Rongeurs

Les souris qui perdent 15 % de leur poids, cessent de s'alimenter plus de vingt-quatre heures ou deviennent apathiques sont retirées de l'étude et tuées par dislocation cervicale. 106 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus. Certaines subissent une inoculation de bactéries directement dans une dent, refermée ensuite, sous anesthésie générale, d'autres un badigeonnage de la bouche cinq fois par semaine pendant cinq semaines, et une partie une chirurgie de réduction de l'estomac de trente à quarante-cinq minutes, avec un régime riche en graisses et des ponctions répétées à la veine de la queue. Les retombées annoncées, des tests salivaires et une médecine personnalisée pour les personnes obèses ou diabétiques, sont renvoyées au long terme, alors que la chirurgie de l'estomac et l'infection dentaire sont, elles, immédiates.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’étudier le rôle du microbiote oral dans l’aggravation des maladies cardiométaboliques et d’évaluer son influence sur la réponse au traitement chirurgical de l’obésité. Des données récentes suggèrent que la translocation bactérienne depuis la cavité buccale pourrait influencer la physiopathologie de pathologies telles que l’obésité, l’hypertension artérielle et le diabète de type 2. Ce projet propose une approche intégrée combinant modèle murin d’obésité, dysbiose orale induite et chirurgie bariatrique pour explorer ces interactions. Les objectifs spécifiques sont : • Analyser la composition et la dynamique du microbiote oral dans un contexte d’obésité induite par un régime riche en graisses. • Évaluer l’impact d’une dysbiose orale sur l’inflammation systémique et la régulation glucidique, en lien avec les paramètres métaboliques majeurs. • Étudier l’influence du microbiote oral sur l’efficacité métabolique de la chirurgie bariatrique, notamment sur la perte de poids et l’amélioration de la tolérance au glucose.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des avancées significatives dans la compréhension du rôle du microbiote oral dans les maladies cardiométaboliques, en explorant ses interactions avec l’inflammation systémique, la régulation glycémique et la réponse métabolique à la chirurgie bariatrique. À court terme, il fournira des données inédites sur l’impact d’une dysbiose orale sur la prise de poids, la tolérance au glucose et l’inflammation dans un contexte d’obésité induite par régime riche en graisses. L’intégration de la chirurgie bariatrique dans le protocole permettra d’évaluer l’influence du microbiote oral sur la variabilité interindividuelle des résultats post-opératoires. Grâce aux approches métagénomiques et métabolomiques, ce projet vise à identifier : • des signatures microbiennes spécifiques corrélées à l’aggravation des troubles métaboliques, • des biomarqueurs prédictifs de la réponse à la chirurgie. Ces connaissances permettront d’évaluer la pertinence du microbiote oral comme biomarqueur des complications métaboliques et ouvriront la voie à des stratégies de modulation ciblée (probiotiques, traitements antimicrobiens, hygiène bucco-dentaire optimisée). À long terme, ces données pourraient contribuer au développement d’outils diagnostiques non invasifs (tests salivaires) et à une médecine personnalisée, améliorant la prise en charge des patients obèses ou diabétiques

Procédures

Pendant l’étude, les souris subiront : • Colonisation buccale : -Option 1 – Badigeonnage buccal : application locale sur les joues et dents, 5 fois/semaine pendant 5 semaines (durée : 1 à 2 minutes par animal). -Option 2 – Inoculation intra-dentaire : acte unique sous anesthésie générale avec fermeture de la dent (durée : 10 à 15 minutes par animal). • Prélèvements sanguins : réalisés une fois par semaine (durée : 1 à 2 minutes par animal). • Prélèvements de salive : réalisés une fois par semaine (durée : 1 minute). • Mesures du poids : deux à trois fois par semaine (durée : moins d’1 minute par animal). • Tests de glycémie : plusieurs fois pendant l’étude, notamment avant et après certains tests (durée : 1 à 2 minutes par mesure). • Chirurgie gastrique (pour certains groupes) : réalisée sous anesthésie complète (durée : 30 à 45 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues concernent principalement les interventions expérimentales et leur suivi : • Manipulations répétées (prise de poids, prélèvements sanguins) : induisent un stress modéré et une contention brève (quelques minutes), pouvant générer une anxiété transitoire (quelques minutes). • Administration orale (inoculation microbiote) : inconfort léger lors des instillations de l’inoculum bactérien, sans effets prolongés (quelques minutes) car acclimatation au geste au préalable et sans anesthésie générale. • Tests de tolérance au glucose (IPGTT) : ponctions répétées à la veine caudale, risque mineur d’hématome ou douleur locale, résolutifs en quelques heures. • Chirurgie bariatrique : Inconfort, voir douleur légère en phase postopératoire immédiate (24–72 h). Risques associés : perte de poids excessive, ralentissement de la reprise alimentaire, déshydratation. • Prélèvements terminaux : réalisés sous anesthésie profonde, sans douleur pour l’animal. • Régime gras prolongé : peut induire une diminution de mobilité et une surcharge pondérale, sans souffrance directe. Tous les animaux feront l’objet d’un suivi clinique renforcé et de points limites prédéfinis, afin d’interrompre ou adapter les procédures en cas de signes de détresse (perte de poids ≥15 %, apathie, altération de la prise alimentaire). En cas d’atteinte des points limites l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale.

