Rongeurs
Immunisation par des nanoparticules d’ARN chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut être mise à jeun jusqu'à six fois, gavée sans anesthésie et soumise jusqu'à six prises de sang sous anesthésie, avec des isolements de trente minutes pour recueillir ses fèces. Il s'agit de vérifier si des nanoparticules d'ARN messager avalées déclenchent une réponse immunitaire dans l'intestin, le vaccin oral restant un bénéfice "à long terme". Des essais sur cellules et sur un intestin reconstitué en trois dimensions ont précédé, mais le porteur écrit que ces méthodes "ne reflètent pas entièrement la réalité du corps vivant".
Objectifs
Développer des vaccins plus efficaces contre les infections au niveau des muqueuses est un enjeu important, notamment celles qui commencent au niveau des muqueuses. Les muqueuses sont en effet la porte d’entrée de nombreux virus et bactéries. Parmi elles, la muqueuse intestinale est particulièrement intéressante, car elle contient de nombreux éléments du système immunitaire et peut déclencher une forte défense directement à l’endroit où l’infection débute. Cependant, administrer un vaccin par voie orale est difficile à cause de l’acidité de l’estomac, des enzymes digestives et de la couche de mucus qui protège l’intestin. La pandémie du Covid-19 a permis le développement de nouveaux vaccins utilisant l’ARN messager (ARNm), une molécule naturellement présente dans notre organisme qui donne aux cellules les instructions pour fabriquer des protéines. Cet ARNm est transporté par des nanoparticules composées de lipides. Néanmoins, il n’existe encore aucun vaccin à ARNm pouvant être pris par voie orale. Pour relever ce défi, des nanoparticules combinant des lipides et des polymères pourrait offrir une meilleure protection de l’ARNm et faciliter son passage jusqu’à la muqueuse intestinale. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer si ces nanoparticules peuvent induire une réponse immunitaire après administration par voie orale.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer les capacités d’immunisation des nanoparticules d’ARNm chez la souris. Les bénéfices scientifiques du projet portent principalement sur la compréhension des mécanismes impliqués dans l’induction d’une réponse immunitaire au niveau de l’intestin (cinétique d’apparition des anticorps, acteurs immunitaires, chimie et composition des nanoparticules utilisées). Le bénéfice majeur du projet à long terme est le développement d’un vaccin à ARNm administré par voie orale, pouvant être adapté à différents agents infectieux touchant le système digestif.
Procédures
560 souris seront soumises à des mises à jeun (6 fois par animal maximum) et à des injections et/ou administrations (6 fois/animal maximum, durée moins d’une minute par administration), dont 370 maximum seront administrées sous anesthésie (1 fois/animal, durée 5min). Un groupe de 285 souris sera soumis à des prélèvements sanguins (3 fois/animal, durée 1 min) sous anesthésie (3 fois/animal, durée 5 min), prélèvement de fèces (6 fois/animal, durée maximal de l'isolement : 30 min) et des prélèvements de salive (2 fois/animal, durée 1 min). Un autre groupe de 275 souris sera soumis à des prélèvements sanguins (6 fois/animal, durée 1 min) sous anesthésie (6 fois/animal, durée 5 min), prélèvement de fèces (6 fois/animal, durée maximal de l'isolement : 30 min) et des prélèvements de salive (2 fois/animal, durée 1 min).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont : - Contention : la manipulation des animaux peut entraîner un stress léger et transitoire. - Anesthésie gazeuse : la phase d’induction peut générer un stress modéré en raison du bruit, de l’odeur et d’une sensation respiratoire désagréable. - Mise à jeun : les souris seront mises à jeun six heures avant l’administration par gavage oral, ce qui peut entraîner une hypoglycémie transitoire, une augmentation du stress et une légère hypothermie. - Administration dans le muscle : l’injection peut induire un inconfort léger au site d’injection. - Administration orale par gavage : ce geste réalisé sur animal vigile entraîne un stress léger lié à la contention et un inconfort transitoire post-administration. - Prélèvement de sang : un risque de lésion des vaisseaux sanguins et des nerfs oculaires existe (risque faible lorsque le geste est maîtrisé). - Prélèvement des fèces : l’isolement temporaire des animaux est indispensable pour prélever les fèces et peut être à l’origine d’un stress léger. - Administration dans le ventre : réalisée sur animal vigile, ce geste peut entrainer un stress léger dû à la contention et un inconfort léger au site d’injection (procédure de classe légère). - Administration d'une molécule qui peut induire des effets transitoires tels que des tremblements, une diarrhée, une piloérection et une augmentation du toilettage.
Devenir
A l’issu des procédures, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de prélever les organes d’intérêts.
Remplacement
Avant de tester les nanoparticules chez l’animal, des expériences ont été réalisées sur des cellules intestinales et immunitaires, ainsi que sur un modèle en trois dimensions reproduisant partiellement l’intestin humain. Cependant, ces modèles ne reflètent pas entièrement la réalité du corps vivant et ne possèdent pas certaines structures de la paroi intestinale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet tout en garantissant des résultats fiables. Au total, le projet prévoit l’utilisation de 560 souris sur une période de 5 ans. Des tests préliminaires ont permis de sélectionner uniquement les formulations les plus prometteuses, ce qui réduit fortement le nombre d’animaux nécessaires. Les formulations seront évaluées et comparées progressivement. Celles ne donnant pas de résultats satisfaisants seront écartées, afin de concentrer les études sur un nombre restreints de candidats. A terme, seules quatre formulations seront retenues pour les étapes finales. De plus, un schéma vaccinal optimisé sera sélectionné afin de réduire davantage le nombre d’animaux utilisés. Cette approche progressive et sélective permettra de limiter au maximum le nombre d’animaux.
Raffinement
Dans l’ensemble du projet, des mesures seront appliquées afin de limiter la souffrance et le stress des animaux tels que l’ajout d’enrichissement dans le milieu en cas de stress, une mise à jeun de jour ce qui correspond à une période où les animaux sont moins actifs et ont l'habitude de moins manger, des administrations réalisées sous anesthésie générale, des prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale et locale et un suivi accru des souris après chaque manipulation. Des points limites sont définis afin de repérer rapidement tout signe de souffrance ou de problème chez les animaux. Si l’un de ces critères est atteint, des mesures seront prises immédiatement, et si nécessaire, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance.
Choix des espèces
La souris est un modèle couramment utilisé dans le développement de vaccin. Dans ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées afin d’analyser la réponse immunitaire induire par des nanoparticules. Des souris de plus de 8 semaines seront utilisées afin d’assurer un système immunitaire mature.
Effet antitumoral d’un composé combiné à différents hydrogels
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 728 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser tumeurs et cellules immunitaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules tumorales sous la peau, elles reçoivent de trois à onze injections d'un composé oncolytique associé à des hydrogels de chitosan, et leurs tumeurs sont mesurées au pied à coulisse tous les deux ou trois jours. Les tumeurs peuvent provoquer des douleurs locales, les traitements une perte d'appétit et de poids, pour des retombées cliniques que le porteur renvoie au "plus long terme". Il juge "indispensable" de confirmer in vivo des données obtenues in vitro, et affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier l'activation immunitaire.
Objectifs
Les approches d’immunothérapie anticancéreuse ont profondément modifié la prise en charge de certains cancers. Néanmoins, seule une fraction des patients présente une réponse durable, en particulier lorsque les tumeurs sont peu infiltrées par les cellules immunitaires. Notre composé est un composé oncolytique membranolytique conçu pour induire localement la mort des cellules tumorales. Cette lyse provoque la libération simultanée d’antigènes tumoraux et de signaux de danger, susceptibles d’activer le système immunitaire. Le projet vise à optimiser cette stratégie en combinant notre composé à différents hydrogels de chitosan. Le chitosan présente un double intérêt scientifique : il augmente la rétention intratumorale du composé grâce à ses propriétés de gel visqueux et mucoadhésif, et il possède des propriétés immunostimulantes/adjuvantes susceptibles de « primer » le microenvironnement tumoral en faveur d’une immunité anticancéreuse. Il existe différentes formulations de Chitosan qui influencent la viscosité, la libération locale du composé et l’immunomodulation. Nous commencerons par déterminer les formulations les plus aptes à potentialiser l’effet antitumoral de notre composé. Puis, les procédures suivantes nous permettront de définir les paramètres les plus favorables à l’obtention d’une réponse antitumorale durable. Nous utiliserons d’abord une approche vaccinale qui pourrait permettre d’exploiter l’effet oncolytique et immunogène de de notre composé sans dépendre uniquement d’une injection intratumorale directe, ce qui serait pertinent pour les lésions non injectables ou les maladies disséminées/métastatiques. Nous vérifierons ensuite si le blocage du point de contrôle immunitaire PD-1 améliore l’effet antitumoral du composé avec son chitosan et définirons plus précisément quels types de cellules immunitaires (Cellules T et/ou cellules dendritiques) sont à l’origine de cet effet.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra d’identifier les formulations de chitosan les plus aptes à potentialiser l’activité antitumorale de notre composé. L’étude fournira des informations importantes sur l’impact des propriétés physicochimiques du Chitosan, son efficacité thérapeutique et sa capacité à induire une réponse immunitaire antitumorale. Elle permettra également de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés à cette combinaison. Ces connaissances contribueront à optimiser l’utilisation de notre molécule et à définir les paramètres les plus favorables à l’obtention d’une réponse antitumorale durable. À plus long terme, les résultats pourraient soutenir le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques à visée translationnelle, notamment l’optimisation d’une formulation locale de notre composé destinée au traitement de tumeurs accessibles à une injection intratumorale, avec l’objectif d’améliorer l’efficacité clinique tout en limitant les administrations répétées.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis trois à onze injections sous anesthésie locale (vigile,
Impact sur les animaux
Les nuisances découleront des interventions et greffes suite à une injection de cellules tumorales sous anesthésie, des injections de traitements, par contention de l’animal avec anesthésie locale, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse tous les deux ou trois jours. Ces différentes manipulations pouvant entraîner du stress chez l’animal. Les croissances tumorales en sous-cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Les traitements médicamenteux peuvent entraîner une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée chez la souris ainsi qu’un possible changement léger de température.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse des tumeurs et des cellules immunitaires après traitement.
Remplacement
Il est indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude de l’activation du système immunitaire et son effet sur la croissance tumorale.
