Rongeurs
Etude de l’efficacité thérapeutique de nanoparticules pour la délivrance d’ARN chez un modèle murin d’inflammation intestinales aigüe et chronique
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
591 souris vont être utilisées, dont 555 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant recevoir jusqu'à six administrations intra-rectales sous anesthésie et six gavages. Un agent chimique leur provoque une inflammation intestinale qui se traduit par une perte de poids, des selles anormales et du sang dans les selles, l'état de chaque animal étant noté chaque jour sur une grille de 0 à 4. Toutes sont tuées, à la fin de l'étude ou à des points intermédiaires, pour des analyses post mortem. Les bénéfices annoncés, une nouvelle génération de traitements ciblés contre la maladie de Crohn et la rectocolite, sont renvoyés au long terme et au conditionnel, quand l'inflammation infligée aux souris est le point de départ du protocole.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de vérifier si des nanoparticules biodégradables à base d’ARN peuvent atténuer efficacement l’inflammation intestinale, un problème majeur dans des maladies comme la colite. En induisant artificiellement une inflammation chez la souris, puis en administrant ces nanoparticules, nous pourrons mesurer leur impact sur les symptômes et l’évolution de l’inflammation. Si les résultats sont positifs, cela ouvrira la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les personnes souffrant de maladies inflammatoires de l’intestin. Les maladies inflammatoires de l’intestin sont des troubles auto-immuns caractérisés par une inflammation sévère et récurrente de la paroi du tube digestif. Ces maladies, en augmentation dans les sociétés modernes, sont graves et les traitements actuels peinent à offrir une efficacité durable, entraînant souvent des effets secondaires pour les patients. Il est donc important de développer des approches thérapeutiques nouvelles et mieux ciblées. Ce projet de recherche a pour but de mettre au point une approche thérapeutique innovante, utilisant une nanoparticule capable d’améliorer la prise en charge de ces pathologies inflammatoires. Ce projet d’expérimentation sur un modèle animal vise précisément à étudier l’efficacité thérapeutique de nanoparticules à base d’ARN, biodégradables et biocompatibles, dans un modèle de maladie intestinale inflammatoire (comme celles de type Crohn et colite ulcéreuse). Le projet s’inscrit dans une démarche scientifique et médicale visant à répondre aux interrogations suivantes : 1. Déterminer si les nanoparticules à base d’ARN, administrées par voie orale, sont capables de réduire efficacement l’inflammation intestinale. 2. Comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels les nanoparticules à base d’ARN modulent la réponse inflammatoire dans l'intestin.
Bénéfices attendus
À court terme, le projet apportera des réponses sur l’efficacité des nanoparticules à base d’ARN pour traiter l'inflammation intestinale dans des modèles murins, tout en améliorant la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués. Il jettera également les bases pour de futures applications thérapeutiques en médecine humaine. À long terme, ces nanoparticules pourraient représenter une nouvelle génération de traitements ciblés pour les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, avec moins d'effets secondaires et un potentiel pour des thérapies personnalisées. Ainsi, ce projet pourrait significativement faire progresser les connaissances scientifiques tout en ayant un impact majeur sur le développement de nouvelles thérapies cliniques pour les maladies inflammatoires.
Procédures
Dans les différentes procédures : - les animaux seront rasées sur une petite zone du dos (1,5x1,5cm, une seule fois en début de procédure, 1 minute) - les animaux recevront une ou plusieurs (6 maximum) administrations intra-rectale (5 minutes maximum pour l’ensemble du geste), sous anesthésie et plusieurs administrations (6 maximum) par gavage oral (moins d’une minute pour le geste), sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux (contention, pesée et anesthésie) pourra entraîner un état de stress. La rasage (tondeuse) nécessaire à la pré-sensibilisation au produit peut créer une légère irritation. L’injection d’un agent chimique va induire une inflammation au niveau de l’intestin peut se traduire par une perte de poids, une consistance des selles particulière et une présence de sang dans les selles. L’administration par voie orale est un geste rapide (moins d’une minute). Toutefois, cela pourrait éventuellement provoquer une légère irritation au niveau de l’œsophage.
Devenir
Pour chacune des procédures : Tous les animaux seront mis à mort soit à la fin de l’étude soit à différents points temporels afin de réaliser des études ex-vivo post mortem.
Remplacement
Bien que les tests en laboratoire (in vitro) soient utiles pour des études préliminaires, ils ne peuvent pas simuler toute la complexité des interactions biologiques qui existent dans un organisme complet. Ces études en laboratoire nous ont déjà permis de démontrer que nos nanoparticules sont stables dans des conditions physiologiques variées (milieux qui simulent les fluides gastrique et intestinal) et qu'elles sont compatibles avec des cellules immunitaires et intestinales. Cependant, pour évaluer efficacement notre traitement dans le cadre de l’inflammation intestinale, il est indispensable d’avoir recours à des tests sur organisme vivant (in vivo). 1. Tolérance et sécurité globales : Pour garantir que le traitement ne déclenche pas de réactions indésirables ou toxiques dans un organisme entier, un modèle vivant est essentiel. 2. Interaction avec le microbiote intestinal : Le microbiote joue un rôle clé dans l’inflammation intestinale. Un modèle in vivo permet d’examiner comment les nanoparticules interagissent avec cette communauté complexe de micro-organismes, un élément qui ne peut être simulé de manière fiable en laboratoire. 3. Réalité des conditions de maladie : Les organismes vivants reproduisent les conditions pathologiques réelles, permettant ainsi de tester la réponse au traitement dans des conditions proches de celles rencontrées par les patients. 4. Effets dynamiques dans l’intestin : L’inflammation intestinale modifie des processus comme la perméabilité de l’intestin et son activité motrice, qui influencent directement l’efficacité des traitements oraux. Un modèle in vivo est donc nécessaire pour vérifier si nos nanoparticules parviennent à atteindre la cible thérapeutique. En somme, l’utilisation d’un modèle vivant permet de recréer un environnement biologique complet et complexe, essentiel pour confirmer l’efficacité, la biocompatibilité, et la sécurité de notre traitement dans des conditions proches de celles de l’humain.
Réduction
Dans l’ensemble de notre projet, le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisant pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente.
Raffinement
Pour préparer les souris au projet, nous les acclimaterons pendant une semaine pour réduire leur stress. Pendant tout le protocole, nous veillerons à leur bien-être et prendrons des précautions pour minimiser toute souffrance ou stress. Dans leurs cages, elles auront des objets comme des petites maisons et du paillage pour les distraire, et seront placées en groupes de cinq car elles sont sociables. Les souris seront transportées en toute sécurité dans des boîtes fermées et isolées du bruit. Toutes les souris seront observées pendant chaque pesée (tous les jours) afin de détecter une éventuelle apparition de signes de souffrance. Quand cela sera nécessaire, des experts montreront les techniques spécifiques pour minimiser le stress des souris. Si elles perdent trop de poids, nous ajouterons de la nourriture humide et de l'eau gélifiée pour les aider à s'alimenter. Si le rasage (tondeuse) provoque une irritation, la litière pourra être adoucie. Avant l’administration intra-rectale, les souris recevront une anesthésie légère, et nous humidifierons leurs yeux pour les protéger. Les points limites seront évalués quotidiennement à partir de l’induction de la pathologie, selon une grille de score : il varie de 0 à 4. De plus les critères comportementaux et apparences seront également pris en compte. Un traitement palliatif sera mis en place dès lors que la situation nécessaire et possible laissant une possibilité de rémission et non mise à mort systématique après 24h.
Choix des espèces
Le développement de nouvelles thérapies types nanoparticules nécessite une évaluation chez le petit animal en complément des études in vitro pour déterminer leur devenir et leur efficacité in vivo. La souris représente un modèle expérimental privilégié pour mimer la physiopathologie des maladies inflammatoires intestinales. Le modèle d’inflammation intestinale induite par l’agent chimique d’intérêt est déjà bien établi et mime la pathologie humaine que nous ciblons. Le modèle choisi est décrit dans la littérature pour être sensible à l’induction d’une inflammation intestinale, contrairement à d’autres. Ce modèle nous permettra donc d’acquérir les données nécessaires pour démontrer l’efficacité thérapeutique notre nanoparticule. Les animaux utilisés auront environ 6 semaines au début des procédures, conformément aux données de la littérature indiquant que les souris de cet âge sont plus réceptives au développement d'une inflammation intestinale après administration de l’agent chimique. Au-delà de cet âge, l'induction d'une inflammation intestinale devient plus difficile.
Évaluation des conséquences dommageables associées à des mutations affectant la protection du génome chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les 88 souris subissent une biopsie de queue pour génotypage, unique procédure décrite, dont le porteur indique qu'elle peut provoquer une légère douleur. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures classées à un niveau de souffrance modéré. Elles portent des mutations identifiées chez des patients atteints de déficits immunitaires, et doivent permettre de décrire l'effet de ces mutations sur le développement du système immunohématologique. Rien n'est dit de ce que ces mutations font subir aux souris elles-mêmes, ni de ce qui justifie le classement en souffrance modérée quand seule une biopsie de queue est mentionnée, le porteur se limitant à affirmer que l'étude ne peut être reproduite hors d'un "organisme vivant entier".
Objectifs
Certaines maladies génétiques associées causent des défauts de réparation de l’ADN qui provoquent des déficits immunitaires. Dans ce cadre, nous avons récemment identifié chez des patients des mutations dans 2 gènes impliqués dans la stabilité du génome. L'objectif du projet est de déterminer précisément l'impact de ces mutations dans des modèles de souris. En particulier en nous focalisant sur le développement du système immunohématologique qui est particulièrement affecté dans ces pathologies. Par ailleurs nous génèreront des fibroblastes embryonnaires de souris afin d'en étudier le phénotype en nous focalisant sur la stabilité du génome.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter de nombreuses informations originales et fondamentales sur les conséquences fonctionnelles de ces mutations et plus largement sur le rôle des facteurs analysés dans la stabilité du génome. Les résultats obtenus devraient permettre d'ouvrir des pistes à des approches thérapeutiques chez les patients porteurs de mutations dans ces gènes.
Procédures
Les animaux seront soumis à des biopsies pour génotypage.
Impact sur les animaux
La réalisation des biopsies de queues nécessaires au génotypage des animaux peut provoquer une légère douleur.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort.
Remplacement
L'étude de l'effet des mutations sur le développement du système immunitaire ne peut pas être reproduite dans des systèmes autres que des organismes vivants entiers.