Devenir

Les analyses prévues (tissus et organes) ne peuvent être réalisées que sur des animaux euthanasiés, afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

Actuellement, aucune méthode in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des interactions entre microbiote oral, système immunitaire et métabolisme de l’hôte dans un contexte d’obésité et de chirurgie bariatrique. Les raisons principales sont : • Absence de modèles alternatifs intégratifs : les cultures cellulaires ou organoïdes ne permettent pas de simuler la circulation systémique, la translocation bactérienne et la réponse immuno-inflammatoire à l’échelle de l’organisme. • Complexité des interactions microbiote-hôte : la composition et la dynamique du microbiote dépendent de facteurs multiples (alimentation, état inflammatoire, chirurgie) qui ne peuvent être reproduits que dans un organisme vivant. • Objectifs du projet : évaluer l’impact d’une dysbiose orale sur la régulation glycémique, l’inflammation et la réponse métabolique à une chirurgie bariatrique nécessite une approche intégrée impliquant plusieurs organes et systèmes physiologiques. En conséquence, le recours à un modèle animal est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Les données obtenues serviront toutefois à alimenter des modèles prédictifs in silico, qui pourraient, à terme, réduire l’utilisation d’animaux dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d’animaux a été défini à partir : • d’un calcul de puissance statistique fondé sur les données de variabilité issues de notre étude pilote (et complétées par notre expérience en nutrition expérimentale. Ce calcul indique qu’au moins 10 animaux par groupe sont nécessaires pour détecter une différence significative sur les paramètres métaboliques (glycémie, inflammation systémique). • d’une marge de 10 % pour anticiper les pertes (points limites, complications postopératoires). Ainsi, nous retiendrons 12 animaux par groupe, pour un total de 105 animaux répartis en 4 groupes expérimentaux, ce qui assure la robustesse des résultats tout en respectant la règle des 3R. Mesures mises en œuvre pour réduire l’utilisation des animaux : • Suivi longitudinal des mêmes individus pour réaliser plusieurs mesures (poids, glycémie, prélèvements biologiques), réduisant le besoin de groupes supplémentaires. • Analyses multi-omiques sur les mêmes échantillons (métagénomique, métabolomique, marqueurs inflammatoires) pour maximiser l’information par individu. • Utilisation des données existantes et comparaisons avec des cohortes antérieures (approches de modélisation in silico en cours de développement), afin de limiter le recours à des expérimentations répétées. Ces pratiques garantissent que le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, tout en assurant une puissance statistique suffisante pour des résultats interprétables.

Raffinement

Afin de limiter la douleur, le stress et les complications, plusieurs mesures spécifiques seront mises en place en plus des obligations réglementaires : Gestion de la douleur et anesthésie • Utilisation systématique d’une anesthésie générale à l’isoflurane pour toute procédure invasive (inoculation orale sous sédation légère, chirurgie bariatrique). • Mise en place d’une analgésie multimodale pendant 3 jours après la chirurgie. • Surveillance renforcée des signes de douleur (score clinique) avec adaptation du traitement si nécessaire. Soins postopératoires et surveillance accrue • Suivi clinique biquotidien pendant les 72 heures postopératoires, puis quotidien jusqu’à cicatrisation complète. • Maintien sur tapis chauffant en phase de réveil et mise à disposition de gel oculaire pour prévenir les lésions cornéennes. • Mise à disposition d’une alimentation enrichie (gel diet) et eau gélifiée pour favoriser la reprise alimentaire. • Réhydratation sous- cutanée (deux fois par jour) si signes de déshydratation ou perte de poids postopératoire. Surveillance du poids et critères d’arrêt • Pesée au minimum 2 à 3 fois par semaine pendant toute la durée du protocole (au lieu d’une fois toutes les deux semaines). • Points limites précoces : retrait de l’étude si perte de poids ≥15 % par rapport au poids initial, altération de la mobilité, anorexie >24 h. Autres mesures de raffinement • Hébergement en groupes homogènes (même sexe) pour éviter les conflits. • Utilisation d’isolateurs ventilés (IVC) pour réduire le risque infectieux, notamment chez les souris transgénique à déficit immun. • Manipulations réalisées en poste de sécurité microbiologique (PSM) pour limiter le stress et garantir l’asepsie. • Aucun transport inter-établissement. Outils d’évaluation • Application d’une grille d’évaluation clinique incluant score de douleur, état du pelage, posture, activité et hydratation, pour ajuster les soins et déclencher les points limites. Ces mesures permettent de réduire la douleur et le stress, d’assurer une récupération rapide après chirurgie et de maintenir un haut niveau de bien-être tout au long du protocole expérimental.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce la plus pertinente pour ce projet car : •Microbiote comparable à celui de l’Homme : le microbiote intestinal et buccal de la souris présente une composition et une diversité proches de celles observées chez l’Homme, permettant des études translationnelles fiables. •Contrôle des variables expérimentales : la souris offre des conditions expérimentales homogènes (statut génétique, alimentation, environnement), indispensables pour analyser l’impact spécifique du microbiote oral sur les paramètres métaboliques et la réponse à la chirurgie bariatrique. •Adaptation aux approches multi-omiques : la taille de l’animal permet la réalisation de prélèvements biologiques et tissulaires multiples (sang, salive, organes), nécessaires pour les analyses métagénomiques, métabolomiques et immunologiques prévues. L’étude sur ces espèces permettra de comparer un contexte immunocompétent et un contexte d’immunité adaptative altérée, garantissant la robustesse des conclusions sur le rôle des réponses immunitaires dans les interactions microbiote/métabolisme.

