Rongeurs
Neuroprotection d’une modulation du métabolisme énergétique cérébral dans le contexte de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des pompes implantées sous la peau, remplacées chaque semaine pendant un mois pour une partie des animaux, délivrent en continu du lactate ou une hormone à 144 souris, dont des transgéniques porteuses d'un modèle d'Alzheimer. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, après trois IRM sous anesthésie de trente à quarante-cinq minutes et une perfusion finale d'une heure sans réveil. Le projet cherche à savoir si un apport énergétique alternatif ralentit le déclin cérébral du vieillissement et de la maladie d'Alzheimer, le cerveau étant prélevé pour l'analyse moléculaire. Le porteur annonce des tests comportementaux évaluant la cognition, la motricité, l'anxiété et les signes de dépression, dont un test de restriction alimentaire, sans préciser lesquels.
Objectifs
Le cerveau est l’organe le plus gourmand en énergie de notre corps. Avec l’âge, et plus encore dans la maladie d’Alzheimer, son métabolisme énergétique ralentit. On sait aujourd’hui que les personnes atteintes de cette maladie utilisent moins efficacement le glucose – la principale source d’énergie du cerveau – que les personnes en bonne santé. Les recherches montrent que ce problème survient très tôt, bien avant l’apparition des pertes de mémoire ou des troubles cognitifs. Ce déficit énergétique touche plusieurs types de cellules cérébrales et perturbe leurs échanges. Un mécanisme central est particulièrement affecté : la « navette lactate » entre les astrocytes et les neurones, qui permet normalement aux cellules de se transmettre et d’exploiter efficacement l’énergie. Avec le vieillissement et dans la maladie d’Alzheimer, certains transporteurs et enzymes indispensables à l’utilisation du glucose et du lactate deviennent moins performants. Résultat : le cerveau n’arrive plus à produire suffisamment d’énergie pour fonctionner correctement. Notre projet vise à stimuler cette navette lactate en administrant soit une substance énergétique alternative, soit une substance hormonale, afin de compenser ce manque d’énergie. L’objectif est de ralentir ou de retarder l’apparition des troubles liés au vieillissement et, plus encore, à la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Le vieillissement et de manière plus exacerbée, la maladie d'Alzheimer sont caractérisés par un déficit énergétique cérébral induit par une diminution de la capacité cérébrale à métaboliser le glucose. Nous proposons dans ce projet une stratégie de substitution énergétique en administrant soit une substance énergétique alternative, soit une substance hormonale. Les bénéfices attendus sont un maintien de l'équilibre énergétique cérébral couplé à un maintien des fonctions cérébrales ou un retard dans leurs altérations.
Procédures
Une intervention chirurgicale est prévue afin d’implanter des pompes permettant l’administration continue de substances. À l’âge de 5 mois, deux modalités d’implantation sont prévues : - Implantation unique : la pompe est posée une seule fois et délivre le traitement pendant un mois. - Implantations répétées : la pompe est posée pour une semaine, puis remplacée chaque semaine, afin de maintenir le traitement sur une durée totale d’un mois. La durée de chaque intervention chirurgicale d’implantation n’excède pas 12 minutes. Les animaux seront anesthésiés pour les examens IRM. Trois examens sont prévus, chacun durant environ 30 à 45 minutes. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer les fonctions cognitivo-sensori-motrices, l’anxiété et les signes de dépression. Chaque test sera effectué une seule fois et dure environ 10 minutes. Enfin, à la fin de l’étude, les animaux recevront une perfusion de substrats marqués au carbone 13 pour mesurer les échanges métaboliques dans le cerveau. Cette procédure est réalisée sous anesthésie pendant une heure, sans réveil.
Impact sur les animaux
- Une chirurgie d’implantation des pompes osmotiques est réalisée, sous anesthésie et antalgie. - L’imagerie par résonance magnétique nucléaire est une technique non invasive, cependant, sous anesthésie : hypothermie et risque de troubles cardio-respiratoires. Cette nuisance entrainera l'arrêt de l'expérimentation. - Les tests de comportement, notamment le test de restriction alimentaire, pourraient induire une anxiété chez les animaux. - Notre étude s’est terminée avant l’apparition de phénotype dommageable (vers 19 mois) qui pourrait entraîner des problèmes de mémoire et d’apprentissage, des modifications cérébrales liées à la maladie, des changements dans le comportement et l’état général de l'animal, et dans de rares cas, un décès soudain.
Devenir
Le cerveau des animaux doit être prélevé pour décrypter les mécanismes moléculaires mis en jeu.
Remplacement
Notre projet de recherche vise à voir si le lactate peut aider à protéger le cerveau dans la maladie d’Alzheimer. Pour le savoir, il est indispensable d’étudier le cerveau dans son fonctionnement global. Aujourd’hui, il n’existe pas d’autre méthode que les modèles expérimentaux pour répondre à cette question et espérer des applications chez l’être humain.
Réduction
Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par le fait que l’IRM est une technique d’investigation non-invasive et permet donc un suivi longitudinal des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les effectifs ont été déterminés par des tests statistiques ainsi que par notre expérience acquise lors d’études précédentes. Les différences intergroupes seront mises en évidence par des tests statistiques.
Raffinement
Les nuisances potentielles sur le bien-être des animaux seront surveillées et limitées au maximum, en particulier lors des périodes pouvant entraîner un stress ou une gêne (anesthésies liées aux examens d’IRM notamment). Les animaux feront l’objet d’un suivi attentif visant à détecter rapidement toute altération de leur état général. Un système de points limites, d’arbre décisionnel de critères d’arrêt sera appliqué afin d’intervenir rapidement si la santé ou le confort des animaux se dégrade. Les conditions d’hébergement et de manipulation seront adaptées de manière à assurer leur confort et une récupération optimale tout au long du protocole.
Choix des espèces
Les souris (modèle de vieillissement sain) et les souris transgeniques (modèle d'Alzheimer) sont deux souches très étudiées dans la littérature, leur utilisation permttra de minimiser le nombre d'animaux contrôles. Les souris partagent de nombreuses similitudes biologiques et génétiques avec les humains, ce qui permet d'observer des mécanismes pathologiques similaires à ceux de la maladie d'Alzheimer chez l'homme. Les modèles de souris transgéniques peuvent être génétiquement modifiés pour développer des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer, ce qui permet d'explorer des hypothèses sur la neuroprotection. Il est possible de suivre des souris sur des périodes prolongées pour observer l'évolution de la maladie et l'impact de l'intervention neuroprotectrice. Les modèles murins permettent d'évaluer les fonctions cognitives et comportementales, fournissant des données sur l'efficacité du traitement neuroprotecteur. Le projet porte sur la neuroprotection dans le cadre du vieillissement cérébral sain ou pathologique (maladie d'Alzheimer). Les animaux seront suivis de l’âge de 5 mois jusqu’à 18 mois. Des IRM seront effectuées à 6, 14 et 16 mois, et des tests comportementaux seront réalisés entre 10 et 18 mois.
Efficacité de décurarisation d’anticorps ou de fragments d’anticorps anti-atracurium
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Paralysées par une injection de curare, des souris peuvent suffoquer pendant deux à trois minutes lorsque l'anticorps testé ne neutralise pas le produit. 1 352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 20 d'entre elles et modéré pour 1 332. Le porteur écrit que l'injection n'entraînera ni spasmes ni douleurs, puis reconnaît qu'aucune mesure de prévention de la douleur n'est rapportée dans la littérature pour cette procédure, ni chez le rat ni chez le singe. Elles sont tuées pour le prélèvement de la rate et des ganglions, ou parce que les produits biologiques injectés fausseraient toute réutilisation.
Objectifs
Ce projet vise à développer de nouvelles solutions pour améliorer la sécurité des patients lors d’interventions chirurgicales nécessitant une anesthésie générale. Actuellement, l’utilisation de certains médicaments anesthésiques (appelés curares) peut entraîner des complications postopératoires, notamment une persistance de leurs effets après l’intervention. Cette situation, fréquente (jusqu’à 8 patients sur 10 concernés), peut provoquer des difficultés respiratoires, des troubles de la déglutition, des risques d’inhalation de liquides gastriques, et parfois prolonger la durée d’hospitalisation ou aggraver l’état de santé du patient. Aujourd’hui, un traitement existe pour limiter ces effets indésirables, mais il présente des limites : il agit lentement et peut lui-même provoquer des effets secondaires, ce qui n’est pas idéal en cas d’urgence. L’objectif de ce projet est donc d’explorer une nouvelle piste thérapeutique en étudiant des molécules capables de neutraliser rapidement et en toute sécurité les effets résiduels des curares, sans entraîner de complications supplémentaires. Plus précisément, nous chercherons à identifier des anticorps (ou des fragments de ces anticorps) capables de lever efficacement le blocage musculaire induit par deux curares couramment utilisés en médecine. Ces anticorps, une fois sélectionnés, pourraient à terme offrir une alternative plus sûre et plus rapide aux traitements actuels. Pour évaluer leur efficacité, nous comparerons l’action de ces anticorps à celle d’un anticorps témoin (sans effet spécifique) chez des souris génétiquement homogènes. Ce modèle animal est indispensable, car les mécanismes en jeu – liés à la circulation sanguine et à l’interaction avec les tissus musculaires – ne peuvent pas être reproduits en laboratoire avec des méthodes in vitro. Les résultats obtenus permettront de sélectionner les anticorps les plus prometteurs en vue d’éventuelles applications cliniques futures. En résumé, ce projet a pour ambition de contribuer à réduire les risques associés à l’anesthésie générale, en proposant une solution innovante pour une récupération plus rapide et plus sûre des patients après une intervention chirurgicale.
Bénéfices attendus
La persistance de l’action des curares étudiés après l’intervention chirurgicale qui conduit à emboliser les services de réanimation ou la nécessité de stopper rapidement l’effet de curarisation d’un patient, nécessite l’administration de composés capables de capturer le curare et de lever le blocage neuromusculaire que celui-ci induit. Ce projet propose de caractériser les propriétés de décurarisation d’anticorps anti-curares que nous identifions dans notre laboratoire de diverses sources, souris et lamas immunisées, répertoires d’anticorps établis à partir de patients allergiques à certains curares. L’anticorps ayant la plus forte capacité de décurarisation pour les deux curares étudiés sera proposé comme une molécule à visée thérapeutique. .
Procédures
Pour certains animaux : 1 injection (quelques secondes) toutes les 3 semaines, 3 fois par animal 1 prise de sang (quelques secondes) toutes les 3 semaines, 2 fois par animal Pour les autres animaux : 2 injections (quelques secondes) une seule fois par animal. La première injection n’induit pas de nuisance particulière. La deuxième injection induit une paralysie partielle et des difficultés respiratoires intenses pendant 2-3 minutes si la première injection ne permet pas la neutralisation du produit injecté lors de la seconde injection.
Impact sur les animaux
Douleur et inconfort légers de courte durée liés aux injections, et aux prélèvements sanguins. L’injection des curares n’entrainera pas de spasmes musculaires ni de douleurs au « réveil » du muscle, mais induiront une respiration abdominale marquée, et potentiellement une suffocation ou aggravation du ralentissement de la respiration de courte durée (estimée à 2-3 minutes).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront euthanasiés pour récolter leurs organes immunitaires (rate et ganglions) en post-mortem, ou ils auront été injectés avec des produits biologiques qui induiraient à terme des réactions immunitaires dirigées contre ces produits biologiques, pouvant ainsi altérer les réponses biologiques de ces animaux.
Remplacement
Des méthodes biochimiques et biophysiques in vitro, ne nécessitant pas l’utilisation d’animaux de laboratoire, sont utilisés en amont de ces expériences in vivo. Elles nous permettent d’identifier les anticorps ayant la meilleure spécificité et la meilleure affinité pour les curares utilisés. En revanche, ces mesures ne sont pas prédictives de la capacité de ces anticorps à capturer efficacement ces curares in vivo, même si nous formulons l’hypothèse que les anticorps les plus affins seront les meilleurs antidotes in vivo. Les pathologies et thérapies qui vont être étudiées ici résultent de réactions systémiques et impliquent des conséquences au niveau de différents tissus et organes. Ces processus sont complexes, reposant sur les singularités du système circulatoire et des tissus cibles, processus qui ne peuvent pas être reproduits in vitro. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinent.