Réduction
Des tests statistiques seront réalisés afin de minimiser le nombre d'animaux produits et analysés.
Raffinement
Des points limites stricts spécifiques au projet on été élaborés. Les animaux seront observés de façon hebdomadaire par le personnel formé et compétent de l’animalerie EOPS selon l'obligation réglementaire en vigueur. Les animaux sont au nombre maximum de 5 par cage. Les cages disposent par ailleurs de matériel d'enrichissement (bouts de coton, tunnels colorés, morceaux de bois). Le maintien des animaux dans une zone exempte de pathogène devrait les préserver d'infections opportunistes.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener des études sur le développement du système immunohématopoiëtique, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement de ce système entre les rongeurs et l’humain. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation de ce projet tels que des anticorps pour les immuno-marquages. Enfin, la souris est un modèle animal dans lequel les techniques de mutagénèse permettent facilement l'introduction des mutations d'intérêt. Lot 1 et 2. Pour les croisements des souris ayant atteint la maturité sexuelle seront utilisées (à partir de 6 semaines) Lot 3. Le phénotype sera analysé dans des animaux adultes (8-10 semaines ), stade dans lequel le système immunitaire est mature.
Formation pratique à la manipulation et à l’évaluation comportementale chez le rongeur
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
Rats : 50
Les gestes appris ici ne produisent aucune connaissance : ils servent à former des étudiants de master et des stagiaires de la formation réglementaire à contenir et piquer des rongeurs. 100 souris et 50 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit trois injections sous-cutanées sur animal vigile, et les souris passent en plus cinq tests comportementaux avant d'être tuées, la formation étant alors terminée. Le porteur affirme qu'aucun mannequin ni simulateur ne permet d'apprendre l'injection, qui exige selon lui de percevoir la tonicité musculaire et la réaction de l'animal, et juge "indispensable" de former les futurs utilisateurs.
Objectifs
Ce projet vise à former deux publics distincts à la manipulation des rongeurs dans un contexte d’expérimentation biomédicale : 1. Étudiants de Master : acquisition des compétences nécessaires pour manipuler la souris et le rat de façon douce et sécurisée, dans le respect des règles de bonnes pratiques et de respect du bien-être animal. Les étudiants apprendront la contention, la réalisation d’une injection sous-cutanée, et seront initiés aux principes d’évaluation comportementale au travers de tests simples non invasifs. 2. Participants à la formation réglementaire à l’expérimentation animale (niveaux applicateur et concepteur) : apprentissage et maîtrise des gestes techniques de manipulation, contention, injection sous-cutanée chez le rat et la souris, afin de garantir une pratique conforme aux bonnes pratiques et au respect du bien-être animal. Dans les deux contextes, l’objectif central est de permettre aux futurs expérimentateurs d’acquérir les compétences nécessaires pour une manipulation précise, contrôlée et respectueuse des animaux.
Bénéfices attendus
L'ensemble des étudiants et apprenants acquerront la maîtrise des gestes techniques de base nécessaires à l’expérimentation animale et les compétences pour manipuler en sécurité pour eux-mêmes et pour l’animal. Ils apprendront à manipuler calmement et sans contrainte excessive les rongeurs, à réaliser des injections sous-cutanées en limitant la douleur. Ceci leur permettra de reconnaître les signes comportementaux d’inconfort. Les étudiants de master apprendront également à utiliser correctement des tests comportementaux et ainsi à interpréter les réponses comportementales des souris dans une approche éthique. Ces procédures permettront aux étudiants/apprenants de pouvoir expérimenter dans les conditions réglementaires et de bien-être animal, contribueront à réduire la variabilité expérimentale future, à améliorer la qualité des manipulations de laboratoire et, de ce fait, leur permettront de développer des projets de recherche à impact pour les connaissances scientifiques. Toutes ces compétences contribueront à réduire la souffrance animale dans les projets futurs et à renforcer l’application concrète du raffinement.
Procédures
L'ensemble des animaux recevra 3 injections, espacées d'au moins 3 jours. Ce geste sera réalisé sous supervision des enseignant.e.s, sur animal vigile. Les souris seront également soumises une fois à 5 tests comportementaux visant à évaluer leurs capacités cognitives et leur état émotionnel. La durée de chaque test est comprise entre 5 et 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress léger, transitoire et limité dans le temps, lié à leur manipulation lors des tests comportementaux et lors de l'injection.
Devenir
- A l'issue de la 3ème séance de TP (réalisation d'injections chez le rat), la totalité des rats seront mis à mort car la formation sera terminée. - A l'issue de la 3ème séance de TP (réalisation d'injections chez la souris), les souris seront conservées pour la séance de TP "tests comportementaux". - A l'issue de la séance de TP utilisant les souris en comportement, les souris seront mises à mort car la formation sera terminée.
Remplacement
Afin que les projets de recherches futurs utilisant des animaux à des fins de recherches scientifiques soient effectués dans le respect du bien-être animal, il est indispensable de former les futurs utilisateurs. Aucune alternative possible (mannequin, vidéo, simulateur) ne permet l'apprentissage de la manipulation et de l’injection sous-cutanée, nécessitant la perception de la tonicité musculaire, de la pression digitale et également de la réaction comportementale de l’animal. Cependant, des mannequins de rats et souris seront disponibles pour que les apprenant.e.s puissent apprendre le geste de contention avant de le réaliser sur animal vivant.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, les animaux seront mutualisés entre les sessions de master et de formation réglementaire qui ont lieu à la même période.
Raffinement
Les manipulations sont réalisées dans un environnement calme. Elles seront douces et courtes, avec la possibilité de réaliser des pauses si l’animal montre des signes d’agitation ou d’apathie. Les manipulations se feront sous supervision systématique par des formateurs habilités niveau applicateur ou concepteur. Une grille de surveillance des animaux, des points limites et des actions associées ont été pré-définis. Ces actions seront mises en place en cas d'atteinte d'un point limite.
Choix des espèces
La souris et le rat sont les deux espèces les plus couramment utilisées dans la recherche biomédicale en neurosciences et en physiologie comportementale. Ils présentent des comportements facilement observables et interprétables, une morphologie adaptée à l’apprentissage des techniques de contention et d’injection, et une grande familiarité pour les expérimentateurs en formation. • Souris : leur tempérament généralement calme et leur robustesse en font un modèle adapté à l’acquisition des gestes techniques en dans le cadre d’un apprentissage progressif et contrôlé. • Rats : leur taille plus importante permet aux apprenants de visualiser plus aisément l’anatomie externe et d’acquérir la précision des gestes dans la contention et l’injection. La combinaison des deux espèces contribue à une formation complète et représentative des pratiques expérimentales sur animaux vivants, en particulier en neurosciences. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte jeune à adulte (1,5 – 4 mois selon disponibilité) : les animaux adultes présentent une stabilité comportementale, un poids constant, et une résistance physiologique permettant un apprentissage sécurisé des techniques de contention et d’injection, sans fragiliser l’animal. Aucun animal néonatal, juvénile ou âgé fragile ne sera utilisé dans ce projet.
Nouvelles stratégies d’évaluation des effets de substances phytosanitaires sur le système nerveux, le microbiote et le comportement chez les rats femelles et leur descendance
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des rates gestantes reçoivent du glyphosate dans une gaufrette pendant la gestation et la lactation, subissent jusqu'à quatre frottis vaginaux et sont isolées physiquement trois semaines durant. 875 rats vont être utilisés, 810 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 65 un niveau modéré, dont 30 femelles rendues réceptives par trois injections hormonales pour servir de stimulus sexuel. Le porteur écrit que cette administration "ne provoque aucune nuisance", et justifie l'effectif par la critique que l'industrie et les agences de réglementation adressent aux études toxicologiques à faibles effectifs, concluant qu'il sera "nécessaire" d'utiliser ce nombre. 845 animaux sont tués pour prélever cerveau, sang et intestins, les 30 femelles stimuli passant à d'autres procédures.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont doubles. 1) Mieux comprendre l’impact de l'herbicide le plus couramment utilisé, c'est à dire le glyphosate, sur le cerveau et sur le comportement et 2) mettre en évidence l’importance d'étudier des caractéristiques physiologiques considérées comme périphériques (en dehors du cerveau) pour comprendre comment des polluants environnementaux, y compris des produits phytosanitaires tels que le glyphosate, peuvent impacter en final le cerveau. Ainsi, au cours de ce projet de recherche, nous mettrons en évidence des mécanismes physiologiques qui peuvent être utilisés comme marqueurs d’exposition chimique en neurotoxicologie. Le nombre de marqueurs biologiques actuels utilisés pour la réglementation de substances environnementales affectant le cerveau est relativement restreint et les approches actuelles se focalisent majoritairement sur un impact direct des molécules chimiques sur le système nerveux, soit en affectant les neurones soit en affectant les cellules qui assurent leur fonctionnement, c’est-à-dire les cellules gliales. Cependant, les travaux plus récents en neuroscience mettent clairement en évidence que le système nerveux, dans un organisme vivant, est régulé par un ensemble de systèmes physiologiques, y compris le système endocrinien, le système immunitaire et le microbiote intestinal. En conséquence, nous proposons donc d’évaluer les effets d’un herbicide, le glyphosate, seul comme molécule pure ou sous formulation commerciale (phytosanitaire), sur le cerveau et sur certains comportements d'interaction sociale en utilisant le modèle rat. Nous suggérons que le glyphosate impactera le cerveau en altérant le microbiote intestinal, ce qui aura des conséquences sur le système immunitaire et sur le système endocrinien pour finalement affecter le cerveau et les comportements. Tous ces paramètres seront analysés au cours de ce protocole expérimental. Il est important de noter que tous les mécanismes biologiques investigués dans le cadre de ce projet sont extrêmement bien conservés et les connaissances acquises ici dans un modèle rat permettront une réévaluation des effets des phytosanitaires potentiels chez les vertébrés de la faune sauvage, des animaux d’élevage ainsi que chez les humains.