Une minipompe implantée sous la peau du dos infuse en continu de la bléomycine pendant six semaines, jusqu'à épaissir la peau comme dans la sclérodermie et parfois atteindre les poumons. 3 000 souris vont subir ce protocole dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, avec des pesées quotidiennes, jusqu'à dix prélèvements sanguins et des administrations de composés pouvant aller jusqu'à deux fois par jour. Le porteur écrit que la gestion de la douleur est délicate parce que certains analgésiques pourraient fausser les résultats, et s'en remet à une surveillance quotidienne avec retrait de l'étude en cas de détresse. La mise à mort finale se fait par ponction cardiaque sous anesthésie, sans réveil, pour prélever les organes et mesurer les biomarqueurs.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de tester l’efficacité de nouveaux traitements contre la sclérodermie systémique, une maladie auto-immune rare mais grave qui provoque un durcissement progressif de la peau et des organes internes comme les poumons, le cœur ou les reins. Cette affection touche principalement les femmes entre 45 et 65 ans et entraîne des douleurs, une perte de mobilité, une baisse de qualité de vie et un risque élevé de mortalité. En France, on estime qu’entre 6 000 et 9 000 personnes en souffrent, et malgré les traitements actuels qui visent à soulager les symptômes et ralentir la progression, il n’existe aucun remède capable d’inverser la fibrose, principal facteur de gravité. Les options disponibles, comme les immunosuppresseurs ou les antifibrosants, offrent des résultats limités, ce qui rend urgent le développement de thérapies innovantes ciblant les mécanismes précoces de la maladie et la fibrose. Notre projet consiste à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques dans un modèle expérimental chez la souris, reproduisant la fibrose systémique grâce à une infusion continue de bléomycine, afin d’identifier des solutions plus efficaces qui pourraient transformer la prise en charge et améliorer la survie et la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Les études prévues dans ce projet serviront à tester si de nouveaux médicaments peuvent être efficaces contre la fibrose systémique. À court terme, elles permettront de décider de la suite du projet : si les résultats sont insuffisants, nous chercherons à améliorer le médicament (par exemple en modifiant sa structure pour qu’il agisse mieux), ou nous arrêterons le projet. Si les résultats sont encourageants, nous passerons à l’étape suivante, qui consiste à vérifier comment le médicament se comporte dans l’organisme et s’il est bien toléré. À plus long terme, ces recherches aideront à déterminer les doses à utiliser chez les patients et, nous l’espérons, à proposer un traitement efficace et mieux toléré pour les personnes atteintes de sclérodermie systémique.

Procédures

• Les gestes techniques concernent tous les animaux. • Pesées : Durée 30 secondes, sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour pendant 6 semaines. • Implantation d’une minipompe osmotique en sous-cutanée sous anesthésie générale gazeuse. Durée 5 minutes. 1 fois par animal. • Prélèvements de sang via la veine caudale, saphène ou mandibulaire : Durée 30 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. Jusqu’à 10 fois par animal. • Prélèvement de sang terminal par ponction cardiaque : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. 1 fois par animal. Sans réveil. •​Administrations des composés à potentiel thérapeutique : Durée 10-30 secondes, 1 fois par semaine à 2 fois par jour, pendant 6 semaines, sur animal vigile ou anesthésié selon voie d'administration.

Impact sur les animaux

Pour provoquer la fibrose cutanée, une petite pompe est implantée sous la peau du dos des souris afin d’infuser en continu une solution qui entraîne un épaississement localisé de la peau, similaire à ce qui se produit dans la sclérodermie, et parfois une atteinte légère des poumons. Les animaux peuvent perdre du poids de manière transitoire et présenter des signes d’inconfort liés à l’inflammation et à l’épaississement cutané. Ce modèle est considéré comme étant de gravité modérée selon les normes du bien-être animal. La gestion de la douleur est délicate, car certains analgésiques pourraient fausser les résultats. Les animaux sont donc surveillés quotidiennement et retirés de l’étude en cas de détresse.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour permettre le prélèvement des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses comme le dosage de biomarqueurs et les paramètres pharmacocinétiques.

