanglante, pelage ébouriffé et posture voûtée pendant cinq à sept jours. Le porteur cite organoïdes, organes sur puce et modèles informatiques, puis les écarte au motif qu'aucun ne reproduit à la fois le système immunitaire, la paroi intestinale et le microbiote.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, comme la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, provoquent une inflammation durable du côlon et altèrent fortement la qualité de vie des patients. Les traitements actuels ne sont pas efficaces chez tous les patients, ce qui rend nécessaire le développement de nouvelles solutions thérapeutiques. Ce projet vise à développer puis utiliser un modèle d’inflammation du côlon chez la souris afin de tester de nouvelles molécules ou formulations ayant un effet anti-inflammatoire. Dans un premier temps, deux méthodes d’induction de l’inflammation, le DSS et le TNBS, seront comparées chez des souris non transgéniques afin de sélectionner le modèle le plus adapté et reproductible. Une fois le modèle établi, il sera appliqué à des souris transgéniques exprimant une protéine humaine impliquée dans l’inflammation intestinale, afin de mieux se rapprocher de la maladie humaine et d’évaluer des traitements ciblés. Sur la durée du projet, un nombre limité de nouvelles molécules sera testé de manière progressive. L’évolution de l’inflammation sera suivie par des méthodes d’imagerie non invasives, permettant de limiter les manipulations et de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Bénéfices attendus

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), comme la colite ulcéreuse ou la maladie de Crohn, sont des maladies de longue durée qui altèrent fortement la qualité de vie. Les traitements actuels ne fonctionnent pas chez tous les patients et peuvent perdre leur efficacité avec le temps, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. À court terme, ce projet permettra de mieux comprendre comment l’inflammation du côlon s’installe et évolue dans des modèles expérimentaux chez la souris. Il apportera des informations claires sur le rôle d’une protéine impliquée dans l’inflammation intestinale, l’IL-26, en comparant des souris classiques et des souris modifiées pour se rapprocher de la situation humaine. Le projet permettra également d’identifier les conditions les plus adaptées pour tester de nouveaux traitements (choix du modèle, doses, schémas d’administration). L’utilisation d’une méthode d’imagerie non invasive permettra de suivre l’évolution de l’inflammation chez un même animal, d’améliorer la qualité des données et de réduire le nombre d’animaux utilisés. À long terme, ce projet ne vise pas à aboutir directement à un traitement pour les patients, mais à générer des données solides permettant d’orienter le développement de nouvelles molécules ou formulations dans des projets ultérieurs. Les résultats positifs serviront de base à des études précliniques plus avancées et à des collaborations industrielles ou académiques. En cas de résultats négatifs ou non concluants, les données produites permettront d’écarter certaines approches, d’optimiser les modèles expérimentaux et d’éviter des essais inefficaces par la suite. Ainsi, quels que soient les résultats, le projet contribuera à faire progresser la recherche et à guider plus efficacement le développement de futurs traitements contre les MICI.

Procédures

Au cours des procédures expérimentales, les animaux peuvent présenter des effets transitoires liés aux manipulations et aux modèles d’inflammation étudiés. Chaque animal pourra faire l’objet d’un prélèvement sanguin unique au niveau d’une veine du cou. Ce prélèvement sera réalisé sous anesthésie générale légère à l’isoflurane, un gaz anesthésiant couramment utilisé chez la souris. La durée d’anesthésie sera courte, comprise entre 5 et 15 minutes. Les animaux pourront également subir jusqu’à trois séances d’imagerie non invasive sur une période maximale de 48 heures. Ces séances, d’une durée de 5 à 15 minutes chacune, seront réalisées après l’administration d’un marqueur fluorescent, soit par injection dans une veine, soit par voie orale. Cette technique permet de suivre l’évolution de l’inflammation sans chirurgie ni douleur durable. Pour les animaux recevant le produit TNBS, l’induction de l’inflammation du côlon sera réalisée par administration intra-rectale, sous anesthésie générale à l’isoflurane afin d’éviter toute douleur ou stress. La durée d’anesthésie sera également limitée à 5 à 15 minutes. Les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure expérimentale concernée, après la dernière séance prévue pour chaque animal. La mise à mort sera réalisée par une méthode réglementaire et adaptée à l’espèce, sous anesthésie profonde, afin d’éviter toute souffrance.