Bénéfices attendus
Les approches classiques en neurotoxicologie sont à l’heure actuelle trop restrictives et ne prennent pas en compte la complexité du fonctionnement du système nerveux, qui implique une interaction forte avec les systèmes périphériques, tels que le système endocrinien, le système immunitaire et le microbiote intestinal et les conséquences sur le comportement. Notre projet repose sur le développement d’une démarche globale d’investigation de l’impact de substances phytosanitaires en combinant une approche physiologique globale afin d’évaluer les effets de substances phytosanitaires sur le système nerveux et le comportement. Ce protocole que nous mettons en place ici permettra de définir de nouvelles stratégies pour évaluer un impact de substances phytosanitaires sur les interactions sociales, fondamentales en santé humaine, pour le bien-être animal en milieu d’élevage et pour la survie et la reproduction des vertébrés de la faune sauvage. De plus, nous nous attacherons à définir l'impact du glyphosate, seul ou sous formulation, sur le développement du système neuroendocrinien d’une part et le microbiote intestinale d’autre part. Les données collectées aideront dans une certaine mesure à mieux définir les stratégies de réglementation que la France, et l’Union Européenne, doivent prendre concernant l’utilisation de ce composé. Le nombre élevé d’individus par groupe est requis pour obtenir une puissance statistique suffisante dans le cadre des tests réglementaires, plus particulièrement en lien avec les tests comportementaux. A noter également que ce nombre élevé permettra de réaliser des tests statisques corrélatif pour mieux comprendre la sensibilité individuelle aux expositions chimiques.
Procédures
- 65 mères: Frottis vaginaux pour définir le cycle des femelles et la fécondation potentielle. Chaque femelle ne devrait pas subir plus de 4 frottis vaginaux. Durant la gestation (entre 18 et 21 jours), les femelles gestantes serons isolées physiquement (mais pas au niveau olfactif, visual ni auditif) afin d'assurant l'absence d'un effet de dominance et la bonne administration du composé via les biscuits. L'exposition des mères durant la gestation et la lactation au glyphosate, seul ou sous formulation commerciale via une gauffrette (voie orale, alimentation). Bien qu'il s'agisse d'une procédure d'exposition, cette administration ne provoque aucune nuisance. - 30 femelles: Induction de la réceptivité chez les femelles stimuli pour les comportements sexuels : 3 injections (48, 24 et 6 heures avant le comportement) - 100 femelles de la descendance: Frottis vaginaux pour définir le cycle des femelles afin de réaliser les tests d'interaction sexuelle au bon moment (si réaliser en dehor de la période fertile, ces tests induisent un stress chez la femelle qui n'est pas réceptive
Impact sur les animaux
Nos premiers résutlats, publiés sur les mères et en cours de rédaction sur la descendance mâle et femelle, se sont attachés à définir l'impact du glyphosate seul ou sous une formulation commerciale sur le comportement, la neuroplasticité et le microbiote intestinal, et ce à des doses supérieures à celles que nous utiliserons dans ce projet. Bien que de très nombreux paramètres physiologiques aient été affectés par le traitement, nous n'avons pas observé de douleur ni d'inconfort sur aucun de nos animaux. Il est possible que les animaux qui seront injectés par des solutions hormonales pourront ressentir une légère douleur ou inconfort et que les frottis vaginaux pour déterminer le cycle et la fécondation chez les femelles pourront induire une gêne. Les volumes d'injection sont réduits au minimum pour limiter cette douleur.
Devenir
Pour tous les animaux expérimentaux (845), nous avons besoin des différents tissus (cerveau, sang, intestin) afin de définir l'impact du glyphosate sur la physiologie. Seules des méthodes histologiques à l'heure actuelle permette de comprendre les mécanismes d'action de molécules sur le cerveau. De très nombreux aspects physiologiques seront analysés: Nous analyserons la présence potentielle du glyphosate dans différents tissus, notamment le cerveau, les intestins et le foie. Il n'existe à l'heure actuelle aucune indication de la présence de cette molécule dans les tissus après ingestion de glyphosate. Nous analyserons l'expression de plusieurs marqueurs de fonctionnement neuronaux dans de nombreuses régions du cerveau, ces différentes régions sont impliquées dans divers aspects des comportements que nous aurons étudiés au préalable. Nous analyserons également des marqueurs d'autres types cellulaires dans le cerveau, c'est à dire les cellules gliales. - Nous analyserons de nombreux marqueurs sanguins, indicateurs du fonctionnement du système immunitaire (cytokines), du fonctionnement du système endocrinien (Estrogènes et Androgènes) et du métabolisme du microbiote intestinal. Dans les intestins, en plus des fèces qui ont été collectées tout au cours de l'expérience, nous analyserons le microbiote intestinal. Les 30 animaux stimuli seront réutilisés dans des procédures ultérieures.
Remplacement
Seules des techniques utilisant l’animal vivant peuvent nous permettre de répondre à nos questions puisque notre intérêt se porte sur des interactions mères-foetus complexes et sur des effets de traitements agissant sur des circuits neuronaux complexes, aboutissant à des modulations potentielles de comportements d’interaction sociale. Il est à noter que des analyses préliminaires ont été intialement réalisées sur cultures cellulaires. Les analyses physiologiques ne peuvent être réalisées en culture cellulaire et les modèles de rongeurs sont à l’heure actuelle les meilleures alternatives pour développer ce projet. Ainsi, ce travail nous permettra de mieux définir une cible potentielle de molécules phytosanitaire en investiguant le système immunitaire, le système endocriniens (stéroïdes) et le système nerveux central ainsi que leur interelation dans le contrôle de comportements socio-sexuels. Le but de ce travail est de définir de nouvelles stratégies pour évaluer un impact de substances chimiques sur les interactions sociales, fondamentales en santé humaine, pour le bien-être animal en milieu d’élevage et pour la survie et la reproduction des vertébrés de la faune sauvage, ce qui permettra ainsi de mieux cibler à l'avenir les paramètres à évaluer
Réduction
Historiquement, une moyenne de 10-20 individus par groupe a été utilisée dans des tests comportementaux similaires afin de s’assurer une puissance statistique et un effet de taille suffisants pour déterminer les effets soit thérapeutique, soit toxicologique, sur le cerveau et surtout sur le comportement. La raison de ce nombre relativement élevé est la variabilité interindividuelle relativement élevée dans le cadre de résultats comportementaux. Nous avons donc le nombre de mères limité à 10 par groupe. Dans le cas de la descendance, les deux sexes seront analysés séparément afin de mettre en évidence les effets potentiels des différences sexuelles sur les résultats comportementaux et neurobiologiques. Il est à noter que certaines études comportementales sur le rat ont été réalisées avec un nombre d’animaux légèrement inférieur mais le faible nombre d’animaux dans diverses études toxicologiques est une critique majeure levée par l’industrie et par les agences de réglementation au niveau national et au niveau européens (empêchant donc la mise en place de réglementations potentielles). Afin de nous prémunir de ce biais potentiel, il sera donc nécessaire d’utiliser ce nombre d’animaux.
Raffinement
L’administration du glyphosate sous forme active ou sous formulation (ou du véhicule) se fera par voie orale à l’aide d’un biscuit fourré, préalablement injecté avec des doses non toxiques du composé ou du véhicule afin d’éviter tout stress provoqué sur des femelles gestantes ou allaitantes. Les tests comportementaux qui seront utilisés sont des paradigmes largement utilisés pour tester les comportements reproducteurs et sociaux chez les rats et que nous maitrisons dans le laboratoire depuis plus de 10 ans. Un grand nombre de ces observations comportementales seront réalisées directement dans la cage d'hébergement via un système de caméra afin de limiter le stress de changement de cage des animaux. Par ailleurs, les animaux seront manipulés journalièrement afin que les rats s'habituent à l'expérimentateur avant le début des traitements et des tests. Aucune chirurgie ou prélèvement ne sera effectué sur animal vivant au sein du laboratoire. Le protocole prévoit un mécanisme de surveillance continue intégrant des seuils d’intervention prédéterminés, déclenchant la mise en œuvre progressive de mesures correctives ou l’arrêt des procédures si la santé ou le bien-être de l’animal se dégradent au-delà de niveaux acceptables, conformément aux bonnes pratiques reconnues. Ces seuils sont intégrés dans un schéma décisionnel, garantissant une réaction rapide et adaptée à chaque situation observée.
Choix des espèces
Le Rat Sprague-Dawley, non consanguin et non transgénique, est le modèle historique utilisé au sein de notre laboratoire, mais aussi dans de nombreux autres laboratoires s’intéressant aux effets de très nombreuses molécules, y compris des pesticides en toxicologie, et également aux interactions sociales et sexuelles. Ainsi, l’utilisation de cette espèce, et de cette souche en particulier, nous permettra de comparer les résultats obtenus avec des données préexistantes au sein de notre laboratoire mais également celles publiées dans la littérature. Par ailleurs le catalogue de comportements de ces animaux et la neuroanatomie associée sont bien décrits dans la littérature. Nous avons choisi plusieurs stades de développement pour ces analyses, c'est à dire pendant la gestation, à la naissance, pendant la lactation, au stade juvénile et à l'ge adulte. Chacun de ces stades sont choisis pour définir s'il existe une période sensible d'exposition au pesticide et si oui, définir si l'exposition précoce au glyphosate va induire des modifications du comportement et des paramètres physiologiques à moyen (juvénile) ou à long terme (adulte).
Etude cinétique et comportementale de l’exposition à différents sels de lithium chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Gavés une à quatorze fois, opérés vingt minutes pour la pose d'un cathéter porté soixante-douze heures, puis saignés neuf fois en vingt-quatre heures alors qu'ils sont éveillés, 118 rats reçoivent différents sels de lithium dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 76 d'entre eux et sévère pour 42. Certains sont isolés quatre fois vingt-quatre heures en cage métabolique, d'autres enfermés huit heures dans un cylindre de plexiglas pour permettre les prélèvements. Une partie passe des tests d'activité locomotrice d'une heure et demie et des tests d'exploration et d'anxiété de cinq minutes, répétés deux jours de suite à trois reprises. Tous sont tués au terme du protocole, par perfusion intracardiaque pour certains, ou plus tôt s'ils atteignent un point limite, leurs organes servant aux analyses de distribution du lithium et de toxicité rénale.