Remplacement

Notre analyse des recherches existantes montre qu’il n’existe pas aujourd’hui de systèmes mathématiques ou de modèles en laboratoire capables de reproduire toute la complexité de la sclérodermie systémique et d’évaluer correctement l’effet de nouveaux traitements. Les modèles les plus avancés, comme les organoïdes, ne représentent que des versions simplifiées d’organes, alors que cette maladie touche plusieurs tissus et organes (vaisseaux, peau, poumons, reins, système immunitaire, sang…). Pour comprendre ces interactions, il est nécessaire d’utiliser un modèle animal. Cependant, nous limiterons autant que possible le recours à l’animal en nous appuyant sur des études réalisées sur des cellules en culture et d’autres systèmes en laboratoire. L’utilisation d’animaux reste une étape indispensable pour vérifier l’efficacité des nouveaux traitements avant de passer à des essais chez des volontaires sains, puis chez des patients

Réduction

Avant d’être testés chez l’animal, les médicaments candidats passent par une série de tests en laboratoire et in silico. Ces tests permettent de vérifier comment le médicament se comporte (par exemple, s’il peut être bien absorbé et distribué dans l’organisme) et s’il agit sur la cible prévue. Seuls les candidats les plus prometteurs sont retenus pour les études chez l’animal, ce qui augmente les chances d’obtenir des résultats utiles. Le nombre d’animaux utilisés est calculé à partir de données scientifiques et de méthodes statistiques pour garantir que les résultats soient fiables tout en limitant le recours à l’animal. Les mesures comme l’épaisseur de la peau ou certains marqueurs biologiques seront analysés avec des outils statistiques afin de confirmer que les différences observées entre les groupes sont réelles et non dues au hasard. Cette approche rigoureuse est essentielle pour valider l’efficacité des traitements avant de passer aux étapes suivantes de développement.

Raffinement

Toutes les procédures susceptibles d’induire douleur ou stress seront réalisées sous anesthésie afin de prévenir toute souffrance. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par le personnel qualifié, sous la responsabilité du vétérinaire désigné. Des soins appropriés seront administrés en cas de besoin. Tout animal présentant des signes de détresse sera retiré de l’étude et euthanasié conformément à la réglementation en vigueur. Le nombre de manipulations sera limité au strict nécessaire afin de réduire le stress, susceptible d’altérer la qualité des données. Des critères d’arrêt prédéfinis permettront d’interrompre l’expérimentation avant l’apparition de douleurs ou lésions irréversibles. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes aux prescriptions réglementaires et aux recommandations en matière de bien-être (température, hygrométrie, cycle lumineux). La taille des groupes sera adaptée à la souris et donc à son comportement social, afin de favoriser les interactions naturelles et prévenir l’isolement ou la surpopulation. Des dispositifs d’enrichissement environnemental seront mis en place pour stimuler les comportements exploratoires et réduire le stress. Ces mesures visent à garantir le respect des principes de raffinement tout en assurant la fiabilité scientifique des résultats.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés en recherche médicale et pharmaceutique ont été développés chez le rat et la souris. Ces espèces sont les plus couramment utilisées car elles permettent d’obtenir des résultats fiables tout en limitant la douleur et la souffrance, conformément à l’article R.214-106 du Code rural. De nombreuses données existent déjà dans la littérature sur les modèles de maladies auto-immunes chez la souris, notamment pour la sclérodermie systémique, ce qui facilite la mise en place des protocoles et l’interprétation des résultats. L’utilisation de la souris, espèce bien caractérisée et adaptée aux études précliniques, répond ainsi à l’exigence de choisir les animaux les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants tout en minimisant les dommages durables. Les données de la littérature indiquent que la sclérodermie systémique expérimentale peut être induite chez la souris adulte, généralement entre 6 et 12 semaines d’âge. Ce stade est choisi pour des raisons scientifiques : il correspond à un organisme pleinement développé, avec un système immunitaire mature et une physiologie stable, ce qui est indispensable pour reproduire les mécanismes complexes de la maladie et évaluer la réponse aux traitements. L’utilisation de souris adultes permet également de limiter la variabilité liée à la croissance ou à l’immaturité des organes, garantissant ainsi la fiabilité des résultats tout en respectant le principe de réduction et de pertinence scientifique.

Les rats utilisés portent la mutation de la dystrophie musculaire de Duchenne, maladie qui détruit progressivement leurs muscles. 74 d'entre eux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus. Le protocole le plus lourd prévoit vingt-quatre injections dans les muscles des pattes arrière, une par patte et par semaine pendant douze semaines, précédées de douze injections d'antalgique, puis un test de réponse nerf-muscle sous anesthésie. Le porteur indique que les animaux sont tués au plus tard à seize semaines, avant les symptômes les plus graves de la maladie, et détaille la répartition de 60 rats, alors que 74 sont déclarés dans le projet.

Objectifs

Les troubles générant une instabilité de la synapse, ou jonction neurone-muscle (NMJ), sont fréquents dans plusieurs maladies neuromusculaires. Ces troubles amplifient un déclin moteur, quand ils n’en sont pas directement la cause. Cette relation est confirmée par des expériences qui montrent qu’en réduisant la fragmentation des NMJ, on améliore la force motrice dans un modèle animal de Myopathie de Duchenne (DMD). L'identification des mécanismes de stabilisation de la NMJ est donc cruciale pour la découverte de traitements innovants contre des maladies neuromusculaires dévastatrices et actuellement incurables. Des sucres complexes particuliers appelés héparanes sulfates pourraient intervenir comme mécanisme stabilisateur des NMJ. Ces sucres complexes ainsi que les enzymes à l’origine de leur production diminuent de manière parallèle à la fragmentation de la NMJ chez les DMD. Cette corrélation temporelle est conforme au rôle stabilisateur des synapses de ces molécules et suggère que ce rôle est perdu dans la DMD. Notre but est de rétablir ce rôle chez les animaux DMD en réexprimant ces molécules de surface modifiées afin de stabiliser la NMJ et de promouvoir la récupération fonctionnelle des muscles. Trois objectifs seront poursuivis : 1) augmenter l'expression des enzymes responsables de l’expression de ces molécules de surface modifiées, 2) étudier l'impact de peptides inhibiteurs de ces molécules sur l'intégrité des NMJ in vivo, et 3) tester l'efficacité de l’utilisation in vivo de mimétiques des molécules de surface modifiées sur la stabilisation des NMJ dans la DMD.