Impact sur les animaux

Les procédures prévues reposent sur l’induction contrôlée d’une inflammation colique chez la souris par administration de DSS (dextran sulfate de sodium) ou de TNBS (trinitrobenzènesulfonique). Ces modèles bien établis reproduisent certains aspects physiopathologiques des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Les effets indésirables attendus sont principalement liés à la réponse inflammatoire locale et systémique ainsi qu’aux manipulations expérimentales. Dans le modèle DSS, les signes cliniques typiques incluent une perte de poids progressive (jusqu’à 15–20 %), une diarrhée plus ou moins marquée, parfois teintée de sang, et une diminution transitoire de la prise alimentaire. Un aspect ébouriffé du pelage, une posture voûtée et une baisse modérée de l’activité peuvent également être observés. Ces symptômes apparaissent entre le 3ᵉ et le 6ᵉ jour après l’induction et régressent généralement 7 à 10 jours après l’arrêt du DSS. Dans le modèle TNBS, l’instillation intra-rectale sous anesthésie peut induire une inflammation plus aiguë, avec douleurs abdominales modérées, réduction temporaire de la mobilité et diarrhée hémorragique dans certains cas. Ces signes surviennent dans les 24 à 48 h suivant l’administration et persistent 3 à 5 jours avant amélioration. Une surveillance rapprochée permettra d’adapter les soins (hydratation, réchauffement, arrêt anticipé ou euthanasie) en cas de souffrance excessive. Les injections sous-cutanées ou intrapéritonéales d’anticorps monoclonaux entraînent des nuisances mineures et transitoires (gêne au point d’injection). L’imagerie par fluorescence (NIR-dextran) est non invasive et sans effet délétère attendu. Les effets globaux sont donc qualifiés de modérés selon la classification réglementaire. L’inconfort est limité à la phase aiguë d’inflammation (environ 5 à 7 jours).

Devenir

À la fin des procédures, la majorité des animaux seront mis à mort de manière rapide et indolore, sous anesthésie, afin de pouvoir prélever les tissus nécessaires aux analyses (intestin, sang, organes lymphoïdes, etc.). Ces prélèvements sont indispensables pour observer au microscope l’état de la paroi intestinale, mesurer précisément l’inflammation et étudier l’effet des traitements sur les cellules et les molécules impliquées dans la maladie. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées sur des animaux vivants et sont essentielles pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les animaux ne seront ni réutilisés dans d’autres expériences, ni replacés, car la maladie induite et les traitements reçus modifient durablement leur état biologique et ne permettent pas une réutilisation dans des conditions éthiques et fiables.

Remplacement

La stratégie de remplacement a été soigneusement examinée avant la conception de ce projet. Il existe des méthodes alternatives, comme des cellules cultivées en laboratoire, des mini-tissus (organoïdes), des systèmes de type « organes sur puce » et des modèles informatiques. Ces outils permettent de mieux comprendre certains mécanismes de l’inflammation de l’intestin, mais ils ne reproduisent pas le fonctionnement d’un organisme entier. Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont en effet très complexes. Elles impliquent à la fois le système immunitaire, la paroi de l’intestin, les bactéries présentes dans le tube digestif et d’autres systèmes du corps. Aujourd’hui, aucune méthode uniquement en laboratoire ne permet de prendre en compte toutes ces interactions en même temps. L’objectif du projet est de tester de nouveaux traitements dans des modèles de colite chez la souris, qui reproduisent les mécanismes principaux de la maladie chez l’être humain. Pour évaluer ces traitements, il faut observer non seulement ce qui se passe au niveau des tissus et des molécules, mais aussi l’état général de l’animal, sa perte de poids et sa réaction inflammatoire globale. Cela n’est possible que chez un organisme vivant. Les souris choisies sont les modèles les plus pertinents pour ce type de recherche, car elles permettent de reproduire de façon contrôlée les caractéristiques essentielles de la maladie humaine. L’utilisation d’animaux reste donc nécessaire pour déterminer les bonnes doses, tester d’éventuelles associations de traitements et vérifier leur efficacité. Ce recours à l’animal s’inscrit dans une démarche stricte visant à limiter son utilisation autant que possible, à réduire le nombre d’animaux et à améliorer leurs conditions de prise en charge.