Objectifs
Le lithium est aujourd’hui l’un des traitements les plus efficaces pour stabiliser l’humeur chez les personnes atteintes de trouble bipolaire. Le lithium existe sous plusieurs formes chimiques et permet de réduire le risque de rechute. Cependant, son utilisation doit être très bien contrôlée, car la dose efficace est proche de la dose toxique. Cela peut entraîner des effets secondaires importants, notamment au niveau des reins et du cerveau. Des études d’imagerie réalisées chez l’être humain ont montré que le lithium ne se répartit pas de la même façon dans toutes les zones du cerveau, et que cette répartition varie d’une personne à l’autre. Cela remet en question l’idée selon laquelle le lithium se diffuserait uniformément dans le cerveau. Ces résultats amènent à se demander si différents sels de lithium pourraient se comporter différemment dans le corps et le cerveau. Parmi eux, l’orotate de lithium (LiOr) est une forme encore peu étudiée. Certaines données en laboratoire suggèrent qu’il pourrait être mieux absorbé et mieux atteindre le cerveau. Si cela se confirme, il pourrait être possible d’utiliser des doses plus faibles tout en limitant les effets secondaires, notamment ceux qui touchent les reins. Dans ce contexte, le but de ce projet est d’étudier comment différents sels de lithium se comportent dans le sang, comment ils se répartissent dans le cerveau, quelle est leur efficacité et quels risques ils présentent pour les reins. Ces tests seront d’abord réalisés chez le rat après une seule dose de chaque forme de lithium administrée par voie orale. Par la suite, les mêmes analyses seront faites après 14 jours d’administration continue. L’objectif final est de mieux comprendre pourquoi certaines personnes répondent mieux que d’autres au lithium, et d’identifier des formes de lithium plus efficaces et mieux tolérées.
Bénéfices attendus
Cette étude constituera une première étape pour vérifier, avant les essais chez l’Homme, si l’orotate de lithium permet au lithium de mieux atteindre le cerveau et d’être plus efficace. Si ces résultats se confirment, cela pourrait, à long terme, permettre d’utiliser des doses plus faibles de lithium. Des doses réduites seraient potentiellement mieux tolérées et pourraient diminuer les effets secondaires, améliorant ainsi le confort et la sécurité des patients sous traitement.
Procédures
L’ensemble des animaux subiront entre 1 et 14 gavages (durée < 30 secondes). L’anesthésie et l’analgésie seront réalisées par injection intrapéritonéale et sous-cutanée respectivement (moins d’une minute chacune 1 à 2 fois maximum). Certains animaux subiront un isolement 4 fois 24 h. Une partie des animaux subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie liquide profonde (15 mins). Une autre partie des animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie liquide (20 mins) + port d’un cathéter (72h) + prélèvements de sang sur animaux vigiles (9 prélèvements ; 30 secondes/ prélèvement sur 24h). Une autre partie des animaux sera soumise à une série de 2 tests comportementaux, répartis sur 2 jours successifs. Les tests incluent l’évaluation de l’activité locomotrice (1h30), de l’exploration et de l’anxiété (5 min) (2 jours consécutifs de tests réalisés 3 fois).
Impact sur les animaux
Stress de courte durée lors des injections, gavage et prélèvements sanguins. Stress induit par l’hébergement individuel du rat pendant 24 heures. Isolement du rat dans un cylindre de plexiglas pendant 8h pour réaliser les prélèvements sanguins.
Devenir
Les rats seront mis à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem ou suite à l'atteinte d'un point limite requérant la mise à mort des animaux.
Remplacement
Des premières expériences réalisées en laboratoire, sur des cellules, ont montré que les différentes formes de lithium n’entrent pas dans les cellules à la même vitesse ni de la même manière. Pour vérifier ces observations, il est essentiel de réaliser des tests chez l’animal. Cela permettra de mieux comprendre comment le lithium circule dans l’organisme après avoir été ingéré, et de voir si ces différences ont un impact réel sur le comportement, la distribution dans l'organisme et l’apparition éventuelle d’effets secondaires, notamment au niveau des reins.
Réduction
Les effectifs ont été determinés comme nécessitant 6 à 10 rats par groupe à l’aide de tests statistiques permettant une analyse des résultats obtenus adaptée. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, les procédures seront réalisées de manière séquentielle. Ainsi, l’étude pharmacocinétique ainsi que l’étude comportementale n’auront lieu que si une différence d’exposition significative au niveau sanguin et/ou cérébrale est observée entre les différents sels de lithium.
Raffinement
L’ensemble des procédures sont réalisés par un personnel compétent. Pour améliorer leur bien-être, les animaux sont hébergés en groupes sociaux dans des cages contenant de l’enrichissement. La surveillance quotidienne des animaux sera assurée par un personnel qualifié, et des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés, tout en veillant à ne pas perturber le déroulement de l'expérience. En cas de besoin, des procédures réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées. Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période périopératoire. De plus, une ouate en silicone sera utilisée après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement. Par ailleurs, lors de la mise en cage métabolique pour 24h des rats, des tunnels en polycarbonate et/ou des batons à ronger seront ajoutés à ces cages pour enrichissement en vue de réduire le stress induit par l’isolement.
Choix des espèces
Le rongeur, et plus spécifiquement le rat, est le modèle de choix dans le domaine de la toxicité rénale, notamment du fait de sa physiologie qui est très proche de la physiologie humaine. De plus, son métabolisme est très semblable à celui de l’Homme, ce qui facilitera les études pharmacocinétiques. Des rats âgés de 7 à 9 semaines seront utilisés dans le but de pouvoir faire l’analogie avec les expériences déjà faites au sein du laboratoire et les articles publiés dans la littérature, puisqu’il s’agit de la période à laquelle est le plus souvent diagnostiquée le trouble bipolaire et donc initiés les traitements.
Rôle d’un médiateur de l’inflammation dans la physiopathologie de la dermatite atopique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune maintenue à la main pour l'application du produit jusqu'à quarante fois de suite dans le protocole chronique, douze fois dans le protocole aigu. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Les oreilles sont rasées sous anesthésie au premier jour, puis une substance y est appliquée pour déclencher une dermatite atopique, ce qui provoque des démangeaisons et un comportement de grattage, avant un prélèvement sanguin terminal et la mise à mort. Le porteur espère que l'oncostatine M deviendra une cible pour de futures biothérapies, en reconnaissant que son implication directe dans la maladie n'a jamais été démontrée dans un organisme vivant.
Objectifs
La dermatite atopique est une maladie inflammatoire chronique de la peau fréquente en Europe, touchant aussi bien les enfants que les adultes. Elle se caractérise par une inflammation persistante de la peau et une altération de sa fonction de barrière naturelle qui nous protège de la pénétration des micro-organismes pathogènes. Cette maladie pose un problème de santé publique car il n’existe pas vraiment de solution pour la guérir. Les personnes atteintes par cette maladie produisent une molécule inflammatoire appelée oncostatine M dont on soupçonne le rôle délétère sur le système immunitaire et son implication dans le développement de cette maladie. Ce projet a donc pour objectif d’étudier le rôle de l’oncostatine M dans le développement et le maintien de l’inflammation de la peau. Bien que l’oncostatine M soit présente dans les lésions de dermatite atopique chez l’être humain, son implication directe dans cette maladie n’a jamais été démontrée dans un organisme vivant. Pour cela, le projet utilisera un modèle de dermatite atopique chez la souris afin de comparer l’évolution de la maladie chez des animaux produisant l’oncostatine M et chez des animaux génétiquement modifiés qui ne produisent pas cette molécule.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude nous permettront de faire progresser les connaissances sur le rôle de l’oncostatine M dans le développement de la dermatite atopique. A plus long terme, s’il s’avère que l’oncostatine M joue un rôle important dans le développement et/ou le caractère chronique de la maladie, celle-ci pourrait constituer une nouvelle cible pour le développement de biothérapies visant à bloquer les effets de cette molécule proinflammatoire, telles que le développement d'anticorps bloquants ciblant l'oncostatine M. Dans un contexte où le nombre de biothérapies pour le traitement de la dermatite atopique est actuellement limité et où certains patients peuvent être non-répondeurs ou développer des résistances à ces traitements, il est nécessaire de pouvoir identifier de nouvelles cibles pour développer ces nouveaux outils thérapeutiques.
Procédures
Pour tous les animaux inclus dans cette étude, une anesthésie sera pratiquée, une seule fois, le premier jour afin de pouvoir immobiliser l’animal pendant le temps de rasage des oreilles (pendant 10 secondes) à l’aide d’une tondeuse puis d’appliquer localement le traitement sur la peau pour induire la dermatite atopique (pendant 10 secondes) et mesurer l’épaisseur de la peau de manière non-invasive (10 secondes par oreille). Les jours suivants, les traitements et mesures seront effectuées sur animal vigile pour éviter les anesthésies répétées. Tous les animaux inclus dans cette étude seront donc brièvement maintenus par l’expérimentateur afin de permettre l’application locale du traitement sur la peau pour induire la dermatite atopique et mesurer l’épaisseur de la peau de manière non-invasive pendant une durée maximale de 20 secondes. Cette contention manuelle de courte durée peut entraîner un stress léger et transitoire. Elle sera répétée 12 fois pour les animaux qui sont inclus dans le protocole d’induction aigue, à court terme, et répétée 40 fois pour les autres animaux qui sont inclus dans le protocole d’induction chronique, à long terme. En fin de protocole, une analgésie et une anesthésie profonde seront réalisées pour effectuer un prélèvement sanguin terminal d’une durée de 30 secondes au maximum et la mise à mort des animaux en vue de collecter les échantillons biologiques.
Impact sur les animaux
Au début du protocole, l'induction d'une anesthésie et le réveil après anesthésie provoquent un stress léger et transitoire des animaux. L’injection pour induire l’analgésie et l'anesthésie à la fin du protocole crée une douleur légère et transitoire. Les protocoles d'induction d'une dermatite atopique aigue et chronique provoquent un prurit susceptible d'occasionner un comportement de grattage des animaux.
Devenir
Tous les animaux inclus dans le projet seront mis à mort de manière à collecter les différents échantillons biologiques (sang, peau de l'oreille) pour effectuer des analyses moléculaires et des analyses de tissus par microscopie.
Remplacement
Des études précédentes ont été réalisées in vitro pour décrire les propriétés de l'oncostatine M dans différents modèles de culture de cellules cutanées d’origine humaine et murine, développés sous la forme de peaux reconstruites. Cependant, il est nécessaire d’effectuer des expériences in vivo chez l’animal afin d’étudier la contribution de cette molécule à l’inflammation cutanée dans un système complexe où de nombreuses cellules immunitaires activées infiltrent la peau et où de nombreux médiateurs de l’inflammation y sont sécrétés. Il n’existe pas encore de modèle in silico pour mimer ces interactions complexes.
Réduction
A partir des données de la littérature scientifique, nous avons pu calculer un effectif de souris minimum nécessaire pour assurer une validation statistique de l’étude, à l’aide d'une formule mathématique appropriée. Une stratégie par étapes sera également appliquée permettant de réduire potentiellement de moitié le nombre d'animaux utilisés. De plus, au sein de l'animalerie, des accouplements de souris seront effectués à la demande, et non en continu, de manière à limiter le nombre d'animaux produits.