Bénéfices attendus

La NMJ est au centre d’un spectre de maladies neuromusculaires, en comprendre la dérégulation permet d’adresser de nouvelles avenues thérapeutiques pour des maladies rares. Notre recherche explore la manière dont des héparanes sulfates (HS) spécifiques régulent la stabilisation de la NMJ dans la DMD. En élucidant le rôle de motifs sulfatés spécifiques dans les HS, nous souhaitons améliorer la compréhension de la fonction musculaire et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouveaux traitements pour les maladies musculaires.

Procédures

Dans ce projet, le traitement sera administré par injections dans un muscle de chacune des pattes arrières, soit 2 injections par animal à chaque fois. Toutes les injections seront réalisées sur des animaux préalablement injectés avec un médicament contre la douleur, injection qui pourra être répétée toutes les 12 heures pendant 2 à 3 jours, uniquement si des signes de douleur sont observés. À la fin de la procédure, un test fonctionnel pour évaluer la réponse nerf-muscle sera réalisé sur des animaux endormis complètement (anesthésiés au moyen d’une injection). Chaque injection sera effectuée en moins d’une minute. Au total 60 animaux, desquels : - 24 recevant : 1 injection d’un médicament contre la douleur, 2 injections du traitement (une dans chaque patte), et 1 injection pour l’anesthésie. - 16 recevant : 4 injections d’un médicament contre la douleur, 8 injections du traitement (une dans chaque patte, une fois par semaine pendant 4 semaines), et 1 injection pour l’anesthésie. - 20 recevant : 12 injections d’un médicament contre la douleur, 24 injections du traitement (une dans chaque patte, une fois par semaine pendant 12 semaines), et 1 injection pour l’anesthésie.

Impact sur les animaux

Des études antérieures réalisées avec ce type de molécules sur d’autres modèles animaux n’ont révélé ni toxicité ni effets secondaires. Sur cette base, aucun effet indésirable particulier n’est attendu dans le cadre de ce projet. Les injections seront réalisées directement dans un muscle de chaque patte, ce qui peut provoquer une légère douleur locale. Ces injections seront effectuées chez des animaux âgés de 4 - 16 semaines, à un stade de la maladie où les muscles sont encore peu affectés de sortes que l’injection ne devrait avoir qu’un faible impact négatif. Les animaux seront suivis jusqu’à un âge maximal de 16 semaines, puis mis à mort avant l’apparition des symptômes les plus graves de la maladie, afin de limiter autant que possible leur souffrance liée à l’évolution naturelle de la pathologie. L’ensemble du protocole a été conçu pour minimiser au maximum les nuisances pour les animaux, tout en permettant d’obtenir des données scientifiques essentielles à l’évaluation de cette approche thérapeutique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des trois procédures pour prélèvement des tissus nécessaires à l’analyse.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps d’une structure multipartite requérant l’interaction entre de nombreux types cellulaires (fibre musculaires, motoneurones, cellules de Schwann, kranocytes). De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par l’in vitro. Préalablement aux essais précliniques sur les animaux issus de nos lignées modèles, l’efficacité des thérapies testées a été démontrée sur des cultures de cellules musculaires. Aucun produit n'est testé chez nos animaux sans connaissance d'un mécanisme biologique robuste, préalablement établi in vitro. La stratégie proposée ici consiste à cibler spécifiquement le muscle plutôt que tout autre organe, permettant de réduire la dose administrée et la toxicité virale sur certains organes tels que le foie. Les stratégies passant par l’utilisation des molecules spécifiques proposés dans ce projet ont déjà été validées sur des animaux de plus petite taille. Le présent projet est la dernière étape chez l'animal visant à confirmer son efficacité en condition réelle, c'est-à-dire sur un organisme mammifère sévèrement atteint par la maladie que le traitement vise à corriger, y compris dans la complexité de la réponse de l'organisme à l'administration du traitement.