Réduction

Le nombre de souris prévu dans ce projet a été calculé avec des méthodes statistiques, afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en obtenant des résultats fiables. La variabilité des modèles de colite utilisés, la perte de poids, le niveau d’inflammation et l’effet attendu des traitements testés ont été pris en compte. Les expériences sont conçues pour tirer un maximum d’informations de chaque animal. Par exemple, une technique d’imagerie par fluorescence (NIR-dextran), non invasive, permet de suivre au cours du temps l’état de l’intestin et l’évolution de l’inflammation chez les mêmes souris. Cela évite de devoir en sacrifier davantage à différentes étapes et limite la création de groupes supplémentaires. Les résultats d’imagerie seront associés à d’autres mesures cliniques et d’analyse des tissus, afin de valoriser au mieux chaque animal inclus. Avant les grandes études, de petites études pilotes seront réalisées pour ajuster les doses de produits utilisés (DSS, TNBS et molécules testées). Cela permet de réduire le risque d’échec par la suite et d’éviter de devoir répéter les expériences. Les données recueillies serviront également à affiner les protocoles pour les étapes suivantes, toujours dans le but de limiter le nombre d’animaux. Les tissus prélevés à la fin des études seront utilisés pour des analyses complémentaires ou partagés avec d’autres projets, afin de ne pas devoir recréer les mêmes modèles de maladie. Enfin, des critères d’arrêt précoces, une surveillance clinique attentive et des examens répétés par imagerie permettront de réduire au maximum la durée de la maladie chez les animaux et d’éviter le recours à des animaux supplémentaires. L’ensemble de ces mesures vise à trouver un équilibre entre la qualité scientifique des résultats et le respect de principes éthiques stricts, en veillant à ce que chaque animal contribue de manière significative aux objectifs du projet.

Raffinement

Dans ce projet, les chercheurs mettent en place plusieurs mesures pour limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les produits utilisés pour provoquer l’inflammation de l’intestin sont administrés à la dose la plus faible possible permettant de mener l’étude. Les animaux sont observés chaque jour afin de vérifier leur état de santé. Si un animal perd trop de poids, paraît très affaibli, ne mange presque plus, se déplace très peu ou montre des signes de détresse, il est retiré immédiatement de l’expérience et euthanasié de façon rapide et indolore. Les injections et manipulations sont réalisées par un personnel formé, pour que les gestes soient précis et les moins traumatisants possibles. Les animaux sont hébergés dans de bonnes conditions (température adaptée, environnement enrichi, vie en groupe lorsque c’est possible), avec un accès permanent à l’eau et à la nourriture, sauf exception clairement justifiée. Les chercheurs utilisent aussi des techniques d’imagerie non invasives pour suivre l’évolution de l’inflammation chez les mêmes animaux, ce qui évite des interventions plus lourdes et limite le nombre d’animaux sacrifiés. L’ensemble des procédures est régulièrement réévalué afin d’améliorer en continu les pratiques et de respecter au mieux le bien-être animal.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour sa physiologie immunitaire bien caractérisée et sa grande sensibilité aux modèles expérimentaux de colite, en particulier après exposition au DSS ou au TNBS, qui reproduisent fidèlement les mécanismes inflammatoires observés chez l’humain. La souche C57BL/6 est la plus couramment utilisée pour ces modèles, offrant une référence robuste et reproductible pour l’évaluation de nouvelles molécules. L’emploi de souris transgéniques exprimant la cytokine humaine IL-26 permet d’explorer le rôle spécifique de cette voie dans la physiopathologie colique et d’évaluer la pertinence de cibles thérapeutiques humaines. Ces modèles combinent pertinence biologique et transposabilité clinique, tout en minimisant le recours à d’autres espèces plus sensibles ou complexes à gérer. Leur taille, leur cycle de reproduction court et la disponibilité d’outils analytiques adaptés en font le choix le plus approprié pour atteindre les objectifs scientifiques du projet tout en respectant le bien-être animal. Les expériences seront réalisées exclusivement sur des souris adultes de souche C57BL/6 et sur des souris transgéniques exprimant la cytokine humaine IL-26, âgées de 8 à 12 semaines, correspondant à un stade physiologique stable et à une pleine maturité du système immunitaire. Ce choix permet de limiter la variabilité biologique liée au développement et d’assurer une réponse homogène aux inducteurs de colite (DSS ou TNBS) ainsi qu’aux traitements testés. Les souris plus jeunes, non sevrées ou en croissance, présentent une immaturité immunitaire et métabolique pouvant modifier la réponse inflammatoire et la tolérance aux traitements, tandis que les animaux âgés développent des altérations spontanées du microbiote et des tissus intestinaux susceptibles de biaiser les résultats. Aucune procédure ne sera réalisée sur des embryons, des fœtus ou des individus en gestation. Le recours à des animaux adultes garantit donc la pertinence scientifique, la comparabilité inter-groupes et le respect du bien-être animal.