Réduction
Chaque groupe comprendra 10 souris, soit 9 animaux nécessaires définis par un logiciel de statistique spécifique et 1 animal supplémentaire pour tenir compte des exclusions possibles (tumeurs hétérogènes au moment du traitement, problème comportemental, atteinte précoce d’un point limite ou mortalité non liée au traitement). Les deux sexes seront utilisés, avec des lots non mixtes, afin de détecter d’éventuelles différences liées au sexe sans risque d’accouplement ni agressivité liée au mélange des animaux. Les expériences seront conduites de manière séquentielle : seules les meilleures formulations identifiées dans les procédures initiales seront poursuivies dans les procédures mécanistiques ultérieures, ce qui limite le nombre d’animaux exposés. Les contrôles seront mutualisés lorsque cela est possible et l’étude sera arrêtée si les premières expériences ne soutiennent pas l’hypothèse scientifique.
Raffinement
Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. Par ailleurs, il s’agit d’un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Enfin, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux sont utilisés au stade adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.
Élevage d’une lignée de souris à phénotype dommageable d’une pathologie neuromusculaire héréditaire
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris de cette lignée sont tuées systématiquement à sept mois, l'âge où leur cardiomyopathie dilatée évolue en insuffisance cardiaque. 823 souris vont être utilisées dans ce projet d'élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie subissant une biopsie de queue pour le génotypage. Dès quatre mois, les souris atteintes développent une atteinte cardiaque et musculaire, une cyphose et une perte d'environ 20 % de leur poids, et le porteur indique qu'aucun signe de douleur n'apparaît avant sept mois selon la grille de l'établissement. Les reproductrices et reproducteurs sont tués en fin de période reproductive, les autres souris partent en "utilisation continue" dans d'autres projets, en cours ou à venir.
Objectifs
Le but de ce projet est d’entretenir une lignée transgénique de souris, modèle murin d’une pathologie neuromusculaire héréditaire, le syndrome d'Emery Dreifuss. Cette pathologie est une maladie rare et à l’heure actuelle il n’existe pas de thérapie curative pour les patients. Cette lignée est un outil essentiel pour approfondir nos connaissances sur la physiopathologie et le développement de thérapies innovantes pour cette pathologie. Cette lignée, n’est pas commercialisée et n’est donc pas disponible en dehors de notre établissement utilisateur. Ce projet permettra le maintient de cette lignée, pour fournir les animaux pour ce projet et pour les autres projets de l’équipe déjà en cours et approuvés par le ministère ou à venir, qui feront l’objet d’un dépôt de dossier afin d’obtenir les autorisations nécessaires.
Bénéfices attendus
Le bénéfice premier de projet est de maintenir notre lignée de souris transgénique en évitant la dérive génotypique afin de fournir des animaux pour les projets en cours ou à venir de l’équipe. Cette production d’animaux permettra de fournir des lots expérimentaux qui seront utilisés pour mettre en évidence de nouveaux mécanismes de signalisation moléculaire impliqués dans le développement des troubles du rythme cardiaque et de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Au 1er janvier 2023, environ 2,74 millions de personnes en France avaient un antécédent d’hospitalisation pour trouble majeur du rythme ou trouble de conduction cardiaque. Cela correspond à une prévalence d’environ 3,2 pour cent de la population française pour la fibrillation atriale, 1,9 pour cent pour les troubles de conduction, et 0,4 pour cent pour les tachycardies ventriculaires ou arrêts cardiaques nécessitant une hospitalisation.
Procédures
Une biopsie de queue d’environ un millimètre sera réalisée sur une partie des animaux pour lesquels une identification génétique est nécessaire.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettiques de type oxydatif, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animal à 4 mois (environ 20 g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. En se référant à l’échelle de la grille d’observation fournie par notre établissement utilisateur, les animaux ne présentent aucun signe caractéristique de douleur avant l’âge de 7 mois. Le génotypage invasif d’une partie des animaux provoque un stress et une douleur de courte durée.
Devenir
Tous les animaux reproducteurs seront euthanasiés en fin de période reproductive. Les souriceaux issus des accouplements serviront d’une part comme animaux reproducteurs et seront euthanasiés en fin de période reproductive. D’autre part, ils serviront en utilisation continue au sein des projets de recherche autorisés en cours et de projets à venir après leur autorisation.
Remplacement
Nous sommes toujours dépendants de l’utilisation de modèles animaux car les questions que nous abordons ne peuvent l'être dans des modèles cellulaires. En effet, les cellules cardiaques adultes, ayant atteint un état de différenciation terminale, ne se divisent pas. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. De plus, ces cellules adultes ne se conservent en culture primaire que quelques jours et ne peuvent pas être transfectés par des agents de transfection non viraux. D'autre part, aucun modèle d'expression in vitro ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques de la cellule cardiaque (expression de protéines spécifiques dans des domaines cellulaires spécifiques). Bien qu’il existe des lignées cellulaires issues de cellules souches, celles ci ne résument la physiologie d’un cœur adulte que partiellement. Elles seront toutefois utilisées pour tester certaines de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans ce projet est évalué à partir de la connaissance et l’expérience approfondie de l’investigateur principal en matière d’entretien de lignée de souris. Le nombre d’accouplements par an et par génotype est évalué en fonction de la durée d’un accouplement, du temps moyen entre deux portés, du nombre de portées moyen par femelle, de la taille moyenne d’une portée (sevrée), du taux de sevrage, du taux de mortalité, du sexe ratio, du génotype ratio, de l’indice de reproductivité. Le nombre total d’animaux est estimé à 823. Ce projet ne nécessite pas d’analyses statistiques. Les tests statistiques seront réalisés dans les projets autorisés qui inclueront ces animaux d'élevage. La lignée est cryoconservée en cas de non‑utilisation prolongée. La gestion des accouplements sera adaptée en fonction de la demande en animaux des projets associés autorisés.
Raffinement
Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum pour les cages après sevrage, jusqu'à 15 (souriceaux et reproducteurs) pour les cages de reproduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. L'hébergement individuel des animaux est évité au maximum, cependant il est possible que certains animaux se trouvent isolés de manière imprévue (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, mâle dominant ayant blessé les autres animaux de la cage, dernier animal dans la cage…). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. Afin de réduire la contrainte liée au phénotype dommageable et de ne pas atteindre les points limites, une grille d'observation mise en place par la Structure chargée du Bien-Être Animal du site est utilisée pour suivre l’évolution du phénotype au cas par cas. Les animaux seront euthanasiés systématiquement à l’âge de 7 mois.
Choix des espèces
La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de ses systèmes cardiovasculaire et musculaire avec ceux des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant une mutation responsable à l’état homozygote du syndrome d’Emery-Dreifuss. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les animaux seront utilisés pour les accouplements à maturité sexuelle entre 2,5 et 6 mois.
Etude de molécules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux dans un modèle d’ischémie chez le rat. EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérés au cou pour qu'un caillot de sang injecté dans leur carotide interne provoque un accident vasculaire cérébral, 413 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après l'AVC, ils peuvent perdre l'équilibre, présenter une faiblesse des membres et avoir du mal à manger et à boire les premiers jours, puis passent deux IRM sous anesthésie ainsi que le neuroscore et le corner test à J1, J3 et J7. Les molécules testées sont fournies par un partenaire industriel, en vue d'essais cliniques et d'une "mise sur le marché dans les années à venir". Pour justifier le choix du rat, le porteur cite notamment "le coût relativement bas, et la logistique aisée".
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est pathologie cérébrale causée par un caillot sanguin qui bloque une artère dans le cerveau. Actuellement, le traitement principal consiste à administrer un médicament appelé activateur tissulaire du plasminogène (tPA) pour dissoudre le caillot, parfois associé à une intervention chirurgicale appelée thrombectomie. Cependant, ces traitements ne sont pas toujours efficaces et peuvent avoir des effets secondaires graves, limitant leur utilisation à moins de 10% des patients. De plus, l'efficacité du tPA peut varier en fonction de la nature du caillot et de l’origine de la maladie. Pour améliorer la prise en charge des patients à long terme, il est crucial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre projet vise à étudier chez le rongeur différentes façons d'administrer des médicaments pour voir comment ils affectent les dommages cérébraux, les saignements dans le cerveau et la récupération après un AVC. Nous utiliserons un modèle d'AVC chez le rat, largement utilisé en recherche. Cela nous permettra d'étudier comment différents traitements pourraient aider les rats à se remettre après un AVC, ce qui pourrait avoir des implications importantes pour le traitement des patients victimes d'AVC. Ce projet sera réalisé sur deux sites, avec un site pour la réalisation des chirurgies et l’évaluation comportementale et un site pour l’imagerie.
Bénéfices attendus
Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (
Procédures
Se déroulera à J-1 un prélèvement de sanguin sur tous les animaux vigiles au niveau de la veine caudale. Ce prélèvement ne prendra pas plus de 5 minutes. Tous les animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir injecter un caillot de sang dans la carotide interne provoquant ainsi un AVC. Une fibre doppler sera positionnée sur la tête afin de valider l’AVC. Cet acte chirugical durera 30 minutes, AVC + pose de la fibre. A J+1 et J+7, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 20 minutes. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux, jusque 3 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J3 et J7. Nous comptons un total de 15 minutes pour la prise du neuroscore et moins de 10 minutes pour le corner test. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une anesthésie léthale. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes, comprenant la récupération de tissu post-mortem.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir des déficits sensorimoteurs dus aux lésions cérébrales de certaines parties du cerveau. Ces déficits sont visibles chez l'animal à court et moyen terme, ce qui nous permet d'effectuer des tests comportementaux et de tirer des conclusions pertinentes. Après un AVC, les animaux peuvent présenter des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres du côté opposé à la lésion cérébrale. Dasn les premiers jours suivant l'AVC, ils peuvent également rencontrer des difficultés à manger, à boire et à intéragir avec leur environnement, nécessitant une surveillance particulière.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font des rats le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, rattus norvegicus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.