Réduction

Le projet a été optimisé pour utiliser un nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre une significativité scientifique et statistique adéquate. La taille d’échantillon a été calculée, recommandant l’utilisation optimale de 10 animaux par groupe. Ce chiffre a été validé par d’autres projets achevés présentant des caractéristiques similaires en termes d’état de développement, de stratégie et de paramètres évalués. Les résultats seront analysés par des tests statistiques qui permettront de confirmer ou infirmer des différences entre plusieurs groupes de variables. Chaque animal sera exploité de manière optimale, en recueillant un maximum de données (analyses histologiques, moléculaires et fonctionnelles) à partir des mêmes animaux, prélèvements et échantillons. Ainsi, nous garantissons que les objectifs scientifiques du projet pourront être atteints tout en réduisant le nombre d'animaux enrôlés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des portoirs équipés de cages ventilées, situés dans des locaux où la température et l’hygrométrie sont rigoureusement contrôlées. Pour leur bien-être, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 par cage à l’âge d’un mois. Puis nous réduisons ce nombre jusqu’à atteindre 3 animaux par cage pour les animaux de plus de 600 grammes. L’isolement n’existe jamais. Afin de favoriser leur bien-être et de limiter les comportements stéréotypés, ils bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant un contact hebdomadaire alterné avec différents éléments tels que du coton aggloméré, des bâtonnets de bois, du papier kraft plié en accordéon, des rouleaux de carton et un hamac. La douleur est prise en charge tout au long des procédures, y compris de manière préventive avant les injections, grâce à l’utilisation de molécules contre la douleur ou pour induire le sommeil. Afin d’anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués quotidiennement en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage et yeux), leur comportement (mobilité) et l’état général de l’animal (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont prises : surveillance renforcée (biquotidienne) et mesures médicamenteuses visant à atténuer ou supprimer la douleur. Afin de réduire le stress lié aux manipulations expérimentales, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement. De plus, ils seront familiarisés avec l’expérimentateur pendant 2-3 jours avant le début des procédures, ce qui permettra de diminuer leur réponse au stress et d’assurer des conditions expérimentales plus harmonieuses.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi dans ce projet présente un système neuromusculaire soumis aux mêmes phases de développement pathologique que chez l’humain et qu’on ne retrouve pas chez d’autres modèles animaux. Ce modèle de rat DMD présente les iso-enzymes médiant la sulfatation des HS, conservées chez l’humain, d’où sa pertinence pour la compréhension physiologique et son intérêt pour les maladies neuromusculaires humaines. Les animaux seront injectés à 4 semaines. La fragmentation des NMJ est perceptible dès 2 mois et est déjà maximale à 7 mois. Les traitements visent à prévenir sur la période 1-4 mois l’apparition de la fragmentation de la NMJ au moment où elle s’installe et s’amplifie. .

Pour reproduire une dégénérescence de la cornée provoquée par la section des nerfs qui l'innervent, 600 souris et 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nerfs ciliaires d'un œil sont sectionnés sous anesthésie générale, puis chaque animal reçoit des collyres jusqu'à six à huit fois par jour pendant une à quatre semaines, des injections intra- ou péri-oculaires parfois quotidiennes et un prélèvement sanguin hebdomadaire, avec examens à la lampe à fente, esthésiométrie et imagerie cornéenne. Une centaine d'animaux écartés avant l'induction pourront être réutilisés dans d'autres protocoles, tous les autres sont tués pour des analyses histologiques et biochimiques. Le porteur annonce une kératite pouvant aller jusqu'à l'ulcération et une opacification de la cornée, et écrit dans le même paragraphe que ces manifestations ne devraient pas générer de douleur manifeste après le réveil.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est de développer un modèle expérimental de kératopathie neurotrophique chez le rongeur afin d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la dégénérescence cornéenne liée à une altération de l’innervation sensitive. La kératopathie neurotrophique est une affection rare mais sévère de la cornée, résultant d’un dysfonctionnement du nerf trijumeau, et observée dans diverses pathologies humaines telles que l’herpès oculaire, le diabète, ou après des interventions neurochirurgicales. Les modèles développés permettent de reproduire de manière contrôlée une dénervation cornéenne, entraînant une perte de trophicité, une altération de la cicatrisation épithéliale, une inflammation chronique et une apoptose des cellules épithéliales. L’activation des cellules immunitaires locales et la perturbation de l’homéostasie des cellules de la cornée contribuent à la progression de la maladie. Ces modèles offrent une plateforme pertinente pour l’analyse des voies de signalisation impliquées dans la régénération nerveuse, la réponse inflammatoire et le stress oxydatif. Ils permettent également d’évaluer l’efficacité de stratégies thérapeutiques neuroprotectrices, régénératives ou anti-inflammatoires, en amont d’études cliniques. En résumé, ces modèles constituent un outil essentiel pour mieux comprendre la physiopathologie de la kératopathie neurotrophique et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est la mise au point de modèles expérimentaux robustes permettant d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques visant à préserver ou restaurer l’intégrité cornéenne après une dénervation. La kératopathie neurotrophique (KN) constitue une pathologie sévère, souvent consécutive à des atteintes du nerf trijumeau, et pour laquelle les options thérapeutiques restent limitées. Il est donc essentiel de disposer de modèles fiables reproduisant les mécanismes physiopathologiques observés chez l’humain, afin de tester ces traitements dans des conditions rigoureuses et contrôlées, tout en respectant les principes du bien-être animal. Ces modèles permettront de simuler les altérations cornéennes caractéristiques de la KN, telles que la perte de sensibilité, la diminution de la sécrétion lacrymale et la dysfonction épithéliale. Ils offriront la possibilité d’évaluer avec précision l’effet des traitements sur la régénération nerveuse et la cicatrisation épithéliale. Ces études contribueront à identifier les molécules les plus prometteuses, à optimiser les schémas posologiques et à approfondir la compréhension des mécanismes d’action, tout en garantissant une approche éthique et conforme aux standards réglementaires.