Réduction
Les animaux sélectionnés appartiennent à des lignées génétiquement homogènes, ce qui permet de limiter la variabilité individuelle et de réduire le nombre d’individus nécessaires. L’évaluation de leur état de santé repose sur une échelle simple et standardisée, allant d’un état normal à une altération marquée, en passant par des degrés intermédiaires. Cette approche permet d’obtenir des données comparables entre les groupes expérimentaux. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en s’appuyant sur des données préalablement obtenues dans des études similaires, ainsi que sur l’expérience acquise par l’équipe. Les analyses statistiques viseront à comparer les effets observés entre les groupes traités et les groupes témoins. Pour chaque série de tests, un groupe témoin sera utilisé comme référence, tandis que plusieurs groupes expérimentaux seront évalués simultanément. Les calculs ont été réalisés en tenant compte d’une variabilité modérée des résultats et d’une marge de sécurité en cas de perte accidentelle d’un animal. Ainsi, pour la phase principale de l’étude, chaque groupe comprendra un nombre d’animaux permettant de détecter des différences significatives avec une grande fiabilité, tout en minimisant le recours aux animaux. Pour la phase initiale de sélection, où l’objectif est d’identifier des candidats prometteurs avant une analyse plus approfondie, le nombre d’animaux par groupe a été réduit. Cette première étape vise à repérer des effets marqués, ce qui permet de limiter le nombre d’individus utilisés sans compromettre la détection des résultats les plus pertinents. Les expériences clés seront répétées pour confirmer la cohérence des résultats. Des méthodes statistiques adaptées permettront de prendre en compte d’éventuelles variations liées à ces répétitions. Plusieurs précautions seront prises pour éviter les biais : • Les animaux seront sélectionnés auprès d’un fournisseur agréé, garantissant une homogénéité d’âge et de conditions d’élevage. • Leur répartition dans les groupes expérimentaux sera effectuée de manière aléatoire,. • Les animaux des différents groupes seront hébergés ensemble, ce qui permettra d’évaluer et, si nécessaire, de corriger d’éventuels effets liés à leur environnement. • Le choix du sexe des animaux a été adapté à chaque phase de l’étude pour éviter toute interférence avec les mécanismes étudiés.
Raffinement
Certains animaux sont immunisés en utilisant des faibles volumes et suivant les bonnes pratiques. Un suivi des animaux est réalisé sur leur apparence et leur comportement tout au long de la procédure. Les prélèvements sanguins sont réalisés avec le minimum de volume possible, et l’espacement en temps entre les deux prélèvements est de plusieurs semaines. La procédure induit dès 2-4 minutes après injection par un ralentissement progressif de l’activité de l’animal, accompagné d’une paralysie progressive de certains muscles. Le suivi sera effectué visuellement (mobilité, vitalité, difficultés respiratoires). La durée ne devrait pas excéder 30 minutes dont seulement 2-3 minutes intensive, ce qui ne nécessite pas de prévoir une réhydratation ni du gel nutritif. Les souris pourront être placées sur des membranes chauffantes pour prévenir l’hypothermie si nous constatons cet inconfort dans les premiers groupes de souris. Des mesures de prévention de la douleur n’ont pas été rapportées dans la littérature pour cette procédure, ni chez le rat ni le singe. Nous proposons des points limites afin de minimiser la souffrance de l’animal. Dans le cas d’un arrêt complet de l’activité de l’animal (estimation visuelle) ou de convulsions, l’animal sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris (BALB/c/) permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Bien que des limitations aient été identifiées pour certaines lignées de souris pour l’arbre respiratoire, les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. L’ensemble des groupes expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte » : entre 7 et 12 semaines au début de l’expérience. A ce stade de développement, le système immunitaire est mature, et le poids de l’animal reste faible. La dose de produit à injecter étant relative au poids de l’animal, les quantités restent faibles et génèrent moins de risques.
Cartographie des représentations des vocalises sociales dans le cortex auditif des Souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Une chirurgie crânienne de quarante ou quatre-vingt-dix minutes, l'injection d'un virus dans le cerveau, puis deux mois d'apprentissage où l'eau n'est accessible que dans le dispositif expérimental : 564 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur range parmi les nuisances la frustration des animaux évacués du dispositif après un temps imposé, de dix secondes à dix minutes selon l'étape. L'objectif est de cartographier le cortex auditif pendant que les souris entendent les vocalises ultrasonores de leurs congénères, présentées comme un possible proto-langage éclairant la dyslexie ou la dysphasie humaines. Le cerveau de chaque animal est prélevé après la mise à mort, et le choix de la souris tient à la maturité des outils d'imagerie calcique et à sa petite taille, qui permet une immobilisation efficace sous le microscope.
Objectifs
Le langage est une fonction cognitive centrale dans le fonctionnement de notre cerveau, qui nous permet de communiquer en société. C’est aussi un élément essentiel de notre vie intérieure et de nos raisonnements. Si l’on connait les aires cérébrales impliquées dans la perception et la reconnaissance du langage chez l’homme, très peu de choses sont connues de l’architecture et du fonctionnement des réseaux de neurones qui les constituent. Quels sont les calculs élémentaires effectués par les cellules de ces réseaux pour identifier les sons spécifiques du langage et les distinguer des autres bruits ? Quels mécanismes au sein de ces assemblées de neurones permettent d’associer ces sons pour percevoir des syllabes, des mots ou des phrases ? Les réponses à ces questions nous permettraient de mieux comprendre l’origine des troubles du langage tels que la dysphasie de compréhension ou la dyslexie. Mais elles nécessiteraient d’être capable d’observer l’activité des cellules à l’échelle individuelles au sein de ces vastes réseaux de plusieurs milliers de neurones pour saisir la logique de leurs circuits. Aucune technique applicable à l’homme ne permet à l’heure actuelle ce type d’observation. Chez la souris en revanche, le développement intense au cours des dernières décennies de nouvelles techniques de microscopie a permis de mesurer l’activité d’ensembles constitués de 1000 à 10 000 cellules simultanément sur l’animal éveillé et en comportement. Les souris émettent elles aussi des vocalises de communication, dans les fréquences ultrasonores, dont la richesse dans différents contextes a été étudiée depuis plus de vingt ans, et qui suggèrent qu’il pourrait s’agir d’un proto-langage. Pourtant, l’existence au sein de leur cortex d’aires spécialisées dans la détection et l’interprétation de ces vocalises sociales reste encore à établir. L’objectif de ce projet consiste à mettre en évidence de telles aires chez la souris et de les imager à l’aide de ces nouvelles approches de microscopie dans un contexte comportemental riche. Il ouvrira ainsi la voie vers une compréhension précise des mécanismes mis en place dans les réseaux de neurones de mammifères pour filtrer et traiter ces sons socialement si importants, et aidera à comprendre à terme l’origine des pathologies du langage chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet relèvent tout d’abord des avancées en neurosciences fondamentales et indirectement pour les applications à la santé humaine. Le projet va permettre de cartographier pour la première fois l’activité des neurones dans le cortex auditif des souris en réponse aux vocalises sociales. Il va permettre d’identifier, si elles existent, des subdivisions au sein du cortex auditif qui pourraient traiter spécifiquement ces vocalises. Dans ces subdivisions, et grâce à la résolution cellulaire de la microscopie infra-rouge, le projet permettra d’identifier les circuits élémentaires qui détectent les caractéristiques telles que la richesse spectrale des vocalises, leurs rythmes saccadés, ou leurs combinaisons au sein de « phrases » élaborées. En offrant l’accès à ces circuits et la possibilité de les manipuler par opto-génétique, le projet ouvre la porte vers une meilleure compréhension des mécanismes d’encodage du langage ou des proto-langages, en contexte normal et pathologique. Du point de vue du développement des méthodes en expérimentation animale, et en particulier des méthodes d’imagerie optique de l’activité cérébrale chez le rongeur en comportement, les bénéfices attendus du projet sont, là aussi, majeurs. L’approche en boîte automatisée s’affranchit des interactions homme-animal, ce qui contribue à réduire le stress engendré chez les animaux (notion de Raffinement dans la règle des 3Rs). Cela contribue aussi à limiter la variabilité des résultats des expériences en éliminant une source importante de variabilité due à l’opérateur humain, et en réduisant le nombre des cohortes nécessaires (notion de Réduction dans la règle des 3Rs). L’entrainement en groupe avec maintien des relations sociales est aussi un facteur de raffinement. Enfin, l’efficacité des protocoles d’entrainement automatisés et collectifs développés dans le projet devrait rapidement les positionner comme méthode de référence chez la souris.
Procédures
Les animaux seront impliqués dans une chirurgie sous anesthésie et analgésie. Deux types de chirurgie, durant 40 minutes pour l’une et 90 minutes pour l’autre seront appliquées, chaque animal n’étant soumis qu’à un seul type de chirurgie. Après récupération, ils suivent un protocole d’apprentissage comportemental. Ce protocole a lieu dans un dispositif connecté à leur cage d’hébergement, dans lequel les animaux peuvent s’engager volontairement aux moments qu’ils choisissent, à la fréquence qui leur convient, et pour des sessions individuelles qui pourront durer de 10 secondes à 10 minutes. Pour une partie des animaux, des mesures d’imagerie sont effectuées pendant certaines sessions comportementales, à l’aide d’un microscope infra-rouge capable d’imager les milieux diffusants. Cumulées sur 24h, ces sessions d’imagerie dureront typiquement 20 minutes. D’autres sessions comportementales seront associées à des interventions optogénétiques susceptibles d’identifier les fonctions cognitives à l’œuvre lors de ces comportements. Ces interventions optogénétiques utilisent un mode « sans contact », uniquement basé sur l’application de lumière sur les animaux. Ces sessions optogénétiques cumulées sur 24h dureront environ 1 minute. Le protocole d’apprentissage, les sessions d’imagerie et d’optogénétique s’étaleront sur une période pouvant aller jusqu’à 2 mois.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus ou envisageables sont les suivants. Stress (estimé faible) lié à l’hébergement, à la manipulation pendant la période précédant le protocole comportemental, à la contrainte d’être maintenu immobile pendant certaines phases du protocole comportemental, à la gêne due à l’implant. Frustration des animaux due à leur évacuation imposée du système comportemental après un temps déterminé (10 sec – 10 min selon les étapes du protocole). Pendant la chirurgie, des évènements rares : anesthésie insuffisante, douleur, écart de température, saignement. En période post-opératoire, des évènements rares : douleur, écart de température, infection, notamment des plaies autour de l’implant, signes neurologiques dus à l’injection de virus. Avant l’anesthésie, des évènements rares : anesthésie insuffisante, douleur.
Devenir
L’euthanasie de tous les animaux dans toutes les procédures est nécessaire afin de permettre le prélèvement du cerveau pour les analyses histologiques post-mortem.
Remplacement
De très nombreux travaux ont été menés en mathématiques et algorithmique pour étudier les caractéristiques sonores de la voix, pour décomposer le langage en briques élémentaires (syllabes, mots, phrases…) et permettre une reconnaissance automatique du langage. Les progrès des approches basées sur l’intelligence artificielle en font aujourd’hui des outils utilisés par un très large public. Cependant l’architecture simplifiée des réseaux de neurones formels sur lesquels reposent ces approches est très éloignée de ce que l’on connait des réseaux de neurones biologiques constitutifs du cortex auditif, beaucoup plus complexes. Une compréhension du fonctionnement des circuits corticaux impliqués dans le traitement du langage et de leurs dysfonctionnents en contextes pathologiques ne peut être obtenue qu’en étudiant des organismes biologiques placés en situation de traitement des signaux vocaux. Il n’est donc pas possible de remplacer pour ce projet l’utilisation de souris en comportement par des systèmes in vitro ou in silico.
Réduction
Deux méthodes mises en œuvre : 1) Automatisation de l’apprentissage : élimination des interactions humaines, sources de variabilité (stress, fluctuations comportementales). Cela permet d’obtenir des résultats robustes avec moins d’animaux. 2) Microscopie à deux photons : mesure de plus de 1000 cellules par animal (dix fois plus qu’en électrophysiologie) permettant un suivi longitudinal des mêmes neurones qui augmente les données exploitables par individu et réduit le nombre d’individus nécessaires au projet. De plus, des analyses effectuées au fur et à mesure de l’obtention des mesures permettront d’ajuster les effectifs en les réduisant au minimum de ce qui s’avèrera nécessaire pour démontrer statistiquement les effets étudiés. Des analyses non paramétriques seront choisies pour leur robustesse statistique. Ainsi, le nombre total d’animaux impliqués dans les trois procédures ne devra pas excéder 564 souris.