7 254 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines pouvant recevoir jusqu'à sept administrations de traitement par semaine. Une partie subit une castration, puis une chirurgie d'implantation destinée à reproduire une endométriose, dont les lésions peuvent provoquer des douleurs abdominales pendant les 63 jours de la procédure. S'y ajoutent un prélèvement sanguin hebdomadaire et jusqu'à trois tests comportementaux par animal, dont un test d'hypersensibilité viscérale et une mesure de la capacité à faire son nid qui suppose quinze heures d'isolement. Le calcul d'effectif cité aboutit à dix souris par groupe pour des expériences reproduites deux fois, sans que le passage à 7 254 animaux soit expliqué.

Objectifs

Ce projet a un objectif principal : mettre au point un protocole d’immunothérapie de l’endométriose. Il permettra aussi de mieux comprendre l’importance de la composante immunitaire dans les mécanismes qui conduisent à l’endométriose.

Bénéfices attendus

L'endométriose est un trouble œstrogèno-dépendant fréquent chez les femmes en âge de procréer (10%). Cette pathologie se caractérise principalement par la présence de tissu endométrial à l'extérieur de l'utérus. Bien que les mécanismes qui conduisent à l’endométriose (pathogénèse) ne soit pas complètement décrits, on sait que le système immunitaire joue un rôle central dans son étiologie, sa pathophysiologie et les morbidités associées de douleur, d'infertilité. Il est maintenant admis que l'endométriose est une maladie inflammatoire chronique. Nous avons montré que cibler la réponse immunitaire peut diminuer l’installation et le développement des lésions. Nous avons identifié plusieurs médicaments en cours de développement dans des protocoles d’immunothérapie antitumorale qui pourraient permettre de moduler la réponse immunitaire et ainsi induire la disparition des lésions d’endométriose. L’objectif de ce projet est donc de developper un protocole de traitement et définir l’impact des traitements sur l’initiation et le développement des lésions d’endométriose, sur les cellules immunitaires et sur la douleur induite par l’implantation et le développement des lésions. Dans un deuxième temps et en fonction de toutes les premières observations, nous définirons les meilleurs protocoles d’administration de ces molécules dans le traitement de l’endométriose. Pour tout ce projet, nous utiliserons un modèle expérimental de référence déjà décrit dans la littérature et maîtrisé dans notre laboratoire. Globalement, ce projet permettra de contribuer à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’origine et le développement de l’endométriose. Ces mécanismes pourraient être exploités pour découvrir d’autres pistes thérapeutiques innovantes.

Procédures

Les animaux pourront subir : - Une castration, réalisée chez des animaux sous anesthésie générale (injection, 30 sec), opération qui dure moins de 10 min par souris -Chirurgie pour modélisation de l'endométriose sous anesthésie générale (injection 30 sec)- des administration de traitement (durée moins de 1 min) au maximum 7 fois par semaine - - des prélèvements veineux de sang - 1 min - au maximum 1 fois/semaine pendant la procédure -des tests comportementaux: test du niveau d'anxiété 10 minutes, une fois par semaine, test des comportements compulsifs: 30 minutes, une fois par semaine, test d'hypersensibilité, 5 minutes, une fois par semaine, test d'hypersensibilité viscerale, 5 minutes une fois par semaine, capacité à faire son nid (représentatif de la douleur) 15h d'isolement, une fois par semaine. Tous les animaux ne seront pas soumis à tous les tests comportementaux (pas plus de trois tests par animal).

Impact sur les animaux

Une partie des animaux subira une castration. Les animaux récupèrent parfaitement de cette opération. Cependant, la chirurgie peut induire des douleurs abdominales modérées post-opératoires (48 h maximum). Les injections réalisées aux animaux sont associées à des douleurs locales modérées et transitoires (moins de 5 minutes) au point d’injection. La croissance des lésions d’endométriose peut induire des douleurs abdominales pendant toute la durée de l'expérience (63 jours maximum). Ces douleurs potentielles seront évaluées quotidiennement par observation du comportement des souris dans les cages et avec des tests comportementaux. En cas de douleur, les souris recevront un analgésiant. De plus, un stress peut être généré chez l’animal par les manipulations répétées (contention lors des injections) (durée maximum 5 minutes). les injections hebdomadaires peuvent induire un stress transitoire lié à la contention, une douleur brève au point d’injection (5 minutes maximum) et, occasionnellement, une réaction inflammatoire locale modérée (24h maximum). Les effets systémiques attendus sont limités aux variations physiologiques liées à la stimulation hormonale, sans altération durable de l’état général lorsqu’elles sont administrées aux doses usuelles.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure

Remplacement

Les réponses immunes dans l’endométriose sont complexes. Elles nécessitent l’implication de plusieurs types de cellules immunitaires qui agissent de manière coordonnée dans le temps (avec des cinétiques précises) et dans l’espace (l ésions, liquide péritonéal et ganglions lymphatiques drainant). Ces différentes étapes ne peuvent pas être mimées/reproduites in vitro.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été réalisée. Elle nous a permis de choisir les modèles les mieux adaptés pour répondre à nos questions scientifiques mais aussi d’adapter le nombre minimal d’animaux nécessaires. Nous avons analysé les résultats déjà obtenus sur ce projet et nous avons réalisé un calcul d'effectif avecun logiciel qui aide à calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour une expérience en se basant sur des études statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en évitant d’en utiliser plus que nécessaire. Ce calcul nous a donné une valeurs de 10 souris par groupe Les expériences seront reproduites 2 fois (5 souris par groupe et par expérience). Un maximum d’étude sera réalisé sur le même animal.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé à l'expérimentation animale et détenteur du diplôme de chirurgie expérimentale quand cela le nécessite (ovariectomie, castration). Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adaptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Afin de limiter les risques d'infection des animaux, les animaux seront placés dans des cages placées sur portoir ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environnement de toutes les cages sera enrichi (matériel permettant la nidification, rouleaux en carton) et de la nourriture/eau gélifiée rajoutée dans la cage si nous notons que les souris perdent du poids sans que les points limites ne soient atteints. Du sérum physiologique tiédi pourra être injecté en cas de déshydratation. Une molécule permettant l'anesthésie locale sera administrée en intradermique au point d'incision pour limiter la douleur. Durant l’opération du gel oculaire sera appliqué afin d’éviter tout dessèchement de la cornée. Durant et après la chirurgie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant afin de limiter l’hypothermie et ce jusqu’à leur réveil. En péri-opératoire (avant et après la chirurgie), les animaux seront analgésiés pendant 24 heures (injection intraveineuse d'une molécule analgésique). Une surveillance accrue pendant les 3 jours post-chirurgie sera réalisée afin de détecter tout signe de douleur et de détresse. Des points limites spécifiques ont été établis et sont décrits pour chaque procédure. S’ils devaient être atteints, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les acteurs de la réponse immunitaire chez la souris sont très similaires à ceux de l'Homme. A ce jour, la souris représente le meilleur modèle animal pour étudier la réponse immunitaire qui est une réponse intégrée dans le temps (précoce avec la réponse immunitaire innée, plus tardive avec la réponse immunitaire adaptative) et dans l'espace (sur le site d’implantation des lésions ou dans les organes lymphoïdes). Les souris seront utilisées entre 6 et 12 semaines d’âge correspondant à un système immunitaire fonctionnel