Procédures

Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à différentes interventions réparties sur une période de 1 à 4 semaines, selon les objectifs et les résultats obtenus avec les traitements testés, parmi lesquelles : 1. La procédure chirurgicale d’induction de la pathologie avec lésion mécanique unilatérale des nerfs ciliaires. Durée estimée à 10 minutes sous anesthésie générale avec prémédication d’une analgésie administrée en sous-cutanée. 2. Les examens ophtalmologiques : . Comme l’observation à la lampe à fente, le prélèvement des larmes par capillarité et l’esthésiométrie réalisés en baseline, au premier, troisième, cinquième, septième et quatorzième jour après l’induction. La durée de ces examens ne dépasse pas cinq minutes par animal : . Comme la tomographie en cohérence optique (OCT) ou microscopie confocale in vivo seront réalisées avant l’induction et une fois par semaine. Ces deux examens se font après une anesthésie légère afin d’immobiliser l’animal et permettre l’obtention de résultats interprétables. 3. Les administrations de traitements comme : . Les instillations topiques (collyres) durent d’une à deux minutes par application sur animal vigile à une fréquence de trois fois/jour en moyenne (max. six à huit fois/jour) sur la durée totale de l’étude à savoir 1 à 4 semaines ; . Les injections intra- ou péri-oculaires sous anesthésie locale et générale qui ne durent que quelques minutes et peuvent être quotidiennes, comme les injections systémiques sur animal vigile et réparties sur l’ensemble de l’étude à savoir 1 à 4 semaines. 4. Les prélèvements sanguins généralement réalisés une fois par semaine sur animal vigile sont définis en fonction du volume de prélèvement et du temps de récupération de l’animal. Ce prélèvement veineux est rapide puisqu’il ne dure qu’une à deux minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables anticipés dans le cadre de ce projet sont considérés comme modérés. Les données issues de la littérature et des expériences antérieures indiquent que les manifestations les plus fréquentes incluent : une hyperémie conjonctivale liée à une inflammation locale modérée, notamment après les procédures d’induction ou d’administration; un saignement léger et transitoire au site d’incision ou d’injection; des troubles cornéens, tels qu’une opacification, une kératite superficielle à profonde avec ulcération. Une perte de sensibilité cornéenne induite par la dénervation est également attendue et constitue un élément central du modèle. Elle peut aussi s’accompagner d’une diminution de la sécrétion lacrymale et d’une altération de la cicatrisation épithéliale. Toutes ces manifestations ne devraient pas générer de douleur manifeste après le réveil de l’animal, conformément aux observations des modèles de référence et qu’une prémédication analgésique pourra être administrée pour limiter d'éventuelle douleur. Les examens et administrations nécessitent une contention brève, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes. Des mesures spécifiques (habituation, manipulation douce, environnement calme) seront mises en place pour limiter cet impact. Les procédures plus invasives, telles que les injections péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire mais ne présentent pas de risque significatif à long terme.

Devenir

À l’issue de la procédure expérimentale, tous les animaux ayant suivi l’intégralité du protocole seront euthanasiés de manière éthique et réglementée, afin de permettre la réalisation des analyses ex vivo nécessaires à la validation des résultats scientifiques (analyses histologiques, dosages biochimiques, études moléculaires, etc.). Cependant, les animaux n’ayant pas été inclus dans la totalité de la procédure — estimés à environ 10 %, hors exclusions liées aux points limites — pourront être réutilisés dans d’autres protocoles expérimentaux compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Ces animaux sont généralement exclus en raison d’un défaut anatomique ou physiologique détecté lors des examens de baseline, notamment au niveau de l’œil, avant le début de l’induction de la pathologie. Ces individus n’auront reçu ni induction de la kératopathie neurotrophique, ni administration de traitement, mais auront uniquement été soumis à des examens non invalidants, parfois réalisés sous anesthésie légère. Leur réutilisation, lorsqu’elle est possible, s’inscrit dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R, tout en garantissant le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.