Raffinement
Deux méthodes de raffinement principales seront mises en œuvre: 1) Automatisation de l’apprentissage : limitation des interactions homme-animal au minimum, contribuant à réduire le stress qui aurait pu être engendré chez les souris lors des manipulations. 2) Entrainement en groupe : maintenance des relations sociales. Autres mesures de raffinement mises en œuvre : Pour les chirurgies, une médication (anesthésie et analgésie) pré- et post-opératoire et un maintien de la condition d’homéothermie sont assurés. L'ensemble des interventions à pratiquer sur un animal sont regroupées afin de n’y opérer qu’une seule chirurgie. Le suivi post-opératoire est constitué de deux phases, le premier jusqu’au réveil complet de l’animal, le second, les jours suivants pour vérifier que l’animal récupère correctement (activité locomotrice, poids, aspect du pelage, activités sociales). Cette récupération aura lieu en dehors du dispositif de la boîte de comportement et de la cage d’habitation, durera deux semaines et sera effectuée dans des cages de stabulation en portoirs ventilés. Des points limites ont été définis et seront appliqués afin de garantir la minimisation de risque de souffrance des souris les atteignant. L’hébergement, pendant la récupération post-chirurgicale ou pendant l’apprentissage dans le dispositif de comportement, se fera dans des conditions conformes à la réglementation. La température (entre 20 et 24 degrés) et l'hygrométrie seront contrôlées et monitorées, le cycle jour nuit sera automatique (12h/12h). Pendant la phase de récupération, les souris auront un accès ad libitum à l’eau et la nourriture. Pendant la phase d’apprentissage, l’eau ne sera accessible que dans la boîte de comportement et la nourriture sera disponible ad libitum dans la cage d’habitation. Les souris seront hébergées par lots de 10 souris de même sexe. L’hébergement individuel des animaux ne sera mis en place transitoirement qu’en cas de nécessité d’isolement dû à des contraintes zootechniques, par exemple en cas d’agression entre congénères. Les hébergements lors de la récupération et de l’apprentissage auront un milieu enrichi pour la nidification (lanière kraft), la mastication (bâton), et la disponibilité de refuges (hutte). Durant l’apprentissage, une roue d’activité sera disposée dans la cage d’habitation. Pour les animaux en provenance d’un fournisseur extérieur, une période d’acclimatation d’une semaine sera prévue avant leur entrée dans l’une des procédures du projet.
Choix des espèces
La souris est un mammifère, dont l’architecture cérébrale est plus proche de celle de l’homme que celle des modèles aviaires chantants. Comparées aux autres mammifères sociaux vocalisants, comme les marmousets, la souris présente deux avantages. Premièrement c’est une espèce pour laquelle les outils d’imagerie calcique sont matures : les rapporteurs fluorescents d’activité neuronale y sont très optimisés et leur petite taille permet une immobilisation sous le microscope efficace. Deuxièmement la disponibilité de souris transgéniques offre des outils puissants pour identifier la composition des circuits neuronaux en manipulant certains types cellulaires (optogénétique), et comprendre leur rapport structure - fonction. La souris représente donc le meilleur compromis entre proximité avec l’architecture de mammifère du cerveau humain, et adaptation aux méthodes optiques d’enregistrement et de manipulation les plus puissantes. Les souris utilisées seront des souris adultes exclusivement, âgées de 8 semaines au moment des chirurgies et de 9-10 semaines au démarrage de l’apprentissage. Le projet vise à comprendre les mécanismes d'apprentissage de l'adulte, et cherche à cartographier les régions corticales auditives telles qu’elles existent chez l’adulte ayant développé une large gamme de vocalises sociales.
Création d’un modèle de souris transgéniques permettant l’étude de l’évolution de la maladie rénale et l’évaluation du risque de cancers du rein associés à une maladie rare, la glycogénose de type Ia : EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Sur 1 008 souris nées pour ce projet, 408 seront tuées pour "régulation de population" faute du bon profil génétique, 100 gardées pour la reproduction, 100 réutilisées pour l'apprentissage des gestes techniques, et 400 tuées après six heures de jeûne pour le prélèvement des reins, de l'intestin et du foie. Le niveau de souffrance déclaré est léger pour 608 d'entre elles, modéré pour 240 et sévère pour 160. Ce second établissement les accueille chaque mois à partir de six mois pour une IRM des reins sous anesthésie d'environ trente minutes, avant leur retour par la route. Le porteur décrit la souris comme "la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible", au motif que sa régulation du sucre ressemble à celle des humains et que les anticorps adaptés existent déjà au laboratoire.
Objectifs
La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie génétique rare qui touche environ 150 à 200 patients en France. Contrairement au diabète, caractérisé par des hyperglycémies (trop de sucre dans le sang) liées à une production excessive de glucose, la GSD1a entraîne des hypoglycémies sévères et potentiellement fatales. Bien que ces deux maladies soient opposées sur le plan de la régulation de la glycémie, elles partagent des complications rénales remarquablement similaires. Les patients peuvent développer une maladie rénale chronique pouvant évoluer vers une insuffisance rénale terminale. Des analyses cellulaires ont révélé que, dans ces contextes pathologiques, le rein adopte un métabolisme favorisant la prolifération cellulaire, comparable à celui observé dans les cancers. Un point commun majeur entre les reins de patients diabétiques, GSD1a et les cancers du rein est l’accumulation excessive de glycogène et de lipides dans les cellules rénales. À ce jour, seuls deux cas de cancer du rein ont été rapportés chez des patients GSD1a en France. Toutefois, grâce à l’amélioration de la prise en charge nutritionnelle depuis les années 1980, l’espérance de vie de ces patients a considérablement augmenté, ce qui pourrait conduire à une augmentation de l’incidence des complications rénales liées au vieillissement. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les mécanismes conduisant à la formation de kystes rénaux et à évaluer le risque de cancer dans des reins soumis à un environnement métabolique favorable au développement de cancer. Pour cela, un modèle murin de GSD1a reproduisant fidèlement les atteintes rénales humaines sera utilisé. Dans ce modèle, les chercheurs inactiveront totalement ou partiellement un gène suppresseur de tumeur fréquemment altéré dans les cancers du rein. L’impact de cette inactivation sur la progression de la maladie rénale sera étudié, avec l’hypothèse d’une accélération de la formation de kystes et de tumeurs rénales. Ce modèle inédit permettra d’explorer les liens entre déséquilibres métaboliques, formation de kyste et de cancer du rein. À terme, ce travail pourrait démontrer un risque accru de cancer du rein chez les patients GSD1a, justifiant la mise en place d’un suivi médical spécifique. Il offrira également un outil unique pour étudier les cancers du rein associés à l’accumulation de graisse, comme chez les diabétiques, mais de façon indépendante de toute perturbation alimentaire.
Bénéfices attendus
Ces nouvelles connaissances sont essentielles, car aujourd’hui, il n’existe aucun traitement capable de stopper ou ralentir efficacement la dégradation progressive des reins chez les patients GSD1a, mais également chez les patients diabétiques. Pourtant, cette complication est fréquente puisque 70 et 80 % des patients atteints de GSD1a développer une maladie rénale chronique, qui peut nécessiter une transplantation rénale ou une dialyse. Mieux comprendre les étapes de cette évolution permettra à terme de concevoir des traitements plus ciblés et efficaces pour préserver la fonction rénale et améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes à l’âge de 7-10 j. Le geste sera réalisé sur animaux vigiles en quelques secondes. Au cours du temps, les souris atteintes de GSD1a vont développer une maladie rénale. Des prélèvements spontanés d’urine auront lieu tous les mois à partir de 2 mois. Dès que les animaux auront atteint l’âge de 6 mois, des prélèvements urinaires et sanguins seront réalisés tous les mois. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles par un prélèvement en veine après immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute dans un tube à contention. Au total, au maximum 20 prélèvements d’urine et 20 prélèvements de sang seront réalisés. Également, les souris seront transférées, à partir de 6 mois, tous les mois dans le 2ème établissement situé à moins de 30 min en voiture du 1er. Leurs reins seront analysés par imagerie IRM. Les souris seront anesthésiées pendant environ 30 minutes, puis ramenées à l’établissement d’origine après leur réveil. En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Un prélèvement de sang sera réalisé immédiatement avant la mise à mort et durera au maximum 15 secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie réalisée au bord de l’oreille entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. Le risque de saignement est très faible. Le développement de la maladie rénale reste sans impact sur le bien-être animal. Au stade avancé de la maladie, caractérisée par l’accumulation d’urée dans le sang (autour de 15 mois), les souris atteintes de GSD1a commencent à perdre du poids et peuvent présenter des signes de mal-être, comme une baisse de la fréquence de toilettage, une prostration, une diminution des déplacements. Le développement de lésions du rein, comme les cancers, peut également être à l’origine de douleurs et d’une gêne. Pour suivre le développement de la maladie, les prélèvements urinaires réalisés de façon spontanée peuvent provoquer un très léger stress. Les prises de sang réalisées après immobilisation de l’animal peuvent entrainer un stress de l’animal et une légère douleur, ainsi qu’un léger saignement dans certains cas. La mise à jeun pendant 6h peut entrainer un léger stress
Devenir
Sur ce projet, seuls les 400 animaux qui subiront l’ensemble des procédures seront mis à mort pour prélèvement des reins, de l’intestin et du foie afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires. Une partie des animaux générés lors des reproductions seront utilisés pour la reproduction et le maintien des lignées (environ 100 animaux) ; une autre partie, estimée à 100 souris de phénotype non dommageable, pourra être réutilisée pour l’apprentissage de gestes sur animaux comme la réalisation de prise de sang ; ces souris seront comptabilisées dans le projet de tutorat des zootechniciens et des expérimentateurs de l’établissement en charge de la reproduction des animaux. Les autres animaux (408) seront mis à mort pour régulation de population.
Remplacement
Même si on sait aujourd’hui fabriquer en laboratoire de petits organes miniatures appelés organoïdes, qui reproduisent en partie la structure du rein, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’évolution d’une maladie rénale sur plusieurs mois. Or, pour comprendre le développement d’une maladie chronique ou l’apparition de cancers, il est essentiel de suivre ce qui se passe dans un organisme vivant sur le long terme. C’est pourquoi une approche chez l’animal, en particulier chez la souris, reste indispensable. Le modèle de souris atteintes de GSD1a utilisé ici est unique : il est viable et reproduit fidèlement les atteintes rénales observées chez les patients atteints, grâce à une technique de modification génétique spécifique à l’espèce. De plus, la souris a un métabolisme très proche de celui de l’humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type d’étude. Il faut aussi noter que la majorité des recherches sur l’insuffisance rénale et les reins présentant des kystes ont été menées chez la souris, ce qui offre une base solide de données scientifiques et de matériel pour ce projet.
Réduction
Le but de ce projet est d’étudier comment certaines modifications génétiques favorisent l’apparition de cancers du rein liés à la maladie GSD1a. Pour cela, deux nouvelles lignées de souris ont été créées. Le projet sera réalisé en 2 temps, sur des groupes de souris étudiées à long terme (1ère étude) et à court terme (2ème étude). La première étude permettra à la fois de vérifier si les animaux développent des signes importants de souffrance dès la naissance et jusqu’à 15 mois ; et de caractériser la maladie rénale grâce au suivi de marqueurs biologiques et l’imagerie par IRM des reins. Si un mal-être important est observé, le projet pourra être arrêté rapidement et les animaux prévus pour la 2ème étude ne seront pas produits. Les chercheurs compareront plusieurs groupes de souris ayant différentes combinaisons de mutations génétiques. Cela permettra de déterminer quel modèle est le plus pertinent pour réaliser la 2ème partie des expériences. Pour limiter le nombre total d’animaux utilisés, l’évolution des lésions rénales sera suivie au cours du temps grâce à des techniques d’imagerie non invasives. Le nombre de souris nécessaires a été calculé à partir de données déjà disponibles (études précédentes et littérature scientifique). Une analyse statistique (test de puissance) a montré qu’il fallait au minimum 10 souris par groupe pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre est doublé (soit 20 souris par groupe) afin d’avoir suffisamment de tissu pour les analyses biologiques et histologiques. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques appropriées. Au total, au maximum 400 souris transgéniques seront utilisées pour l’étude. Leur production entrainera la naissance de 1 008 souris car toutes les souris n’auront pas le bon profil génétique. Celles qui ne sont pas utilisées dans les expériences pourront servir être pour de la reproduction et l’entretien des lignées (environ 100 souris) ou être réutilisées dans un projet de formation aux gestes techniques réalisés sur les animaux, comme les prises de sang (environ 100 souris). Ce projet de tutorat est autorisé dans l’établissement de production des souris et permet au personnel technique de se former et de vérifier les compétences de chaque utilisateur. Enfin, les lignées de souris sont conservées sous forme congelée (cryoconservées), ce qui permet de les préserver sans devoir les maintenir leur reproduction en permanence.