Raffinement
Afin de satisfaire les besoins comportementaux des souris, celles-ci seront maintenues en groupes de 3 à 4 individus par cage ventilée. Leur milieu sera enrichi de structures adaptées répondant à leur besoin naturel de ronger (buchettes de peuplier) et leur permettant de se cacher (nid). Afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés, avec contrôle de la température par tapis chauffant, lors de certaines phases d’expérimentation. Des points limites gradés, précis et adaptés sont listés dans une grille et feront l’objet d'une surveillance quotidienne des animaux. Une prise en charge par un traitement antalgique sera mise en oeuvre précocement en cas de besoin.
Choix des espèces
Le protocole que nous utilisons chez la souris est reconnu pour reproduire de nombreuses caractéristiques cliniques de la pathologie humaine (rougeur, épaississement cutané, desquamation, prurit), histologiques (épaississement de l’épiderme, présence anormale de cellules immunes dans le derme) et ses mécanismes moléculaires et cellulaires. Par ailleurs, le système immuno-inflammatoire de la souris est décrit et étudié depuis des décennies et autorise des comparaisons avec le système immuno-inflammatoire humain. Les modèles murins, bien que pouvant présenter certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier la réponse immuno-inflammatoire de la peau et évitent d’avoir recours à des espèces animales plus proches de l'Homme. Les animaux seront inclus dans le projet à partir de l’âge de 8 semaines, lorsque leur système immuno-inflammatoire est bien développé.
Développement de nouveaux traitements pour prévenir un cancer du sang (leucémie myéloïde aiguë) MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Cancers
La mise à mort intervient dès l'apparition d'une paralysie des pattes arrière ou d'une chute des plaquettes. 652 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Greffées de cellules leucémiques par la veine de la queue, elles subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires dans la joue et reçoivent jusqu'à deux administrations quotidiennes de médicaments par gavage, par la veine ou dans le ventre, tous ces gestes étant faits sans anesthésie pendant quatre à douze semaines. Le porteur annonce que la greffe fera développer aux souris une perte de poids et une paralysie des membres postérieurs, tout en écrivant que les traitements ne causent pas de problèmes importants.
Objectifs
Notre projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité de divers médicaments déjà existants, administrés seuls ou en combinaison, sur des souris atteintes de leucémie myéloïde aiguë, un type de cancer du sang, afin d’explorer de nouvelles associations thérapeutiques. L'objectif est de voir comment ces traitements peuvent aider à combattre la maladie chez ces modèles de souris, ce qui pourrait éventuellement nous aider à mieux comprendre leur impact sur les patients humains.
Bénéfices attendus
L’utilisation de modèles souris pour étudier et tenter de guérir la leucémie myéloïde aiguë (LMA), un type de cancer du sang, afin de tester des traitements, offre plusieurs avantages. Elle permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie, d'évaluer l'efficacité des traitements, d'optimiser les doses et les schémas thérapeutiques, d'étudier les résistances aux traitements et de réduire les risques pour les patients. Ces modèles de souris constituent une étape cruciale pour sélectionner et affiner les stratégies thérapeutiques avant leur mise en application clinique, ce qui contribue à accélérer le développement de traitements plus efficaces contre la leucémie myéloïde aiguë.
Procédures
Les souris recevront une injection de cellules malades dans la veine de la queue (sans anesthésie; durée: 1 min), suivie de prélèvements sanguins hebdomadaires pendant 4 semaines pour certaines et 12 semaines pour d’autres (prélèvement dans la veine de la joue; durée: 1 min sans anesthésie). Elles seront ensuite traitées avec cinq médicaments différents, administrés une ou deux fois par jour (tous les deux jours pendant 4 ou 12 semaines selon le médicament), selon le protocole (chaque groupe de souris recevra un médicament parmi ces cinq et parfois une combinaison de deux médicaments). Les traitements seront délivrés dans la veine de la queue (sans anesthésie, durée: 1 min), par gavage (à l'aide du sonde métallique de taille adaptée à la souris, sans anesthésie; durée: 1 min) ou par injection dans le ventre (sans anesthésie; durée: 30 secondes). À la fin de l'étude, les souris seront euthanasiées, et leurs organes seront prélevés pour des analyses approfondies.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, des souris sont greffées avec des cellules leucémiques, ce qui leur fera développer des symptômes comme la perte de poids et la paralysie des pattes arrières quelques semaines ( 4 semaines pour les souris non traitées et jusqu’à 12 semaines si avec traitements) après la greffe. Les traitements ne causent pas de problèmes importants, mais les méthodes d'administration, comme les injections ou le gavage, peuvent provoquer de légers effets secondaires, comme des blessures légères au site d'injection ou des saignements. Les souris peuvent aussi ressentir un inconfort temporaire lors des injections ou des prélèvements sanguins.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées dès l’apparition des signes de la paralysie des membres inférieurs ou si elles présentent une quantité faible de plaquettes pour éviter leur souffrance. L’euthanasie des animaux en fin d’expérience est nécessaire afin de récupérer leurs organes en post-mortem pour effectuer des analyses.
Remplacement
Pour réaliser notre projet, l’utilisation d’animaux vivants est nécessaire, car c’est uniquement dans un organisme vivant que l’on peut observer les interactions complexes entre les cellules tumorales, le système immunitaire et les autres éléments du corps. Ces interactions sont cruciales pour tester de façon précise l’efficacité des traitements, en tenant compte de leur distribution dans l’organisme, de leurs effets secondaires et de l’évolution de la maladie au fil du temps.
Réduction
Pour déterminer combien de souris sont nécessaires dans chaque groupe de l’étude, nous avons utilisé un test statistique, qui est une méthode mathématique permettant de vérifier si les différences observées entre les traitements sont significatives. Dans cette étude, certains groupes de souris ne recevront pas de traitement, ce sont les groupes témoins. Ces groupes sont composés des mêmes souris (même fond génétique) que celles des groupes expérimentaux, ce qui permet de les comparer plus facilement. En testant plusieurs traitements en même temps, on peut utiliser un seul groupe témoin pour plusieurs expériences, ce qui permet de réduire le nombre de souris. Les expériences seront menées de manière très similaire pour réduire les différences entre les groupes et ainsi obtenir des résultats fiables.
Raffinement
En plus de la surveillance quotidienne, qui permettra de détecter rapidement toute anomalie liée au geste technique de la greffe, un suivi clinique hebdomadaire sera réalisé. Pour cela, l'analyse sanguine permettra aussi de vérifier le taux de plaquettes, une baisse progressive étant associée avec l'apparition la maladie. En dessous d'une certaine valeur, de la nourriture sera ajoutée dans la cage et lorsque cette faible valeur est associée à d'autres signes cliniques (affaiblissement avec paralysie des pattes arrières), la souris sera immédiatement euthanasiée. L'évaluation clinique prendra également en compte le comportement des souris et leur poids. L'ensemble des paramètres permettra de mettre en place rapidement des actions adaptées. Un enrichissement des cages sera également fait (buchette en bois à ronger, papier pour faire un nid/cachette).
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à identifier le traitement qui sera le plus efficace et le plus adapté pour être transféré et testé en clinique chez l’homme. Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’au moins 6 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.
Etude de l’effet anti-ostéoporose de nouvelles molécules d’intérêt thérapeutique chez la souris (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
154 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une opération de vingt minutes reproduisant la perte osseuse post-ménopausique, puis une injection tous les deux jours pendant huit à seize semaines, jusqu'à trois prélèvements sanguins et deux séances d'imagerie, avec des allers-retours en voiture entre les deux établissements. Ce volet est le second d'un projet déclaré en deux parties, chacune portant sur 154 souris et sur la même famille de molécules mise au point par l'équipe. Le porteur écrit qu'à sa connaissance il n'existe "pas d'alternative non animale efficace", que les modèles d'organes isolés ne fourniraient pas de réponse pertinente et que les données disponibles restent "trop minimalistes" pour une modélisation numérique.
Objectifs
L’ostéoporose est une problématique de santé publique. Cette maladie touche près de 40% des femmes de plus de 65 ans dans le monde. Elle se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures. Il y a donc un important impact pour la société en raison des hospitalisations et médicaments nécessaires à ces patientes. Dans le cadre du développement de traitements contre l’ostéoporose nous avons développé une famille de molécules agissant à la fois sur les symptômes directs de l’ostéoporose mais également sur les phénomènes inflammatoires associés. L’objectif de ce projet est donc de consolider les données déjà disponibles sur l’effet biologique de ces molécules, en étudiant la qualité osseuse dans un modèle d’ostéoporose induit chez la souris. Ce modèle permet de récapituler les changements majeurs intervenant sur l’os dans le cadre de la ménopause. Ce travail permettra donc, à terme, de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre l’ostéoporose. Le projet sera réalisé sur deux sites, l’EU1 pour la chirurgie et l’EU2 pour l’imagerie.
Bénéfices attendus
L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens médicamenteux et non médicamenteux (prise de calcium, une activité physique). Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments qui bloquent la dégradation de l'os, limitant ainsi la perte osseuse, mais cette approche thérapeutique ne permet pas de regagner la densité osseuse perdue car elle bloque également la formation de nouveaux tissus osseux. Par ailleurs de nombreux effets secondaires sont associés aux différents types de traitements : douleurs, troubles digestifs, risque de nécrose des os de la mâchoire. L’approche proposée vise à l’obtention d’une efficacité similaire à celle de ces molécules via des modes d’actions différents, laissant présager de ne pas reproduire leurs effets secondaires principaux, favorisant la prise en charge des patientes souffrant d’ostéoporose post-ménopause.
Procédures
Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 20 min au sein du premier établissement utilisateur sous anesthésie générale, puis des injections tous les 2 jours pendant 16 semaines au maximum sur animaux vigiles, sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale. Les animaux subiront également un maximum de trois prélèvements sanguins, sous anesthésie générale, le premier en pré-opératoire, le second à 4 semaines post-opératoires et le troisième à 8 semaines post-opératoires. Ils seront également soumis au maximum à deux séances d’imagerie de 15 min, sous anesthésie générale, au sein du second établissement utilisateur.
Impact sur les animaux
Toute approche chirurgicale implique un risque. Une mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie de 10% est le maximum acceptable au-delà duquel la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée en post-opératoire, est attendue dans les premiers jours, avant une reprise de poids classique ensuite. A notre connaissance, aucun autre effet indésirable n’est attendu.