Réduction
Pour l’étape de mise au point, nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction tout en aquérant un certain niveau d'expertise technique. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon l'expertise nécessaire à la bonne réalisation des gestes techniques. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire pour cette étape de mise au point, a été calculé selon l’expérience de l’expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes) désigné pour réaliser ces gestes chirurgicaux. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 15 par groupe dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux, l’augmentation de l’effectif à 20 par groupe expérimentaux est prévu mais non obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 15 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages conformes à la Directive, isolées des nuisances sonores, avec enrichissements, nourriture et eau ad libitum. Les rats sont maintenus à 2 par cage. Le bien-être est suivi deux fois par jour en semaine et quotidiennement les week-ends et jours fériés par du personnel qualifié. Lors des chirurgies, les animaux sont anesthésiés avec analgésie pour soulager la douleur. La température corporelle des rats sera maintenue stable pendant la chirurgie. Le site opératoire est tondu, désinfecté et reçoit une application d'anesthésiant local. Les sutures seront faites par points séparés afin de limiter le risque de déhiscence. Au réveil, les animaux sont placés en cage individuelle chauffée, puis remis en cage avec alimentation facilitée et gel nutritif. La surveillance est continue et renforcée en post-opératoire immédiat. Les points limites sont définis ; en cas de dépassement, ils seront mis à mort. Un suivi strict est assuré les jours suivants (pesée, état général). Le transport entre établissements s’effectue dans les cages d’origine, sur chariot, via un passage souterrain sans exposition extérieure, avec maîtrise des vibrations. À l’arrivée, une période de repos d’1 h est respectée avant toute manipulation.
Choix des espèces
Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et le rat, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font des rats un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation des rats devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés de 6 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids allant de 250 à 275 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles dèjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.
Etude pilote de mise en place de modèles de croissance tumorale prostatique chez la souris avec un système immunitaire fonctionnel.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
Deux séances d'imagerie par bioluminescence sous anesthésie chaque semaine, jusqu'à douze semaines, et autant de contentions pour des injections dans le péritoine : 128 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever la tumeur et d'autres organes. Certaines subissent une chirurgie pour recevoir des cellules cancéreuses dans la prostate, avec un risque d'inflammation chronique et d'incontinence urinaire, d'autres une injection sous la peau dont la tumeur peut devenir nécrotique et douloureuse. Ce projet pilote sert à mettre au point des greffes tumorales, avant de futures études sur les macrophages. Le porteur présente l'effectif comme "le minimum requis", tout en écrivant que l'étude se passe de toute analyse statistique.
Objectifs
Le cancer de la prostate (CaP) représente le premier cancer chez l'homme en France. La majorité des patients CaP évolue favorablement, mais environ 20% de ces patients développent une maladie agressive avec l’apparition de métastases. Pour ces patients, des hormonothérapies visant à bloquer la voie du récepteur des androgènes (RA) et de la chimiothérapie sont proposées, mais des résistances apparaissent amenant au décès de près de 8700 patients chaque année. La compréhension des mécanismes de résistance thérapeutique est donc l’un des grands enjeux dans le domaine du CaP. Il a été montré ces dernières années que les cellules non cancéreuses comme les macrophages associés aux cellules tumorales (TAM) participent au développement du CaP et à sa résistance aux traitements. Nous souhaitons étudier l’impact des différents traitements, dont l’hormonothérapie, sur ces TAM dans un contexte tumoral. L’objectif de ce projet est de mettre en place des modèles de croissance tumorale prostatique utilisant des cellules cancéreuses murines. Ces lignées seront injectées chez des souris ayant un système immunitaire fonctionnel. Ces cellules proviennent de la même souche de souris ce qui permet à la tumeur de se développer. Les cellules tumorales seront injectées dans deux conditions : en sous-cutanée ou en intra-prostatique. Plusieurs lignées cellulaires et plusieurs quantités de cellules seront testées pour mettre au point les modèles. Enfin la mise en place de ces modèles sera également testée dans une lignée de souris possédant des macrophages de fluorescences différentes selon leur provenance ce qui permet d’étudier l’hétérogénéité des macrophages au sein des tissus.
Bénéfices attendus
Les études récentes montrent une implication de plus en plus importante des cellules immunitaires et en particulier des macrophages dans de nombreuses pathologies, notamment le cancer et les maladies inflammatoires. La mise en place de ces modèles est un départ essentiel qui permettra d’étudier par la suite le rôle des macrophages dans un contexte de tumeur prostatique et permettra à moyen terme de mieux comprendre leur hétérogénéité et leur complexité notamment lors des différents traitements de chimiothérapie et d’hormonothérapie. A plus long terme ce projet permettra d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cancer de la prostate afin d’éviter la résistance aux traitements.
Procédures
Les animaux au cours de ce projet seront soumis à des injections dans le péritoine et des contentions régulières (deux fois par semaines pendant 12 semaines au maximum). Certaines souris subiront une chirurgie pour une injection de cellules cancéreuses de la prostate. Elles subiront également des prises d’images de bioluminescence sous anesthésie (deux fois par semaines pendant 12 semaines au maximum).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus seront dus à l’acte chirurgical et à la croissance des tumeurs. La croissance tumorale sous-cutanée peut engendrer un inconfort de déplacement, parfois des nécroses et des douleurs chroniques si la taille tumorale devient trop importante. La croissance tumorale intra-prostatique peut engendrer une inflammation chronique et une incontinence urinaire. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer une légère douleur transitoire. Tous les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière afin de détecter précocement tout signe de souffrance.
Devenir
A la fin de la procédure expérimentale les animaux seront mis à mort afin de prélever la tumeur et différents organes pour étudier le système immunitaire dans ces différents organes.
Remplacement
Des modèles cellulaires permettent d’étudier les macrophages dans des systèmes simples et l’étude des tissus de patients permettent d’intégrer ces données à des moments définis. Cependant l’étude dynamique de la complexité des populations de macrophages et notamment de l’impact des systèmes hormonaux et de leur inhibition (hormonothérapie) sur ces populations nécessite l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
Ce projet est une étude pilote qui permettra de mettre en place des modèles de croissance tumorale prostatique chez la souris présentant un système immunitaire fonctionnel. Cette étude ne nécessite pas d’analyse statistique. Le nombre d’animaux présenté est le minimum requis pour s’assurer de la mise en place du modèle. Il permettra d’obtenir des données sur la variabilité de la croissance tumorale qui serviront par la suite à calculer le nombre d’animaux nécessaire aux prochaines études. Pour la greffe intra-prostatique, l’utilisation d’une imagerie du petit animal par bioluminescence permettant de suivre de manière non invasive dans le temps la croissance tumorale et de réduire le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
L’environnement d’hébergement sera enrichi par l’ajout systématique d’au moins deux éléments parmi du papier kraft, des carrées de coton, une maison en cellulose et un bout de bois à ronger accroché à la cage. Ces enrichissements permettront de diminuer fortement le stress et de favoriser les comportements naturels des souris. Un suivi quotidien des souris tout au long des procédures sera effectué et une évaluation bihebdomadaire de leur état sera effectuée à l’aide d’une grille de score. Cette grille permettra de détecter précocement tout signe de souffrance. L’injection intra-prostatique se fera sous anesthésie générale. Une analgésie pré- et post-opératoire sera administrée systématiquement afin de contrôler la douleur.
Choix des espèces
L'étude de la complexité des populations de macrophages lors de la croissance tumorale et particulièrement de l’impact des systèmes hormonaux sur ces populations sont des éléments importants pour comprendre le fonctionnement et le rôle du système immunitaire dans le cancer. Dans la littérature scientifique, la souris est l’espèce la plus largement utilisée comme modèle du cancer en général et plus particulièrement du cancer de la prostate. Elles sont un moyen unique de suivre et d'étudier les cellules immunitaire d'intérêts dans le cadre du cancer. Les souris de ce projet seront âgées de 6 à 8 semaines (matures d’un point de vue hormonal) et seront uniquement des mâles car seuls les mâles possèdent une prostate et les cellules tumorales prostatiques ont besoin des androgènes (testostérone) pour croitre.
Mise au point de solutions thérapeutiques dans le domaine de l’infection au virus SARS Cov2
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Hamsters dorés : 2150
4 300 rongeurs, 2 150 souris et 2 150 hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectés par le SARS-CoV-2 par le nez sous anesthésie, ils reçoivent ensuite des composés candidats, jusqu'à 84 fois par voie orale en six semaines ou par injection, et peuvent perdre du poids ou présenter des difficultés respiratoires. Une partie des souris est génétiquement modifiée pour porter la protéine humaine ACE2, et tous finissent par une ponction intracardiaque sous anesthésie profonde. Pour écarter les méthodes sans animaux non-humains, le porteur invoque "les exigences réglementaires de tous les pays de destination des produits".
Objectifs
Dans ce projet, nous voulons évaluer l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques contre le virus SARS-CoV-2, responsable de la COVID-19. Ces composés pourraient empêcher le virus d’entrer dans les cellules ou limiter sa multiplication dans l’organisme. Nous souhaitons également étudier la réponse immunitaire de l’organisme face à l’infection et déterminer si ces composés peuvent la moduler afin d’aider à éliminer plus rapidement le virus. La présence du virus sera mesurée grâce à des méthodes permettant de détecter son matériel génétique et sa capacité à infecter des cellules en laboratoire. Les différentes variantes circulantes du virus pourront également être étudiées. Les modèles d’infection utilisés chez le hamster reproduisent plusieurs caractéristiques observées chez l’Homme lors d’une infection par le SARS-CoV-2 et permettent ainsi d’évaluer l’efficacité potentielle des traitements. Les études pourront également être réalisées chez des souris génétiquement modifiées afin de rendre leur sensibilité au virus plus proche de celle de l’Homme. Dans ce projet, le virus SARS-CoV-2 est administré par voie intra-nasale sur animal anesthésié. Après l’infection, le virus se développe principalement dans les voies respiratoires et les poumons, ce qui permet d’étudier l’évolution de la maladie et l’effet des traitements testés. Dans ce projet, il est anticipé un total de de 40 études et 4300 animaux pour les 5 prochains années.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer l’efficacité de composés candidats dans des modèles animaux d’infection par le SARS-CoV-2. Les études réalisées permettront d’obtenir des données précliniques essentielles sur l’activité antivirale et l’impact des traitements sur la progression de l’infection. Plus largement, ces études permettront de produire des données précliniques d’efficacité dans des modèles pertinents de la maladie, nécessaires à l’évaluation et au développement de candidats thérapeutiques. À terme, ces données pourront contribuer au développement de traitements visant à réduire la sévérité de l’infection et ses complications chez l’humain.
Procédures
Aucune procédure chirurgicale ne sera mis en œuvre sur les animaux. Selon les procédures appliquées : • Infection des souris ou hamsters : Injection intra-nasale : anesthésie générale, 1 fois par animal, 2 minutes • Administration de composés thérapeutiques sur une durée de 24h à 2 semaines. Par voie orale (20mL/kg/dose), vigile, 1 à 2 fois par jour par animal maximum 84 administration pour une étude de 6 semaines avec deux administration par jour, 1 minute OU Par voie sous-cutanée (10mL/kg/dose) : anesthésie générale, 1 fois par jour maximum sur 5 jours maximum, durée 1 minute OU par voie intramusculaire (0.05ML/site): anesthésie générale, administration unique quel que soit la durée de l’étude donc 2 maximum, une pour chaque patte arrière, durée 1 minute OU par voie intrapéritonéale (20mL/kg/dose) : vigile, 1 fois maximum, durée 1minute OU par voie intrathécale (20µl max) : anesthésie générale, 1 fois maximum, durée 1minute OU par voie intraveineuse (5ml/kg) : vigile, 1 fois par jour maximum sur 5 jours maximum),, durée 1minute • Suivi clinique et pondéral : Pesée et bilan clinique tous les jours par animal sur la durée de l’étude, sur animal vigile. La périodicité sera adaptée en fonction des signes cliniques et des recommandations du vétérinaire. • Prélèvement sanguin : À la veine submandibulaire (1×/2 semaines, 1 prélèvement maximum par animal sur 2 semaines) ou à la queue chez la souris (avec une période de récupération adaptée), sur animal vigile, pendant 2 semaines maximum au cours de l’étude. Prélèvement terminal sous anesthésie profonde, par ponction intracardiaque, durée 2 minutes, sur tous les animaux du projet.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, les souris et les hamsters sont infectés par le virus responsable de la COVID-19 afin d'évaluer de nouveaux traitements. Au cours de l'infection, certains animaux peuvent présenter des signes de maladie, tels qu'une perte de poids temporaire, une baisse d'activité, un aspect plus fatigué ou des difficultés respiratoires généralement modérées. Les traitements testés dans cette étude ont pour objectif de limiter la multiplication du virus et de diminuer l'inflammation provoquée par l'infection. Ils sont donc susceptibles de réduire l'intensité et la durée des signes de la maladie chez les animaux. Les composés évalués ayant pour objectif de limiter la réplication virale et la réponse inflammatoire, leur administration devrait contribuer à réduire la sévérité et la durée des signes cliniques observés, mais dans la phase de développement de candidat-médicament, des effets secondaires imprévus ne sont jamais totalement exclus. Cependant, par expérience du Projet autorisé précédent, cela est pas/peu attendu avec les molécules testées. Cependant, par expérience du projet autorisé précédent, la survenue d’effets indésirables est peu attendue avec les molécules testées, notamment au regard des données de tolérance et des études PK/PD préalablement réalisées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin d’étude pour les nécessités scientifiques des études (prélèvements tissulaires terminaux). Dans le contexte infectieux, les règles de biosécurité ne nous permettent pas de garder ou d’envisager un autre devenir pour les animaux.
Remplacement
Aucune méthode évitant totalement le recours à l’animal selon les exigences réglementaires de tous les pays de destination des produits n’est développée à ce jour pour les procédures expérimentales décrites. A l’heure actuelle, les tests in vitro, effectués préalablement pour valider l’intérêt des cibles identifiées et l’efficacité de nouvelles molécules, ne permettent pas d’appréhender l’intégralité des mécanismes de l’infection et de l’interaction hôtes/pathogènes. C’est pourquoi, le recours à des modèles expérimentaux in vivo s’avère nécessaire pour la compréhension et l’évaluation des mécanismes d’actions des composés candidats. Ces modèles in vivo permettent également d’anticiper l’éventuelle toxicité des molécules thérapeutiques dans ces conditions complexes de relation hôte/pathogène (implication du système immunitaire).
Réduction
Le schéma expérimental des procédures de ce projet s’appuie sur les données bibliographiques actualisées ainsi que sur les résultats préliminaires obtenus au sein du laboratoire. Le nombre d’animaux nécessaires est déterminé au plus juste à l’aide de calculs de puissance statistique réalisés en collaboration avec un biostatisticien, afin de garantir la robustesse scientifique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Une stratégie de sélection en amont est systématiquement mise en œuvre. Les candidats sont d’abord évalués au moyen de tests in vitro et d’approches in silico permettant de prioriser les molécules les plus pertinentes. Seuls les composés présentant un profil compatible avec une évaluation in vivo sont retenus, ce qui permet de réduire significativement le nombre d’animaux exposés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe social de 3 à 5 animaux pour les souris et de 2 pour les hamsters compatibles dans des cages conformes aux normes réglementaires en vigueur et bénéficiant d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, abris). Les locaux d’hébergement et d’expérimentation sont suivis par un personnel spécifiquement formé et habilité. Les procédures mises en œuvre sont classées de gravité modérée et s’étendent de quelques heures à deux à quatre semaines selon le modèle étudié. Un suivi clinique quotidien est assuré et renforcé durant la phase aiguë post-infection si nécessaire. Lorsque cela est possible, une anesthésie générale ou locale est pratiquée pour les gestes techniques susceptibles d’induire une douleur. Des mesures analgésiques adaptées sont mises en place si la procédure le justifie. Les manipulateurs sont spécifiquement formés et régulièrement évalués dans leurs pratiques, ce qui permet de limiter le stress, la durée des manipulations et les risques de douleur ou de détresse pour les animaux.
Choix des espèces
Les études sont réalisées chez la souris et le hamster syrien, deux espèces couramment utilisées dans la recherche biomédicale. Certaines souris utilisées ont été modifiées afin de posséder une protéine humaine appelée ACE2, qui est le point d'entrée utilisé par le virus responsable de la COVID-19 pour infecter les cellules. Ce modèle permet de mieux comprendre le déroulement de l'infection et d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. D'autres lignées de souris présentant des caractéristiques génétiques particulières sont également utilisées afin d'étudier le fonctionnement du système immunitaire et la manière dont l'organisme réagit à l'infection. La souris est un modèle de référence en recherche, car de nombreux outils permettent d'analyser précisément les réponses biologiques observées. Le hamster syrien est également largement utilisé pour l'étude de la COVID-19, car il développe une maladie présentant des similitudes avec celle observée chez l'Homme. Il constitue donc un modèle pertinent pour évaluer l'efficacité de futurs traitements antiviraux avant leur utilisation dans des essais cliniques. La maturité du système immunitaire diffère selon l’âge et peut influencer le déroulement de l’infection. Pour les études d’infection par le SARS-CoV-2 réalisées chez le hamster et la souris transgénique K18-hACE2, des animaux adultes seront privilégiés, afin de disposer d’un système immunitaire mature et d’un modèle d’infection reproductible et représentatif. L’âge pourra toutefois être adapté en fonction du modèle utilisé, des données bibliographiques disponibles et des objectifs scientifiques de l’étude.
Endométriose modélisée chez les rongeurs pour l’étude de nouvelles stratégies thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Rats : 4032
8 064 rongeurs, 4 032 souris et 4 032 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Pour provoquer une endométriose, une partie reçoit du tissu d'endomètre greffé dans le péritoine au cours d'une chirurgie d'une heure, parfois après ablation des ovaires, avant des mesures de la douleur par le test de Von Frey et le comptage des léchages, et certains reçoivent un cathéter dans la vessie pour une cystométrie de quatre heures. Le porteur reconnaît que ces rongeurs n'ont pas de menstruations et ne développent pas la maladie, et les traitements testés peuvent durer jusqu'à 24 semaines. Les femelles atteintes sont tuées à la fin de la procédure, tandis que les témoins sans endométriose ni ovariectomie et leur descendance sont gardés en vie pour d'autres projets.
Objectifs
L’endométriose est une maladie gynécologique chronique où des cellules similaires à celles de la muqueuse de l’utérus (appelée endomètre) se développent en dehors de celui-ci. Elle touche environ 10% des femmes en âge de procréer et peut apparaître dès l’adolescence. Elle provoque des douleurs pelviennes souvent importantes et peut entraîner des problèmes d’infertilité. Ses causes ne sont pas entièrement connues. Une hypothèse fréquente est celle des règles dites « rétrogrades », où une partie du sang menstruel remonterait vers l’abdomen et y transporterait des cellules de l’endomètre. Mais d’autres facteurs semblent aussi intervenir, notamment le système immunitaire, la génétique et d’autres mécanismes biologiques. L’endométriose est donc une maladie multifactorielle. Il n’existe pas de traitement curatif à ce jour. Les traitements visent surtout à réduire les symptômes, notamment grâce à des hormones qui mettent le cycle au repos, mais qui peuvent avoir des effets secondaires. La chirurgie peut aussi être proposée, sans garantir une guérison définitive. Face à une origine encore mal connue, la recherche est essentielle. Les études sur tissus humains sont utiles mais insuffisantes pour reproduire tout le fonctionnement du corps. Les modèles animaux sont donc indispensables pour comprendre la physiopathologie et tester de nouvelles thérapies. Chez les animaux, les rongeurs sont les plus utilisés, mais ils ne développent pas naturellement l’endométriose car ils n’ont pas de menstruations. La maladie spontanée n’existe que chez l’humain et certains primates non humains. Chez les rongeurs, des modèles d’endométriose ont été développés, qui consistent à injecter ou à greffer dans la cavité abdominale de l’animal du tissu endométrial. Le rat et la souris seront utilisés dans ce projet, car aucun des modèles disponibles ne reproduit à lui seul l’ensemble des caractéristiques de l’endométriose humaine. Chaque espèce présente des avantages et des limites, notamment en termes d’anatomie et d’évaluation des paramètres fonctionnels ou comportementaux. Le choix de l’espèce et du modèle sera donc guidé par le rationnel scientifique de chaque étude et les objectifs expérimentaux poursuivis. Ce projet vise donc à optimiser les modèles animaux d’endométriose chez les rongeurs. Et ensuite, d’évaluer l’efficacité des nouveaux traitements sur ces modèles d’endométriose validés.
Bénéfices attendus
Selon l’organisation mondiale de la santé, l’endométriose touche environ 190 millions de personne à l’échelle mondiale. Elle a d’importantes répercussions sur la santé, la vie sociale et la situation économique des personnes touchées. Les douleurs aiguës qu’elle provoque, ainsi que les saignements menstruels abondants, la fatigue, la dépression, l’anxiété, l’infertilité, les difficultés en matière de santé sexuelle et l’isolement social, peuvent fortement compromettre la qualité de vie. Ce projet de recherche permettrait le développement d’un modèle robuste et valide d’endométriose chez le rat et la souris. Ensuite, le projet vise à évaluer les nouveaux traitements de l’endométriose sur ces modèles animaux, donc une preuve de concept préclinique, avant les essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
Tous les animaux ne subiront pas les mêmes nuisances. Une partie des animaux vont avoir une procédure chirurgicale pour l’implantation de tissus d’endomètre dans le péritoine afin d’induire l’endométriose. Cette procédure sera réalisée une fois pour l’animal et dure environ une heure sous anesthésie générale. Une ovariectomie peut être requise préalablement à l’induction de l’endométriose, et la procédure chirurgicale dure environ 30 minutes. Ensuite, les animaux vont recevoir une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et d’une molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 24 semaines). Des frottis vaginaux seront réalisés chez les animaux, avant le début de l’induction de l’endométriose une fois par jour pendant 14 jours, puis de manière ponctuel le jour des évaluations d’autres symptômes. Des évaluations de douleur seront faites, soit par observation et comptage du nombre de léchage pendant 10 à 20 minutes, soit par un test de douleur induit par l’application d’un filament sur l’abdomen ou les pattes (test de Von Frey) qui dure environ 30 minutes. Un test de fertilité par accouplement peut être réalisé afin d’observer le déroulement de la gestation. Les femelles seront mis en accouplement pendant 2 semaines au maximum et la gestation sera mené à terme (environ 3 semaines). Une deuxième partie des animaux vont avoir en plus des précédentes procédures expérimentales, une évaluation de leur fonction vésicale (cystométrie), précédée de l’implantation d’un cathéter vésical deux jours auparavant. La procédure chirurgicale d’implantation du cathéter est sous anesthésie générale et dure environ 1 heure, tandis que la cystométrie dure 4 heures. Enfin, si le protocole le requiert, des prélèvements de sang, du liquide intrapéritonéal et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 3 minutes.
Impact sur les animaux
Les chirurgies pour l’ovariectomie, l’implantation des pompes osmotiques, des lésions d’endométriose ou du cathéter vésical sont réalisées sur des animaux anesthésiés, sous antalgiques et avec une antibiothérapie prophylactique. Toutefois, une sensation d’inconfort peut apparaître chez l’animal après ces procédures, ainsi qu’un stress potentiellement induit par la période d’isolement après la chirurgie. Ces chirurgies durent moins d'une heure et réalisées une seule fois par animal. Un stress passager peut potentiellement être induit lors de l’évaluation de la douleur (test d’observation de fréquence de léchage de l’abdomen, et test par application du filament), et de la cystométrie, notamment lorsque l’animal sera seul dans sa cage pendant les évaluations. Ces évaluations de douleur durent entre 10 et 30 minutes. Elles peuvent être faites de manière hebdomadaire dans l'étude. L’administration des composés, la réalisation des frottis vaginaux et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress et ou une sensation d’inconfort passager chez les animaux. Ces manipulations peuvent être requises tout au long de l'étude selon le rationnel scientifique du composé à tester et suivant les limitations dans les bonnes pratiques en expérimentation animale pour les prélèvements sanguins. Le test d'accouplement peut engendrer un léger stress et anxiété au début, lors de l'acclimatation avec le mâle. Le test sera réalisé une seule fois à la fin de la procédure expérimentale.
Devenir
Les animaux issus des groupes contrôles n'ayant pas l'endométriose ni d'ovariectomie, ainsi que leur descendance seront gardés en vie et utilisés dans d'autres projets de recherche. Tous les autres animaux avec une endométriose, ayant reçu ou non un traitement médicamenteux, seront euthanasiés à la fin de la procédure pour éviter une potentielle aggravation de la maladie à plus long terme.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer l’efficacité d’un principe actif sur l’endométriose. En effet, le développement des lésions endométriales et l’apparition des douleurs pelviennes sont le résultat d’un ensemble de désordres hormonaux, tissulaires et inflammatoires. D’ailleurs, la croissance des lésions n’est pas corrélée à l’apparition des douleurs, confirmant la complexité de cette maladie.
Réduction
La réalisation des études sera conduite de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le modèle expérimental sera optimisé, notamment en ajustant la quantité de tissu implanté dans le péritoine ainsi que la durée des études, afin d’obtenir un modèle robuste, reproductible et suffisamment discriminant pour limiter le nombre d’animaux nécessaires par groupe expérimental. Cette optimisation sera particulièrement importante pour l’analyse des tests comportementaux, pour lesquels un modèle présentant des manifestations symptomatiques clairement caractérisées permettra de réduire la variabilité des résultats et, par conséquent, le nombre d’animaux requis. Une étude pilote sera réalisée, quand cela s’avère possible, pour l’optimisation du modèle expérimental. Les échantillons prélevés à la fin des études expérimentales seront proprement conservés pour permettre leur réutilisation sur le long terme sans devoir refaire l’expérience chez les animaux. Si un test d’accouplement est réalisé, les rats mâles seront réutilisés dans la mesure du possible afin de limiter leur nombre. Une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés en même temps dans la même étude sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin de limiter le nombre de groupe contrôles (non traités ou traités par une molécule de référence). Des tests statistiques seront aussi réalisés pour comparer les paramètres mesurés dans les groupes d’animaux étudiés.
Raffinement
Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les animaux sont hébergés en groupe dans les cages (2 rats et jusqu’à 5 souris) afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un suivi quotidien de tous les animaux sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Pour les animaux avec une production excessive d’urine, notamment les rats diabétiques, une augmentation de la fréquence de renouvellement des cages et litières sera mise en place. Une anesthésie gazeuse avec l’isoflurane sera réalisée pour les procédures chirurgicales qui le nécessite, ainsi qu’un traitement antalgique contre les douleurs avant et après l’opération. Des points limites adaptés ont été fixés pour la réalisation du projet. L’atteinte d’un point limite sera signalé par le zootechnicien à un responsable des soins et au responsable du projet. Le cas échéant, si les symptômes sont réversibles, l’animal sera sorti de l’expérience et des procédures de soins peuvent être mis en place avant une éventuelle ré-inclusion dans l’étude. Si les symptômes sont irréversibles, l’animal sera euthanasié. Toute décision (sortie de la procédure en cours, soins ou euthanasie) sera prise en concertation avec le responsable du projet, le vétérinaire référent, et/ou le responsable de la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le responsable de la plateforme animalerie.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Bien que les rongeurs ne présentent pas de menstruations, ils constituent à ce jour les modèles les plus couramment utilisés dans la recherche sur l’endométriose. En particulier, le modèle autologue consistant à greffer ou implanter du tissu endométrial dans la cavité péritonéale, permet de reproduire des manifestations physiopathologiques proches de celles observées chez la femme, notamment en termes de développement des lésions et de symptômes associés. Par ailleurs, que ce soit chez le rat ou la souris, ce modèle a déjà été largement validé et utilisé dans des études précliniques visant à évaluer l’efficacité de traitements destinés à prévenir ou atténuer les conséquences de l’endométriose. Les deux espèces seront utilisés dans ce projet car aucun des modèles disponibles ne reproduit à lui seul l’ensemble des caractéristiques de l’endométriose humaine. Chaque espèce présente des avantages et des limites, notamment en termes d’anatomie et d’évaluation des paramètres fonctionnels ou comportementaux. Les animaux seront utilisés adulte, à partir de 8 semaines d’âge, âge auquel les organes sexuels sont à maturité. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.
Etudes précliniques non-réglementaires d’une immunothérapie à IgA pour le traitement de maladies inflammatoires MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Un fragment de queue prélevé sous anesthésie et la pose d'une boucle, puis, pour 181 d'entre elles, trois cures de DSS de cinq jours dans l'eau de boisson qui enflamment l'intestin, espacées de dix jours, et pour 110 six semaines de gavage : c'est le parcours le plus long prévu pour les souris de ce projet. 891 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour tester une version orale d'un anticorps anti-TNF contre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Le DSS peut provoquer une douleur modérée et des diarrhées pendant le traitement et quelques jours après. Chaque cohorte est tuée à date fixe, et l'équipe mesure alors la longueur du côlon et la taille de la rate.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), regroupant principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, touchent plus de 10millions de personnes dans le monde, 3 millions de personnes en Europe et environ 300000 personnes en France. Les MICIs sont un groupe de troubles inflammatoires affectant le tube digestif. Les 2 principales MICIs sont : - la maladie de Crohn qui affectant toutes les partie du tractus gastro-intestinal, de la bouche à l'anus, le plus souvent la partie terminale de l'intestin grêle et le côlon. - la rectocolite hémorragique (RCH) qui se limite principalement au côlon et au rectum. Les symptômes communs aux MICIs incluent des douleurs abdominales, diarrhées (souvent sanglantes), fatigue, pertes de poids, et parfois des complications extragastro-intestinales, comme des atteintes articulaires, de la peau, des yeux… Les causes exactes des MICIs sont mal comprises, on pense qu'elles résultent d'une interaction complexe entre des facteurs génétiques, environnementaux et immunologiques. Le traitement vise généralement à contrôler l'inflammation, à soulager les symptômes. Les MICIs n’ont pas encore de traitement curatif, mais il existe des biothérapies et la chirurgie. Parmi les biothérapies, il y a les anti-TNF comme l’Adalimumab qui bloque une protéine responsable de l’inflammation, le facteur de nécrose tumorale (TNF). En inhibant cette protéine, l'Adalimumab réduit l'inflammation et les douleurs. Il est administré par injection sous-cutanée. L’adalimumab est un anticorps monoclonal humain de type IgG. Nous avons créé un anticorps de type sIgA avec les mêmes régions variables, c’est-à-dire celles permettant de reconnaitre les mêmes épitopes (cibles) que l’Adalimumab. La sIgA (immunoglobuline A sécrétoire) joue un rôle clé dans l'immunité des muqueuses. Elle est présente dans les sécrétions comme la salive, les larmes, le mucus respiratoire, le lait maternel et les sécrétions intestinales. Le but du projet est d’obtenir un nouvel anticorps de type sIgA ciblant le TNFα et ayant un effet supérieur ou au minimum équivalent à l’Adalimumab. Cet anticorps pourra être administré par voie oral ce qui facilite la vie quotidienne des patients, diminue la toxicité du produit et donc les effets secondaires. Cette molécule pourra aussi servir de traitement pour certaines maladies inflammatoires ou lors d’arthrite rhumatoïde.
Bénéfices attendus
Cet anticorps pourra être administré par voie orale ce qui facilite la vie quotidienne des patients, diminue la toxicité du produit et donc les effets secondaires. Cette molécule pourra aussi servir de traitement pour certaines maladies inflammatoires ou lors d’arthrite rhumatoïde.
Procédures
Tous les animaux vont avoir un prélèment de tissus au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse ce qui va entrainer un léger stress de quelques minutes. Elles seront bouclées lors de cette anesthésie.15 souris vont avoir une injection par voie intra-veineuse et 2 prélèvements sanguin sous mandibulaire sous anesthésie gazeuse le même jour. 25 souris vont avoir une injection sous-cutanée, 30 auront une administration par voie orale (gavage). Ces 75 souris auront ensuite une injection par voie intra-veineuse et un prélèvement sanguin sous mandibulaire sous anesthésie gazeuse le même jour. 195 souris vont ingérer du DSS pendant 5 jours. Parmi ces animaux, 14 auront une seule injection en sous-cutanée, 25 auront de 2 à 6 injections en sous-cutanée. Ensuite 103 souris auront un gavage pendant 7 jours. Les autres n’auront pas de traitement. Pour finir, 181 souris vont ingérer 3 fois du DSS pendant 5 jours, espacé de 10 jours. Puis 39 auront 1 à 6 injection sous-cutanée et 110 autres auront 6 semaines de gavage. Les injections par voie intra-veineuse, en sous-cutanée, les gavages et le prélèvement de sang vont entrainer un stress de quelques minutes à chaque manipulation.
Impact sur les animaux
Les injections par intra-veineuse ou en sous-cutanée n’entraineront pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille. Elles entraineront un léger stress de quelques secondes pour les injections en sous-cutanées et de quelques minutes pour les injections intra-veineuse (contention dans un tube spécifique). L’ingestion du DSS va induire une inflammation de l’intestin qui peut entraîner une douleur modérée, du stress, de la diarrhée, durant le traitement et quelques jours après, et qui seront étroitement surveillés grâce à une grille de score des points limites. Dans la littérature, il n'y a pas de perte de poids durant les 4-5 premiers jours de taitement et le DSS dans l'eau de boisson n'impacte pas la quantité ingérée par les animaux.
Devenir
Après le traitement, chaque cohorte sera mise à mort à un temps donné afin de prélever les organes (colon, rate, sang) pour observer la longueur du colo, la taille de la rate... En parallèle, des analyses permettront d’observer les populations immunitaires recrutées au niveau de l'inflammation permettant de valider l’action des anticorps médicaments.
Remplacement
Des tests in vitro ont été au préalable effectués afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de notre traitement cependant le recours à des techniques totalement in vitro ou sur organes isolés est impossible car la complexité de l’environnement cellulaire est primordial et la voie d’administration de notre molécule est primordial sur la biodistribution. En effet, les différents traitements testés ont besoin de l’environnement cellulaire afin d’être efficaces car ils engendrent des mécanismes cellulaires (par exemple, le recrutement des cellules du système immunitaire muqueux ou le trafic sanguin et lymphatique). Enfin, ces techniques in vivo nous permettent de vérifier l’accessibilité de notre traitement à la zone de l’inflammation.
Réduction
Afin de tester ces différentes conditions de manière fiable, il faut un nombre suffisant d’animaux afin d’obtenir des résultats robustes nous permettant de passer à des études pré-cliniques réglementaires puis cliniques chez l’Homme. Les doses et conditions testées ont été longuement réfléchies afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaire. Une approche statistique a aussi été étudiée afin d'obtenir un nombre suffissant de données permettant de valider l'étude expérimentale avec le nombre minimal d'animaux nécessaire.
Raffinement
Afin de limiter le stress des animaux, une période minimale de 5 jours d'acclimations à la zone d'hébergement expérimentale sera effectuée. Ils seront également progressivement manipulés régulièrement lors du change et des surveillances afin de les habituer aux contentions et autres manipulations. Toutes les manipulations et expérimentations seront effectué par du personnel qualifié. Les animaux seront surveillés strictement tout au long de l'expérimentation grâce à la grille de score permettant de détecter tous signes de souffrance et pouvoir évaluer si un point limite est atteint.
Choix des espèces
L’espèce a été choisie pour son temps de gestation court, de plus, cette espèce est utilisée à des fins scientifiques internationalement et possède un système immunitaire proche de celui de l’Homme. Les animaux utilisés auront entre 2 et 8 mois afin d'avoir un système immunitaire non défaillant.
Analyse chez le rat de l’air exhalé au cours d’une exposition à un polluant émergeant, le benzène.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Exposés éveillés à du benzène gazeux en chambre d'inhalation, une ou plusieurs fois par semaine pendant 25 minutes, des rats subissent aussi, pour une partie, une atteinte pulmonaire de type emphysème provoquée sous anesthésie. 92 rats vont être utilisés, tous tués pour l'analyse du cœur et des poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. L'objet est de valider un capteur qui mesure le benzène dans l'air expiré, et certains rats serviront aussi à former l'expérimentateur à l'échocardiographie. La gravité sévère n'est rattachée à aucune procédure précise, alors que le porteur mentionne "un cumul de stress physiologique et une récupération incomplète entre les sessions".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de tester une nouvelle technologie de capteur capable de mesurer très précisément certains polluants présents dans l’air que l’on expire. Dans un premier temps, nous allons vérifier que le système fonctionne correctement en mesurant le monoxyde de carbone, un gaz bien connu en clinique humaine, non toxique à la concentration utilisée. Une fois cette étape validée, nous l’utiliserons pour mesurer le benzène. Le benzène est un polluant toxique que l’on retrouve souvent dans l’air intérieur. Il peut provenir des chauffages, des appareils à combustion, de la fumée de cigarette ou encore de certaines activités professionnelles comme le travail en industrie ou en station-service. Il est reconnu pour ses effets nocifs sur la santé et est associé à un risque plus élevé de maladies respiratoires et cardiovasculaires, même lors d’expositions faibles mais répétées sur une longue période. Mesurer le benzène directement dans l’air expiré présente un grand avantage : cette méthode est simple et non invasive. Elle permet d’estimer la quantité de polluant réellement absorbée par l’organisme après une exposition. Cela donne une indication plus précise de ce que le corps a accumulé. Grâce à cette approche, il devient possible de mieux comprendre l’impact de la pollution sur la santé respiratoire et cardiovasculaire, et de faire le lien entre l’exposition quotidienne à certains polluants et leurs effets sur l’organisme.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment la pollution de l’air affecte notre organisme. Il cherche à mesurer directement, dans l’air que l’on expire, la quantité d’un polluant qui a réellement été absorbée par le corps. En comparant le niveau d’exposition (unique ou répété sur une longue période) avec la quantité retrouvée dans l’air expiré, on pourra mieux déterminer à partir de quel seuil des effets sur la santé apparaissent. Cela permettra aussi d’identifier les éléments qui peuvent aggraver ou au contraire limiter ces effets. L’étape essentielle du projet sera de vérifier, chez l’animal, que ce nouveau capteur est fiable pour détecter le benzène dans l’air expiré. Si cette méthode est confirmée, elle pourrait devenir un moyen simple, rapide et sans douleur pour surveiller l’exposition à certains polluants et évaluer leurs effets sur le cœur et les poumons.
Procédures
Dans cette étude, les animaux seront exposés à de faibles quantités de benzène sous forme de gaz, une ou plusieurs fois par semaine pendant 25 minutes, alors qu’ils sont éveillés. Certains subiront des examens simples et sans chirurgie pour évaluer le fonctionnement des poumons et du cœur : la respiration sera mesurée sur animal éveillé, et le cœur sera examiné par imagerie sous anesthésie légère. Dans un autre groupe, une courte anesthésie sera réalisée pour mettre en place un modèle expérimental d’atteinte pulmonaire. Au cours d'expériences de mise en place et validation, quelques animaux auront trois prélèvements de sang à plusieurs heures d'intervalle.
Impact sur les animaux
L’exposition chronique ou intermittente au benzène peut entraîner à long terme, des altérations cardio-respiratoires et hématologiques. Dans le modèle d'emphysème, nous simulons une infection bactérienne qui peut induire des symptômes transitoires classiques de l'emphysème pulmonaire exacerbé chez l'homme tels qu’une difficulté respiratoire modérée, une réduction de l'activité physique, et dans des cas très rares une perte de poids. Concernant les chambres d’exposition, un stress peut apparaître en lien avec la manipulation des animaux et leur contention dans les chambres d’inhalation. Le suivi de la fréquence respiratoire pendant l’exposition permettra de détecter une agitation excessive et persistante de l’animal qui sera un critère d’arrêt. L’exposition répétée au benzène, pourrait induire une irritation des voies respiratoires. Des effets systémiques tels qu’une fatigue, une baisse d’activité et des altérations neurocomportementales seront surveillés. La répétition des expositions dans le cadre des protocoles entraîne un cumul de stress physiologique et une récupération incomplète entre les sessions. De plus, un stress peut apparaitre quand les animaux sont manipulés lors des explorations fonctionnelles non invasive sur animal éveillé et lors de la prise de sang à la queue. Les animaux feront l’objet d’une surveillance adaptée tout au long de l’étude afin de détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’inconfort.
Devenir
À la fin des expériences, les animaux sont mis à mort afin de permettre l’étude détaillée de leurs organes, en particulier le cœur et les poumons. Cette étape est essentielle pour mieux comprendre les éventuelles altérations de ces organes et vérifier les effets de l’exposition.
Remplacement
Nous optimisons nos expériences pour utiliser le moins d’animaux possible. Chaque rongeur subit plusieurs analyses complémentaires, ce qui permet de limiter le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats scientifiques plus riches et fiables. Le nombre d’animaux inclus a été calculé statistiquement pour garantir la robustesse des résultats.
Réduction
Nous optimisons nos protocoles expérimentaux afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés. Pour cela, chaque rongeur est soumis à plusieurs analyses complémentaires (échographiques, hémodynamiques et biologiques), ce qui permet à la fois de limiter le nombre d’animaux et d’enrichir les interprétations scientifiques. Certains animaux servent à plusieurs procédures et serviront pour la formation de l'expérimenteur à l’échocardiographie, dans le but de garantir la robustesse et la reproductibilité des résultats obtenus.
Raffinement
Les rats sont hébergés dans des conditions adaptées, avec un environnement enrichi pour répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Des protocoles d’habituation ont été mis en place pour que les animaux s’habituent aux procédures et réduire leur stress. Ils sont surveillés chaque jour par un personnel formé, qui contrôle leur état de santé et leur bien-être. Si un animal montre des signes de détresse inhabituelle, il est euthanasié pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le modèle de rat est largement caractérisé sur le plan cardiovasculaire, il présente une physiologie cardiovasculaire plus proche de celle de l’homme, ce qui en fait un modèle plus pertinent pour l’étude des effets toxicologiques liés à l’inhalation de polluants. Par ailleurs, le métabolisme du benzène chez le rat reflète plus fidèlement celui observé chez l’homme dans des conditions d’exposition environnementales, alors que la souris présente des différences métaboliques notables qui limitent la transposabilité des résultats. Le choix du rat permet donc d’obtenir des données plus représentatives et exploitables pour l’évaluation du risque chez l’homme. Les études sont réalisées sur des animaux adultes mâles et femelles âgés de 7 à 8 semaines. Nous utilisons le stade adulte car nous souhaitons étudier les effets extra-pulmonaires, notamment cardiovasculaires, dont le système est pleinement mature chez les rongeurs à l’âge adulte. Nous voulons également éviter les biais liés à la croissance ou au vieillissement, afin d’obtenir des résultats comparables aux autres études environnementales publiées, qui utilisent majoritairement des animaux adultes.
Evaluation de la propriété analgésique de la mycolactone dans un modèle incisionnel plantaire chez le rat (test de Brennan)
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
240 rats vont être utilisés, tous tués après le dernier test pour récupérer leurs pattes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Sous anesthésie, 180 d'entre eux subissent une incision de la plante de la patte, puis tous passent jusqu'à six tests plantaires où l'équipe mesure leur temps de réaction à un stimulus de chaleur. Le but est de savoir si la mycolactone, toxine produite par la bactérie M. ulcerans, soulage la douleur postopératoire, et 60 rats incisés ne reçoivent aucun traitement, groupe chez qui le porteur attend une douleur modérée. Il écrit que "Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude".
Objectifs
Notre équipe travaille sur les propriétés analgésiques de la mycolactone, toxine produite par M. ulcerans. Nous avons démontré par des approches in vivo que la mycolactone induisait une hypoesthésie locale pendant plus de 24h après son inoculation en ciblant AT2R. Cette fixation permet l’activation d’une voie cellulaire permettant l’ouverture des canaux potassiques de la famille TRAAK. L’ouverture de ces canaux permet une fuite de potassium provoquant une hyperpolarisation cellulaire, empêchant la diffusion de l’influx nerveux par les cellules nerveuses. Jusqu’à maintenant, l’activité analgésique de la mycolactone n’avait été évaluée au laboratoire que sur des modèles de rats ne présentant pas de douleur. L’utilisation de ces modèles a d’ores et déjà permis de démontrer que la mycolactone présente des propriétés analgésiques supérieures à la morphine. De plus, nous avons pu augmenter son pouvoir analgésique en l’encapsulant dans des nanocapsules. Dans ce contexte, notre objectif est de déterminer si la mycolactone pourrait être utilisée comme analgésique local (en raison de sa faible diffusion après inoculation) dans des modèles de « douleur ». Compte tenu de son effet analgésique durable (entre 24 et 48 h après une injection unique en sous cutanée) et de sa faible diffusion dans l’organisme, la mycolactone pourrait présenter un intérêt pour traiter les douleurs post opératoires. Ainsi nous proposons d’évaluer l’effet analgésique de la mycolactone dans un modèle pertinent de douleur postopératoire
Bénéfices attendus
Nos résultats antérieurs ont montré que la mycolactone présentait des propriétés analgésiques lorsqu’elle était administrée par injection en sous cutanée chez des rats naïfs. Parallèlement, nos collaborateurs ont montré l’effet analgésique de la mycolactone dans le traitement de la douleur induite par des neuropathies (modèle de ligature du nerf sciatique). Compte tenu de l’ensemble des résultats positifs obtenus ces derniers mois, il nous semble judicieux d’évaluer les propriétés analgésiques de la mycolactone dans le traitement des douleurs post-opératoires. Ce projet se justifie puisque l’arsenal thérapeutique contre les douleurs reste limité.
Procédures
Les animaux seront répartis en 4 groupes de 60 animaux chacun (soit 240 animaux au total) : - sans incision - avec incision non traité - avec incision traité par un anesthésique de référence pour le traitement des douleurs post-opératoires (bupivacaïne). - avec incision traité par la mycolactone Incision plantaire, réalisée une seule fois. Geste réalisé sous anesthésie gazeuse. La durée de ce geste est d’environ 5 à 10 minutes. Les animaux concernés sont au nombre de 180 (Procédure 2 + 3 + 4). Les 60 animaux restants subiront tout le geste technique (anesthésie, désinfection de la patte) mais sans l’incision. Traitement : Injection à proximité du nerf sciatique, réalisée une seule fois. Geste réalisé sous anesthésie gazeuse 24 heures après l’incision. La durée de l’injection est rapide (
Impact sur les animaux
Suite à l’incision, il est attendu une douleur modérée, tout particulièrement chez les animaux non traités. Plusieurs indicateurs seront suivis : - L’induction d’une sensibilité excessive que nous détecterons lors des tests plantaires par un temps de réaction au stimulus chaleur réduit par rapport aux rats non incisés. - L’induction d’une modification de la démarche (telle qu’un boitement). - Un changement du comportement les 24 premières heures. De plus, malgré nos précautions, une surinfection (gonflement du coussinet, changement du comportement accentué de l’animal) de l’incision n’est pas à exclure. L’inoculation de la mycolactone ou de la bupivacaïne pourrait entraîner les effets suivants : -Surinfection au site d’inoculation (gonflement du coussinet, rougeur, changement de comportement marqué de l’animal) - Inflammation due aux propriétés pro-inflammatoires de la mycolactone - Altération de la démarche (boitement ou gêne locomotrice)
Devenir
A la suite du dernier test plantaire, tous les animaux seront mis à mort et les pattes seront récupérées pour des études histologiques.
Remplacement
Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude mais nous ne pouvons à ce stade nous passer d'utiliser des animaux. En effet, la phase réalisée chez les animaux permettra de valider l’effet de la mycolactone dans le traitement de douleurs post opératoires dans un système biologique complexe où de nombreux facteurs peuvent intervenir (disponibilité du composé, dégradation, capacité du composé à atteindre sa cible...). De plus, cette phase est obligatoire pour le développement d’analgésique destiné à la santé humaine et animale.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour cette étude est suffisant pour que les résultats soient statistiquement significatifs sans pour autant exagérer ce nombre. Afin de valider des différences statistiques, les groupes seront composés de 6 rats et un test statistique 2-way ANOVA sera réalisé. Si l’analyse des résultats montre l’absence d’effet analgésique de la part de la dose de mycolactone utilisée, ou souligne des effets secondaires (non rapportés à ce jour dans nos travaux précédents), les expériences ne se poursuivront pas pour cette dose. Cependant, si les résultats montrent un effet analgésique sans effet indésirable, alors l’expérience sera répétée une seconde fois indépendamment pour accroître la qualité de nos résultats. Ce préalable est indispensable pour la poursuite de notre étude, qui vise à réaliser une étude dans un modèle animal plus complexe.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des rats, un suivi adapté des animaux a été instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'elles pourraient éprouver. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Un suivi régulier sera effectué sur l'ensemble des animaux et des indicateurs comportementaux et physiques sont prédéfinis et constituent les points limites. Pour éviter toute souffrance ou stress lors du protocole expérimental, un anesthésique volatil (isoflurane) sera utilisé. La procédure d’incision sera d’abord pratiquée sur des cadavres pour s’entrainer à maitriser et calibrer l’incision avant de démarrer le protocole sur animaux vivants. Cet entrainement permettra de réaliser la procédure efficacement et rapidement pour éviter toute souffrance ou stress inutile aux animaux et diminuer le temps d’anesthésie générale. La dose de mycolactone maximale sera 4 μg car nos travaux précédents montrent qu’au-delà de cette dose il y a un risque de lésions tissulaires et d’inflammation. Lors de chaque expérience, les données des tests plantaires seront analysées au fur et à mesure et les tests seront arrêtés si à 6h aucun effet analgésique n’est observé de la part de la dose de mycolactone testée. Si un effet analgésique apparait, les tests se poursuivront jusqu’à ce que l’effet disparaisse, c’est-à-dire lorsque le temps de réaction au test plantaire des rats ayant reçu la mycolactone sera de nouveau identique à celui des rats du groupe témoin incisé non traité (arbre décisionnel en annexe). De plus, pour le groupe de rats ayant reçu la bupivacaïne(anti-douleur de référence pour le traitement des douleurs post-opératoires, un test sera réalisé 30 min après l’injection puis les animaux seront mis à mort (il a été montré par nos collaborateurs que l’effet est maximal jusqu’à 30 min après injection et disparait après 1 heure). Nous testerons les doses dans l’ordre décroissant, dès qu’une dose n’aura pas d’effet analgésique, nous arrêterons nos expérimentations et ne testerons pas les autres doses. Ce projet s’inscrit ainsi dans une gestion éthique de l’expérimentation animale et, est donc en accord avec les réglementations européennes et françaises de bonnes pratiques de laboratoire.
Choix des espèces
De nombreuses études visant à identifier de nouveaux analgésiques pour la prise en charge de la douleur postopératoire utilisent « l’espèce rat ». En effet, le modèle de Brennan est le modèle de référence pour évaluer des analgésiques sur la douleur postopératoire. Les animaux utilisés pour ce protocole devront, à l’initiation de l’expérimentation, être âgés de 6 semaines afin d’être homogène avec les autres partenaires du consortium.
Traitement d’une maladie auto-immune des reins dûe à la production anormale d’anticorps par des thérapies ciblées. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles immunitaires
Porteuses de gènes humains, ces souris développent dès douze semaines une maladie rénale auto-immune, avec du sang et des protéines dans les urines, puis subissent des prises de sang à la joue deux fois par mois, des injections dans la veine de la queue, des gavages et, pour un petit groupe, une biopsie du rein sous anesthésie générale. 492 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des anticorps, des ARN messagers et des nanoparticules, dans des études sollicitées par l'industrie pharmaceutique. Le porteur affirme qu'"Il n'y a pas de nuisances lié à la maladie de Berger", celle-là même qu'il décrit chez ces souris. Toutes sont tuées après chaque traitement pour analyser l'inflammation de leurs reins.
Objectifs
Nous disposons d'un modèle unique dans le monde, le modèle de souris avec des gènes humains exprimant des anticorps spécifiques et un récepteur pour les anticorps spécifiques. Ces souris développent une maladie auto-immune rénale (c'est à dire qui résulte d'un dysfonctionnement du système immunitaire qui conduit ce dernier à s'attaquer à l'organisme) et ainsi cause l'accumulation anormale des anticorps dans les reins avec de la protéinurie (présence de protéines dans les urines) et d'hématurie (présence de sang dans les urines) à partir de 12 semaines. Comme il n'existe pas de traitement curatif pour cette maladie, notre laboratoire cherche à développer des nouveaux traitements. Nous avons généré cinq anticorps anti-inflammatoires et l'industrie pharmaceutique nous a sollicité pour des études sur l'animal basées sur nos recherches précèdentes . En effet, nous avons démontré une belle efficacité d'une enzyme, une protéine capable de couper les anticorps et ainsi réduire l'inflammation liée à la maladie. Le problème était que comme il s'agit d'une protéine d'origine bactérienne, il y a une réponse immunitaire contre cette enzyme , des anticorps anti-enzymes bloquant son activité. L'objectif de notre étude est de traiter les souris exprimant la maladie avec les anticorps anti-inflammatoires, des ARN messagers (molécule capable d'induire la production d'une protéase qui est une enzyme (=protéine) capable de cliver les anticorps responsable de la maladie) ou avec des nanoparticules (particules de petite taille) permettant d'induire une tolérance au traitement avec la protéase recombinante d'origine bactérienne. Ces traitements sont bien tolérés sans aucun dommage chez la souris (résultats obtenus au laboratoire). L'objectif est d'évaluer l'action de ces traitements sur les anticorps circulants, sur les dépôts rénauxd'anticorps, l'inflammation tissulaire rénale et sur la protéinurie.
Bénéfices attendus
La néphropathie (ou maladie de Berger) est l'une des premières causes d'insuffisance rénale en France et dans le monde. Cette maladie est causée par une accumulation anormale d'anticorps dans les reins. Il n'existe actuellement pas de traitement spécifique de cette maladie, les patients n'ont que des traitements de suppléance (dialyse, greffe). Le développement d'un traitement pourrait éliminer la cause de la maladie et ainsi pouvoir proposer un traitement curatif. Les traitements proposés chez les souris qui développent la maladie seront une étape pré-clinique cruciale avant le passage à l'homme pour des essais cliniques.
Procédures
Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les anticorps anti-inflammatoires : les souris seront soumises à des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue (deux fois par mois). Des prélèvements d'urines (2 fois par mois) les prélèvements seront faits sur animaux non anesthésiés, lors de l'immobilisation de la souris, le jet d'urine est en général spontanée . Des injections d'anticorps par voie intraveineuse (une fois par semaine pendant 1 mois) seront faites principalement par la veine caudale qui est située sur la queue de l'animal. Le gavage par une sonde gastrique (1 fois par mois pendant 1 mois). Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les ARNmessagers (ARNm) : les souris seront soumises à des injections d'ARNm (une molécule retrouvée dans toutes les cellules qui sera traduite en protéine) principalement par la veine caudale (veine sur la queue) une fois par semaine pendant un mois puis une fois par mois pendant 6 mois. Les prélèvements de sang (au niveau de la veine de la joue) se feront à J0 puis une fois par mois pendant 6 mois, en même temps que les urines. Afin d'évaluer la traitement de la maladie par les nanoparticules : les souris seront soumises à des injections par voie intraveineuse (veine de la queue) 3 fois pendant 1 mois puis à des prélèvements sanguins et d'urines à J0, J1 et J7. De plus, une fois la dose et la voie optimale de traitement déterminée pour les anticorps et l'ARNm, une biopsie rénale sera faite, ce qui consite à prelever un petit fragment de tissu rénal (1mm) sous anesthésie générale avant traitement sur un petit groupe de souris afin de confirmer définitivement l'efficacité du traitement à la dose optimale.
Impact sur les animaux
Les traitements donnés sont très bien tolérés et bénéfiques pour cette maladie de Berger. Les seules nuisances attendues sont celles liées à la biopsie rénale, aux injections intraveineuse des produits, au gavage et aux prélèvements de sanguins et d'urines. Ceux-ci pourraient occasionner un stress et un inconfort pour la souris de courte durée lors de la contention et de l'injection et de quelques jours pour la biopsie. Il n'y a pas de nuisances lié à la maladie de Berger.
Devenir
A l'issue de chaque traitement, les animaux seront euthanasiés et des analyses complementaires post mortem seront réalisées au niveau des reins afin d'évaluer l'inflammation rénale.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d'un organe en entier dans le cas du developpement de la nephropathie. Le travail à l'échelle de l'organisme en entier est nécessaire, compte tenu de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire et de la fonction rénale. Il est indispensable de travailler sur l'organisme entier, vivant et proche de l'homme pour pouvoir ensuite envisager un traitement curatif chez l'homme.
Réduction
Nous avons estimé qu'il faudra 6 animaux par groupe afin obtenir des résultats statistiquement exploitables et mener à bien notre projet. En effet, nos expériences précèdentes nous ont permis de préciser ce nombre d'animaux nécessaire.
Raffinement
Dans le but de répondre à la loi des 3R (Raffiner) et dans un souci de bien-être animal de l'enrichissement (coton, Kraft, tunnels) sera mis en place pour les animaux tout au long de l'expérience pour que les animaux puissent faire des nids. Les souris sont placées sur des portoirs ventilés par groupe de 5 individus. L'environnement , la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours par le personnel technique. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour anticiper toute douleur ou angoisse infligée aux animaux. Les gestes experimentaux seront effectués par une personne compétente. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés 1 fois par semaine par l'expérimentateur ( état général, comportement et pesées). Un analgésique sera administré si l'état de l'animal le nécessite et toutes les 12heures et de façon systématique pendant 3 jours après chirurgie. Si l'animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour développer la maladie de Berger car elle n'exprime pas la maladie, ce qui permet après transgénese c'est à dire la fait d'incorporer des gènes humains dans son génome d'induire et d'exprimer cette maladie en question chez ces souris transgéniques. De plus, son comportement et sa génétique sont largement connus ce qui nous permet une meilleure évaluation et prise en charge de son bien-être tout au long du projet. Il est donc indispensable pour nous d'utiliser ce modèle de souris transgéniques exprimant la maladie pour évaluer l'action et l'efficacité des traitements que nous proposons. A 12 semaines d'âge car c'est à cet âge là que les souris développent la maladie rénale.
Évaluation de nouvelles thérapies ciblées contre le cancer de la prostate – EU 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
Toutes tuées en fin d'étude pour l'analyse de leurs organes, 2 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des traitements radioactifs ciblés contre le cancer de la prostate. Elles subissent une greffe tumorale, une castration chirurgicale, parfois une irradiation du corps entier qui supprime un temps leurs défenses immunitaires, un transport de cinq à six heures entre deux établissements et jusqu'à six séances d'imagerie sous anesthésie. Certaines sont immunodéficientes, et la tumeur peut provoquer nécroses et amaigrissement. Le porteur affirme qu'on ne peut se passer d'un "organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes", pour des souris castrées et parfois irradiées.
Objectifs
Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos projets est le développement de nouvelles thérapies ciblées couplées à des radioéléments. Cette dernière repose sur le principe suivant : « attacher » une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement une protéine surexprimée par les cellules tumorales prostatiques. Pour la thérapie, on utilise des molécules radioactives puissantes sur une distance très courtes (de l’ordre du millimètre ou micromètre), détruisant ainsi les cellules tumorales à proximité immédiate de l’endroit où elle est transportée, tout en limitant la toxicité sur les tissus sains environnant la tumeur. Dans ce projet, l’objectif principal est d’évaluer l’activité antitumorale de nouveaux traitements ciblés. Dans le cas où aucune donnée de toxicité ne serait disponible, une étude de la toxicité de ces thérapies ciblées pourra être réalisée au préalable dans le cadre de ce projet. Ce projet est un projet multisite entre deux Etablissements Utilisateurs différents (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Le développement de la radiothérapie interne vectorisée est actuellement en plein essor. En effet, cette thérapie cible de façon spécifique la tumeur de chaque patient, et permet un traitement personnalisé. Notre projet permettra ainsi d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés de radiothérapie interne vectorisée.
Procédures
Une induction tumorale : sous anesthésie (
Impact sur les animaux
- Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées. - L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires sur une courte période et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu dans des conditions sanitaires protégées. - L’implantation sous cutanée de cellules tumorales ou des fragments de tumeurs va mener à une masse sous cutanée qui pourrait, si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. De plus, des nécroses peuvent apparaitre. Il est aussi possible, selon le modèle tumoral, que la progression tumorale entraîne une cachexie (amaigrissement et fatigue) constatée par une perte de poids. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - lors de la répartition en groupes homogènes selon les critères de volume tumoral et de poids corporel, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. - Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés intraveineux qui pourront induire un stress léger. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.
Devenir
Différentes analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.
Remplacement
Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes ; les modèles animaux sont ainsi indispensables. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible.
Réduction
Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. Les effectifs d’animaux dans les groupes expérimentaux ont été adaptés pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant au maximum les effectifs des groupes. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle permet d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.
Raffinement
La chirurgie pour la greffe de fragments tumoraux et la castration sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse sur lit chauffant afin de réduire l’inconfort potentiel et permettre ainsi le raffinement de l’étude. La chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une couverture analgésique. Une surveillance post opératoire et des soins post opératoires adaptés sont appliqués si nécessaires.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de choix en pharmacologie car son génome est connu et ses principales fonctions physiologiques (fonction rénale, hépatique) sont comparables à l’Homme. D’autre part, les souris sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie utilisés pour la caractérisation des molécules utilisées pour cibler et visualiser les tumeurs chez l’homme. Du point de vue scientifique, la souris porteuse de tumeur reste le modèle de choix dans les études d’évaluation de l’efficacité des nouvelles thérapies contre le cancer. Les animaux pourront être utilisés pour l’induction tumorale à un âge minimum de 5 semaines (jeune adulte), et pourront ensuite être traités à partir de l’âge de 7 semaines (adulte), les modèles de tumeur de prostate humaine nécessitant au moins 2 semaines post implantation pour commencer à pousser. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de traiter des animaux possédant les fonctions physiologiques correspondant au stade adulte.