Raffinement
Les biopsies seront réalisées chez les souriceaux à 7-10 jours après la naissance, une période durant laquelle les terminaisons nerveuses ne sont pas encore complètement développées, ce qui permet de limiter la douleur. Pour réduire le stress lié à la manipulation, les gants du technicien seront imprégnés de l’odeur de la litière, et les animaux seront manipulés à l’aide d’un petit tunnel. La GSD1a sera induite uniquement dans les reins des souris, ce qui permettra d’éviter les fortes baisses de sucre dans le sang grâce à la fonction préservée du foie, qui continue de produire du glucose. Le bien-être des nouvelles lignées de souris créées (nombre de souris par portée; courbe de croissance…) sera suivi dès la naissance. Les prises de sang seront réalisées dans le respect des volumes de prélèvement selon les recommandations internationales.Une légère pression sera appliquée après la piqûre pour stopper le saignement.Les souris seront habituées à la contention au préalable. L’urine sera récupérée naturellement, sans avoir à isoler les animaux. L’imagerie médicale par IRM permettra de détecter très tôt les éventuelles atteintes des reins. Pendant les examens sous anesthésie, la fréquence respiratoire sera surveillée et la température corporelle sera maintenue grâce à un circuit de réchauffement des souris dans l’appareil. Le comportement des animaux (posture, mobilité, etc.) sera observé régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si des douleurs apparaissent, notamment en lien avec la formation de kystes ou de tumeurs, des traitements anti-douleurs et antispasmodiques adaptés seront administrés. L’état de santé sera également surveillé grâce au suivi du poids (quasi journalier en période de sevrage, puis hebdomadaire ou mensuel), à des tests urinaires mensuels, et à l’analyse de marqueurs biologiques. Si une souris montre des signes de mal-être (perte de poids ou posture anormale, lésions trop importantes, etc.), elle sera prise en charge avec des soins renforcés : nourriture posée au sol, gel hydratant et nutritif. Si son état ne s’améliore pas ou si l’animal atteint un seuil critique, l’animal sera euthanasié dans le respect des protocoles pour permettre l’analyse des reins. Enfin, les souris devront être transportées lors de chaque IRM entre deux lieux d’expérimentation situés à moins de 10 km. Ce transfert se fera en voiture, avec leur litière et leur matériel habituel pour éviter le stress.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car elle présente des similitudes importantes avec l’humain en ce qui concerne la régulation du sucre dans l’organisme. Chez des espèces plus simples comme le poisson, ces mécanismes sont différents et ne permettent pas d’étudier la maladie de manière fiable. De plus, le modèle de souris atteintes de GSD1a est unique car il reproduit très fidèlement les signes de la maladie rénale que l’on observe chez les patients atteints de glycogénose de type 1 sans développer d’hypoglycémies qui pourraient être fatales. De plus, les outils moléculaires spécifiques à la souris, comme des anticorps, sont disponibles en laboratoire pour analyser finement les mécanismes biologiques impliqués. Ainsi, l’utilisation de la souris est aujourd’hui la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible pour faire avancer la recherche sur cette maladie rare. Les souris seront suivies tout au long de leur vie de la naissance à l’âge de 15 mois maximum, car la maladie rénale évolue très lentement. Aucun symptôme n’est observé pendant plusieurs mois avant d’atteindre la dégradation importante du fonctionnement des reins. Des analyses régulières nécessitant des prélèvements d’urine et de sang chez les souris adultes seront réalisées pour suivre l’évolution de la maladie jusqu’à la fin du protocole (15 mois au maximum).
Création d’un modèle de souris transgéniques permettant l’étude de l’évolution de la maladie rénale et l’évaluation du risque de cancers du rein associés à une maladie rare, la glycogénose de type Ia : EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Biopsiées à l'oreille à sept jours, les souris subissent ensuite jusqu'à vingt prises de sang et vingt prélèvements d'urine, des trajets mensuels en voiture vers un second établissement et des IRM sous anesthésie d'une trentaine de minutes, jusqu'à l'âge de quinze mois. 1 008 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 608, modéré pour 240 et sévère pour 160. Seules 400 suivront le protocole complet : les 408 restantes, nées sans le bon profil génétique, seront tuées pour "régulation de population", 100 seront gardées pour la reproduction des lignées et 100 autres utilisées pour entraîner les zootechniciens aux prises de sang. Le porteur affirme que le développement de la maladie rénale reste sans impact sur le bien-être des animaux non-humains, et décrit dans le même paragraphe une perte de poids, une prostration, une baisse du toilettage et des douleurs liées aux tumeurs du rein.
Objectifs
La glycogénose de type 1a (GSD1a) est une maladie génétique rare qui touche environ 150 à 200 patients en France. Contrairement au diabète, caractérisé par des hyperglycémies (trop de sucre dans le sang) liées à une production excessive de glucose, la GSD1a entraîne des hypoglycémies sévères et potentiellement fatales. Bien que ces deux maladies soient opposées sur le plan de la régulation de la glycémie, elles partagent des complications rénales remarquablement similaires. Les patients peuvent développer une maladie rénale chronique pouvant évoluer vers une insuffisance rénale terminale. Des analyses cellulaires ont révélé que, dans ces contextes pathologiques, le rein adopte un métabolisme favorisant la prolifération cellulaire, comparable à celui observé dans les cancers. Un point commun majeur entre les reins de patients diabétiques, GSD1a et les cancers du rein est l’accumulation excessive de glycogène et de lipides dans les cellules rénales. À ce jour, seuls deux cas de cancer du rein ont été rapportés chez des patients GSD1a en France. Toutefois, grâce à l’amélioration de la prise en charge nutritionnelle depuis les années 1980, l’espérance de vie de ces patients a considérablement augmenté, ce qui pourrait conduire à une augmentation de l’incidence des complications rénales liées au vieillissement. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre les mécanismes conduisant à la formation de kystes rénaux et à évaluer le risque de cancer dans des reins soumis à un environnement métabolique favorable au développement de cancer. Pour cela, un modèle murin de GSD1a reproduisant fidèlement les atteintes rénales humaines sera utilisé. Dans ce modèle, les chercheurs inactiveront totalement ou partiellement un gène suppresseur de tumeur fréquemment altéré dans les cancers du rein. L’impact de cette inactivation sur la progression de la maladie rénale sera étudié, avec l’hypothèse d’une accélération de la formation de kystes et de tumeurs rénales. Ce modèle inédit permettra d’explorer les liens entre déséquilibres métaboliques, formation de kyste et de cancer du rein. À terme, ce travail pourrait démontrer un risque accru de cancer du rein chez les patients GSD1a, justifiant la mise en place d’un suivi médical spécifique. Il offrira également un outil unique pour étudier les cancers du rein associés à l’accumulation de graisse, comme chez les diabétiques, mais de façon indépendante de toute perturbation alimentaire.
Bénéfices attendus
Ces nouvelles connaissances sont essentielles, car aujourd’hui, il n’existe aucun traitement capable de stopper ou ralentir efficacement la dégradation progressive des reins chez les patients GSD1a, mais également chez les patients diabétiques. Pourtant, cette complication est fréquente puisque 70 et 80 % des patients atteints de GSD1a développer une maladie rénale chronique, qui peut nécessiter une transplantation rénale ou une dialyse. Mieux comprendre les étapes de cette évolution permettra à terme de concevoir des traitements plus ciblés et efficaces pour préserver la fonction rénale et améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Afin de sélectionner les souris transgéniques nécessaires au projet, un morceau de tissu (biopsie) sera prélevé pour caractériser leurs gènes à l’âge de 7-10 j. Le geste sera réalisé sur animaux vigiles en quelques secondes. Au cours du temps, les souris atteintes de GSD1a vont développer une maladie rénale. Des prélèvements spontanés d’urine auront lieu tous les mois à partir de 2 mois. Dès que les animaux auront atteint l’âge de 6 mois, des prélèvements urinaires et sanguins seront réalisés tous les mois. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles par un prélèvement en veine après immobilisation de l’animal pendant moins d’une minute dans un tube à contention. Au total, au maximum 20 prélèvements d’urine et 20 prélèvements de sang seront réalisés. Également, les souris seront transférées, à partir de 6 mois, tous les mois dans le 2ème établissement situé à moins de 30 min en voiture du 1er. Leurs reins seront analysés par imagerie IRM. Les souris seront anesthésiées pendant environ 30 minutes, puis ramenées à l’établissement d’origine après leur réveil. En fin de protocole, les souris seront mises à jeun pendant 6h avant leur mise à mort. Un prélèvement de sang sera réalisé immédiatement avant la mise à mort et durera au maximum 15 secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie réalisée au bord de l’oreille entraine une légère douleur et un stress lié à la contention des nouveau-nés. Le risque de saignement est très faible. Le développement de la maladie rénale reste sans impact sur le bien-être animal. Au stade avancé de la maladie, caractérisée par l’accumulation d’urée dans le sang (autour de 15 mois), les souris atteintes de GSD1a commencent à perdre du poids et peuvent présenter des signes de mal-être, comme une baisse de la fréquence de toilettage, une prostration, une diminution des déplacements. Le développement de lésions du rein, comme les cancers, peut également être à l’origine de douleurs et d’une gêne. Pour suivre le développement de la maladie, les prélèvements urinaires réalisés de façon spontanée peuvent provoquer un très léger stress. Les prises de sang réalisées après immobilisation de l’animal peuvent entrainer un stress de l’animal et une légère douleur, ainsi qu’un léger saignement dans certains cas. La mise à jeun pendant 6h peut entrainer un léger stress.
Devenir
Sur ce projet, seuls les 400 animaux qui subiront l’ensemble des procédures seront mis à mort pour prélèvement des reins, de l’intestin et du foie afin de réaliser des analyses anatomo-pathologiques et moléculaires. Une partie des animaux générés lors des reproductions seront utilisés pour la reproduction et le maintien des lignées (environ 100 animaux) ; une autre partie, estimée à 100 souris de phénotype non dommageable, pourra être réutilisée pour l’apprentissage de gestes sur animaux comme la réalisation de prise de sang ; ces souris seront comptabilisées dans le projet de tutorat des zootechniciens et des expérimentateurs de l’établissement en charge de la reproduction des animaux. Les autres animaux (408) seront mis à mort pour régulation de population.