Devenir
A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser un prélèvement sanguin, puis de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner à haute résolution et analyses histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace pour étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme. Les modèles d’étude mimétiques d’organes isolés ne peuvent pas, à notre connaissance, fournir une réponse pertinente. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place du recrutement des cellules qui résorbent l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse
Réduction
Des méthodes de réduction (analyse à mi-parcours avec dispositif d’arrêt de l’expérience (GO/NO GO)) selon les résultats de projections statistiques) seront appliquées. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Nous proposons donc d’effectuer une première série de 5 animaux par groupe, avec une analyse statistique intermédiaire permettant de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir une puissance statistique satisfaisante dans la limite de 10 animaux par groupe. Des tests statistiques adaptés à nos effectifs seront utilisés
Raffinement
Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de quarantaine d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton...) permettant aux animaux d'améliorer leur milieu. A chaque intervention les animaux seront anesthésiés si nécessaire afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’approche chirurgicale, une douleur post-opératoire sera anticipée avec l’injection préventive et curative d’antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les trois jours suivants la chirurgie et dès les premiers signes d’inconfort détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours lors des injections de façon à contrôler l'absence de points limites tout au long de l'étude. Les molécules choisies seront injectées sur animaux vigiles sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale (afin de réduire le stress des animaux) tous les deux jours pendant 8 à 16 semaines. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Des points limites ont été mis en place afin de suivre le bien-être animal tout au long de la procédure. Les animaux seront finalement euthanasiés sous anesthésie gazeuse. Afin de réaliser les analyses par imagerie sur un site distant abritant la plateforme dédiée, les animaux seront transportés par véhicule personnel (8 km, environ 10 minutes) dans des cages de transport spécifiquement préparées, et remis dans des cages habituelles avec eau et nourriture à volonté dès leur arrivée. Le retour s’effectuera de la même manière.
Choix des espèces
La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures ont donné des résultats exploitables concernant les traitements dans ce champ d’application et dans d’autres. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure
Etudes des interactions entre les cellules nerveuses mutantes et le système immunitaire à l’aide de modèles murins génétiquement modifiés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
4 195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, certaines passant jusqu'à trente-sept jours seules en cage après une chirurgie et trois sessions de cinq jours consécutifs d'enregistrement cérébral en continu. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 471 d'entre elles, modéré pour 3 624 et sévère pour 100. Des femelles gestantes sont opérées quarante-cinq minutes pour qu'une injection soit faite dans le cerveau de chacun de leurs embryons, au risque d'un arrêt prématuré de la gestation, et les souris porteuses de la mutation développent des crises d'épilepsie dès l'âge de vingt jours. Le porteur attend de ce travail des cibles d'immunothérapie contre les gliomes, hypothèse formulée au conditionnel, quand l'implant crânien, l'isolement social et les crises convulsives sont, eux, programmés.
Objectifs
Les gliomes sont les tumeurs cérébrales les plus fréquentes et les plus agressives. Les traitements actuels n’ont qu’un effet limité sur la survie des patients, et ces tumeurs sont souvent résistantes aux traitements, ce qui les rend rapidement mortelles. Il est donc urgent de trouver de nouvelles solutions pour les traiter. On retrouve peu de cellules immunitaires dans les gliomes, car les cellules tumorales et certaines cellules immunitaires créent un environnement qui empêche le système immunitaire de combattre la tumeur efficacement. Dans le cerveau, il existe des cellules spécialisées appelées microglies, qui jouent un rôle important dans le maintien de la santé du tissu cérébral. Cependant, leur rôle dans les gliomes n’est pas encore bien compris. Étudier comment les cellules tumorales et la microglie interagissent pourrait nous aider à trouver des moyens de stimuler le système immunitaire pour mieux lutter contre ces tumeurs. Nous étudions des gliomes avec une mutation particulière qui provoque de l’épilepsie et qui, contrairement aux autres gliomes, présente une forte présence de cellules immunitaires appelées lymphocytes. Dans ces tumeurs, les microglies sont également modifiées. Nous pensons que la communication entre les cellules tumorales et la microglie favorise le recrutement des lymphocytes, qui pourraient aider à combattre la tumeur. Précédemment, un modèle a été développé chez la souris pour étudier cette mutation et a montré qu’elle est nécessaire au développement des tumeurs et est responsable de l’épilepsie liée à ces tumeurs. Ce projet a pour but d’étudier l’effet des cellules mutées sur les cellules immunitaires (microglie) du cerveau en développement chez la souris. L’objectif est de suivre l’évolution de ces microglies au fil du temps et de comprendre comment elles interagissent avec les cellules mutées. Nous utiliserons des enregistrements de l’activité électrique du cerveau pour observer l’apparition de l’épilepsie liée à cette mutation et l’impact des changements dans les microglies.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre comment une mutation génétique spécifique affecte la microglie, modifie la communication entre la microglie et les cellules tumorales et comment elle influence la réponse immunitaire. Cela pourrait également permettre d’identifier comment ces changements dans la microglie pourraient être liés à l’épilepsie qui accompagne ces tumeurs. Nous analyserons également les profils génétiques des microglies afin de pouvoir les comparer avec ceux des patients atteints de gliomes avec cette même mutation d’intérêt. Cela nous aidera à comprendre comment ces changements se produisent au fil du temps et à identifier les mécanismes responsables de la modification des microglies et du recrutement des cellules immunitaires, appelées lymphocytes. Le projet fournira des informations cruciales sur l'évolution des réponses immunitaires et des cellules cérébrales dans le cadre de cette mutation génétique d’intérêt. Il permettra aussi de créer une base de données génétiques pour mieux comprendre l’infiltration des cellules immunitaires et aidera à concevoir des tests et des traitements pour l’avenir. En outre, les résultats offriront un aperçu du rôle des modifications du système immunitaire cérébral dans l’apparition de l’épilepsie liée à cette mutation. Ce projet pourrait aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour générer de nouveaux traitements d’immunothérapie et pourrait donc amener à améliorer les soins pour les patients atteints de gliomes.
Procédures
Pour obtenir nos animaux génétiquement modifiés d’intérêt, un petit prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur une partie des souriceaux produits pour connaitre leur patrimoine génétique. Cet acte se fera une seule fois sur animal vigile et durera moins de 1 minute par animal. Des femelles gestantes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (45minutes maximum) et analgésie adaptée afin de réaliser une injection intracérébrale dans le cerveau de chaque embryon. Une partie de ces femelles recevra 3 semaines après une injection quotidienne pendant 5 jours d’une molécule permettant de mettre en place notre modèle (vigile, durée inférieure à 1 minute par injection). Pour une autre partie des souris, une chirurgie sous anesthésie générale (1h maximum) et analgésie adaptée sera pratiquée afin de mettre un implant au niveau de leur tête permettant ensuite d’enregistrer l’activité électrique du cerveau. Cette activité sera enregistrée pendant 3 sessions de 5 jours consécutifs (24 heures sur 24), espacées de 5 jours minimum, sur les animaux vigiles via une connexion indolore et leur permettant de se déplacer librement. Tous les animaux ayant eu une chirurgie seront hébergés seuls au maximum 37 jours. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin des procédures.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux peut générer une légère et brève douleur et un léger stress chez l’animal. Il existe un risque de léger saignement. Les chirurgies génèreront un risque de douleurs post-opératoires. L’anesthésie générale nécessaire à leur réalisation entrainera un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire, et de difficultés cardio-respiratoires. La chirurgie sur les femelles gestantes impliquera également un risque d’arrêt prématuré de la gestation. Le dispositif implanté sur la tête des animaux pour enregistrer l’activité du cerveau impliquera une gêne pour l’animal. Tous les animaux qui auront eu une chirurgie seront ensuite hébergés individuellement, s’agissant d’animaux sociaux cela génèrera un stress. Les injections de la molécule permettant de mettre en place notre modèle génèreront un stress lié à la contention et une légère et brève douleur au point d’injection. Cette molécule peut parfois provoquer une perte de poids chez la souris. La mutation génétique de l’animal (modèle de la maladie étudiée) peut, après activation, générer des crises épileptiques à partir de l’âge de 20 jours.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés soit pour réaliser des prélèvements pour répondre à notre question scientifique soit parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
L’impact de la mutation d’intérêt sera étudié dans des cellules tumorales issues de patients et dans des modèles d’organoïdes créés à partir de cellules souches. Ces modèles nous permettront d'étudier l’interaction entre les cellules mutées et la microglie dans un environnement en trois dimensions qui ressemble davantage à celui du cerveau humain. Cependant, bien que ces modèles soient utiles pour étudier les mécanismes d’action de la mutation, ils ne peuvent pas reproduire toute la complexité du microenvironnement immunitaire du cerveau. De plus, ils ne permettent pas d’observer l’évolution temporelle, en particulier pendant le développement embryonnaire. C’est pourquoi il sera nécessaire d’utiliser un modèle animal pour étudier l’impact des cellules mutées sur la microglie dans un cerveau en développement. Ce modèle permettra d’observer les interactions complexes entre différents types de cellules sur une période de temps et dans un espace précis, ce qui n’est pas possible dans des cultures de cellules en laboratoire. De plus, pour étudier comment une mutation affecte le développement cérébral et la survenue de pathologies, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal, qui reflètera la complexité du cerveau en développement et des maladies qui y sont associées. Bien que les organoïdes soient proches du cerveau en termes de structure, ils ne permettent pas d’étudier comment la microglie se développe et interagit avec les autres cellules du cortex cérébral. Nos analyses exigent l’utilisation de modèles animaux, et dans le cadre de ce projet de souris génétiquement modifiées, car elles permettent d’étudier l’évolution des cellules mutées et leur impact sur la microglie dans un environnement en développement, ce qui ne peut pas être fait en laboratoire. Enfin, pour comprendre comment les changements du système immunitaire du cerveau influencent l’apparition de l’épilepsie, il est essentiel de mener cette étude dans un modèle vivant, donc chez la souris.