Perfusés jusqu'à six heures par un cathéter implanté dans la veine saphène, ou gavés, 1 800 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont placés au préalable jusqu'à quinze minutes dans une enceinte à 38 degrés pour faciliter l'injection, et tous sont tués après un prélèvement sanguin terminal suivi d'une nécropsie. L'objet est de vérifier la tolérance de produits avant les études d'efficacité, en identifiant les doses qui provoquent apathie, prostration, convulsions, œdème sévère ou perte de poids d'au moins 20 %. Le dispositif d'accès vasculaire est présenté comme un progrès du raffinement parce qu'il évite six heures de contention en tunnel, alors qu'il permet précisément des perfusions de six heures.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer la tolérabilité de produits administrés par voie orale et intraveineuse chez le rat, en administration aiguë et répétée. L'objectif est de déterminer les effets potentiels sur les paramètres cliniques, le comportement, la mortalité, et les organes cibles, afin de garantir la sécurité des composés avant leur développement.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à sécuriser les études d’efficacité en amont, en évaluant la tolérabilité des produits testés chez le rat, en administration aiguë et répétée. Lors de ces études, il est essentiel de s’assurer que les doses administrées ne génèrent pas d’effets indésirables non anticipés. L’objectif est de mieux cibler les plages de doses à utiliser dans les protocoles d’efficacité, en identifiant les seuils de tolérance et les éventuelles toxicités liées à la formulation ou à la voie d’administration. Cette approche permet d’éviter l’exposition inutile des animaux à des doses potentiellement délétères, tout en garantissant la robustesse des résultats obtenus dans les études suivantes. Les données générées permettront également d’optimiser les plans expérimentaux, de réduire les risques d’échec liés à une mauvaise tolérabilité, et de renforcer la qualité des dossiers réglementaires associés au développement des produits. Justification scientifique et éthique de l’usage du VAB : L’utilisation du VAB permet une administration intraveineuse sans contention physique prolongée. En méthode traditionnelle, les animaux doivent être maintenus dans un tunnel de contention pendant au maximum 6 heures, ce qui génère un stress important. Ce stress est d’autant plus problématique dans les protocoles à administration répétée, où il serait réitéré plusieurs fois. Avec le VAB, les animaux restent libres de leurs mouvements, ce qui réduit significativement le stress et améliore leur bien-être. Cette approche est donc scientifiquement pertinente pour garantir des données fiables, et éthiquement justifiée pour respecter les principes du raffinement dans l’expérimentation animale.

Procédures

Dans le cadre des administrations intraveineuses, deux modalités sont envisagées : Administration aiguë : chaque injection est réalisée sur un animal vigile après passage dans une enceinte thermostatée à 38°C avec une durée maximale de 15 minutes, la durée de l'administration est courte, généralement comprise entre 5 et 10 secondes. Perfusion lente : l’administration est réalisée sur animaux implantés , qui leur permettent d'avoir une totale liberté de mouvement, ell peut durer jusqu’à 6 heures. Pour les procédures par gavage, les administrations sont brèves, inférieures à 10 secondes. Fin de procédure : À l’issue des expérimentations, les animaux seront anesthésiés profondément. Un prélèvement sanguin terminal sera alors réalisé, suivi d’une euthanasie sans réveil, conformément aux recommandations éthiques et réglementaires en vigueur.

Impact sur les animaux

Les études de tolérabilité visent à identifier les effets délétères liés à l’administration de composés, immédiats ou après expositions répétées. Bien que supposés bien tolérés, certains effets peuvent survenir selon la dose, la formulation ou la voie d’administration. Les injections IV peuvent provoquer des réactions locales (érythème, œdème, hématome, croûte), notamment en cas d’irritation liée au véhicule. Les administrations orales peuvent entraîner des troubles digestifs, une baisse de consommation alimentaire ou une perte de poids. Ces effets seront surveillés quotidiennement. Le traitement est interrompu en cas de signes cliniques sévères : apathie, prostration, yeux fermés, décubitus latéral, piloérection, tremblements, convulsions, œdème sévère, perte de poids ≥ 20 %, ou absence d’alimentation (liste non exhaustive). Ces critères permettent de limiter la douleur sans compromettre les résultats. Lors d’administrations répétées, l’évolution clinique sera suivie avec attention. Une adaptation des doses ou de la durée pourra être envisagée en cas de toxicité. Les injections seront réalisées dans les règles de l'art. La couleur de la peau (pâleur) et le comportement seront observés le lendemain pour détecter toute atteinte physiologique. Afin de faciliter l’injection IV et éviter le passage en périveineux, les animaux sont placés au maximum 15 minutes dans une enceinte thermostatée à 38°C. Chez les animaux porteurs de VAB implantés à la veine saphène, des effets indésirables spécifiques peuvent apparaître : réactions locales (érythème, œdème, croûtes, hématomes), gêne ou douleur à la manipulation, risque d’infection ou de déplacement du dispositif. Une surveillance renforcée est mise en place : inspection du site, suivi du comportement et de l’état général, mesures d’hygiène strictes. Toute anomalie est évaluée par le porteur de projet ou le personnel du bien-être animal, et peut conduire au retrait de l’animal de l’étude.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort de manière éthique et réglementaire, après un prélèvement sanguin terminal réalisé sous anesthésie profonde. Ce prélèvement a pour objectif de détecter d’éventuels effets indésirables ou toxiques du composé testé, notamment par l’analyse de biomarqueurs spécifiques. Par ailleurs, une nécropsie sera systématiquement effectuée afin d’identifier, par observation macroscopique, d’éventuelles altérations des organes cibles, permettant ainsi une évaluation complète de l’impact du traitement.