Remplacement
Même si on sait aujourd’hui fabriquer en laboratoire de petits organes miniatures appelés organoïdes, qui reproduisent en partie la structure du rein, ces modèles ne permettent pas d’étudier l’évolution d’une maladie rénale sur plusieurs mois. Or, pour comprendre le développement d’une maladie chronique ou l’apparition de cancers, il est essentiel de suivre ce qui se passe dans un organisme vivant sur le long terme. C’est pourquoi une approche chez l’animal, en particulier chez la souris, reste indispensable. Le modèle de souris atteintes de GSD1a utilisé ici est unique : il est viable et reproduit fidèlement les atteintes rénales observées chez les patients atteints, grâce à une technique de modification génétique spécifique à l’espèce. De plus, la souris a un métabolisme très proche de celui de l’humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour ce type d’étude. Il faut aussi noter que la majorité des recherches sur l’insuffisance rénale et les reins présentant des kystes ont été menées chez la souris, ce qui offre une base solide de données scientifiques et de matériel pour ce projet
Réduction
Le but de ce projet est d’étudier comment certaines modifications génétiques favorisent l’apparition de cancers du rein liés à la maladie GSD1a. Pour cela, deux nouvelles lignées de souris ont été créées. Le projet sera réalisé en 2 temps, sur des groupes de souris étudiées à long terme (1ère étude) et à court terme (2ème étude). La première étude permettra à la fois de vérifier si les animaux développent des signes importants de souffrance dès la naissance et jusqu’à 15 mois ; et de caractériser la maladie rénale grâce au suivi de marqueurs biologiques et l’imagerie par IRM des reins. Si un mal-être important est observé, le projet pourra être arrêté rapidement et les animaux prévus pour la 2ème étude ne seront pas produits. Les chercheurs compareront plusieurs groupes de souris ayant différentes combinaisons de mutations génétiques. Cela permettra de déterminer quel modèle est le plus pertinent pour réaliser la 2ème partie des expériences. Pour limiter le nombre total d’animaux utilisés, l’évolution des lésions rénales sera suivie au cours du temps grâce à des techniques d’imagerie non invasives. Le nombre de souris nécessaires a été calculé à partir de données déjà disponibles (études précédentes et littérature scientifique). Une analyse statistique (test de puissance) a montré qu’il fallait au minimum 10 souris par groupe pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre est doublé (soit 20 souris par groupe) afin d’avoir suffisamment de tissu pour les analyses biologiques et histologiques. Les résultats seront analysés avec des méthodes statistiques appropriées. Au total, au maximum 400 souris transgéniques seront utilisées pour l’étude. Leur production entrainera la naissance de 1 008 souris car toutes les souris n’auront pas le bon profil génétique. Celles qui ne sont pas utilisées dans les expériences pourront servir être pour de la reproduction et l’entretien des lignées (environ 100 souris) ou être réutilisées dans un projet de formation aux gestes techniques réalisés sur les animaux, comme les prises de sang (environ 100 souris). Ce projet de tutorat est autorisé dans l’établissement de production des souris et permet au personnel technique de se former et de vérifier les compétences de chaque utilisateur. Enfin, les lignées de souris sont conservées sous forme congelée (cryoconservées), ce qui permet de les préserver sans devoir les maintenir leur reproduction en permanence
Raffinement
Les biopsies seront réalisées chez les souriceaux à 7-10 jours après la naissance, une période durant laquelle les terminaisons nerveuses ne sont pas encore complètement développées, ce qui permet de limiter la douleur. Pour réduire le stress lié à la manipulation, les gants du technicien seront imprégnés de l’odeur de la litière, et les animaux seront manipulés à l’aide d’un petit tunnel. La GSD1a sera induite uniquement dans les reins des souris, ce qui permettra d’éviter les fortes baisses de sucre dans le sang grâce à la fonction préservée du foie, qui continue de produire du glucose. Le bien-être des nouvelles lignées de souris créées (nombre de souris par portée;courbe de croissance…) sera suivi dès la naissance.Les prises de sang seront réalisées dans le respect des volumes de prélèvement selon les recommandations internationales. Une légère pression sera appliquée après la piqûre pour stopper le saignement. Les souris seront habituées à la contention au préalable.L’urine sera récupérée naturellement, sans avoir à isoler les animaux dans des cages spécifiques. L’imagerie médicale par IRM permettra de détecter très tôt les éventuelles atteintes des reins. Pendant les examens sous anesthésie,la fréquence respiratoire sera surveillée et la température corporelle sera maintenue grâce à un circuit de réchauffement des souris dans l’appareil.Le comportement des animaux (posture, mobilité, etc.) sera observé régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de douleur ou de malaise. Si des douleurs apparaissent, notamment en lien avec la formation de kystes ou de tumeurs, des traitements anti-douleurs et antispasmodiques adaptés seront administrés. L’état de santé sera également surveillé grâce au suivi du poids (quasi journalier en période de sevrage, puis hebdomadaire ou mensuel), à des tests urinaires mensuels, et à l’analyse de marqueurs biologiques. Si une souris montre des signes de mal-être (perte de poids ou posture anormale, lésions trop importantes, etc.), elle sera prise en charge avec des soins renforcés : nourriture posée au sol, gel hydratant et nutritif. Si son état ne s’améliore pas ou si l’animal atteint un seuil critique, l’animal sera euthanasié dans le respect des protocoles pour permettre l’analyse des reins. Enfin, les souris devront être transportées lors de chaque IRM entre deux lieux d’expérimentation situés à moins de 10 km. Ce transfert se fera en voiture, avec leur litière et leur matériel habituel pour éviter le stress
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car elle présente des similitudes importantes avec l’humain en ce qui concerne la régulation du sucre dans l’organisme. Chez des espèces plus simples comme le poisson, ces mécanismes sont différents et ne permettent pas d’étudier la maladie de manière fiable. De plus, le modèle de souris atteintes de GSD1a est unique car il reproduit très fidèlement les signes de la maladie rénale que l’on observe chez les patients atteints de glycogénose de type 1 sans développer d’hypoglycémies qui pourraient être fatales. De plus, les outils moléculaires spécifiques à la souris, comme des anticorps, sont disponibles en laboratoire pour analyser finement les mécanismes biologiques impliqués. Ainsi, l’utilisation de la souris est aujourd’hui la seule option scientifiquement pertinente et techniquement possible pour faire avancer la recherche sur cette maladie rare. Les souris seront suivies tout au long de leur vie de la naissance à l’âge de 15 mois maximum, car la maladie rénale évolue très lentement. Aucun symptôme n’est observé pendant plusieurs mois avant d’atteindre la dégradation importante du fonctionnement des reins. Des analyses régulières nécessitant des prélèvements d’urine et de sang chez les souris adultes seront réalisées pour suivre l’évolution de la maladie jusqu’à la fin du protocole (15 mois au maximum).
Compréhension des mécanismes anti-tumoraux de la testostérone dans un modèle de corticosurrénalome chez la souris et recherche de cibles thérapeutiques alternatives
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 384 d'entre elles et sévère pour 192. Toutes subissent l'amputation d'une phalange pour le génotypage, puis reçoivent sous anesthésie un implant de testostérone, de dihydrotestostérone ou un placebo, avant un suivi échographique du corticosurrénalome qu'elles développent par construction génétique, jusqu'au stade métastatique à 18 mois. Le bénéfice avancé pour les patients, de nouvelles pistes contre un cancer dont la survie médiane reste de quinze mois, tient à des mécanismes moléculaires encore à établir. Sur le remplacement, le porteur écrit vouloir éviter les manipulations in vivo autant que possible, puis conclut que les lignées cellulaires disponibles ne répondent pas aux androgènes et que la "nécessité" du recours aux animaux se justifie.
Objectifs
Le carcinome corticosurrénalien est un cancer rare et agressif, caractérisé par un pronostic défavorable. À son diagnostic, près de 50 % des patients présentent des métastases, ce qui explique un faible taux de survie à 5 ans. Actuellement, l’unique option curative pour les patients non métastatiques repose sur une exérèse complète de la tumeur primaire. Cependant, le risque de récidive est élevé (30 à 70 %), constituant la principale cause de décès. Pour les patients métastatiques, la chirurgie est inenvisageable, et les traitements existants, bien que lourds, n’améliorent pas la survie globale médiane, qui demeure autour de 15 mois. Les essais d’immunothérapie dans le carcinome corticosurrénalien ont donné des résultats décevants, probablement en raison de l’immunosuppression induite par l’hyperactivité endocrine observée dans environ 50 % des cas. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il a été récemment montré dans un modèle murin de carcinome corticosurrénalien, que la testostérone produite au moment de la puberté induit un recrutement de macrophages chez les souris mâles, ce qui conduit à une régression de la tumeur. De façon similaire, le traitement des souris femelles portant des carcinomes corticosurrénaliens avec de la testostérone conduit aussi à un recrutement de macrophages et à une diminution de la taille de la tumeur. Ces résultats suggèrent que la testostérone possède un fort potentiel en tant qu’agent antitumoral dans le contexte du carcinome corticosurrénalien. Dans cette étude, l’objectif est d’approfondir la compréhension du rôle antitumoral de la testostérone dans le carcinome corticosurrénalien et d’identifier les mécanismes de réponse en aval, en utilisant des implants de testostérone ou de dihydrotestostérone chez des souris femelles portant des carcinomes corticosurrénaliens. L’objectif global de ces expériences est de comprendre l’importance de la testostérone et de comprendre également comment la testostérone est capable d’avoir un puissant effet antitumoral. Finalement ce projet a pour but d’évaluer la faisabilité d’une modulation hormonale ciblée comme stratégie thérapeutique innovante. La compréhension des mécanismes d’action en aval de la testostérone permettra également de proposer différentes approches thérapeutiques pour les patients atteint de carcinomes corticosurrénalien.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de confirmer le rôle de la testostérone dans la régression du carcinome corticosurrénalien. Elle contribuera à identifier les mécanismes moléculaires antitumoraux impliqués dans cet effet protecteur. Les résultats attendus permettront d’améliorer la compréhension des voies de signalisation impliquées dans la réponse à la testostérone, ouvrant la voie au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Ces approches pourraient reposer sur l’utilisation de la testostérone elle-même ou sur le ciblage des mécanismes moléculaires identifiés grâce à cette étude, dans le but d’améliorer la prise en charge des patients atteints de carcinomes corticosurrénaliens.
Procédures
576 souris seront soumises à une phalangectomie (durée 2 min, 1 fois). 288 souris femelles recevront des implants de testostérone ou de dihydrotestostérone sous anesthésie générale et 288 souris femelles recevront des placebos sous anesthésie générale. L'intervention sera pratiquée 1 seule fois et dure environ 7 minutes.
Impact sur les animaux
La phalangectomie, nécessaire à l’identification et au génotypage des individus, peut entraîner une douleur légère et de courte durée. Cependant, cette procédure n’induit aucune complication durant le développement des animaux et n'affecte pas leur comportement, ni celui des individus de la portée ni de leur mère. L’implantation des implants hormonaux peut entraîner une douleur modérée, localisée et transitoire au site d’insertion. L’insertion des implants pourrait également entrainer une infection locale. L’échographie, réalisée sous anesthésie générale, ne provoque pas de douleur mais peut générer un léger stress lié à la manipulation. Les modèles murins de carcinomes corticosurrénaliens présentent un développement tumoral et éventuellement des métastases.
Devenir
Tous les animaux ayant subi la procédure seront mis à mort à la fin de l’expérience pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer le rôle de la testostérone et de ses mécanismes sous-jacents dans le développement du carcinome corticosurrénalien et ainsi pouvoir potentiellement identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du carcinome corticosurrénalien.
Remplacement
Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux sacrifiés sans manipulation préalable. Cependant, l’ensemble des lignées de carcinome corticosurrénalien actuellement disponibles ne répondent pas aux androgènes, ce qui limite leur pertinence pour l’étude du rôle de la testostérone. De plus, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.
Réduction
Dans l’optique de réduire le nombre d’individus par expérience, nous mettons en œuvre plusieurs mesures. Nous planifions, lorsque c’est possible, plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque animal soient utilisées. De même, le sang des animaux mis à mort sera systématiquement recueilli pour réaliser des dosages. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration scientifique convaincante, basée sur des arguments statistiques valides et la variabilité biologique attendue. Les groupes expérimentaux comprendront au maximum 12 souris. Une phase préliminaire de mise au point des expériences sera conduite sur un petit nombre d’animaux pour valider la faisabilité des expériences. Les analyses complètes ne seront engagées qu’après validation de cette phase. Pour les souris présentant un carcinome corticosurrénalien avancé, les implants seront maintenus pendant 2 mois afin d’évaluer un effet sur la régression tumorale et la dissémination métastatique. Si des effets anti-tumoraux sont constatés, un groupe supplémentaire sera traité pendant 2 semaines, afin d’évaluer si un traitement court ralenti la croissance tumorale et permettra de caractériser les mécanismes d’action en aval sur des stades de carcinome corticosurrénalien avancés.