Réduction
Le nombre total d’animaux maximum utilisés dans ce projet sera de 4195. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte les lignées murines génétiquement modifiées nécessaires à l'étude et en réduisant au plus petit nombre le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables et valides. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée et optimiserons nos choix de croisement afin d’obtenir un maximum d’animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt, diminuant ainsi le nombre d’animaux produits et le nombre impacté par le prélèvement pour connaitre leur patrimoine génétique. Toutes les données obtenues seront analysées avec des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisées. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils seront observés quotidiennement et en cas d’anomalie un processus déclaratif à la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et au vétérinaire sera mis en place afin qu’ils apportent conseils et recommandations à l’équipe de recherche pour une prise en charge adaptée de l’animal. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide). Il sera de la plus petite taille possible et sera réalisé à l’aide de matériel propre et désinfecté entre chaque animal. Les animaux sont replacés rapidement avec leur mère après le geste afin de leur redonner un environnement réconfortant. Nous vérifierons l’absence de saignement et la bonne prise en charge par la mère immédiatement après le geste puis après environ 30 minutes. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et avec une prise en charge analgésique adaptée. Elles seront réalisées le matin afin de pouvoir observer les animaux sur la journée et administrer les médicaments nécessaires. La température des animaux sera maintenue tout au long de l’anesthésie (chambre d’induction et de réveil chauffées et tapis chauffant pendant la chirurgie). Le maintien de l’hydratation sera assuré également et un gel oculaire sera appliqué sur les yeux pour éviter toute sécheresse oculaire. Nous surveillerons le réveil des animaux et leur mettrons à disposition de l’eau sous forme gélifiée ainsi que de la nourriture dans le fond de la cage afin de favoriser leur récupération. Nous ajouterons également une maisonnette en carton en plus du nid en coton et du bâtonnet de bois mis en routine dans les cages afin d’améliorer leur bien-être, notamment pour les femelles gestantes et les animaux hébergés seuls. Après les chirurgies les animaux bénéficieront d’un suivi renforcé, ils seront ensuite examinés de manière spécifique une fois par jour minimum pendant deux jours minimum, et plus si nécessaire. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Le modèle murin nous permet un travail sur le génome car il est bien connu et nous possédons des outils moléculaires bien développés pour travailler sur le génome de cette espèce et le modifier. Ainsi, les lignées génétiquement modifiées d’intérêt pour ce projet n’existent que chez la souris. Enfin, les lignées choisies sont nécessaires pour l'étude des tumeurs malignes humaines et reproduisent de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique de nos animaux sera réalisé sur des souriceaux de 7 à 10 jours. Nous génèrerons des modifications génétiques sur des embryons de 14,5 jours embryonnaires lors d’une chirurgie impliquant donc une femelle gestante. Cette femelle sera âgée d’au moins 7 semaines afin d’être mature sexuellement. Sachant que le but de ce projet est de suivre le développement du système immunitaire cérébral de ces embryons, nous allons nous focaliser sur les âges suivants : stade embryonnaire tardif (18,5 jours embryonnaires), à une semaine post natale (phase de croissance, maturation en cours) puis aux stades de 21 et 60 jours, lorsque le cerveau devient mature. L’implantation du dispositif pour l’enregistrement de l’activité du cerveau a lieu sur un animal sevré de plus de 23 jours, période qui correspond à l’apparition des crises épileptiques dans ce modèle et permet de faciliter la prise en charge péri-opératoire ainsi que leur hébergement individuel suite à la chirurgie.
Rôle d’un moteur moléculaire dans la migration des cellules dendritiques chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie de la queue vers six jours pour le génotypage, un marquage de l'oreille et une injection dans le coussinet plantaire sous anesthésie, ce dernier geste pouvant provoquer une boiterie passagère. Les retombées annoncées, de nouvelles cibles thérapeutiques contre le cancer par l'amélioration de la mobilité des cellules dendritiques, restent au conditionnel et renvoyées à d'éventuelles thérapies cellulaires. Le porteur indique que des outils de microfluidique appliqués in vitro ont déjà mis en évidence le défaut de migration recherché, et propose malgré cela de refaire l'observation chez la souris pour disposer d'un microenvironnement tumoral complet.
Objectifs
Dans notre corps, certaines cellules jouent un rôle de sentinelles : ce sont les cellules dendritiques. Elles font partie du système immunitaire et sont chargées de repérer les intrus, comme les virus ou les cellules cancéreuses. Dès qu’elles détectent un danger, elles déclenchent une réponse de défense adaptée. Pour remplir cette mission, les cellules dendritiques doivent se déplacer rapidement dans l’organisme. Ce mouvement dépend d’un bon fonctionnement de leur "squelette" interne, composé de deux éléments : l’actine et les microtubules. Ces deux structures doivent parfaitement collaborer, mais les détails de cette coordination sont encore mal compris. Notre recherche s’intéresse à un élément clé de ce mécanisme : un moteur moléculaire. Lorsqu’il est absent dans certaines cellules immunitaires, ces dernières ont plus de mal à présenter les signes d’alerte et à déclencher une réponse efficace contre les tumeurs. Nous cherchons donc à mieux comprendre le rôle de ce moteur dans le déplacement des cellules dendritiques. Pour cela, nous comparons deux groupes de souris : l’un avec ce moteur, l’autre sans. Si nous confirmons que son absence freine le déplacement des cellules, nous testerons des traitements pour tenter de rétablir leur mobilité. L’objectif final est d’améliorer la capacité du système immunitaire à réagir face aux menaces, comme les cancers.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir de nouvelles connaissances fondamentales sur les mécanismes moléculaires nécessaires à une motilité efficace des cellules dendritiques. Il permettra d'identifier des voies de régulation susceptibles d'améliorer l'efficacité des stratégies thérapeutiques basées sur les cellules dendritiques, qui pourraient être combinées avec les effets bénéfiques des inhibiteurs des points de contrôle immunitaire, ouvrant la voie à de potentielles thérapies cellulaires.
Procédures
Un marquage de l’oreille est réalisé sur un animal anesthésié, d’une durée de 30 secondes. Une injection dans le coussinet plantaire est réalisée sur un animal anesthésié, d’une durée de 30 secondes. L'intégralité des animaux seront également génotypés de manière invasive, avec une biopsie de queue effectuée vers 6 jours.
Impact sur les animaux
Une légère douleur de courte durée peut être ressentie suite au prélèvement d'une biopsie de queue pour le génotypage. Des nuisances consécutives aux injections dans le coussinet plantaire peuvent être envisagées, entraînant une légère boiterie dans les quelques minutes suivant l’injection. Des nuisances liées au marquage de l’oreille peuvent également être envisagées, entraînant une irritation légère au niveau de l'oreille ainsi que des changements comportementaux mineurs.
Devenir
La mise à mort à la fin de la procédure est nécessaire pour réaliser le prélèvement des organes et leurs analyses.
Remplacement
Des approches alternatives ont été explorées dans la première partie de ce projet. Grâce à divers outils de microfluidique appliqués in vitro sur des cellules dendritiques primaires murines et humaines, nous avons mis en évidence un défaut migratoire des cellules dendritiques déficientes en ce moteur moléculaire, ainsi qu’une altération de leur capacité d’internalisation des antigènes. Afin de mieux comprendre le rôle de ce moteur moléculaire dans la réponse anti-tumorale chez l’homme, nous prévoyons d’étudier le profil migratoire des cellules dendritiques chez la souris, ainsi que de tester l’efficacité des drogues validées in vitro dans un contexte physiologique reproduisant le microenvironnement tumoral complexe. Ces résultats sont cruciaux et pourraient ouvrir la voie à de nouvelles cibles thérapeutiques chez l’homme, notamment dans le cadre de pathologies impliquant un défaut de surveillance des cellules immunitaires.
Réduction
Des lots de 25 souris sont nécessaires afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques. Sur la base des travaux publiés et d’une analyse associée, le nombre de souris à utiliser a été déterminé.
Raffinement
Toutes les souris seront surveillées, tout d'abord au moment du réveil, puis 3h après le réveil par l'expérimentateur, afin de vérifier l’absence de signes de souffrance ou de gênes physiques. Les souris sont groupées par 5. Un enrichissement des cages, composé de maisonnettes en carton et de coton d’enrichissement, est prévu afin de diminuer le stress des animaux.
Choix des espèces
La souris est particulièrement adaptée pour étudier la migration des cellules dendritiques, car elle partage avec l’humain les principaux sous-types de cellules dendritiques ainsi que les mécanismes de migration. Ces processus de migration sont fortement conservés entre les espèces, ce qui permet des extrapolations pertinentes chez l’homme. Enfin, ces expériences s'appuient sur des études publiées menées chez la souris, ce qui justifie l'utilisation de ce modèle afin d'appliquer ces protocoles dans notre propre étude. Comme décrit dans la littérature, les souris utilisées auront entre 6 et 8 semaines. A cet âge les souris sont matures et le système immunitaire complétement développé.
Comprendre les bases structurales, moléculaires et cellulaires du processus réplicatif et neuro-invasif de l’alpha synucléine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie stéréotaxique injecte dans le cerveau de chaque souris des fibrilles d'alpha-synucléine, la protéine qui s'agrège dans l'atrophie multisystématisée. 1 288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, sévère. Le porteur décrit pourtant des produits dont l'impact sur le comportement serait "très limité" et la symptomatologie "très réduite", les effets attendus étant présentés comme moléculaires et ne concernant que peu de neurones. Après l'opération, les animaux sont maintenus en vie pour laisser la maladie progresser, parfois vingt-quatre mois, avant d'être tués par vagues successives pour le prélèvement de leur cerveau.
Objectifs
L’atrophie multisystématisée (AMS) est une maladie rare et grave du cerveau. Elle apparaît généralement chez des personnes âgées de 50 à 60 ans et entraîne rapidement une détérioration de la santé, avec un décès souvent en moins de 10 ans. Malheureusement, on ne connaît pas encore son origine et il n’existe pas de traitement curatif aujourd’hui. Dans l’AMS, une protéine appelée alpha-synucléine s’accumule anormalement dans le cerveau. Au début, ces dépôts se forment dans les neurones. Plus tard, ils s’accumulent surtout dans des cellules de soutien du cerveau, qui normalement n’ont pas d’alpha-synucléine. Ces dépôts sont spécifiques à l’AMS et sont liés à la destruction progressive des neurones. Une forme particulière d’alpha-synucléine, appelée fibrille 1B a été synthétisée. Cette forme reproduit très fidèlement les anomalies observées dans le cerveau des patients. Quand ces fibrilles 1B sont injectées à des souris, elles déclenchent les mêmes dépôts d’alpha-synucléine que dans l’AMS, et ce dans les neurones et les cellules de soutien. Dans notre étude, nous cherchons à comprendre d’une part comment les neurones prennent en charge cette protéine anormale. Pourquoi et comment elle change de forme pour devenir toxique. De plus, nous espérons comprendre comment elle se propage d’un neurone à l’autre et finit par atteindre les cellules de soutien. L’objectif final est de mieux comprendre l’AMS pour, à terme, ouvrir la voie à de futurs traitements.