Remplacement

L’œil est un organe sensoriel d’une grande complexité, composé de structures anatomiques et physiologiques très diverses (cornée, cristallin, rétine, nerf optique...), interagissant de manière dynamique avec leur environnement local et systémique. Il est soumis à des variations mécaniques, physicochimiques et biologiques constantes, qui influencent directement sa fonction et sa réponse aux traitements. Bien que des méthodes alternatives aient été développées ces dernières années, telles que les cultures cellulaires, les organoïdes ou les modélisations in silico, ces approches, bien qu’utiles, ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions fonctionnelles et pharmacocinétiques observées dans un œil vivant. En particulier, elles ne permettent pas de simuler de manière fiable les effets de la dénervation sensitive, les altérations de la cicatrisation cornéenne, ni les réponses neurodégénératives complexes impliquées dans la kératopathie neurotrophique. Dans ce contexte, le recours à un modèle animal reste actuellement indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, notamment pour : 1. Reproduire fidèlement les conditions pathologiques de la kératopathie neurotrophique, 2. Évaluer l’efficacité et la tolérance de nouvelles approches thérapeutiques dans un organisme vivant, 3. Étudier les effets à long terme sur la cornée et les structures nerveuses associées dans un environnement physiologique complet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été délibérément limité afin de respecter les principes éthiques liés à l’expérimentation animale, tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour permettre une analyse fiable et reproductible des résultats et déterminer l’effectif optimal nécessaire à la détection d’un effet significatif. Ce calcul permettra, le cas échéant, d’ajuster à la baisse le nombre d’animaux inclus dans les procédures, sans compromettre la validité scientifique des conclusions. Dans une démarche active de réduction du nombre d’animaux utilisés, plusieurs stratégies complémentaires seront mises en œuvre. L’utilisation de méthodes non invasives pour le suivi de la pathologie, telles que l’imagerie cornéenne en temps réel (OCT, microscopie confocale), permettra de réaliser des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, évitant ainsi la nécessité de sacrifices à chaque point d’analyse. Lorsque cela est scientifiquement pertinent, les deux yeux d’un même animal pourront être analysés, ce qui permet de doubler les données collectées sans augmenter le nombre d’animaux. Par ailleurs, l’optimisation des protocoles expérimentaux (standardisation des conditions d’induction de la dénervation, contrôle rigoureux des paramètres environnementaux et biologiques) contribuera à limiter la variabilité interindividuelle et à maximiser la robustesse des résultats. Enfin, une attention particulière sera portée à la formation des opérateurs et à la qualité des soins apportés aux animaux, afin de garantir leur bien-être tout au long de l’étude.

Raffinement

Un suivi quotidien rigoureux des animaux sera assuré tout au long des études afin de détecter rapidement tout signe de stress, d’inconfort ou d’effet indésirable lié aux procédures expérimentales. Cette surveillance permettra une intervention rapide et adaptée, conformément à des points limites prédéfinis, conçus pour être précoces, prédictifs et spécifiques à la pathologie étudiée. Ces points limites visent à réduire toute douleur potentielle et à garantir une prise en charge éthique et réactive des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages enrichies, avec accès libre à la nourriture et à l’eau (ad libitum). L’environnement sera optimisé par des abris, des matériaux à ronger et des structures d’exploration favorisant le bien-être psychologique et comportemental. Une attention particulière sera portée à la qualité des conditions d’hébergement, à la réduction du stress et à la stimulation des comportements naturels. Dans le cadre du projet, une anesthésie générale sera indispensable lors des chirurgies d’induction afin d’assurer l’immobilité de l’animal. Elle pourra être complétée par une anesthésie locale si nécessaire. Une prémédication analgésique sera administrée pour limiter la douleur, et une antibioprophylaxie locale pourra être appliquée au niveau de l’œil ou de l’incision en cas de risque infectieux. Les examens destinés à évaluer la kératopathie neurotrophique seront principalement non invasifs et similaires à ceux pratiqués en ophtalmologie humaine ou vétérinaire, tels que l’imagerie cornéenne, la mesure de la sensibilité cornéenne et l’évaluation de la cicatrisation épithéliale. Ces techniques permettront des suivis longitudinaux sur les mêmes individus, réduisant le nombre d’animaux nécessaires et évitant leur euthanasie à chaque point d’analyse. Lorsque l’immobilité est requise, une anesthésie légère et courte pourra être administrée pour assurer le confort et limiter le stress. Après chaque anesthésie, les animaux seront sous environnement chauffant pour prévenir l’hypothermie. Une hydratation locale sera réalisée sur les cornées jusqu’au réveil afin d’éviter les complications oculaires. Les animaux seront ensuite replacés dans leur environnement habituel pour réduire le stress post-manipulation. Ce projet a été validé par un comité d’éthique sera suivi par la structure en charge du bien-être animal.

Choix des espèces

Les espèces sélectionnées pour ce projet, le rat et la souris, présentent des caractéristiques anatomiques, physiologiques et métaboliques bien documentées dans la littérature scientifique, ce qui facilite l’extrapolation des résultats vers l’humain, notamment dans le contexte des pathologies cornéennes telles que la kératopathie neurotrophique. Ces deux espèces sont couramment utilisées dans les modèles expérimentaux validés de dénervation cornéenne et de régénération nerveuse, et leur emploi repose sur une expérience étendue au sein de la communauté scientifique. Leur utilisation permet une grande flexibilité expérimentale, notamment en termes de suivi longitudinal, d’imagerie cornéenne et de quantification des marqueurs moléculaires. L’expérience accumulée avec ces modèles garantit la reproductibilité des résultats, la comparabilité avec d’autres études précliniques, et la pertinence des données obtenues pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Le choix de ces espèces s’inscrit dans une démarche scientifique rigoureuse, éthique et translatoire, visant à maximiser la qualité des résultats tout en respectant les principes de l’expérimentation animale. Les animaux utilisés dans ce projet seront des jeunes adultes, âgés d’au minimum 6 semaines pour les rats et d’environ 5 à 6 semaines pour les souris, correspondant à une maturité fonctionnelle et physiologique des structures cornéennes et nerveuses impliquées dans la kératopathie neurotrophique. Ce stade de développement garantit une réponse cohérente aux protocoles d’induction de la pathologie, ainsi qu’une meilleure reproductibilité des résultats. Le choix de cette tranche d’âge permet également d’éviter les biais liés à la croissance ou à la sénescence, tout en assurant une bonne tolérance aux procédures expérimentales.