Remplacement

Avant toute expérimentation in vivo, plusieurs tests de toxicité cellulaire sont réalisés afin d’évaluer la cytotoxicité, les effets mutagènes et les interactions métaboliques des composés. Ces tests permettent d’éliminer les produits les plus toxiques et d’éviter des expositions trop fortes ou inappropriées chez l’animal. Cependant, malgré leur utilité, ces modèles in vitro présentent des limites importantes. Ils ne permettent pas de reproduire les interactions complexes d’un organisme entier, notamment les effets systémiques, les réactions immunitaires, les compensations physiologiques ou les effets secondaires liés à la voie d’administration. De plus, certains effets indésirables ne se manifestent qu’en contexte multi-organes ou après plusieurs jours d’exposition. C’est pourquoi l’expérimentation animale reste indispensable pour confirmer la tolérabilité des produits dans des conditions proches de leur usage clinique. Les études in vivo permettent de valider les doses sûres, d’identifier les seuils de toxicité, et de garantir la sécurité des protocoles d’efficacité à venir.

Réduction

Les études de tolérabilité sont conçues pour être réalisées sur un nombre restreint d’animaux, tout en permettant une évaluation fiable des effets potentiels des produits testés. Chaque protocole est optimisé pour limiter les effectifs tout en assurant la détection des signes de toxicité, qu’ils soient liés à la dose, à la formulation ou à la voie d’administration. Ces études préalables permettent d’éviter l’administration de doses potentiellement toxiques dans les protocoles d’efficacité, qui mobilisent un nombre d’animaux plus important. En ciblant précisément les plages de tolérance, elles contribuent à réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés dans l’ensemble du programme de recherche. Cette approche est pleinement conforme au principe de réduction des 3R, en évitant les expositions inutiles, les traitements non pertinents, et en affinant les plans expérimentaux grâce aux données obtenues. Les effectifs sont définis à partir de données bibliographiques, de tests in vitro, et d’études pilotes, permettant le calcul de puissance statistique et l’ajustement des groupes en fonction de la réponse observée.

Raffinement

Les études de tolérabilité ont été conçues pour limiter au maximum les nuisances potentielles tout en garantissant la qualité des observations. Contrairement aux modèles pathologiques, les produits testés dans ce protocole ne sont pas censés induire de symptômes sévères. Toutefois, des effets liés à la formulation, à la voie d’administration ou à la dose peuvent survenir et seront surveillés avec attention. Ces signes sont considérés comme des atteintes de points limites et entraînent la mise à mort éthique de l’animal concerné, ainsi qu’un réajustement des paramètres expérimentaux (dose, durée, formulation). Les procédures sont réalisées avec un hébergement adapté au bien-être des animaux, incluant un enrichissement du milieu (tunnels, éléments de nidification, bois à ronger). Les injections intraveineuses sont réalisées, dans les règles de l’art, afin d’éviter les réactions locales ou les erreurs techniques. Les observations sont renforcées dans les heures suivant l’administration, et une attention particulière est portée à la couleur de la peau et au comportement des animaux. Ce niveau de raffinement permet de garantir une expérimentation respectueuse, conforme aux exigences réglementaires et éthiques, tout en assurant la fiabilité des données générées.

Choix des espèces

Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour de reproduire de manière fiable les mécanismes physiopathologiques ciblés par nos produits, notamment ceux liés à des atteintes systémiques ou métaboliques. Les modèles murins, tels que le rat et la souris, présentent une homologie génétique d’environ 90 % avec l’humain, ce qui en fait des espèces de choix dans les études pharmacologiques. Le choix d’utiliser à la fois le rat et la souris repose sur le fait que nos modèles d’efficacité ont été développés spécifiquement dans l’une ou l’autre de ces espèces. Il est donc pertinent, avant de procéder aux tests d’efficacité, de vérifier l’innocuité des produits dans l’espèce concernée par le modèle utilisé. Les animaux utilisés dans ce projet seront des individus jeunes adultes, âgés de 8 à 10 semaines. Ce stade de développement est choisi car il correspond à une période où les animaux sont suffisamment matures sur le plan immunologique et physiologique, tout en étant encore dans une phase de stabilité métabolique. Cela permet d’obtenir des données fiables et reproductibles sur la tolérabilité des composés testés, tout en limitant les biais liés à l’âge ou au développement.