Raffinement
Tout au long des procédures, des mesures spécifiques seront mises en place afin d’assurer le bien-être des animaux et de minimiser toute source de stress ou d’inconfort. Du coton sera ajouté dans les cages pour favoriser le maintien de la température corporelle. Pendant la phase de réveil post-anesthésie, les cages seront placées sur un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie. De la nourriture et du gel d’hydratation seront disposés au sol pour faciliter l’accès à l’alimentation et à l’hydratation sans effort. La réalisation de toutes les procédures sera effectuée par du personnel qualifié afin de réduire au maximum la durée de la procédure. Durant toute la procédure, les animaux seront hébergés en cages transparentes et munies d’une grille, qui permettront de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif entre les congénères, limitant ainsi l’isolement social dû à l’hébergement individuel. Les implants seront insérés avec du matériel stérile ce qui réduit fortement l’apparition d’infection chez les animaux. Une surveillance approfondie au niveau du site d’insertion des implants sera réalisée tous les jours pendant 1 semaine. Afin de limiter les nuisances associées aux implants, aux manipulations et les nuisances associés au développement tumoral (inconfort, douleur), les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel formé et expérimenté. Tout animal présentant des signes de souffrance ou atteignant un point limite précis défini sera retiré de l’expérimentation et mis à mort, si nécessaire, conformément aux procédures établies.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant le cancer de la cortico-surrénale. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Au cours de ce projet, une lignée de souris est utilisée. Cette lignée est un modèle préclinique murin de corticosurrénalome reposant sur l’invalidation de gènes suppresseurs de tumeurs mutés chez les patients. Nous réaliserons nos analyses aux 3 stades de développement tumoral identifiés chez les femelles dans ce modèle murin. Un stade d’hyperplasie à 6 semaines, un stade de corticosurrénalome avancé à 16 mois et un stade de corticosurrénalome métastatique à 18 mois.
Étude de la perception et encodage du temps à court et long termes chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Pour étudier comment le cerveau perçoit le temps, 512 souris sont entraînées une à trois semaines dans des enceintes expérimentales, motivées par des récompenses alimentaires obtenues au prix d'une réduction contrôlée de leur ration. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Jusqu'à deux chirurgies de deux heures sous anesthésie générale servent à implanter le système d'imagerie que les animaux portent ensuite pendant les tests, encombrement dont le porteur reconnaît l'inconfort. Les souris qui ne peuvent pas être incluses dans les tests comportementaux seront, écrit le porteur, "valorisées" dans une expérience de mise au point d'outils d'analyse.
Objectifs
Dans notre vie quotidienne, nous évaluons constamment le temps : combien de temps avant que le feu passe au vert ? Quand avons-nous voyagé la dernière fois ? Ces processus sont fondamentaux pour notre mémoire, nos prises de décision et nos capacités d’adaptation. En effet, la perception du temps est une fonction cognitive essentielle permettant aux organismes d’interagir efficacement avec leur environnement. Que ce soit pour anticiper un événement imminent ou pour structurer des actions ou des expériences vécues sur des périodes étendues, la capacité à percevoir et encoder le temps joue un rôle clé dans la survie et l’adaptation. Des perturbations de ces processus peuvent altérer les capacités d’adaptation face au stress et contribuer à des troubles psychiatriques tels que la dépression, les troubles anxieux et de stress post-traumatique. La manière dont le cerveau représente et stocke les informations temporelles reste encore mal comprise. La perception et l’encodage du temps reposeraient sur des réseaux cérébraux complexes impliquant des régions comme l’hippocampe et le striatum. Cependant, ces régions n’encodent pas le temps comme un simple chronomètre : leur activité fluctue, se transforme au fil du temps et s’adapte en fonction de l’expérience, de l’apprentissage et de l’âge. Il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes associés, ceux permettant notamment d’estimer la durée de stimuli ou l’horodatage et les caractéristiques temporelles des expériences vécues. Ainsi, ce projet a pour objectif d’étudier les mécanismes cérébraux impliqués dans la perception du temps, à des échelles courtes (dizaines de secondes) et longues (heures à semaines), à travers l’étude du comportement des animaux dans différentes situations expérimentales . En outre, nous testerons dans une dernière expérience, les effets d’un mélange gazeux d'oxygène et de protoxyde d'azote, utilisé pour ses effets analgésiants, qui est actuellement développé comme alternative thérapeutique à action rapide dans certaines pathologies psychiatriques comme la dépression. Il est établi que le mélange gazeux affecte les états de conscience mais ses effets immédiats et différés sur la perception et l’encodage du temps ne sont pas connus alors qu’ils pourraient avoir un rôle important à jouer dans ses effets bénéfiques comportementaux et thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le premier objectif de ce projet est d’apporter des connaissances essentielles sur les mécanismes cérébraux sous-tendant l’encodage du temps à court-terme et dans la mémoire à long terme. Une meilleure compréhension de ces processus fondamentaux est cruciale pour comprendre les bases neuronales de la mémoire et les capacités d’adaptation cognitive. L’approche par imagerie calcique offre une précision inatteignable pour observer en temps réel le fonctionnement des populations neuronales du cerveau lors de la réalisation de tâches liées à la perception du temps et à la mémoire, permettant d’analyser des mécanismes auparavant inaccessibles. Ces découvertes seront d’autant plus précieuses que les zones du cerveau impliquées jouent un rôle central dans de nombreuses autres fonctions cognitives et sont affectés dans troubles comme la dépression, l’anxiété et les troubles de stress post-traumatiques. En outre, ce projet implique également l’évaluation des effets d’un mélange gazeux d’oxygène et protoxyde d’azote actuellement utilisé pour ces propriétés analgésiantes mais en cours de développement et d’évaluation comme alternatives thérapeutiques à action rapide dans la dépression.
Procédures
Les animaux seront soumis à des phases d’entrainement et de tests comportementaux sur des périodes allant de 1 à 3 semaines, selon l’expérience concernée. Ces phases correspondent à des explorations libres ou dirigées quotidiennes, dans différentes enceintes expérimentales (avec des récompenses alimentaires), d’une durée comprise entre 10 et 30 minutes par session et qui pourront être répétées selon l’expérience. Afin de maintenir la motivation pour la récompense alimentaire, certaines phases expérimentales incluront un contrôle alimentaire léger, consistant en une réduction contrôlée de l’apport alimentaire avant la session expérimentale sur une période de 1 à 3 semaine. La distribution est quotidienne et ajustée individuellement. Dans certaines expériences, les souris seront également soumises au maximum à 2 interventions chirurgicales, chacune d’une durée approximative de deux heures, réalisées sous anesthésie générale. Les animaux pourront être hébergés en cage individuelle de manière ponctuelle, notamment après les interventions chirurgicales (pendant 24 à 72 heures) et lors des périodes nécessitant un contrôle alimentaire individualisé (1 à 3 semaines)
Impact sur les animaux
Les différentes manipulations/contentions ainsi que l’hébergement isolé en cage, l’isolement lors des tests de comportement et la restriction alimentaire peuvent engendrer du stress pour l’animal. L’intervention chirurgicale peuvent induire des douleurs post-opératoires légères avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal. Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les souris seront encombrées d’un système d’imagerie lors des tests, ce qui peut engendrer de l’inconfort.
Devenir
La totalité des animaux de l’étude seront mis à mort. Pour les besoins de l’étude, nous devons prélever le cerveau pour vérification histologique et investigation de l’expression de protéines d’intérêt.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée : l’étude des bases comportementales et neurales de la perception et l’encodage du temps et de leur mémoire à différentes échelles d’analyse. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale de fonction cognitive complexe comme dans notre étude repose sur l’observation directe du comportement de l’animal et de ses performances mnésiques tout en effectuant l’enregistrement de l’activité neuronale lors de la réalisation de ces tâches comportementales et de mémoires.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques.
Raffinement
Les chirurgies sont réalisées par du personnel formé et expérimenté, sous anesthésie générale afin de garantir l’absence d’inconfort pendant les gestes réalisés. Des constantes physiologiques sont suivies pendant l’intervention et des précautions sont prises pour maintenir l’animal dans les meilleures conditions. Des mesures sont mises en place avant et après les interventions afin d’assurer un confort et une récupération rapide des animaux. Les animaux font l’objet d’une surveillance régulière pendant plusieurs jours afin de vérifier leur bon état général et leur reprise d’activité normale Les expériences comportementales incluent une phase d’habituation progressive à l’expérimentateur, aux dispositifs et conditions de test afin de réduire le stress. Les manipulations ne nécessitent pas de contentions. Lorsqu’un hébergement individuel est requis, il est limité dans le temps. Des enrichissements supplémentaires sont apportés (matériel de nidification, abris, des tubes et objets à mordiller). Les animaux sont regroupés dès que les conditions le permettent. Les animaux ne pouvant pas être inclus dans les expériences comportementales seront valorisés, en intégrant une expérience permettant la création de nouveaux outils d’analyses sans recourir à des animaux supplémentaires.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des études des bases neurobiologiques de la mémoire, de la formation des souvenirs et de dysfonctions de la mémoire. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes normaux sous-tendant l’association temporelle de souvenirs et sa mise en mémoire dans des conditions normales. Il n’est pas nécessaire d’utiliser des stades plus spécifiques du développement par rapport à l'objectif scientifique de l'étude.
Evaluation de l’impact des microbiotes intestinaux « sauvage » et de « laboratoire » sur les phénotypes de la souris domestique en conditions contrôlées
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
Des mâles sauvages sont vasectomisés puis accouplés avec des femelles, chez qui des embryons de souris de laboratoire sont ensuite transférés par chirurgie. Sur les 510 souris du projet, 240 relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 150 d'un niveau modéré et 120 d'un niveau léger, toutes tuées à l'issue des expériences d'infection pour prélever leurs organes. Elles sont hébergées seules trois semaines pour que leur activité sur roue soit mesurée, puis infectées par un parasite intestinal et une bactérie administrés dans l'eau de boisson. Le porteur range parmi les bénéfices attendus une amélioration des conditions de vie des souris en animalerie et une baisse de leur anxiété.
Objectifs
L’apport de souris porteuses de microbiotes intestinaux sauvages dans les expériences étudiant l’immunité des souris est incontestable notamment en vaccinologie, et aujourd’hui la question est posée d’utiliser ce type de modèle lors des essais précliniques. Notre projet permettra de tester l’impact de ces microbiotes sur d’autres phénotypes cruciaux dans d’autres domaines de recherche (comportements, activité physique, métabolisme) ainsi que sur la résistance aux parasites et pathogènes et aux co-infections. D’un point de vue fondamental, l’étude des microbiotes intestinaux sauvages en laboratoire devrait permettre de mieux comprendre leur rôle dans l’adaptation des rongeurs à leur environnement. D’un point de vue bien-être animal, nous nous attendons à ce que ces microbiotes améliorent certains phénotypes comme la résistance aux pathogènes, et la diminution de l’anxiété. Ainsi ce projet pourrait permettre d’améliorer les conditions de vies des souris en animalerie, de limiter les épidémies au sein de ces infrastructures, et potentiellement d’améliorer certains résultats pour lesquels l’anxiété des souris ou la faible résistance aux pathogènes représente une nuisance ou un biais expérimental. Notre projet est donc conçu comme la première étape vers une utilisation plus large des microbiotes intestinaux sauvages, au sein des animaleries.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont : - Comme expliqué dans la partie « objectif du projet », plus on progresse le long du gradient d’urbanisation, plus la diversité du microbiote intestinal des souris sauvages diminue. Cette dégradation est suspectée 1. d’altérer les fonctions assurées par le microbiote intestinal au sein de son hôte, et 2. de favoriser la transmission des agents zoonotiques. Notre projet permettra d’évaluer les conséquences de la perte de diversité du microbiote intestinal de la souris domestique liée à l’artificialisation environnementale créée par l’urbanisation. - De comparer les performances des souris porteuses de microbiotes intestinaux sauvages avec celle porteuses de microbiote de laboratoire. Plusieurs articles font état de l’apport des microbiotes intestinaux sauvages dans les expériences étudiant l’immunité des souris, notamment en vaccinologie. L’utilisation de souris porteuses de microbiote sauvages est aujourd’hui posée lors des essais précliniques. Notre projet permettra de tester l’impact de ces microbiotes sur d’autres phénotypes cruciaux dans d’autres domaines de recherche (comportements, activité physique, métabolisme) ainsi que sur la résistance aux parasites et pathogènes et aux co-infections. Si, nos résultats montrent effectivement une différence entre microbiotes intestinaux sauvages et de laboratoire, ils pourront également nous permettre de comprendre si la diversité du microbiote intestinal est impliquée dans ces performances et si certaines espèces ou groupes d’espèces bactériennes sont impliquées dans ces gains de performances.
Procédures
Sur les souris sauvages un maximum de 3 prélèvements sanguins sera réalisé sur animaux vigiles. Les mâles seront stérilisés chirurgicalement avant d’être accouplés avec des femelles. Des embryons de souris de laboratoire seront transférés par chirurgie chez ces femelles. Ces interventions seront réalisées sous anesthésie générale et ne dépassent pas 30 minutes. Les animaux subiront des tests non invasifs d’activité motrice (3 fois 5 minutes) et de comportement (3 fois 5 minutes). Ils seront ensuite hébergés individuellement pendant 3 semaines pour l’étude de leur activité physique spontanée sur roues. En fin d’expérience, un parasite intestinal et/ou une bactérie seront administrés oralement par abreuvement spontané des souris au biberon contenant les bactéries. Un prélèvement sanguin sera réalisé (30 secondes) une fois par semaine sur ces souris infectées afin d’évaluer l’intensité de la réponse immunitaire soit 3 prélèvements au total.