Bénéfices attendus
Les résultats de nos études apporteront probablement un éclairage moléculaire sur les mécanismes pathologiques de la MSA, pouvant expliquer la propagation des fibrilles et la destruction des fonctions cellulaires. Ces résultats pourraient être transférables à d’autres pathologies semblables, telles que la maladie de Parkinson et la démence à corps de Lewy.
Procédures
Les animaux subiront des injections cérébrales par chirurgie stéréotaxique. Une chirurgie sera réalisée par animal. L'intervention dure 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables peuvent être causées par les chirurgies réalisées sur les animaux. Ces nuisances peuvent être l'hypothermie (pendant la chirurgie, l'animal est profondément endormi, ce qui réduit son métabolisme). On pourrait observer des douleurs locales du fait des injections de médicaments, et aussi un stress du fait des manipulations. Néanmoins, les produits injectés ont un impact très limité sur le comportement (moteur par exemple) et ont une symptomatologie très réduite, car les effets attendus sont moléculaires, concernent peu de neurones et sont liés à la mécanistique de la pathologie. De plus, les injections de médicaments sont réduites (l'anesthésie est faite au gaz isoflurane), la chirurgie est faite sur tapis chauffant, l'animal est mis au réveil dans une cage chauffée.
Devenir
Après les chirurgies, les animaux sont maintenus en vie afin de laisser progresser la maladie moléculairement. Ensuite, à différents stades, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus (essentiellement le cerveau), dans le but de réaliser différentes analyses.
Remplacement
Nous souhaitons étudier et caractériser des modèles mimant la pathologie chez l’humain nécessitant ainsi l’utilisation de modèles animaux. L'intérêt du projet est d'étudier et d'évaluer la circulation de fibrilles au sein du cerveau, afin de déterminer comment se propage la pathologie chez l'humain. Ainsi, bien que les modèles de culture cellulaire soient des outils très performants ils ne permettent pas de mimer l'organe, (ici le cerveau) dans sa totalité avec tous les échanges qui s'y opèrent. Ainsi, les animaux sont requis afin de mener à bien le projet.
Réduction
La souris a été choisie car nos études antérieures ont montré une bonne stabilité et reproductivité, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux pour réaliser ces études. De plus, le statut sanitaire des animaux étant maîtrisé, la stabilité du modèle est éprouvée. Le nombre d’individu sera ajusté au minimum afin d’obtenir une réponse statistique robuste. Le maximum de tissu sera récupéré par animal afin de servir aux différents projets de l’équipe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en collectivité afin de réduire le stress et répondre au besoin de sociabilisation de l’espèce. Chaque procédure chirurgicale sera précédée de médication (anesthésique et analgésique). Un suivi post opératoire de plusieurs jours sera effectué afin d’évaluer le rétablissement post chirurgical et s’assurer de l’absence de douleur. Si présence de douleur, un antalgique sera administré. Si l’animal ne présente pas de signe d’améliorations dans les deux jours suivant la procédure chirurgicale, une mise à mort sera effectuée. De plus, des points limites ont été mises en place et seront vérifiés tout au long de la vie de l'animal. Dès lors que ces points limites sont atteints, l'animal est euthanasié.
Choix des espèces
Nous avons besoin des animaux afin d'obtenir du matériel biologique, base de nos études. Les stratégies utilisant des modèles synthétiques ne répondent pas à des exigences d'études de mécanismes cellulaires et pathologiques. Seule une approche in vivo permet la modélisation de la progression de la maladie et l’étude des interactions entre les acteurs moléculaires clés qui interviennent dans les mécanismes physiopathologiques. C'est pourquoi, les expériences débuteront sur des animaux adultes (âgés d’au moins 8 semaines), qui seront étudiés ensuite jusqu'au stade "animal âgé" (3 semaines, 6 semaines, 6 mois, 8 mois, 12 mois, 18 mois et 24 mois après les injections). Cela nous permettra de mimer la progression cellulaire de la pathologie qui s’exprime à l’âge adulte chez l’humain.
Caractérisation de l’acclimatement à l’oxygène hyperbare chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Pour savoir si les nageurs de combat de l'armée française peuvent s'acclimater à l'oxygène pur sous pression, 82 rats mâles sont enfermés dans un caisson hyperbare, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Tous sont tués à l'issue, pour le prélèvement de sang et de tissus. Après des séances d'acclimatement de trente à cent dix minutes, ils subissent une plongée simulée en oxygène pur jusqu'à quatre, cinq ou six atmosphères, pression à laquelle se déclenchent des convulsions comparables à celles d'une crise d'épilepsie. Le porteur qualifie ces crises d'indolores en s'appuyant sur l'expérience humaine, et indique que le protocole en limite la durée en décomprimant les animaux dès les premiers symptômes.
Objectifs
Dans le cadre de ses opérations, l’armée française demande à ses nageurs de combat d’effectuer des plongées à l’oxygène pur, or ce gaz lorsque respiré à une pression supérieure à 1.7 atmosphère peut provoquer des crises hyperoxiques susceptibles de compromettre la mission et faisant courir un risque de noyade au plongeur. Les effets neurologiques de l’oxygène hyperbare sont connus depuis la fin du XIX siècle et les travaux de Paul Bert ; ils se traduisent par l’apparition de convulsions similaires à celles observées lors de crises épileptiques. Ces crises, indolores, se résolvent rapidement si la pression d’oxygène est réduite. Elles ont été caractérisées chez l’homme et l’animal (sans que le mécanisme en soit clairement identifié) mais la question de l’acclimatement à de fortes pression d’oxygène reste non étudiée. L‘hypothèse d’un acclimatement à l’oxygène hyperbare a été suggérée dans quelques articles scientifiques sans qu’aucune étude n’ait encore permis de le confirmer. Si elle s’avérait fondée, elle pourrait constituer une avancée pour améliorer la sécurité des nageurs de combat. La présente étude a pour objectif de déterminer, chez le rat, : 1- si un acclimatement à l’oxygène hyperbare est possible et 2- d’étudier les mécanismes physiologiques à l’origine des crises hyperoxiques.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de vérifier l’existence d’un acclimatement à l’oxygène hyperbare ainsi que de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la crise hyperoxique. Ces travaux pourront être bénéfiques pour les forces armées françaises dans le cadre opérationnel de la plongée à l’oxygène pur. Il aura aussi un intérêt en santé humaine dans le cadre de l’oxygénothérapie hyperbare utilisée en clinique humaine. L’oxygénothérapie hyperbare consiste à faire respirer de l’oxygène pur à un patient placé dans une chambre où la pression est supérieure à celle atmosphérique normale (généralement entre 2 et 3 atmosphères). Dans ces conditions il existe un risque de déclenchement de crise hyperoxique chez le patient, or l’oxygénothérapie hyperbare est indiquée dans de nombreuses pathologies. Une meilleure compréhension du déclenchement de la crise hyperoxique permettrait une meilleure prise en charge de ces patients.
Procédures
Les rats seront manipulés une fois pour être anesthésiés/analgésiés (durée 1 min) afin de subir un prélèvement sanguin unique (durée 1 à 2 min). Dans la seconde partie du projet, les animaux seront acclimatés à l’oxygène en étant placés dans le caisson hyperbare pour des durées de 30 à 110 minutes à des pressions partielles d’oxygène comprises entre 0.21 (Pression d’oxygène dans l’air ambiant) et 3.5 atmosphères selon les groupes expérimentaux. Trois groupes de rats seront soumis à une plongée simulée en oxygène pur jusqu’à des pressions de 4, 5 ou 6 atmosphères (selon les groupes). A 14 semaines, tous les animaux seront exposés à une plongée simulée en caisson hyperbare en oxygène pur après 30 min d’acclimatement au caisson.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : (1) : le stress lié à la pesée hebdomadaire (acte de gravité légère, d’une durée de 1-2 min/pesée). (2) : le stress lié à la réalisation des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitaire (acte de gravité légère, d’une durée estimée à 1-2 minutes, réalisé 1 fois sur l’ensemble du projet à l’âge de 12 semaines) (3) : le stress et l’angoisse liés à la plongée simulée (acte de gravité légère, d’une durée totale maximale de 2h30 correspondant au temps de l’exposition hyperbare) (4) : La désorientation induite par l’apparition de la crise hyperoxique (cette nuisance sera sévère mais brève, moins de 10 minutes, et l’expérience humaine nous apprend que les crises sont indolores et n’induisent pas de lésion neurologique après une seule crise).
Devenir
Les 82 animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure afin de procéder aux prélèvements de sang et de tissus pour les analyses prévues dans le projet.
Remplacement
Notre travail cherche à déterminer s’il existe une possibilité d’acclimatement à la crise hyperoxique hyperbare. Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler sur un modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité à la crise hyperoxique
Réduction
Dans un premier temps, l'objectif est de déterminer le couple pression - durée qui sera utilisé par la suite, le nombre d’animaux par groupe a été réduit à 6 animaux par groupe. Ensuite, les comparaisons de sensibilité des animaux (acclimatés ou non acclimatés à l’oxygène) seront effectuées en utilisant des tests statistiques adaptés. Les effectifs nécessaires pour obtenir une puissance statistique suffisante ont été calculés ; 16 animaux par groupe sont nécessaires pour mettre en évidence une différence de résistance de 50 % à la crise hyperoxique (il faudrait 61 animaux pour mettre en évidence une différence de 30 %).
Raffinement
Tout au long des procédures le remplissage quotidien d’une grille de score et l’identification de points limites prédictifs et spécifiques au projet permettront de satisfaire au bien-être de l’animal. Avant de démarrer le protocole d’exposition hyperbare, les animaux seront maintenus pendant 30 minutes dans le caisson hyperbare afin de les habituer à l’environnement et de réduire le stress. Le protocole utilisé limite au maximum la durée des crises hyperoxiques en décomprimant les animaux dès l’apparition des premiers symptômes.
Choix des espèces
Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des effets de l’oxygène hyperbare. De ce fait, nous disposons d’un certain nombre de données nous permettant de cibler les pressions et temps d’exposition et ainsi de réduire le nombre de groupes utilisés. Nous possédons en outre des données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ces résultats. Le contexte de cette étude est le maintien opérationnel des nageurs de combat en condition de plongée à l’oxygène pur. Les plongeurs concernés sont de jeunes adultes. Nous souhaitons donc utiliser des animaux mâles au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement.