Rongeurs
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement modifiés utilisés dans l’étude de la douleur chez la souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Prélèvement de deux millimètres du bout de la queue, sur animal vigile maintenu en contention, sans anesthésie : 600 souris âgées de quinze à vingt et un jours vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte sert à génotyper des lignées modifiées destinées à l'étude de la douleur, le porteur indiquant que les méthodes non invasives testées ne donnent pas de résultats assez fiables. Il justifie l'absence d'anesthésie par le fait que l'extrémité de la queue est peu ossifiée et peu vascularisée, donc peu douloureuse, tout en annonçant une douleur légère et un saignement possible. 500 souris rejoignent l'élevage ou d'autres projets autorisés, les 100 dont le génotype n'est pas recherché sont tuées.
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés (modifié par l’homme au niveau des gènes ) sont utilisés dans la recherche pour mieux comprendre le rôle des gènes et leurs impacts sur la santé des humains, des animaux ou de l’environnement. Pour cela, ces animaux sont élevés dans des conditions adaptées, et leurs caractéristiques génétiques doivent être bien connues afin de former des groupes expérimentaux fiables et de maintenir les lignées sur le long terme. Pour identifier les animaux qui conviennent aux projets et assurer le suivi des lignées, il est nécessaire de vérifier leur génétique. Parfois, il n’est pas possible de faire ces vérifications de manière totalement non invasive. Ce projet a pour but de présenter la méthode utilisée pour prélever les échantillons permettant de connaître le profil génétique des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de sélectionner les animaux pertinents pour les études scientifiques.
Procédures
Prélèvement unique de 2mm de l’extrémité de la queue sur animaux vigiles sous contention - Durée: 10 secondes par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement sur la queue. Un saignement peut aussi apparaître.
Devenir
Les animaux au génotype non recherché seront mis à mort. Les animaux au génotype recherché seront : a/ Utilisés dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé ; b/ Utilisés pour le maintien de la lignée ; c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem
Remplacement
Nous avons testé plusieurs méthodes qui permettraient d’obtenir les informations nécessaires sans prélever de tissus sur les animaux. Pour l’instant, ces techniques non invasives ne donnent pas de résultats suffisamment fiables. Le projet reste donc indispensable pour produire et mettre à disposition des animaux génétiquement modifiés utilisés dans des recherches autorisées.
Réduction
Nous faisons tout pour utiliser le moins d’animaux possible. Pour cela : •Nous ne gardons en élevage que les lignées réellement utilisées dans des projets en cours ; les autres sont conservées sous forme congelée. •Nous maintenons les lignées génétiquement modifiées sur des bases génétiques stables pour éviter de produire des animaux dont le profil n’est pas utile. •Nous adaptons les schémas d’accouplement pour limiter la naissance d’animaux qui ne possèdent pas le génotype recherché, ce qui réduit aussi le besoin de prélèvements. De plus, certaines méthodes de marquage, comme les encoches à l’oreille, ne sont pas fiables sur le long terme. Elles peuvent entraîner des erreurs d’identification et obliger à refaire des prélèvements ou à utiliser davantage d’animaux. Pour éviter cela, nous privilégions des pratiques qui garantissent la précision tout en respectant les principes de réduction et de raffinement.
Raffinement
Nous appliquons des méthodes rapides, précises et standardisées, conçues pour être les moins stressantes possible pour les animaux. L’extrémité de la queue étant peu ossifiée et peu vascularisée, l'utilisation d'anesthésique n'est pas nécessaire pour la réalisation du prélèvement car ce dernier est peu douloureux et avec des risques hémorragiques extrêmement réduits. Après le prélèvement, chaque animal est immédiatement remis dans sa cage avec ses congénères. Le point de prélèvement est ensuite surveillé visuellement tous les jours (réglementairement obligatoire) par le personnel s’occupant des cages, afin de vérifier la bonne cicatrisation. Une liste de signes d’alerte et d’actions à entreprendre est utilisée pour garantir leur bien-être. Enfin, dès que la science le permet, nous privilégierons des techniques non invasives, afin de réduire encore davantage les contraintes pour les animaux.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain. Les prélèvements de l’extrémité de la queue seront réalisés entre 15 et 21 jours après la naissance. En effet, durant cette période, l’extrémité de la queue est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douloureux et avec des risques hémorragiques extrêmement réduits."
Etude de la morphogenèse de l’épithélium intestinal durant la fission de crypte chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une à trois injections de tamoxifène sur animal vigile, à dix-huit jours de vie : 200 souris juvéniles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées pour prélever le tissu intestinal. L'objet est de comprendre comment les cellules de la niche intestinale contrôlent le dédoublement des cryptes, un processus que le porteur relie à la formation d'adénomes et à des maladies intestinales infantiles rares. Il indique que la contention et l'aiguille provoquent un stress et une douleur de faible intensité, avec de possibles réactions inflammatoires. Le stade juvénile est retenu parce que la majorité des fissions de crypte s'y produisent, et les souris sont génétiquement modifiées pour rendre un type cellulaire visible au microscope.
Objectifs
L’épithélium intestinal se caractérise par une intense capacité de renouvellement et de régénération assurés par les cryptes qui abritent les cellules souches et sont donc riches en mécanismes de régulation et de contrôle. Lors de cette régénération, le nombre de cryptes augmente par un processus appelé fission de crypte qui consiste en un dédoublement d’une crypte mère en deux cryptes filles. Le processus de fission de crypte est essentiel pour la croissance intestinale pendant la maturation postnatale. Malgré son importance dans la formation et le maintien de l’intestin, ce processus reste aujourd’hui très mal documenté. La littérature montre que les cellules de la niche des cellules souches intestinales jouent un rôle prépondérant au cours du processus de crypte fission. Le but de notre projet est de définir comment les cellules de la niche intestinale contrôle cette fission de crypte. Notre hypothèse est que la mécanique des cellules souches est cruciale lors de la fission de cryptes.
Bénéfices attendus
De récentes études ont montré qu’une perturbation de ce fonctionnement peut entrainer des fissions anormales et donner des cryptes corrompues impliquées dans la formation de micro-adénomes et d’adénomes dans le petit intestin et le côlon. Notre équipe a notamment identifié des fissions de cryptes anormales à l’origine du développement de maladies intestinales infantiles rares. Ainsi, la fission de crypte est au cœur de la physiopathologie intestinale humaine. Cependant, les mécanismes régissant la fission de crypte sont mal connus. Ainsi, notre équipe cherche à caractériser ce processus post-développemental en collaboration avec des cliniciens gastroentérologues.
Procédures
Une injection sur animal vigile (geste de 1 minute maximum) par jour. Seront testés 2 types d'administration: soit une seule injection, soit une injection par jour pendant 3 jours consécutifs.
Impact sur les animaux
Les lignées de souris avec lesquelles nous travaillerons n'ont pas de phénotype dommageable. Du stress peut subvenir lors de la contention pour l’injection, ainsi qu’une douleur de faible intensité lors de l’introduction de l’aiguille.Des réactions inflammatoires ou des douleurs post-injection peuvent potentiellement survenir.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de prélever le tissu intestinal.
Remplacement
Une grande partie du projet est déjà réalisée in vitro à l’aide de cultures d’organoïdes dans notre équipe ; des cultures d’organoïdes intestinaux nous permettent d’étudier le mécanisme de fission des cryptes de façon globale. Cependant, pour suivre spécifiquement les cellules de la niche des cellules intestinales dans l’environnement complexe du tissu nous devons utiliser des animaux. En effet, les méthodes utilisant les cellules en culture ne peuvent pas remplacer la complexité des interactions tissulaires dans un organe tel que l’intestin.
Réduction
Nous nous efforçons de limiter le nombre d’animaux par groupe en utilisant le maximun de données pour chaque animal. Ainsi, pour chaque animal, sont prélevés des échantillons pour l’histologie, l’immunohistologie et analyse en microscopie à fluorescence confocale, et isolation de cryptes pour préparation de cultures d’organoïdes.De plus, le nombre d'animaux a été déterminé à partir d'une analyse de puissance statistique.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des zones satisfaisant leurs besoins physiologiques et leur apportant un maximum de bien-être. Les conditions de température, lumière, et humidité sont contrôlées. Les souris sont au nombre de 5 maximum par cage et disposent de différents enrichissements (coton, dôme et tubes en carton). Une désinfection systématique du site d’injection à l’éthanol sera réalisée sur chaque souris pour l’injection de la tamoxifène. Les souris qui auront subi cette injection seront placées dans une zone de stabulation dédiée, avec moins de bruit et de passages et seront observées quotidiennement par un animalier ou l’expérimentateur. Les personnes pratiquant les injections sont formées et ont une expertise afin de maitriser le geste et réduire le temps de contention et de ce fait réduire le stress chez les souris. Enfin, des points limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Chez la souris, l’organisation du tissu intestinal est similaire à celle décrite chez l’Homme et c’est un modèle expérimental très utilisé dans la littérature pour l’étude du développement et de la physiologie intestinale. Les animaux seront utilisés au stade juvénile entre les jours postnataux 18 (P18) et 22 (P22) car c’est dans cette fenêtre développementale que se réalisent la grande majorité des fissions de crypte. Nous utiliserons des animaux génétiquement modifiés pour pouvoir permettre de suivre de façon spécifique à l'aide de la microscopie le comportement d'un type cellulaire donné lors du développement intestinal.
Vectorisation tumorale des principes actifs par des liposomes photosensibles 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Tuées pour des prélèvements analysés plus tard, 284 souris immunodéficientes vont être utilisées dans la seconde partie de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux tumeurs sont greffées sous la peau de chaque animal, puis viennent les injections de liposomes photosensibles, les prélèvements sanguins hebdomadaires, l'éclairage des tumeurs pendant dix à soixante minutes et jusqu'à quinze séances d'imagerie. Le porteur annonce une gêne, une douleur légère, une brûlure cutanée possible et un risque d'infection lié à l'immunodéficience des souris. La preuve de concept visée reste une étape de laboratoire, l'usage en thérapie humaine étant renvoyé au "plus long terme".
Objectifs
La vectorisation, c'est-à-dire le transport, des médicaments à l’aide de véhicule est une alternative thérapeutique très prometteuse, car elle présente plusieurs avantages par rapport aux produits non-vectorisés: (1) une meilleure biodisponibilité des médicaments ; (2) une meilleure accumulation dans les tumeurs ; (3) une meilleure biocompatibilité : grâce à une accumulation privilégiée dans les tumeurs par rapport aux tissus sains, les effets nocifs sont diminués ; et (4) une libération prolongée des médicaments. Dans le cas des véhicules sensibles à la lumière, le relargage des molécules transportées peut être contrôlé par la lumière. L'objectif est de montrer l'efficacité des véhicules sensibles à la lumière que nous avons développés dans le cadre du traitement de tumeurs cutanées. Ce projet sera réalisés dans 2 établissement utilisateurs : EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Preuve de concept de l'efficacité du relargage contrôlé par la lumière des produits anticancéreux, à partir de véhicules sensibles à la lumière. A plus long terme, cette technologie pourrait être utilisée en thérapie chez l'homme.
Procédures
Injection dans la veine sur animal anesthésié : 1 à 3 fois, durée inférieure à 1 minute, dans l'EU2. Injection dans le ventre sur animal vigile : 1 à 3 fois, durée 10 secondes, dans l'EU 2. Prélèvement de sang sur animal anesthésié : une fois par semaine , 2 ou 3 fois, durée 1 minute, dans l'EU 2. Injection sous la peau sur animal anesthésié : 1 fois, durée 1 minute, dans l'EU 1. Eclairage d'une tumeur sur animal anesthésié : 1 à 3 fois, durée entre 10 et 60 minutes, dans l'EU 2. Imagerie sur animal anesthésié : 9 à 15 fois, durée entre 1 à 5 min, dans l'EU 2. Anesthésie : 11 à 20 fois, durée entre 5 et 10 min, dans l'EU 1 et EU 2.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules cancéreuses en sous cutané peut provoquer une infection au niveau du site d’injection. La présence d’une tumeur sous cutanée peut engendrer une légère douleur, une gêne. Une perte de poids liée à la croissance tumorale peut survenir. Le suivi en imagerie peut fatiguer les animaux à cause des anesthésies répétées. L’injection du véhicule peut provoquer une mauvaise réaction chez l’animal, une douleur au niveau du site d’injection. L’irradiation peut engendrer une légère brulure cutanée. L’immunodéficience des animaux peut entrainer une infection par des pathogènes.
Devenir
Les souris seront euthanasiées afin de récupérer des prélèvements qui seront analysés ultérieurement.
Remplacement
Malgré la possibilité de valider sur des cellules in vitro l’efficacité des molécules, nous souhaitons montrer l’intérêt de notre technologie dans le traitement des tumeurs qui sont des structures dont la composition est hétérogène. De plus l’objectif est d'injecter ces molécules dans la circulation sanguine ce qui est à l’heure actuelle quelque chose de difficile à reproduire sur des modèles in vitro. Nous souhaitons tester notre approche thérapeutique dans un contexte tumoral sachant que le microenvironnement joue un rôle primordial, le modèle animal reste donc nécessaire.
Réduction
L’efficacité des molécules et leur toxicité seront en amont testées sur des cellules en culture. Nous avons prévu des étapes de décision entre les différentes procédures en fonction des résultats obtenus. Les souris seront porteuses de 2 tumeurs sous la peau afin d’avoir sur la même souris une tumeur traitée et une tumeur non traitée. Le suivi du devenir des molécules une fois injectées dans l’animal est réalisé par imagerie non invasive permettant un suivi dans le temps sur un même animal. L’éclairage des tumeurs se fera par une source lumineuse externe ce qui nous permettra, si besoin, d’éclairer plusieurs fois la même tumeur sans être invasif. Le nombre d’animaux (284) a été déterminé en utilisant une application dédiée et un test statistique sera réalisé.
Raffinement
Les souris seront acclimatées pendant 3 jours après leur arrivée dans l'établissement. Les souris seront hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel ou maison, paille, bâton à ronger) sur un portoir ventilé. L’hébergement en portoir ventilé permet de limiter les risques d’infection des animaux par des pathogènes et/ou des opportunistes. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix en imagerie optique de par sa petite taille. La souris étant un animal de petit gabarit, nous sommes capables de détecter des signaux faibles et profonds en imagerie optique. Le bioimageur utilisé pour l’imagerie de fluorescence est adapté à la souris. Les modèles de tumeurs sous cutanées utilisés dans ce projet ont été établis chez la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation et l’imagerie optique.
Maintien d’une lignée à phénotype dommageable à visée de recherche de nouvelles approches thérapeutiques pour normaliser le rythme cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour maintenir en élevage une lignée de souris qui développent avec l'âge une insuffisance cardiaque avec tachycardie, 1 096 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une fois dans sa vie une biopsie de queue sous anesthésie générale, destinée à établir son génotype. Le porteur affirme que le phénotype dommageable n'altère pas leur état général, respiration, pelage et locomotion inchangés, et qu'un suivi mensuel du poids permettra de prévenir un développement précoce. Les souris retenues partent vers des procédures expérimentales ou vers le renouvellement des reproducteurs, ces derniers étant remplacés toutes les trois portées, avant vingt semaines d'âge.
Objectifs
L'objectif du projet est de maintenir l'élevage de la lignée TG4 à phénotype dommageable et de caractériser génétiquement cette dernière via une méthode de génotypage invasif. La production de ces animaux est nécessaire pour nos projets de recherche qui ont pour objectif de développer de nouvelles approches pharmacologiques afin de normaliser la fréquence cardiaque dans un modèle d'insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Cette lignée a été utilisée dans une étude visant à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de l'insuffisance cardiaque. Les bénéfices du projet sont attendus à la fois dans le domaine de la recherche fondamentale et dans le domaine médical. Nous savons qu'il est essentiel de normaliser la fréquence cardiaque en cas d'insuffisance cardiaque. Cela permet d'éviter la décompensation cardiaque. Les approches pharmacologiques utilisées en clinique présentent de nombreux effets secondaires et il est important de développer des approches alternatives qui réduisent ces effets secondaires. Cette lignée à phénotype dommageable permettra à court terme d'identifier de nouveaux peptides limitant la tachycardie associée à l'insuffisance cardiaque. Cela pourait aboutir à une réduction des conséquences arythmiques de l'insuffisance cardiaque. A plus long terme, ces peptides pourront être optimisés et devront être validés lors d'études précliniques. Le génotypage de cette lignée permet la caractérisation génétique de la lignée pour optimiser la gestion des colonies et des reproductions pour les projets scientifiques.
Procédures
Une biopsie de queue est réalisée une fois dans la vie de l’animal pour déterminer son génotype.
Impact sur les animaux
Les souris utilisée dans ce projet développent une insuffisance cardiaque avec l'âge. Ces modifications phénotypiques n'altèrent pas leur état général (respiration, pelage et locomotion non modifiés, pas de tremblements, pas de prostration, prise de nourriture et de boisson normale). Un suivi mensuel du poids des souris sera réalisé pour prévenir tout développement précoce du phénotype dommageable. Pour le génotypage, la biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. Cette procédure sera donc réalisée sous anesthésie générale.
Devenir
Les souris TG4 sont gardées pour les procédures expérimentales et pour renouveler les reproducteurs. Les reproducteurs sont renouvelés toutes les 3 portées (age inférieur à 20 semaines).
Remplacement
Nos projets de recherche visent à étudier les effets cardiaques de composés actifs et de limiter les effets secondaires associés en développant des approches phramacologiques innovantes. Ces projets écessitent une exploration fonctionnelle au minimum sur organe entier. Seule l'expérimentation sur ce modèle de souris, in vivo ou ex vivo, peut permettre de déterminer si le traitement testé présente un intérêt clinique en normalisant l'activité électrique cardiaque et en prévenant les arythmies qui ne peuvent être observées sur un modèle cellulaire. Des modèles in silico existent pour reproduire une partie de la fonction cardiaque mais ceux-ci ne prennent pas le coeur dans son intégralité et ne permettent pas de modéliser l'action d'un composé.
Réduction
Les croisements sont lancés en fonction de nos besoins : maintien des reproducteurs, besoins de lots expérimentaux. Le schéma d'accouplement en duo permet l'obtention d'animaux en continu, il est adapté aux besoins afin de limiter la génération de souriceaux non inclus. L'utilisation de tous les animaux sans distinction de sexe permet de limiter les animaux non utilisés et augmenter les reproductions.
Raffinement
La biopsie de queue est réalisée lors du baguage sous anesthésie générale à l’isoflurane. Cette méthode est approuvée, précise, rapide et standardisée, ce qui limite les effets indésirables stress/douleurs. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur. Le phénotype dommageable est pris en charge par un suivi clinique accrue de la naissance au sevrage des animaux.
Choix des espèces
Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques associés à l'insuffisance cardiaque. Le modèle de souris TG4 est actuellement le seul présentant une sur-expression d'un trangène induisant une insuffisnace cardiaque avec tachycardie. C'est un bon modèle de cette pathologie humaine. Les autres modèles necessitent des approches chirurgicales lourdes et sont moins reproductibles. Les animaux sont utilisés pour le maintien de l’élevage et pour générer des lots expérimentaux qui sont utilsés soit en prélèvements terminal hors procédures, soit dans des procédures futures associées à cette DAP élevage. Nous utilisons des animaux mâles et femelles sexuellement matures (à partir de 6-8 semaines).
Vectorisation tumorale des principes actifs par des liposomes photosensibles 1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
284 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune porte deux tumeurs greffées sous la peau, l'une traitée et l'autre non, subit de neuf à quinze séances d'imagerie, de onze à vingt anesthésies, et des éclairages de tumeur pouvant durer une heure. Le porteur annonce une possible brûlure cutanée liée à l'irradiation, une perte de poids liée à la croissance tumorale et une fatigue liée aux anesthésies répétées. Il reconnaît que l'efficacité des molécules peut être validée sur cellules, et justifie le recours aux souris par l'hétérogénéité des tumeurs et la difficulté de reproduire une injection dans la circulation sanguine.
Objectifs
La vectorisation, c'est-à-dire le transport, des médicaments à l’aide de véhicule est une alternative thérapeutique très prometteuse, car elle présente plusieurs avantages par rapport aux produits non-vectorisés: (1) une meilleure biodisponibilité des médicaments ; (2) une meilleure accumulation dans les tumeurs ; (3) une meilleure biocompatibilité : grâce à une accumulation privilégiée dans les tumeurs par rapport aux tissus sains, les effets nocifs sont diminués ; et (4) une libération prolongée des médicaments. Dans le cas des véhicules sensibles à la lumière, le relargage des molécules transportées peut être contrôlé par la lumière. L'objectif est de montrer l'efficacité des véhicules sensibles à la lumière que nous avons développés dans le cadre du traitement de tumeurs cutanées. Ce projet sera réalisés dans 2 établissement utilisateurs : EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Preuve de concept de l'efficacité du relargage contrôlé par la lumière des produits anticancéreux, à partir de véhicules sensibles à la lumière. A plus long terme, cette technologie pourrait être utilisée en thérapie chez l'homme.
Procédures
Injection dans la veine sur animal anesthésié : 1 à 3 fois, durée inférieure à 1 minute, dans l'EU2. Injection dans le ventre sur animal vigile : 1 à 3 fois, durée 10 secondes, dans l'EU 2. Prélèvement de sang sur animal anesthésié : une fois par semaine , 2 ou 3 fois, durée 1 minute, dans l'EU 2. Injection sous la peau sur animal anesthésié : 1 fois, durée 1 minute, dans l'EU 1. Eclairage d'une tumeur sur animal anesthésié : 1 à 3 fois, durée entre 10 et 60 minutes, dans l'EU 2. Imagerie sur animal anesthésié : 9 à 15 fois, durée entre 1 à 5 min, dans l'EU 2. Anesthésie : 11 à 20 fois, durée entre 5 et 10 min, dans l'EU 1 et EU 2.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules cancéreuses en sous cutané peut provoquer une infection au niveau du site d’injection. La présence d’une tumeur sous cutanée peut engendrer une légère douleur, une gêne. Une perte de poids liée à la croissance tumorale peut survenir. Le suivi en imagerie peut fatiguer les animaux à cause des anesthésies répétées. L’injection du véhicule peut provoquer une mauvaise réaction chez l’animal, une douleur au niveau du site d’injection. L’irradiation peut engendrer une légère brulure cutanée. L’immunodéficience des animaux peut entrainer une infection par des pathogènes.
Devenir
Les souris seront euthanasiées afin de récupérer des prélèvements qui seront analysés ultérieurement.
Remplacement
Malgré la possibilité de valider sur des cellules in vitro l’efficacité des molécules, nous souhaitons montrer l’intérêt de notre technologie dans le traitement des tumeurs qui sont des structures dont la composition est hétérogène. De plus l’objectif est d'injecter ces molécules dans la circulation sanguine ce qui est à l’heure actuelle quelque chose de difficile à reproduire sur des modèles in vitro. Nous souhaitons tester notre approche thérapeutique dans un contexte tumoral sachant que le microenvironnement joue un rôle primordial, le modèle animal reste donc nécessaire.
Réduction
L’efficacité des molécules et leur toxicité seront en amont testées sur des cellules en culture. Nous avons prévu des étapes de décision entre les différentes procédures en fonction des résultats obtenus. Les souris seront porteuses de 2 tumeurs sous la peau afin d’avoir sur la même souris une tumeur traitée et une tumeur non traitée. Le suivi du devenir des molécules une fois injectées dans l’animal est réalisé par imagerie non invasive permettant un suivi dans le temps sur un même animal. L’éclairage des tumeurs se fera par une source lumineuse externe ce qui nous permettra, si besoin, d’éclairer plusieurs fois la même tumeur sans être invasif. Le nombre d’animaux (284) a été déterminé en utilisant une application dédiée et un test statistique sera réalisé.
Raffinement
Les souris seront acclimatées pendant 3 jours après leur arrivée dans l'établissement. Les souris seront hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel ou maison, paille, bâton à ronger) sur un portoir ventilé. L’hébergement en portoir ventilé permet de limiter les risques d’infection des animaux par des pathogènes et/ou des opportunistes. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix en imagerie optique de par sa petite taille. La souris étant un animal de petit gabarit, nous sommes capables de détecter des signaux faibles et profonds en imagerie optique. Le bioimageur utilisé pour l’imagerie de fluorescence est adapté à la souris. Les modèles de tumeurs sous cutanées utilisés dans ce projet ont été établis chez la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte, entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation et l’imagerie optique.
Dynamiques cérébrales de la mémoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 200
Deux chirurgies par animal, la seconde durant de quatre à douze heures, puis des enregistrements cérébraux d'une à six heures pendant leur sommeil : 200 rats et 200 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont hébergés en cages individuelles ou semi-partagées et maintenus en restriction alimentaire pendant environ un mois, avant d'être entraînés à des tâches de mémoire dans des labyrinthes puis soumis à des micro-stimulations cérébrales destinées à modifier leurs performances. Le porteur écrit que la restriction alimentaire est bénéfique pour la santé et ne constitue pas une nuisance, et que l'isolement n'engendre qu'un stress léger. La validation des enregistrements exige un prélèvement histologique, donc la mise à mort, seuls des animaux non implantés pouvant être placés auprès d'associations, et les tests comportementaux sont annoncés sans être précisés.
Objectifs
Le but de ce projet est d’étudier les mécanismes de la formation et de la consolidation de la mémoire, ainsi que de son utilisation pour la prise de décision, l’anticipation et l’imagination. Nous entraînerons des rongeurs à effectuer des tâches de mémoire, nous enregistrerons leur activité cérébrale pendant l’accomplissement de ces tâches et pendant le sommeil, et nous tenterons de modifier les performances des animaux grâce à des micro-stimulations cérébrales ciblées (à l’instar des micro-stimulations qui améliorent la motricité de patients atteints de la maladie de Parkinson). Des rats et des souris seront utilisés pour toutes les étapes de ce projet. Ces rongeurs sont des modèles standards, aussi bien en psychologie animale qu’en neurophysiologie chez l’animal libre de ses mouvements, pour l’étude de la mémoire en conditions normales et pathologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux de la mémoire. Nous nous intéresserons en particulier à l’hippocampe, une structure qui chez l’homme joue un rôle clef dans la mémoire des souvenirs personnels (mémoire épisodique) et des faits généraux (mémoire sémantique), et qui est particulièrement impactée dans les troubles mnésiques liés aux maladies neurologiques, notamment l’épilepsie, la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer. À ce titre, nos travaux précédents décrivant une méthode d’amélioration de la consolidation de la mémoire chez le rat ont été récemment répliqués chez l’homme et laissent entrevoir la possibilité de pallier certains déficits mnésiques liés à l’âge ou à la pathologie.
Procédures
Ce projet utilisera au plus 200 rats et 200 souris. Les animaux seront hébergés en cages semi-partagées ou individuelles et en légère restriction alimentaire typiquement pendant 1 mois. Tous subiront 2 chirurgies : la première durant typiquement 1 à 2 heures, la seconde durant typiquement 4 à 12 heures. Les deux chirurgies sont espacées de 1 à 3 semaines. Les enregistrements dureront typiquement 1 à 2 heures pendant les tests comportementaux et 1 à 6 heures pendant leur sommeil, le tout pendant 2 à 3 semaines. En général, chaque animal n’est testé que dans une seule tâche, et n’explore donc qu’un labyrinthe particulier (dans certains cas, comme pour des tâches en plusieurs étapes, ils peuvent être amenés à en explorer plusieurs, mais le principe reste le même et la durée totale est similaire, soit typiquement un mois en incluant la familiarisation et le pré-entraînement avant enregistrements). État de conscience : les animaux sont vigiles pendant l’hébergement, les tests comportementaux et les enregistrements ; ils sont anesthésiés pendant les chirurgies.
Impact sur les animaux
Les chirurgies peuvent engendrer des douleurs post-opératoires modérées sur de courtes périodes. Les implants peuvent être source d’inconfort pendant le cours laps de temps que l’animal s’y habitue. L’isolement des animaux va engendrer un stress léger typiquement pendant 1 mois. Concernant les tests comportementaux et les enregistrements, ils peuvent occasionner un très léger stress lié à la nouveauté lors des toutes premières sessions. La légère restriction alimentaire est bénéfique pour la santé et ne constitue pas une nuisance.
Devenir
À l'issue de l'ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. La validation des enregistrements nécessite un prélèvement histologique. Certains animaux non exploitables seront replacés auprès d’associations spécialisées (animaux non implantés, jugés aptes par un vétérinaire, acceptés pour placement, etc.)
Remplacement
Certains mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant la mémoire (par exemple, le recrutement de nouveaux récepteurs au niveau synaptique) peuvent être défrichés in vitro. Certaines propriétés computationnelles de petits réseaux de neurones peuvent être testées in silico. Mais in fine, l’étude des mécanismes de réseau de la mémoire nécessite de faire des liens corrélationnels et causaux précis entre activité neuronale à grande échelle et comportements d’apprentissage et de mémoire, et ne peut se faire que sur des animaux au cours même de l’apprentissage, du sommeil et du rappel.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons des systèmes d'acquisition haute densité, permettant d'enregistrer >100 neurones simultanément, ce qui maximisera la quantité d'information apportée par chaque animal. L'approche statistique tirera profit des tout derniers développements statistiques et analytiques du domaine.
Raffinement
Les soins post-opératoires incluront des traitements analgésiques, ainsi qu'une surveillance quotidienne des animaux. Nos expériences s'effectueront sur des animaux vigiles, libres de leurs mouvements pour se rapprocher au mieux de la physiologie et limiter le stress. Les systèmes d’enregistrement sont miniaturisés au maximum pour s’assurer que les animaux implantés aient un comportement tout à fait normal. Pendant les périodes nécessitant une restriction alimentaire précise et une protection des implants, les animaux (rats et souris) doivent être maintenus dans des cages semi-partagées maintenant un contact auditif, olfactif, et visuel. Les rats auront également un lien tactile partiel. De la musique sera diffusée dans la pièce pour réduire le stress causé par les éventuels bruits environnants, qui bien que réduits pourraient devenir plus saillants dans le silence. La légère restriction alimentaire est bénéfique pour un grand nombre de marqueurs de santé et de vieillissement. L’exploration de labyrinthes constitue par ailleurs une stimulation bénéfique (exercice physique, curiosité, récompenses alimentaires,…) Les animaux sont suivis grâce à l’utilisation de grilles de score qui permettent la mise en place de points limites adaptés.
Choix des espèces
Le rongeur est un modèle idéal pour étudier la mémoire spatiale en raison de ses excellentes capacités de navigation. S’agissant de l’espèce de référence pour toutes les études depuis les années 70, les données déjà publiées servent de base pour faire progresser nos connaissances. De plus, l’existence de modèles transgéniques permet de cibler des groupes cellulaires spécifiques. Nous utiliserons de jeunes adultes (typiquement 2 à 6 mois), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.
Etude des effets de candidats médicaments dans un modèle préclinique d’hypertension artérielle pulmonaire MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 920 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, chacun passant trois semaines enfermé dans un caisson d'hypoxie où l'humidité dépasse 80 %, avec accumulation possible d'ammoniaque et de gaz carbonique. Une injection sous-cutanée déclenche l'hypertension artérielle pulmonaire, puis viennent jusqu'à six semaines de traitements quotidiens par gavage ou injection, une pompe implantée sous la peau, des prélèvements à la jugulaire et une thoracotomie finale pour cathétériser le ventricule droit. Le porteur indique que la pathologie s'aggrave et devient irréversible, que les rats prennent 50 % de poids en moins qu'en hébergement classique, et qu'ils peuvent mourir de la maladie. Les effectifs par groupe intègrent d'avance une perte de 15 % à 40 % des animaux, morts en cours de protocole.
Objectifs
L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie cardiovasculaire et pulmonaire rare et grave : sa prévalence dans la population générale en France est estimée à 15 cas par million et la survie médiane sans traitement après diagnostic est inférieure à 3 ans. Elle se caractérise par l’augmentation des résistances artérielles pulmonaires, responsable d'une hypertension, et aboutit à une insuffisance cardiaque. Cette maladie peut survenir de cause inconnue, dans un contexte familial ou compliquer l’évolution de certaines pathologies (insuffisance cardiaque). En identifiant et en traitant les patients le plus tôt possible, il est possible de retarder la progression de l'HTAP. Malheureusement, cette maladie est souvent mal diagnostiquée et traitée, car les symptômes initiaux sont légers et peu spécifiques (essoufflements, lipothymie et asthénie). Si les options thérapeutiques ont progressé ces dix dernières années et ont permis d'améliorer les conditions de vie des malades, la prise en charge de l'HTAP demeure incomplète car ne prolonge pas significativement le durée de vie après diagnostic. Ainsi, la recherche de médicaments ciblant de nouveaux mécanismes physiopathologiques reste un enjeu majeur pour les années à venir. Les tests de nouvelles molécules doivent se réaliser sur des modèles animaux suffisamment prédictifs de la maladie, afin d’optimiser la sélection des candidats médicaments qui entreront en phase clinique. Le modèle présenté d'HTAP chez le rat, induit conjointement par l’administration d'un composé diminuant la formation de vaisseaux sanguins et par une hypoxie (diminution des apports en oxygène) chronique, est un modèle qui reproduit l'ensemble des caractéristiques physiopathologiques décrites chez l'Homme, à savoir une atteinte vasculaire qui est associée à long terme avec le développement d'une insuffisance cardiaque droite. De plus, les traitements actuellement proposés chez l'Homme montrent des résultats bénéfiques significatifs dans ce modèle. Ainsi, ce modèle d'HTAP représente un modèle préclinique de choix pour l’étude de l’HTAP. Ce modèle nous permettra d’évaluer, chez le rat, l’efficacité de nombreux candidats médicaments qui s’intéressent à des mécanismes d’actions connus (atteintes vasculaires) et des cibles thérapeutiques nouvelles (atteintes cardiaques). Ce modèle nous permettra également une meilleure compréhension des mécanismes mise en jeu dans la maladie afin d’améliorer la prise en charge des patients.
Bénéfices attendus
L’HTAP est une maladie rare et grave pour laquelle il n’existe actuellement pas de traitements curatifs efficaces. Si les traitements prescrits actuellement, essentiellement des vasodilatateurs, permettent une amélioration de la qualité de vie des patients et une prolongation de la survie en freinant l’évolution de la pathologie, la moitié des patients décèdent dans les sept ans qui suivent le diagnostic. Compte-tenu de l’évolution de l’HTAP dans ce modèle animal qui mime fidèlement la maladie humaine, la réalisation d’études précliniques utilisant des candidats médicaments novateurs apparait primordiale pour mettre en évidence de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, à terme, l’utilisation de ce modèle animal permettra de sélectionner des composés présentant des bénéfices sanitaires significatifs en vue d’essais cliniques.
Procédures
Une injection sous-cutanée (S.C.) du composé diminant la formation des vaisseaux est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines avant de retourner en condition de normoxie (conditions d'hébergement classique) durant 0 à 6 semaines. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). [MODIFICATION Les animaux pourront subir une chirurgie sous anesthésie générale afin de placer sous la peau une pompe contenant des substance, permettant la diffusion continue de candidats médicaments et dont la durée d'intervention est d'environ 15-25min]. Des injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Durant la normoxie, des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse. A la fin du protocole, une chirurgie sous anesthésie gazeuse et analgésie est réalisée afin de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant.
Impact sur les animaux
Les animaux sont soumis à une anesthésie gazeuse et reçoivent une injection sous-cutanée pour induire une hypertension artérielle pulmonaire. Ils sont ensuite placés dans une enceinte d’hypoxie pendant 3 semaines. L’humidité dans l’enceinte est supérieure à 80%. En hypoxie, les animaux présentent une prise de poids ralentie de 50% par rapport à une stabulation conventionnelle à cause du stress et de l’asthénie provoqués par la déplétion en oxygène. De plus, le confinement dans l'enceinte d'hypoxie génère un inconfort, indépendamment de l'hypoxie elle même, via une humidité élevée et un risque d'accumulation d'ammoniaque et de CO2. De plus, le niveau sonore est plus élevé dans les caissons hypoxiques que dans les salles d'hébergements classiques pouvant engendrer du stress et de l'inconfort pour les animaux.A la fin de ces 3 semaines d’hypoxie, ils retournent dans la pièce d’hébergement conventionnelle pendant 0 à 6 semaines, période pendant laquelle la pathologie va s’aggraver et devenir irréversible. A long terme, les animaux peuvent mourir de la pathologie. Pendant la période de normoxie, les animaux pourront être traités quotidiennement, une à 2 fois par jour selon le composé testé, par gavage, injection intrapéritonéale (I.P.), sous-cutanée (S.C.), ou intranasale (I.N.). Ces administrations répétées peuvent êtres associées à des risques de fausses route, d'irritation ou de lésions de l'oesophage (PO), et d'irritations (I.P., S.C.). [MODIFICATION Une chirurgie d’implantation de pompe contenant les composés pourra être réalisée après ouverture de la peau pouvant être source de douleur et/ou d'une gêne avec la présence de la pompe et de la diffusion des subtances]. Des injections intraveineuses sous anesthésie pourront également être réalisées 1 à 2 fois par semaine. Des anesthésies gazeuses seront potentiellement réalisées au cours du protocole afin de réaliser des prélèvements de sang à la veine jugulaire ou des examens échocardiographiques de suivi. A la fin du protocole, les animaux sont anesthésiés afin de réaliser un acte chirurgical qui permet de mesurer les pressions artérielles en insérant un cathéter relié à un capteur de pression dans l’artère carotide. Une thoracotomie est ensuite réalisée afin d’insérer un cathéter dans le ventricule droit puis dans l’artère pulmonaire pour des mesures de pressions. Un prélèvement de sang terminal intracardiaque pourra être réalisé avant la mise à mort des animaux par surdose de produit euthanasiant.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux HTAP seront mis à mort afin de récupérer des organes pour des analyses de tissus (cœurs, poumons, artères pulmonaires) et/ou des analyses de morphologie des organes (pesée des deux ventricules du cœur). Les mesures de pressions dans le ventricule droit sont également trop invasives pour envisager un réveil des animaux. Un prélèvement de tissu sur les animaux Sham (non porteurs d'un HTAP) est nécessaire pour comparer aux conséquences cardiovasculaires des animaux porteurs de la maladie.
Remplacement
S'il existe un certain nombre de modèles de culture de cellules musculaires lisses, ces modèles in vitro sont utilisés en première intention (modèles de screening) et sont utilisés uniquement pour tester des activités moléculaires et identifier des voies de signalisation. Ces modèles cellulaires in-vitro ne permettent pas de tester l'efficacité d'un candidat médicament sur l'aspect de la restauration hémodynamique et morphologique mais sont utilisés en amont afin de sélectionner les meilleurs candidats à tester sur nos modèles in vivo. La validation de la formation aux techniques de mesures de pressions nécessite d’avoir recours à des animaux vivants car les phases critiques de l’approche chirurgicale reposent sur les risques hémorragiques qui peuvent entraîner des mesures de pression faussées, voir la mort de l’animal.
Réduction
Pour chaque groupe avec une HTAP, le nombre d'animaux nécessaire par groupe est fixé à 11. Ce nombre a été déterminé par un calcul de N, sur la base de données obtenues préalablement et prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Basés sur les données historiques dans ce modèle d’HTAP, un pourcentage de perte de 15% est attendu jusqu’à 3 semaines de normoxie, correspondant aux animaux qui meurent au cours du protocole à cause du développement de la pathologie. Le nombre d’animaux inclus dans chaque groupe en début d’étude est donc de N=13. Lorsque le protocole inclus une période de normoxie supérieure à 3 semaines (jusqu’à 6 semaines), le nombre d’animaux par groupe est fixé à N=18 car le développement de la pathologie entraîne une mortalité plus importante des animaux (jusqu’à 40% de perte). Généralement, le groupe contrôle négatif (non malade) n’est composé que de 6 animaux car il y a peu de variabilité des paramètres cardiovasculaires étudiés. Ainsi, 1800 rats HTAP sont prévus dans le cadre de cette procédure et 120 rats Sham. Des échantillons de plasmas et/ou de tissus d'animaux sont prélevés à l'issue de certaines séries expérimentales et conservés pour pouvoir être utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche (par exemple recherche d’un récepteur cible présent dans le plasma ou dans les tissus cardiaques ou vasculaires). L'utilisation de ces banques de tissus pour d'autres projets de recherches permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés car il permet de réduire le nombre de séries expérimentales réalisées.
Raffinement
l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 5 jours est respectée. L'administration du composé induisant la pathologie est réalisée sous anesthésie gazeuse. Pendant les 3 semaines d'hypoxie, les animaux sont hébergés dans des grandes cages en plexiglass prévues à cet effet avec une sciure particulièrement absorbante (8 animaux par cages). Les caissons d’hypoxie sont ouverts et nettoyés tous les jours. De la chaux sodée est placée dans le caisson pour absorber le C02 et changée tous les jours, de l'acide borique permet d'absorber l'ammoniaque générée par les urines et est remplacé toutes les semaines ; et des absorbeurs d'humidité sont présents pour absorber l'humidité assurant des conditions correctes pour les animaux. La ventilation des caissons peut également être adaptée à l’aide d’aérations présentes sur les caissons dont l’ouverture et la fermeture peut être ajustée pour diminuer une humidité excessive. Les animaux sont observés quotidiennement et tout signe de douleur ou de détresse entraîne l’établissement d’un score grâce à une grille d’évaluation du bien-être animal. En fonction du score obtenu, un protocole d’analgésie approprié est mis en place si besoin. Des points limites spécifiques au protocole sont également établis (présence de plaies cutanées, fausse route…) Si des prélèvements de sang sont réalisés au cours du protocole, les animaux sont anesthésiés. Une anesthésie locale est également réalisée. Les rats sont placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température, et une réhydratation est réalisée en injectant en S.C. 3 fois le volume prélevé en NaCl ou Ringer Lactate. Si des injections en voie I.V. sont réalisées, les animaux sont anesthésiés avec une analgésie locale et contôle de la température corporelle. Les mesures hémodynamiques réalisées en fin de protocole se font sur animaux anesthésiés ayant reçus une injection préalable d'analgésiant au minimum 30 minutes avant la première incision. Pour chaque anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux [MODIFICATION-Les pompes osmotiques sont implantées en s.c. sous anesthésie générale et analgésie locale. Un massage de la zone d'implantation de la pompe est effecuté pour limiter la fibrose des tissus et optimiser son fonctionnement].
Choix des espèces
Même si de nombreuses espèces animales sont concernées, la majorité des modèles d’HTAP ont été développés chez le rat adulte parce qu’il permet d’obtenir, après induction de la pathologie, des données hautement reproductibles. De plus, les rats présentent des modifications cardiovasculaires similaires à l’homme : modifications des pressions, remodelage vasculaire et cardiaque, perte de fonction. Finalement, ce modèle d'HTAP développé chez le rat représente un modèle de référence pour l’étude de l’HTAP car la progression de la pathologie est continue au cours du temps et mime ainsi l’évolution délétère de la maladie observée chez l’homme. Des rats de 4/6 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés pour ce modèle. Ce modèle est sensible à l’âge et des animaux plus âgés ne présentent pas le même développement de la pathologie.
Utilisation d’un microARN inhibiteur pour le traitement de l’Ostéogénèse Imparfaite [MODIFICATION]
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
190 souris porteuses de la mutation de l'ostéogenèse imparfaite vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. À sept jours, un fragment d'oreille est prélevé pour les génotyper, puis chaque souris retenue reçoit huit injections intraveineuses hebdomadaires sous anesthésie, chacune suivie d'une radiographie au scanner. Le porteur qualifie ces mesures de non invasives et sans douleur, tout en indiquant que ces souris subissent en moyenne dix fractures spontanées à dix-huit semaines. 186 sont tuées pour analyser os, sang et organes, quatre gardées vivantes pour de futurs projets, et le porteur conclut que les études in vivo restent "indispensables" malgré les résultats déjà obtenus sur cellules osseuses.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de tester un nouveau traitement potentiel pour une maladie rare appelée l'ostéogenèse imparfaite (OI), communément connue sous le nom de "maladie des os de verre". Cette maladie héréditaire rend les os très fragiles et sujets à des fractures, même avec des traumatismes mineurs, et cause des déformations du squelette. Elle est due à une mutation génétique qui affecte la production de collagène de type 1, une protéine essentielle à la solidité des os. Il n’existe actuellement aucun traitement ayant fait solidement preuve de son efficacité sur la réduction du risque de fracture. Le traitement que nous testons utilise un inhibiteur de microARN, appelé AntagomiR, qui est administré par injection dans la veine. Les microARNs sont de petites molécules qui régulent l'activité des gènes, et dans le cas de l'OI, ils sont dérégulés, contribuant à l'aggravation des symptômes de la maladie. Au laboratoire, nous avons observé que cet inhibiteur stimule la production de collagène et d'autres composants importants pour la formation des os par les cellules osseuses. Cette étude se déroule sur des souris qui présentent les mêmes mutations génétiques que les personnes atteintes de la maladie des os de verre et des fractures sur faible traumatisme tout comme les patients atteints. L'objectif est de voir si ce traitement peut renforcer les os et réduire les déformations squelettiques et fractures. Nous espérons développer de nouvelles thérapies pour les patients atteints de cette maladie, ou améliorer les traitements existants, qui sont actuellement très limités, surtout chez les enfants.
Bénéfices attendus
Bénéfices Scientifiques : Compréhension des mécanismes de la maladie : Cette étude vise à approfondir notre compréhension du rôle d'un microARN, qui influence la formation et le remodelage des os. En étudiant comment ce microARN agit, nous pourrions découvrir des mécanismes fondamentaux liés à la fragilité des os chez les personnes atteintes de la maladie des os de verre (ostéogenèse imparfaite et mieux comprendre la complexité des interactions biologiques impliquées dans cette maladie. . Identification de nouvelles cibles pour les traitements : Si cette recherche démontre que le traitement à base d'un AntagomiR est efficace, cela pourrait confirmer que le microARN est une cible valable pour de futurs médicaments. Le mécanisme étudié pourrait être applicable pour un futur traitement pharmaceutique. Cette étude mènerait à la mise en place de nouveaux traitements pour la maladie des os de verre, mais aussi pour d'autres maladies où les os sont anormalement fragiles. Progrès technologiques : En menant cette étude, nous allons également perfectionner des techniques avancées pour administrer des traitements basés sur les microARNs, comme cet AntagomiR, directement dans les organismes vivants. Bénéfices Cliniques : Amélioration des traitements disponibles : Si le traitement avec cet AntagomiR s’avère efficace, il pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques pour les patients atteints de la maladie des os de verre, une maladie pour laquelle les traitements actuels sont limités. Un tel traitement pourrait non seulement renforcer les os et réduire les fractures, mais aussi améliorer de manière significative la qualité de vie des patients en diminuant les risques liés aux dommages osseux et des autres tissus comprenant du collagène. Réduction des effets secondaires : Comparé aux traitements existants, comme les bisphosphonates, qui peuvent entraîner des effets secondaires parfois difficiles à gérer, surtout chez les enfants, cet AntagomiR pourrait offrir une alternative mieux tolérée
Procédures
[Modif. du 22/12/2025 : A 7j les souriceaux sont sélectionnés par analyse d’ADN sur une biopsie de 1mm d’un bout d’oreille au cours d’une anesthésie gazeuse courte] Les injections seront hebdomadaires pendant 8 semaines dans chaque procédure et réalisées au cours de l'anesthésies gazeuse des radiographies. Pour connaitre l’efficacité du traitement, les souris sont anesthésiées pour une durée de 15 minutes pour avoir une injection intraveineuse du traitement suivie d’une radiographie par scanner afin d’évaluer la qualité osseuse et le nombre de fractures. Ces mesures sont non-invasives, ce qui signifie qu'elles ne causeront pas de douleur ou de dommage aux animaux. Cette intervention permet : > la surveillance de l'apparence et de la santé générale : Chaque semaine, nous examinerons les souris pour suivre leur croissance, si leur poids change et si elles subissent des fractures. > radiographies hebdomadaires et recherche de fracture. > Une analyse détaillée des os par imagerie : permet de voir l’aspect 3D des os et de mesurer plusieurs éléments importants, comme la densité des os, le volume osseux par rapport au volume total, l'épaisseur des petites structures osseuses (trabécules), leur nombre, et l'espace entre elles. Cette intervention sera donc répétée 8 fois par souris pour une durée estimée de 15 minutes par souris.
Impact sur les animaux
[Modif. du 22/12/2025 : La biopsie d’oreille peut entrainer une douleur légère chez le souriceau (7-10 jours) avec administration d’antalgiques. Elle est précédée d’une désinfection et elle est suivie d’une compression douce d’un retour au nid immédiat et d’une surveillance rapprochée pour limiter le risque d’infection, de saignement, de stress et de complication respectivement] Au cours de cette étude, les souris pourraient éprouver certains inconforts en raison des manipulations fréquentes et des injections répétées du traitement ou des fractures. Les effets possibles incluent une perte de poids, une diminution de l'appétit, et des difficultés à se déplacer. En raison de leur mutation génétique spécifique, les souris sont également plus susceptibles de subir des fractures osseuses spontanées, ce qui peut causer de la douleur. Les souris présentent des fractures spontanées sur de faible traumatisme, en moyenne 10 fractures à 18 semaines, sans mortalité associée. Les signes de douleur ou de stress que nous pourrions observer chez les souris incluent un frottement ou un léchage excessif, une agressivité ou prostration inhabituelle, ou une posture anormale. Elles pourraient également montrer un malaise général, une réduction de leur activité, et un pelage qui semble mal entretenu. Conformément à la littérature scientifique, il n’existe pas d’effet attendu du traitement sur le plan de la tolérance viscérale ou comportementale au-delà de l’effet thérapeutique recherché.
Devenir
[Modif. du 22/12/2025 A l’issue de la procédure de croisement les souriceaux sont sélectionnés pour la procédure d’élevage pour être orientés vers la phase expérimentale lorsqu’ils sont porteurs de deux copies de la mutation invalidante ou pour être gardés comme animaux reproducteurs lorsqu’ils sont porteurs d’une seule copie de la mutation. Les souris qui ne sont pas gardées pour ces procédures (d’élevage ou d’expérimentation) sont retirés du projet de manière indolore par injection de produit euthanasiant sous anesthésie générale. 4 souris disposant d’une seule copie de la mutation seront maintenues en vie à l’issue du projet en animalerie sécurisé en vu de futurs projets à moyen terme (
Remplacement
Pour trouver de nouvelles solutions de traitement pour la maladie des os de verre (ostéogenèse imparfaite, OI), il est crucial de mener des études sur des souris. Ces études sont nécessaires car elles permettent de recréer un environnement qui se rapproche le plus possible de celui des patients atteints d’OI. Les souris utilisées dans ces expériences présentent des altérations génétiques et physiques similaires à celles des personnes atteintes par la maladie, c’est-à-dire une mutation du collagène qui se traduit par une fragilité osseuse et des fractures. Ceci rend les résultats plus pertinents pour le développement de nouveaux traitements. Ces projets sont basés sur les résultats obtenus par nos études cliniques chez l’homme qui montrent que de petites séquences d’ARN (miRNAs) excrétés des tissus, notamment du tissu osseux sont dérégulés chez les patients. Avant de passer à ces études in vivo, nous avons réalisé des expériences en laboratoire sur des cellules osseuses de souris, montrant que l'inhibiteur de l’un de ces miRNAs, appelé AntagomiR, a des effets bénéfiques sur la fragilité osseuse. Ces tests nous ont permis d'affiner notre approche et de nous préparer pour les essais plus complexes sur des souris. Bien que nous ayons déjà effectué des tests en laboratoire sur des cellules osseuses, ces modèles cellulaires ne peuvent pas reproduire toutes les interactions complexes présentes chez la souris notamment en termes de tolérance et efficacité phénotypique. Par conséquent, les études in vivo sur des souris restent indispensables pour obtenir des données cliniquement pertinentes. Les souris OIM constituent le modèle le moins sensible reproduisant le plus fidèlement sur le plan physiopathologique et sur le plan clinique l’atteinte humaine.
Réduction
[Modif. du 22/12/2025 Concernant l’étape de reproduction, nous constituerons 2 trios à partir de souris d’un élevage agréé. L’orientation précoce des souris est assurée par un génotypage réalisé à j7–j10 ce qui évite d’élever inutilement des animaux non inclus. Les reproducteurs ne présentent pas de phénotype dommageable]. Les protocoles d'injection seront optimisés au cours d’une première étape pilote sur 10 animaux avec 5 régimes d’injection différents, garantissant que le rythme d'injection le mieux toléré et le plus efficace sera utilisé dans les étapes suivantes. L’innocuité et la durée du traitement seront précisés par absence d’effets secondaires et le rythme d’injection le mieux toléré par les souris, sera déterminé en observant la réaction des animaux à l’issue de la première administration et les signes pertinents de mal être. L’efficacité du traitement sera également prise en compte par le jugement du critère principal d’amélioration fonctionnelle, c’est-à-dire une diminution de la fragilité osseuse et du nombre de fractures, en fin de procédure. Cela permettra de minimiser les variations et de réduire le nombre total d'animaux nécessaires par la suite, avec l’injection chez 10 souris de l’antagomiR et 10 souris de l’antagomiR-contrôle. Enfin dans une dernière phase, en cas d’échec de la phase 2, l’utilisation de 10 souris avec cette fois l’injection unique d’un antagoniste du microARN sous forme de particules lentivirales qui conduirait à une antagonisation stable et continue du microARN. Pour réduire le nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats statistiquement significatifs, nous avons défini des critères précis de réduction basés sur l'incidence des fractures. Nous anticipons une diminution de 30% des fractures par rapport au groupe contrôle. Cette estimation nous conduit à un échantillon de 10 souris par groupe expérimental. L'utilisation de cette approche statistique rigoureuse permet de minimiser le nombre d'animaux nécessaires tout en garantissant la robustesse des résultats obtenus. La collecte de données longitudinales sur les mêmes animaux à différents points de temps maximisera les informations recueillies et réduira le besoin d'augmenter la taille des groupes pour les analyses de fin d'étude.
Raffinement
Pour leur confort, les souris bénéficieront d’un environnement enrichi avec des matériaux de nidification et des structures souples pour limiter le stress et les traumatismes, particulièrement chez les souris à fragilité osseuse accrue. Les manipulations seront effectuées à l’aide de tunnels pour éviter les traumatismes et réduire le stress, toute manipulation autre que par main en coupe étant proscrite. Le personnel recevra une formation continue sur les meilleures pratiques de soins et de manipulation. Les conditions d’hébergement seront adaptées : les souris seront logées en groupes réduits pour minimiser les risques d’agressivité et bénéficier d’un suivi qualitatif renforcé. Les cages seront équipées de matériaux non abrasifs et d’une litière épaisse, avec de la nourriture et de l’eau gélifiée disposées au fond pour faciliter l’accès, même en cas de douleur ou de boiterie. Une évaluation du bien-être et de la douleur de manière standardisée permettra une intervention rapide. Des anti-douleurs seront mis dans l’eau de boisson pour la gestion autonome des douleurs, et en cas de douleur ou de fracture, de l'anti-inflammatoire ou un anti-douleur plus puissant sera administré. Si un animal atteint un état de stress important ou un point limite de bien-être, il sera euthanasié après une sédation gazeuse pour une fin de vie sans douleur. Tous les équipements ou fournitures entrant en contact avec les souris seront stérilisés pour éviter toute contamination. Les expérimentations auront lieu dans un environnement confiné et sécurisé. En cas de plaies mineures, une crème apaisante sera appliquée pour faciliter la cicatrisation. [Modif. du 22/12/2025 Les effets indésirables du prélèvement d’oreille du souriceau sont minimisés par la rapidité du geste réalisées sous anesthésie gazeuse avec compression du tissu et remise immédiate de l’animal dans le nid. Pour les procédures d’élevage et d’expérimentation l’ensemble des souris, y compris celles qui ne présentent pas de signe clinique de la maladie et qui ne sont donc pas exposes aux procédures expérimentales bénéficient des mêmes conditions de raffinement en élevage.]
Choix des espèces
L'utilisation de souris dans cette étude est justifiée par leur capacité à mimer la maladie humaine, en particulier les souris oim+/+, qui présentent un phénotype très proche de celui observé chez les patients atteints d’ostéogenèse imparfaite (OI). Âge des Souris : 6 Semaines à J0 : Développement Osseux Critique : À 6 semaines, les souris sont en pleine croissance rapide, ce qui est essentiel pour étudier l'effet des traitements sur le développement osseux et la fragilité liée à l'OI. Les manifestations de l'OI, telles que les fractures et les dommages osseux, sont déjà présentes à cet âge, permettant une évaluation claire des effets thérapeutiques. Homogénéité et Comparabilité : Utiliser des souris du même âge assure une cohérence dans les données, réduisant les variations dues à des différences de développement entre individus. Cette approche soigneusement planifiée permet d'assurer que les résultats obtenus seront significatifs et utiles pour envisager des interventions thérapeutiques chez les patients humains souffrant d'OI.
Entretien d’une lignée murine immunodéficiente à phénotype dommageable
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Dépourvues de défenses immunitaires par construction génétique, donc vulnérables à toute infection, 1 824 souris vont être élevées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Aucune intervention n'est prévue dans ce projet, qui encadre le seul entretien de la lignée, la réglementation européenne imposant de déclarer l'élevage d'animaux à phénotype dommageable. Le porteur affirme que ce phénotype ne s'exprime pas grâce à des conditions sanitaires contrôlées, et que ces lignées restent "indispensables" pour greffer un système immunitaire humain sans rejet. Les souris arrivant en fin de fertilité vers six mois sont tuées, les autres partant vers des projets expérimentaux dont le détail est renvoyé à d'autres autorisations.
Objectifs
La lignée de souris qui fait l’objet de cette Demande d’Autorisation de Projet (DAP) est fortement immunodéprimées : les animaux issus de cet élevage sont immunodéficients (sans défense immunitaire). Leur phénotype (l’ensemble des caractères visibles) est par conséquent considéré comme dommageable : les animaux deviennent sensibles et vulnérables aux infections. Cependant, ce phénotype peut ne pas s’exprimer si leur élevage est réalisé dans des conditions sanitaires optimales : statut sanitaire contrôlé sans pathogène, hébergement en cages ventilées, utilisation d’équipements, d’aliment, d’eau de boisson et d’enrichissements stériles, ce qui est le cas dans notre établissement utilisateur. Désormais la règlementation européenne nous demande de déclarer l’élevage de ces animaux à phénotype dommageable, même si ce phénotype ne s’exprime pas grâce aux conditions adéquates de maintien de cette lignée. C’est l’objet de cette demande.
Bénéfices attendus
Cette DAP a pour objectif d’encadrer l’entretien d'une lignée, nécessaire à la réalisation de projets de recherche translationnelle dans les maladies infectieuses (évaluation de vaccins, d’immunothérapies) avec à terme un bénéfice pour la santé humaine.
Procédures
Aucune intervention n’est prévue dans cette DAP.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus chez ces animaux immunodéficients proviendraient d’une contamination par des pathogènes opportunistes. Ces risques sont réduits au minimum grâce aux conditions d’hébergement et d’expérimentation au sein de notre structure (EOPS (Exempt d'organisme pathogène spécifique), hébergement en portoirs ventilés, équipements de travail, nourriture, enrichissements, et outils stériles).
Devenir
Les animaux arrivant en fin de fertilité (environ 6 mois d’âge) seront mis à mort. Le sort des animaux destinés à des protocoles expérimentaux sera précisé dans les DAP des projets correspondants.
Remplacement
Les méthodes alternatives à l’expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques comme l’étude de l’activation du système immunitaire après une vaccination ou une immunothérapie, elles demeurent inadaptées, puisqu’elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d’un organisme vivant. De plus, les lignées murines immunodéficientes restent indispensables pour greffer un système immunitaire humain sans risque de rejet de greffe et permettre ainsi d’étudier l’activation d’un système immunitaire humain.
Réduction
Les plans de reproduction sont effectués selon les besoins expérimentaux nécessaires dans les divers projets, de manière très précise pour ne pas produire d’animaux plus que nécessaire. Les animaux sont issus d'une lignée stable pour que toute la descendance puisse être incluse dans les protocoles expérimentaux ou pour de la reproduction. Ainsi, tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation soit en renouvellement de géniteurs.
Raffinement
Tous les animaux sont utilisés soit en expérimentation, soit en renouvellement des accouplements. Nos conditions d’élevage réduisent les risques que le phénotype dommageable s’exprime : élevage en établissement EOPS, cages ventilées, change sous hotte à la pince, matériels stérilisés. Les enrichissements stériles sont variés (pour les femelles : petite maison et/ou rouleau en papier catonné, craft, coton ; pour les mâles: un escalier, des bâtons en bois) et adaptés au type d’animaux dans la cage.
Choix des espèces
Ce modèle murin présentant une immunodéficience sévère. Les souris n'ont pas de système immunitaire ce qui permet l’humanisation avec des cellules humaines sans pré-traitement préalable et sans risque de rejet de greffe. Par ailleurs, la mutation additionnelle du gène cKit (CD117), qui code pour un récepteur essentiel à la survie des cellules souches hématopoïétiques murines améliore significativement la greffe de cellules souches humaines. Cette modification génétique constitue une avancée majeure pour obtenir une humanisation efficace, stable et complète du système immunitaire humain. De fait, ce modèle permet d’obtenir des résultats robustes, reproductibles et représentatifs de l’immunologie humaine, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires dans les études. Il constitue un outil indispensable dans des études de vaccinologie notamment pour modéliser in vivo le système immunitaire humain et étudier les mécanismes complexes de réponses immunitaires dans leur intégralité.
Mesure continue de la concentration portale de glucose par une sonde télémétrique chez la souris : étude de faisabilité.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Opérées à douze semaines pendant une heure sous anesthésie gazeuse pour recevoir une sonde télémétrique dans un vaisseau sanguin, puis mises à jeun six heures à plusieurs reprises et piquées à la queue deux fois par semaine, 130 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Quatre-vingt-seize d'entre elles reçoivent en plus cinq injections sous-cutanées quotidiennes. Toutes sont tuées pour autopsie. Une partie sont des animaux de réforme, que le porteur décrit comme des souris transgéniques de génotype non pertinent "systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet", et il annonce 130 souris sur quatre ans pour ce qu'il qualifie lui-même d'étude de faisabilité.
Objectifs
Les objectifs de cette étude sont : - de maîtriser la méthode d’utilisation d’une sonde de mesure de glucose posée dans l’artère carotide d’une souris. - de développer chez la souris une technique chirurgicale permettant de mesurer la glycémie en continu dans le sang entre l’intestin et le foie grâce à cette sonde télémétrique. Cette mesure de glucose se réalise habituellement dans le sang périphérique, il est donc nécessaire de réaliser des adaptations pour pouvoir la mesurer dans le sang qui sort de l’intestin. Cette étude permettra également de vérifier si cette sonde permet de mesurer une production de glucose par l’intestin. Pour cela, les souris seront soumises à des courtes périodes de jeûnes et des régimes variés pour suivre en continu les variations de cette glycémie.
Bénéfices attendus
L’intérêt de développer la surveillance continue du glucose par télémétrie dans les circulations sanguines artérielle et veineuse est de fournir un suivi en temps réel avec une haute précision des variations subtiles du glucose sans avoir à intervenir sur l’animal. L’innovation tient au développement de la mesure continue du glucose dans la veine porte, située entre l’intestin et le foie. La présence de glucose et de nutriments dans la veine porte contrôle le fonctionnement du foie et la régulation de l’appétit. A court terme, cette mesure continue du glucose au niveau de la veine porte aidera à comprendre la régulation de la prise alimentaire et le fonctionnement du foie. Elle offrira la possibilité de comprendre la dynamique du glucose dans des modèles de souris reproduisant diverses maladies : obésité, diabète, maladies cardiovasculaires, cancer.
Procédures
Les souris de cette étude seront soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie gazeuse pour implanter la sonde télémétrique dans les vaisseaux sanguins (durée 1h). En pré-médication, 2 injections d’analgésiques sous la peau seront effectuées (2x 15 secondes) et au moment de la chirurgie, une injection d’analgésie locale sera rajoutée (30 secondes). Pour gérer la douleur post-opératoire une injection sous la peau d’un analgésique sera effectuée 1 fois/jour pendant 3 jours (3x 15secondes). Pour 6 souris : une mise à jeun pendant 6 heures sera réalisé avant une injection de glucose. Le geste nécessaire à l’injection dure 20 à 30 secondes et la mesure de glycémie quelques secondes. Pour cela, une goutte de sang sera prélevée (au total 7 fois au cours du test) à l’extrémité de la queue. Une seule incision initiale de l’extrémité de la queue sera réalisée après application d’une crème anesthésiante. Des prélèvements 2 fois/semaine sur 2,5 semaines soit 5 prélèvements de 30 secondes chacun seront ensuite réalisés. Pour 96 souris, 5 injections journalières sous la peau à différents endroits (durée 15 secondes) à l’âge de 13 semaines seront réalisées et ces souris seront mises à jeun pendant 6h à 4 reprises. Un prélèvement de sang à la queue sera réalisé 2 fois/semaine pendant 4 semaines (8x30 secondes) Pour diminuer la douleur, une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements. Une anesthésie gazeuse sera mise en place avant la mise à mort des animaux.
Impact sur les animaux
A l’âge de 12 semaines, les souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un capteur de glucose dans un vaisseau sanguin. Les chirurgies sont susceptibles de provoquer de la douleur post-opératoire, notamment au niveau des sutures de l’abdomen. Le prélèvement d’une goutte de sang à la queue, peut provoquer du stress et une douleur transitoire. Les mise à jeun pendant 6H chez ces souris opérées peuvent induire un stress. A l’âge de 13 semaines, 96 souris recevront une injection sous-cutanée, qui peut induire un stress lié à la contention et une douleur au point d’injection. Les points d’injection seront différents tous les jours afin d’éviter une douleur au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour autopsie.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de suivre en continu la glycémie d’un organisme entier, en fonction de ses états physiopathologiques. La régulation de la glycémie dépend de la coopération de différents organes et ne peut pas être reproduite sur cellules ou organoïdes. Actuellement il n’existe pas de modèle informatique de la régulation du glucose sanguin.
Réduction
Une partie des animaux utilisés sont des animaux de réforme, c’est-à-dire des souris transgéniques de génotype non pertinent non utilisables en protocole et non replaçables, systématiquement euthanasiées en dehors de ce projet. L’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux uniquement pour les étapes de mises au point. Le nombre de souris utilisées dans la procédure d’étude a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux, du métabolisme du glucose et des connaissances acquises par les études précédentes. Afin de réaliser une analyse statistique, des groupes de 16 souris maximum par génotype et par sexe seront utilisés pour déterminer si la production de glucose par l’intestin peut être mesurée par une sonde télémétrique placée en veine porte. Au total, ce projet réalisé sur 4 ans nécessitera 130 souris transgéniques.
Raffinement
Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Ces interventions seront réalisées par des personnes expérimentées avec du matériel biocompatible et adapté à la souris. Pendant l’intervention chirurgicale, les souris seront placées sur un tapis chauffant afin de maintenir leur température corporelle entre 36 et 38°C et un gel lubrifiant sera déposé sur les yeux. En fin d’intervention, les animaux seront réhydratés par une injection sous-cutanée de solution physiologique et surveillés dans une pièce chauffée à 28°C pour faciliter leur récupération. Le suivi post-opératoire se fera dans une pièce dont la température sera réglée à 24°C pendant une semaine pour favoriser la reprise de poids des souris. De l’aliment hydraté sera également mis à disposition dans la cage les jours suivants. Les injections répétées sous la peau seront réalisées en changeant de point d’injection pour éviter des inflammations locales. La mise en place d’une grille de score pendant toute la durée du projet permet d’adapter la surveillance et l’utilisation d’antalgiques selon l’état de l’animal. Cette grille de score et l’utilisation de points limites adaptés ont permis de déterminer les critères d’arrêt de souffrance à tout moment du projet.
Choix des espèces
En ce qui concerne la régulation de la glycémie, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson, montrent que les régulations ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux, comme la souris, dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le protocole sera réalisé chez des souris adultes âgées de 12 semaines, âge auquel les animaux ont un meilleur rétablissement post-chirurgical.
Etude de biocompatibilité et de néovascularisation d’un assemblage de biomatériaux chez le rat irradié (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies animales
Avant de tester un implant de reconstruction faciale sur des chiens et des chats atteints de cancers de la bouche, 34 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués trois mois après la dernière intervention. Chacun subit une chirurgie d'implantation d'environ trente minutes, et vingt-cinq d'entre eux reçoivent ensuite douze séances d'irradiation réparties sur quatre semaines. Le porteur annonce des douleurs postopératoires, des difficultés à s'alimenter, une dermatite radio-induite et des troubles du comportement, anxiété, dépression ou agressivité, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet une telle évaluation. Il inscrit l'ensemble dans une démarche "One Health" qu'il présente comme une réduction du nombre d'animaux non-humains utilisés.
Objectifs
La présente demande couvre une sous partie du projet de recherche hospitalo-universitaire (RHU) , qui vise à développer une solution innovante pour résoudre un problème clinique pour lequel les solutions actuelles ne sont pas optimales : la reconstruction osseuse immédiate et personnalisée pour les cancers de la tête et du cou, tout en limitant la morbidité. Nous souhaitons modifier le procédé chirurgical standard de reconstruction des os du visage - qui consiste actuellement à utiliser un lambeau osseux libre du patient - en proposant un dispositif médical (DM) idéal, combinaison de 4 biomatériaux. Le projet repose sur un consortium de 7 partenaires experts dans le domaine de la recherche clinique humaine et vétérinaire, du DM, et de la caractérisation des biomatériaux. Le DM final sera constitué par 4 DM distincts qui seront associés le jour de l’intervention: 1- Implant en céramique: substitut osseux. 2- Implant à base de Titane : Système de fixation utilisé en combinaison avec le substitut osseux . 3- Membrane d’albumine (Alb) : revêtement cicatrisant et biocompatible, avec des propriétés anti-inflammatoires. 4- Spray antimicrobien.. Plus particulièrement la partie du projet qui fait l’objet de cette présente demande d’autorisation a pour but d'évaluer l’efficacité du DM en termes de biocompatibilité et néovascularisation après irradiation versus sans irradiation. L’objectif primaire est d'évaluer l’efficacité du DM en termes de biocompatibilité et néovascularisation après irradiation versus sans irradiation. La tenue d’un tel dispositif post-irradiation reste un challenge, compte tenu de l’impact de la radiothérapie sur les tissus environnant. L'objectif secondaire vise à évaluer l'effet de l'albumine avec ou sans spray antibactérien sur la biocompatibilité du DM et sa capacité de néovascularisation comparée à celui du DM HA-Ti seul chez le rat irradié ou non irradié. La biocompatibilité du DM sera évaluée par analyse histopathologique dans les différentes conditions. Cet essai est nécessaire avant l’essai clinique de reconstruction osseuse faciale par la procédure sur des animaux de compagnie souffrant de cancers de la cavité orale dans le cadre d’une médecine « One Health ». Le projet est réalisé dans 2 Etablissements Utilisateur (EU1 et EU2)
Bénéfices attendus
A moyen terme, le projet permettra d'éviter le risque de séquelles esthétiques et morbides sévères aux patients atteints d’un cancer de la tête et du cou et aux animaux de compagnie ayant besoin d’une reconstruction osseuse, et ainsi d’améliorer leur qualité de vie et réduire le fardeau économique pour la collectivité. Le DM mis au point dans le cadre du projet pourra également bénéficier aux animaux de compagnie, pour lesquels il n’existe actuellement pas de solution de reconstruction des os de la face. Plus particulièrement, cette étude de biocompatibilité et de néovascularisation chez le rat irradié est cruciale puisqu’elle permettra de donner les premières preuves de faisabilité d’utilisation du DM suite à une radiothérapie avant de passer à des essais cliniques sur des animaux de compagnie souffrant de cancer de la tête et du cou.
Procédures
Les 34 rats vont subir 1 chirurgie d’implantation du dispositif sous anesthésie générale d’environ 30 minutes réalisés dans l'EU 2/2. Les 2/3 des animaux (25 rats) seront ensuite irradiés 3 fois par semaine pendant 4 semaines (soit 12 séances d’une durée d'une minute maximum par animal à chaque fois), 4 semaines après l’implantation , cette étape est réalisée dans l'EU 1/2. 3 mois après la chirurgie (groupe contrôle),ou 3 mois après la dernière séance d’irradiation (groupe expérimental) seront mis à mort et explantés pour analyse, étape réalise dans l'EU 2/2
Impact sur les animaux
1. Douleurs post-opératoires dans les jours suivant l'implantation 2. Difficultés à l'alimentation dans les jours suivant l'implantation / les séances d'irradiation 3. Infection du site opératoire dans les jours suivant l'implantation 4. Mauvaise cicatrisation dans les jours suivant l'implantation 5. Dermatite radio induite dans les jours suivant les séances d'irradiation 6. Effets secondaires systémiques : tels que des effets sur le poids corporel, le métabolisme, ou d'autres paramètres physiologiques. 7. Problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité.
Devenir
Tous les rats seront euthanasiés trois mois après la dernière intervention (implantation ou radiothérapie, selon le groupe). Les analyses qui seront faites pour vérifier l’intégration des DMs ne permettent pas de maintenir les animaux en vie.
Remplacement
Cette étude de biocompatibilité et de néovascularisation vise à évaluer la faisabilité d’implantation d’un nouveau DM dans un contexte de tissu irrad L’utilisation des implants à base d’Hydroxyapatite et à base de Titane est déjà autorisée en reconstruction osseuse et a été largement documentée. Les deux autres éléments qui composeront le DM final, le spray antibactérien et la membrane d’albumine, ont déjà fait d’étude in vitro et in vivo mais dans le cadre de tests séparés. Cette étude sera la première à tester la biocompatibilité et la néovascularisation suite à l’implantation de l’assemblage des 4 DMs. Il n’existe à ce jour et à notre connaissance aucun modèle in vitro permettant une telle évaluation.
Réduction
Le projet s’inscrit dans la démarche One Health. En effet, il est prévu que le DM mis au point soit aussi testé chez des chats et chiens atteints de cancers oraux dans le cadre d’une étude clinique vétérinaire. Les données générées lors de cette étude permettront de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire tout en offrant une solution de reconstruction pour les animaux participants à cette étude clinique. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus (avec un biostatisticien), ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Le taux de succès sera estimé dans chaque groupe avec un intervalle de confiance de 95% . L’effet de l’irradiation sera évalué par un test statistique non paramétrique . Le protocole d’irradiation a été défini avec une spécialiste de radio-oncologie vétérinaire
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux. Les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire, notamment en post-opératoire). Les animaux seront surveillés avec attention chaque jour (comportement, cicatrice) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. La douleur sera prise en charge dès que nécessaire. La taille des DM a été adaptée à la morphologie des animaux. Dans les jours suivants la chirurgie et les séances d’irradiation, une surveillance renforcée des animaux sera mise en place (Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.
Choix des espèces
Le rat est un modèle établi pour les tests de biocompatibilité..De plus, comme nous cherchons à reproduire le protocole de soins, et en particulier la radiothérapie subit par les patients et les animaux de compagnie atteints de cancer de la tête et du cou. Le projet visant la mise au point d’un DM permettant la reconstruction faciale chez l’adulte, les procédures ne concerneront que des rats adultes
Etude du rôle du récepteur ERa sur la fonction endothéliale lymphatique. EU1/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système urogénital
Gavage quotidien pendant cinq jours, chirurgie du lymphœdème, injection de cellules tumorales, puis jusqu'à huit prélèvements sanguins à la queue par test de tolérance : 530 souris, en grande majorité des femelles, subissent ces actes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet porte sur le rôle des hormones féminines dans le système lymphatique et la diffusion métastatique, et se déroule dans deux établissements entre lesquels les animaux sont transportés. Le porteur écrit que la chirurgie du lymphœdème ne génère pas d'effet indésirable majeur, tout en listant les signes qui déclencheraient un analgésique, dos voûté, yeux plissés, absence de toilettage. Les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour récolter les tissus.
Objectifs
Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs. L’AJOUT DE DEUX TECHNIQUES NÉCESSITE UNE MODIFICATION DU PROJET INITIAL AUTORISÉ (MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE ET TEST DE TOLÉRANCE ORALE AUX LIPIDES).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.
Procédures
Dans le premier établissements utilisateur : dans un premier temps, une gavage quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). TROIS FOIS AU COURS DU PROTOCOLE, UNE MESURE DE LA COMPOSITION CORPORELLE, un test de tolérance au glucose et UN TEST DE TOLÉRANCE LIPIDIQUE SERONT RÉALISÉS, ESPACÉS DE DEUX JOURS. LA COMPOSITION CORPORELLE SERA ÉVALUÉE PAR RMN (MINISPEC, BRUKER) CHEZ DES SOURIS ÉVEILLÉES (2 MINS). LES TESTS DE TOLÉRANCE AU GLUCOSE ET LIPIDES IMPLIQUENT UN GAVAGE (20 SEC), SUIVI DE PRÉLÈVEMENTS SANGUINS SÉQUENTIELS À LA QUEUE (8 POUR LE TEST DE TOLÉRANCE AU GLUCOSE ET 4 POUR LE TEST DE TOLÉRANCE LIPIDIQUE). Dans le second établissement utilisateur : les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie juste avant la mise à mort. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure.
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place. LE MINISPEC PEUT PROVOQUER UN STRESS LÉGER ET TEMPORAIRE DÛ AU CONFINEMENT. LE GAVAGE PEUT CAUSER UN STRESS TEMPORAIRE, UNE LÉGÈRE IRRITATION DE L’ŒSOPHAGE ET UN RISQUE D’ASPIRATION, AVEC UN RISQUE MINIME DE LÉSIONS SI LA TECHNIQUE EST CORRECTE.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.
Remplacement
Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de métastases ou l'apparition du lymphoedème secondaire après curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation génique du récepteur aux oestrogènes ERα a été généré seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant à une invalidation du ERα de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 22 semaines.