Impact sur les animaux
La méthode de transfert de microbiote utilisée nécessite des interventions chirurgicales sur quelques individus sauvages, notamment la vasectomie, et le transfert d’embryons de souris de laboratoire. Ces procédures peuvent entrainer des nuisances post opératoires (douleur, et dans de très rares cas fièvre, infection). Les expériences de phénotypage des comportements, de l’activité physique, et du métabolisme peuvent induire un léger stress. L’infection par un parasite intestinal semble être sans réel effet sur le bien-être des souris d’élevage. En revanche, l’infection par ingestion d’un pathogène bactérien, peut induire des nuisances plus importantes. De plus, lors des expériences d’infections, des prises de sangs seront réalisées régulièrement afin de mesurer l’efficacité de la réponse immunitaire, ce qui induit des souffrances légères de courte durée aux animaux.
Devenir
Durant la dernière expérience du protocole, les souris sont infectées par un pathogène et/ou un parasite intestinal, et des prélèvements d'organes devront être réalisés sur ces individus. Ces individus devront donc être euthanasiés.
Remplacement
Le projet vise à étudier l’impact des Microbiotes intestinaux sauvages sur les phénotypes de la souris hôte. Le remplacement n’est pas possible car il n’est pas possible d’utiliser un modèle in vitro ou informatique capable de modéliser des interactions biologiques aussi complexes.
Réduction
Nous avons pour objectif de réaliser ce projet en suivant la recommandation d’étudier les deux sexes, tout en réduisant au maximum le nombre d’individus utilisés et cela sans compromettre la puissance statistique de nos analyses. La personnalité des individus, l’effet du sexe et l’effet du microbiote intestinal, sont des facteurs qui augmentent la variabilité des résultats. Selon des données préliminaires, réaliser nos expériences avec des groupes de 12 individus, permettra d’avoir des données suffisamment robustes pour être exploitées statistiquement. Par ailleurs, le fait d’étudier les mêmes individus dans l’ensemble des expériences (mesure du comportement, de l’activité physique, de l’efficacité du métabolisme et de la résistance aux infections), plutôt que des individus différents pour chacune des expériences, permet de réduire considérablement le nombre d’individus utilisés.
Raffinement
Le bien-être animal sera au centre de notre projet. Un suivi régulier sera appliqué dès le début de nos expérimentations. Une grille de score/suivi sera mise en place. Concernant l’accueil des souris sauvages en conditions d’élevages, elles recevront un enrichissement supplémentaire au sein des cages (batônnets de bois à ronger, igloos en carton pour permettre la nichée que les individus sauvages affectionnent particulièrement), afin de prendre en compte leur caractère sauvage / non habitué aux conditions d’élevage. Pour les chirurgies décrites dans le projet, les animaux seront placés sur tapis chauffant dès l’endormissement (anesthésie) et jusqu’au réveil. Une analgésie est prévue avant la chirurgie et pendant le post-opératoire. De l’onguent ophtalmique sera déposé sur les yeux afin d’éviter le dessèchement de la cornée. Le suivi post opératoire permettra de prendre en charge les douleurs potentielles subies par l’animal. Une surveillance accrue de la souffrance des animaux sera également réalisée pendant l’expérience d’infection expérimentale. En cas de souffrance trop importante (estimée grâce à grille d’évaluation), les souris seront euthanasiées.
Choix des espèces
Le modèle souris est choisi car il est le modèle de prédilection pour l’étude du microbiote intestinal en conditions contrôlées. C’est également le modèle biologique utilisé par les différents membres du consortium de laboratoires amenés à exploiter les données de ce projet. Enfin, les MI sauvages préalablement collectés sont des MI de souris. Des mâles et femelles juvéniles (4 semaines) seront utilisées pour le transfert de microbiote par gavage. Après 6 semaines supplémentaires, ces femelles porteuses du MI greffé, seront mises en présence d’un mâle de manière à produire une descendence. Ainsi à la naissance des petits, la composition du MI greffé sera stabilisée et le MI transmis dès leur naissance. Dans toutes les autres procédures, seuls des individus adultes seront utilisés (à partir de 12 semaines).
Evaluation de la réponse immunitaire antitumorale après radiofréquence de tumeurs colorectales chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales ou l'implantation d'un fragment de tumeur, subissent une intervention de vingt minutes pendant laquelle la tumeur est brûlée par radiofréquence, puis quatre injections de médicaments et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur prévoit des douleurs modérées, des infections locales, des saignements et des douleurs persistantes après l'opération. L'effectif de 2 744 souris n'est adossé à aucun calcul détaillé, le porteur indiquant seulement que le nombre réellement utilisé sera probablement inférieur, les conditions jugées non optimales étant abandonnées en cours de route.
Objectifs
Le cancer colorectal est le 3e cancer le plus fréquent dans le monde, les métastases hépatiques qui apparaissent chez 50% des patients, sont responsables de la forte mortalité. Le traitement chirurgical de référence, la chimiothérapie et les biothérapies ciblées, ont une efficacité limitée par leur toxicité et par l’acquisition d’une résistance au traitement. Depuis quelques années, les traitements thermiques comme les radiofréquences sont très utilisés pour traiter métastases hépatiques. Ce traitement a l’avantage d’augmenter également la réponse immunitaire chez des patients mais insuffisamment. Dans ce projet, nous évaluerons, chez la souris, des formulations gélifiantes immunomodulatrices associées aux radiofréquences. Les résultats de ce projet permettront d’optimiser et de choisir la formulation, la plus efficace pour stimuler la réponse immune antitumorale et ainsi réduire le risque de récidive.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus chez la souris seront le socle d’un essai clinique de phase I ; qui a terme pourrait offrir une alternative thérapeutique innovante pour les patients atteints de cancer colorectal métastatique en combinant radiofréquences et immunothérapie.
Procédures
Injection de cellules tumorales ou implantation de fragments tumoraux après analgésie – durée 1min. Intervention chirurgicale sous anesthésie application des radiofréquences et injection des formulations des médicaments -durée 20 min. 4 Injections des médicaments - durée 1 min. Imagerie sous anesthésie – durée 5 min.
Impact sur les animaux
L’injection de cellules tumorales peut induire un léger inconfort ou une irritation locale. Les implantations de fragments entraînent des douleurs modérées. L’intervention chirurgicale peut induire une réaction inflammatoire locale entraînant des douleurs modérées. Il existe un risque de complications post-opératoires telles que des infections locales, des saignements ou des douleurs persistantes. Les radiofréquences peuvent entraîner des douleurs locales et un inconfort au site d’intervention. Les Injections peuvent provoquer une douleur modérée ou de légères irritations, pouvant provoquer une gêne temporaire
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour étudier l’effet du traitement sur la survie et analyser son impact sur les organes.
Remplacement
L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet car elle constitue un organisme modèle fiable pour mimer le cancer colorectal humain. Il n’existe actuellement aucune alternative capable de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Le recours aux modèles animaux demeure dans notre cas essentiel pour garantir la validité et la transposabilité des résultats avant toute application clinique potentielle.
Réduction
Afin de maximiser la significativité et la robustesse de notre étude, les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés. Les expériences sont conçues de manière à ce chaque étape nous donne des informations permettant de réduire le nombre de souris utilisées dans l’étape qui suit. De plus, il est fort probable que le nombre de souris réellement utilisées soit inférieur à celui initialement prévu, car si certaines conditions ne sont pas optimales, elles ne seront pas retenues, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Une grille d'évaluation du bien être des souris spécifiques a été élaborée pour assurer un suivi rigoureux de l’état général des animaux. Une surveillance quotidienne sera réalisée. Cette grille comprend la détermination de points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter le stress et la douleur à son minimum. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînera la mise à mort anticipée de l'animal.
Choix des espèces
La souris représente le modèle le plus adapté à l’étude de la réponse immunitaire en raison des nombreuses données disponibles dans la littérature et des travaux antérieurs du laboratoire. Nous utiliserons de souris de 7-8 semaines chez lesquelles le système immunitaire est mature et permet de refléter ce qui se passe chez l’Humain.
Nouvelle approche d’immunothérapie dans le cancer du pancréas
- Recherche appliquée
- Cancers
400 souris reçoivent une implantation chirurgicale de cellules tumorales dans le pancréas, dix minutes d'opération, puis huit injections dans l'abdomen réparties sur quatre semaines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour des prélèvements terminaux. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu des traitements, la croissance tumorale et la perte de poids figurant en revanche parmi les conséquences annoncées, sans qu'aucun seuil de taille de tumeur ne soit indiqué. Le bénéfice espéré, une inhibition totale de la tumeur grâce à un organisme unicellulaire produisant des molécules d'immunothérapie, reste au conditionnel.
Objectifs
L’adénocarcinome pancréatique (PDAC) est l'un des cancers les plus agressifs, présentant un très mauvais pronostic et étant prévu pour devenir la deuxième cause principale de décès liés au cancer dans la prochaine décennie. L'échec des traitements standards ou des études cliniques récentes à guérir la majorité́ des patients est dû (i) à un diagnostic tardif, (ii) à l’hétérogénéité de la tumeur et (iii) à la présence d’un micro-environnement riche et dense. Notre équipe cherche de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contourner cette résistance aux traitements notamment en ciblant les cellules du mico-environnement.
Bénéfices attendus
Nous espérons obtenir une inhibition totale du développement tumoral en associant la chimiothérapie déjà utilisée en clinique avec un organisme unicellulaire qui sécrétera une ou plusieurs molécules immunothérapeutiques d’intérêt contre le carcinome pancréatique. Ceci laisse envisager une nouvelle issue thérapeutique pour les patients.
Procédures
Tous les animaux serons soumis à une procédure chirurgicale, afin d'implanter des cellules tumorales, d'environ 10 minutes par animal. Les traitements se déroulent sur 4 semaines à raison de deux injections dans l’abdomen par semaine (d'une durée d'une trentaine de secondes environ).
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux peut générer du stress et de l'inconfort. Effets indésirables directs : - douleur associée à une injection dans l’abdomen lors des traitements ou associé à la chirurgie lors de l'implantation de cellules en intra-pancréatique. Effets indésirables indirects, conséquence des produits injectés : - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale. Concernant les traitements, de nombreuses études ayant déjà été élaborées, les doses administrées aux animaux sont maîtrisées et de ce fait aucun effet indésirable dû au traitement est attendu.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux.
Remplacement
Toutes les alternatives sans recours aux animaux comme les modèles 2D, les modèles 3D ou organoïdes ont été explorés. L’utilisation de ces derniers reste très complexe et limitée en termes de données obtenues (car ne reproduisent pas encore totalement la complexité de la tumeur). La suite du travail nécessite maintenant d’utiliser un modèle vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’analyse statistique sera réalisée en collaboration avec une unité de biométrie. Les différentes analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un logiciel. D’après nos expériences précédentes et la littérature, la variabilité de prise de greffe nécessite des groupes de 10 animaux.
Raffinement
La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur la plateforme. Ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement (5 souris par cage de 484 cm2, le milieu est enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et dôme en plastique opaque). Les animaux sont hébergées en portoir ventilé et l'équipe gérant la zone surveilleront quotidiennement les animaux. Une grille de scoring ayant été établi, tous les soins nécessaires pour apaiser le stress ou la douleur seront mis en place, jusqu’à l’euthanasie si besoin.
Choix des espèces
Le modèle d’implantation/développement de tumeur est déjà établi et maîtrisé chez la souris qui est un modèle adapté à la greffe de cellules tumorales syngéniques. De plus, tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire chez la souris. Age 6-7 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité.
Etude de la réactivité cellulaire dans deux régions cérébrales lors de la réexposition au contexte après modulation du métabolisme cérébral du cholestérol chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le rat est retenu parce qu'il consomme spontanément la plupart des drogues d'abus et apprend vite les tâches qui lui en donnent accès. 800 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré: pose d'un cathéter intraveineux sous anesthésie, chirurgie crânienne de deux heures, puis jusqu'à vingt-cinq séances quotidiennes d'auto-administration d'héroïne de trois heures ou dix séances de cocaïne de six heures. Ils vivent seuls dès la première opération et jusqu'à la fin, isolement que le porteur présente comme reproduisant les conséquences négatives de la consommation de drogues. Tous sont tués à la fin de l'expérience pour que deux régions de leur cerveau soient analysées.
Objectifs
L’addiction aux drogues est une maladie chronique, marquée par un risque important de rechute, c’est-à-dire la reprise de la consommation après une période d’abstinence. Ces rechutes sont souvent déclenchées par des situations, des lieux ou des contextes associés à la consommation passée. Elles seraient liées à des modifications durables du cerveau provoquées par les drogues. Des études chez l’animal montrent que le métabolisme du cholestérol dans le cerveau joue un rôle important dans les comportements addictifs et que manipuler le métabolisme du cholestérol dans le cerveau permettrait de réduire la recherche de drogue après une période d’abstinence. Cependant, les mécanismes précis à l’origine de cet effet restent mal compris. Une hypothèse est que cette diminution de la recherche de drogue serait liée à une baisse de la sensibilité aux contextes associés à la consommation, qui sont connus pour déclencher l’envie de consommer. Ce projet de recherche a trois objectifs principaux : 1. L’objectif est de déterminer le rôle respectif de deux zones cérébrales dans les effets bénéfiques de la manipulation du cholestérol, afin de mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués. 2. Le projet vise également à déterminer si la modification du métabolisme du cholestérol dans ces régions du cerveau influence la réactivité aux contextes associés à la consommation de drogue. 3. Enfin, l’étude examinera si des effets similaires sont observés avec l’héroïne, une drogue appartenant à une classe différente de la cocaïne.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et comportementaux expliqués dans la vulnérabilité à la rechute dans le cadre d’une addiction à la cocaïne ou à l’héroïne. Ces expériences pourraient conduire à une meilleure prise en charge des personnes addictes et au développement de thérapies médicamenteuses pour réduire les taux de rechutes (nouvelles consommations) de cocaïne ou héroïne, en particulier celles déclenchées par le contexte.
Procédures
Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter (durée : 15minutes par animal,) pour permettre l’auto-administration. - chirurgie crâniale pour moduler l’expression d’un gène : 1 fois (2 heures par animal) Sur animaux vigiles : - en amont de chaque chirurgie, 1 injection d'antalgiques et 1 injection d’analgésique - après la chirurgie, 2 injections d’antalgiques par animaux - 10 sessions d’auto-administration de cocaïne (1 session / jour, 6 heures par session) - 10 sessions d’auto-administration de saline (1 session / jour, 6 heures par session, contrôle de la cocaïne) - 25 sessions d’auto-administration d’héroïne (1 session / jour, 3 heures par session) - 25 sessions d’auto-administration de saline (1 session / jour, 3 heures par session, contrôle de l’héroïne)
Impact sur les animaux
Chirurgies : inconfort transitoire au réveil minoré par des antalgiques et une surveillance renforcée Implantation d’un cathéter intraveineux à demeure : risques d’infection ou démangeaisons Auto-administration de drogue (cocaïne ou héroïne) et abstinence : induction d’un stress léger à modéré Effets liés à la cocaïne : L’administration contrôlée de cocaïne peut induire des effets secondaires comportementaux (hyperactivité, stéréotypies, anxiété), sans atteinte somatique attendue à court terme. Une surveillance comportementale est prévue pour prévenir toute dérive. Effets liés à l’héroïne : L’administration contrôlée d’héroïne peut induire des effets secondaires comportementaux tels que sédation, hypoactivité locomotrice et modifications transitoires de la vigilance, sans atteinte somatique attendue à court terme dans les conditions expérimentales prévues. Une surveillance comportementale est mise en place pour prévenir toute complication. Isolement : peut induire un stress modéré, qui fait partie intégrante du protocole utilisé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.
Remplacement
Ce type de recherche, visant à comprendre les bases comportementales, cellulaires et moléculaire du comportement de recherche de drogue et de l’apparition de nouvelles consommations chez les personnes addictes peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Les effectifs sont optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance et en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Chaque animal sera valorisé : il participe à des mesures comportementales, et son cerveau sera analysé à l’issue de l’étude, ce qui permet de combiner des données fonctionnelles et biologiques sans duplication des effectifs.
Raffinement
Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide à surveiller l’atteinte éventuelle des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée journalière pendant 3 jours après les chirurgies, journalière pendant les sessions de consommations et 1 fois par semaine pendant l’abstinence. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau ad libitum. Lors de l’entrée en procédure (première chirurgie, les animaux seront séparés pour être exposés à des conditions de vie reflétant les conséquences négatives de la consommation de drogues isolement social et ce pendant toute la durée de la procédure. Un contact visuel sera maintenu. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Lors des chirurgies un recours à une anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, ainsi que d’un maintien de la température par tapis chauffant sera effectué. Un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire pour une couverture totale de 72heures. Les animaux seront manipulés à partir du cinquième jour pour une habituation à l’expérimentateur.
Choix des espèces
Le rat est l’une des espèces les plus pertinentes et les plus utilisées pour l’étude des mécanismes d’addiction. Il présente une pharmacosensibilité aux substances addictives proche de celle observée chez l’humain, et consomme spontanément la plupart des drogues d’abus, dont la cocaïne et l’héroïne. Le rat apprend facilement des tâches opérantes complexes et développe des comportements addictifs reproductibles, ce qui n’est pas le cas d'autres espèces. Ceci en fait un modèle de choix pour étudier l’addiction et les rechutes. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.
Évaluation du risque à long terme de l’utilisation d’opioïdes chez les adolescents pour traiter la douleur induite par la chimiothérapie, dans un modèle rongeur. MODIFICATION.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Traitées par chimiothérapie puis par morphine pendant leur adolescence, à partir de cinq semaines, 920 souris reçoivent vingt injections quotidiennes sur animal vigile, dont une injection sous la plante de la patte que le porteur décrit comme aiguë et inflammatoire. 600 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 320 d'un niveau sévère, et toutes sont tuées pour analyse post-mortem. Il s'agit de mesurer, une fois adultes, leur sensibilité à la douleur, leur humeur et leurs comportements de dépendance, la morphine induisant l'état de dépendance physique que le protocole cherche précisément à provoquer. Les tests comportementaux sont annoncés par grandes catégories, seuils nociceptifs, anxiété, récompense, sans qu'aucun soit nommé.
Objectifs
Environ 70 % des jeunes patients souffrant de cancers pédiatriques rapportent également des douleurs sévères. Ces dernières peuvent être le résultat des traitements destinés à éliminer les cellules cancéreuses. En effet, la plupart des agents chimiothérapeutiques détruisent les microtubules dans les nerfs périphériques, favorisent les processus inflammatoires et le dysfonctionnement axonal, provoquant ainsi des douleurs neuropathiques et des douleurs musculaires ou osseuses qui sont fréquemment décrites 4 à 5 jours après les cycles de traitement. Pour soulager ces douleurs, pour l’heure, les opioïdes tels que le tramadol ou la morphine restent le traitement de référence. Cependant, nous ne savons que peu de choses sur les effets à long terme de l'utilisation répétée d'opioïdes à un stade précoce de la vie. Il est donc urgent de mieux comprendre les effets à long terme de l'utilisation d'opioïdes chez les enfants atteints de cancer et ce sous différents angles. Il semble notamment crucial de comprendre les effets sur la sensibilité à la douleur, l'humeur et l'utilisation abusive d'opioïdes une fois que ces jeunes enfants atteignent l’âge adulte. Ainsi, ce projet pilote, réalisé sur un modèle murin, sera développé autour de deux objectifs principaux : (i) évaluer l'impact de l'utilisation répétée d'opioïdes au début de la vie (adolescence), suite à des traitements chimiothérapeutiques, sur la nociception, l'humeur et les comportements d’addiction à l'âge adulte ; (ii) identifier les régions du cerveau affectées par l'utilisation d'opioïdes au début de la vie (adolescence) en se concentrant particulièrement sur les structures impliquées dans la matrice de la douleur et le traitement de la récompense.
Bénéfices attendus
Ce projet, validé par un comité d’évaluation scientifique, a le potentiel d'apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur les effets comportementaux à long terme d’une traitement anti-cancéreux combiné à la prise de morphine à un stade précoce de la vie. De plus, ce projet apportera les premières informations permettant de comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans ces effets et permettra de mettre en évidence de potentielles différences sexuelles, souvent sous-estimées dans les études axées sur les adolescents. A long-terme, ce projet permettra d’améliorer le soin des cancers pédiatriques et surtout la gestion de la douleur associée aux traitements utilisés.
Procédures
Le but de ce projet est d’étudier l’effet à long terme d’un traitement anti-cancéreux combiné à des morphiniques effectué lors de l’adolescence. Nous évaluerons les effets nociceptifs, émotionnels et en lien avec les comportements d’addiction. Ainsi des groupes de souris seront traitées avec ce traitement [20 injections au total (1/jour), sur animal vigile; durée d'une injection ~10sec]. Les différentes procédures expérimentales mettront en jeu des tests comportementaux (de 5 min à 30 min de test) évaluant les seuils nociceptifs, les comportements anxiodépressifs et les en lien avec la récompense. Un seul test sera réalisé par jour et un délai minimal de 24h sera respecté entre chaque test. MODIFICATION : UNE INJECTION SUR ANIMAL VIGILE D'UNE DUREE DE 10 SECONDES SERA EFFECTUEE. Des chirurgies sur animal anesthésié seront nécessaires (1 chirurgie d'une heure maximum / animail). La combinaison du traitement anti-cancéreux et l'étude de la chornification de la douleur peut entrainer une nuisance sévère pour les animaux.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures nécessitent un traitement anti-cancéreux qui peut provoquer une douleur modérée aux animaux. L’administration aigue ou répétée de morphine peut induire un état de dépendance physique. De plus, la répétition des injections peut provoquer une douleur aigue transitoire, une inflammation locale au niveau du site d’injection, voire une induration. Certaines des procédures de ce projet nécessitent des chirurgies sur animal anesthésié (1 chirurgie d'une heure maximum / animal) pouvant induire une douleur modérée, une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. MODIFICATION : L'INJECTION SOUS CUTANEE AU NIVEAU PLANTAIRE induit UNE DOULEUR AIGUE AINSI QU’UNE POTENTIELLE INFLAMMATION AU NIVEAU DU SITE D’INJECTION nécessaires à l'étude réalisée. La combinaison du traitement anti-cancéreux et l'étude de la chornification de la douleur peut entrainer une nuisance sévère pour les animaux.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l’évaluation de réponses nociceptives, de comportement émotionnels et de type addictifs nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vigile.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance (power analysis) qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 20 animaux/groupe pour le comportement et 10 pour les analyses immunohistologiques. Bien que de nombreux groupes contrôles soient nécessaires pour ce projet et que les deux sexes soient utilisés, les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation d’enregistrement longitudinaux permettra de réduire grandement le nombre d’animaux nécessaire pour notre projet et les approches sur cerveau entier permettront d’identifier un grand nombre de cibles potentielles sans avoir à répéter les expériences.
Raffinement
Tout au long des expériences, les souris sont hébergées en cage collective, dans un milieu enrichi (matériel de nidification et bâton), et observées quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Pour le suivi du bien-être animal lors du traitement à la vincristine, une grille de score sera utilisée permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale. Cette grille de score visera également à évaluer la zone d’injection et d’ainsi vérifier l’absence d’inflammation locale, d’induration ou de dommages cutanés. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire. De plus, en complément de la grille de score du suivi, après chaque chirurgie, l’état de santé des animaux sera évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale.
Choix des espèces
Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, entier et complexe afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’humain, le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences. Enfin, les outils viraux nécessaires à ce projet ont été développés et validés chez la souris, qui apparait encore donc comme le modèle le plus adapté à ce projet. Par ailleurs, d’autres expérimentations portant sur les conséquences d’une douleur neuropathiques ont déjà été réalisées par notre équipe sur des souris mâles et femelles. De ce fait, par soucis de cohérence et reproductibilité, nous souhaitons conserver la même souche de souris pour ce projet. Des animaux adolescents seront utilisés (début des procédures à 5 semaines pour le traitement anti-cancéreux/morphine) car l’objectif de l’étude est d’évaluer l’effet à long terme des traitements subis à un stade précoce de la vie.