Rongeurs

280 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une opération de 15 minutes sous anesthésie générale dont le résumé ne précise pas l'objet, puis certaines reçoivent pendant 14 semaines au plus un anticorps injecté trois fois par semaine et un traitement oral quotidien, éveillées et contenues. Le projet teste cet anticorps, déjà en essai clinique pour d'autres pathologies selon le porteur, seul ou combiné à un inhibiteur de RAS contre le cancer du pancréas, dont la progression entraîne selon lui des signes de douleur au-delà d'un certain stade. Pour le choix de l'espèce, il décrit les souris comme "très proches de l'homme notamment du point de vue immunologique".

Objectifs

Le cancer du pancréas est la 7ème cause de mortalité attribuable au cancer dans le monde. De nouveaux types de traitement ciblant le système immunitaire se sont montrés efficaces dans d’autres types de cancers mais n’ont pas encore fait leur preuve pour le pancréas. Par ailleurs, de récents essais cliniques ont montré la capacité de nouveaux traitements à améliorer la survie des patients atteints de cancer du pancréas. Cependant, le taux de réponse reste faible et la survie de ces patients sous traitement ne dépasse pas un an. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers. Nous avons montré dans le cancer du pancréas que notre anticorps pouvait réduire la taille des tumeurs, influencer le système immunitaire et améliorer les thérapies ciblant le système immunitaire chez la souris. L’objectif de notre nouveau projet est de valider ces premiers résultats dans nouveau modèle et de tester l’efficacité de notre traitement en comparaison ou en combinaison avec un nouveau traitement prometteur qui améliore la survie des patients atteint d’un cancer du pancréas.

Bénéfices attendus

Le cancer du pancréas sont un grave problème de santé public. Bien que rare, il est pratiquement incurable en l’état actuel et les patients atteints ont une durée de vie très faible. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et/ou en combinaison avec le nouveau traitement ciblant le cancer du pancréas et ainsi améliorer la survie de très nombreux malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologies.

Procédures

Tous les animaux de l’étude seront soumis à une opération chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée d’environ 15 minutes. Une fois par semaine, une partie des animaux seront anesthésiés afin de réaliser une mesure de taille tumorale par imagerie qui durera au maximum 10 minutes. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 3 fois par semaine par injection, ainsi qu’un traitement oral quotidien. L’administration des traitements sera réalisée sur animaux vigiles, prend environ deux minutes à être réalisée, et dure maximum 14 semaines. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur au niveau des sites d’injection. La contention sur animal vigile peut engendrer un stress. Les traitements peuvent induire des effets secondaires modérés, mais sont globalement bien tolérés et ils devraient avoir un effet bénéfique sur la progression de la maladie et ses effets néfastes. La progression tumorale entraine des signes de douleurs et de stress (perte de poids, modification du comportement, etc.) au-delà d’un certain stade.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons prévu de procéder à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront hébergés en portoirs ventilés, ce qui les protégera des infections. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Un tapis chauffant ou une cage thermostatée sera utilisée quand nécessaire. Un gel ophtalmique sera appliqué lorsque nécessaire. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale avec utilisation d’un analgésique. L’analgésique sera utilisé à nouveau en cas de signes de douleur modérés (perte de poids, modification du comportement, etc.). Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux traitements.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus le cancer du pancréas étant un cancer plus fréquent chez l’adulte (âge moyen au diagnostique 70 ans chez l’homme, 74 ans chez la femme), il est préférable d’utiliser des animaux adultes pour ce projet.

Rendues obèses par un régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, 80 souris reçoivent aussi, sous anesthésie, un tatouage d'identification et une injection de vecteurs viraux AAV dans le muscle. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis transportées vers un second établissement pour un test terminal avec injection d'insuline, glucose radiomarqué et trois prises de sang pour la moitié d'entre elles. La description des procédures affirme qu'après l'injection les souris "ne subiront ensuite qu'une expérimentation terminale", sans mentionner le régime que le porteur dit susceptible d'"engendrer un inconfort significatif". Toutes sont tuées et nécropsiées à l'issue pour prélever tissus et organes, et le porteur fixe leur nombre d'après ses "habitudes expérimentales".

Objectifs

Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la Souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire et l’homéostasie glucidique et ce chez des animaux adultes jeunes dans le contexte de l’obésité qui favorise le développement de la résistance à l’insuline. Ce projet est multisite sur deux établissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires dans le contexte de l’obésité et/ou du vieillissement. La compréhension du rôle de ces espèces de sphingolipides dans le muscle squelettique dans le contexte précité nous permettra d’envisager de nouvelles stratégies dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur (EU1/2), les animaux seront individuellement identifiés par tatouage sous anesthésie (moins d’une minute). Ensuite, ils recevront une injection par voie intramusculaire (env. 30 sec). Cette procédure sera réalisée une seule fois sur animaux anesthésiés et ayant reçu un antalgique ce qui diminuera grandement la douleur, avec une procédure de réveil adaptée. Les animaux ne subiront ensuite qu’une expérimentation terminale nécessitant une injection (env. 30 sec), effectuée par un expérimentateur maîtrisant le geste. Dans le second établissement utilisateur (EU2/2) et pour la moitié des animaux, l’expérimentation terminale nécessite le prélèvement de sang à 3 reprises durant le test (moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables allant de l’inconfort à des douleurs légères sur de courtes durées pourraient être observés au cours de la vie des animaux. Un inconfort, une mobilité légèrement réduite et une légère douleur pourraient être constatés suite à leur identification par tatouage. Le régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance, pourrait engendrer un inconfort significatif pour l'animal. Un inconfort et/ou un stress pourrait intervenir lors des pesées de suivi. Les injections intramusculaires pourraient entrainer des douleurs et une mobilité réduite pendant quelques minutes. Un stress et une légère douleur liée à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des expérimentations terminales (test de transport de glucose et injection d’insuline). Les prélèvements répétés de sang (3 prélèvements) lors du test terminal de flux de glucose radiomarqué peut provoquer du stress, des douleurs légères, œdèmes et gonflements. Enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre dans les cages d’origine des animaux peut entraîner de l’inconfort et/ou du stress même si la distance est restreinte et qu’il sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, ainsi que l'homéostasie glucidique, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en œuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.

Raffinement

A l’arrivée des animaux en zootechnie, ils seront répartis en cages de 4 à 5 individus et acclimatés à minima 5 jours. Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés en accord avec la SBEA du site. Un suivi quotidien sera réalisé soit par les zootechniciens soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permet une habituation à l'Homme ce qui diminue le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées ; ce paramètre permet également de se rendre compte de l’état de l’animal. Si des lésions cutanées apparaissent suite à des bagarres, une pommade sera appliquée. 30 minutes avant l’injection des AAV, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’antalgique. Le réveil de l'animal, après anesthésie et injection des AAVs, se fera dans une cage posée sur tapis chauffant. Du collyre sera appliqué sur les yeux de l’animal. Une vérification de l’absence d’œdème ou de rougeur au point d’injection des AAV sera effectuée dans les 48 heures post-injection. Si le cas se présentait nous consulterions le vétérinaire référent afin de soigner les animaux ; l’utilisation d’une crème type Cortanmycétine ou Meloxicam sont envisagés. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring en annexe. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du score obtenus, le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU 2/2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d’origine des animaux incluant des enrichissements type igloos ou tunnels sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est prédéterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (8 semaines lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) seront utilisés, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes rendus obèses par un régime nutritionnel approprié pour lesquels une insulino-résistance peut se développer. Les animaux seront hébergés entre 8 semaines et 7 mois, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. La mise en régime obésogène débutera à 3 mois, afin d’induire une obésité et une insulino-résistance chez la souris adulte.

Six à huit essais de nage d'une minute par jour, pendant dix à douze jours, attendent une partie des 724 souris de ce projet dans la piscine de Morris, en plus de l'open-field, du labyrinthe en croix et d'un test de reconnaissance d'objets. Toutes reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant cinq jours à six semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis sont tuées pour l'analyse de leur cerveau. Ces souris, privées par invalidation génétique du gène en cause dans le syndrome de Coffin-Lowry, sont utilisées pour tester un traitement des déficits cognitifs, dès 14 jours de vie pour les plus jeunes. Le porteur précise que ce traitement est déjà administré en recherche clinique à des adultes et à des enfants.

Objectifs

Nous étudions une souris modèle du syndrome de Coffin Lowry. Cette pathologie est due à des mutations d'un gène et conduit à une déficience intellectuelle modérée à sévère chez l’Homme. Il n’existe à ce jour aucun traitement. Pour ce projet, nous utilisons des souris invalidées pour le gène responsable. Notre projet a pour premier objectif de mettre au point un traitement pharmacologique pour corriger les altérations comportementales et cognitives de la souris modèle du syndrome de Coffin Lowry. Notre second objectif sera de tester si ce traitement pharmacologique délivré au plus tôt au cours de la période postnatale, permet d’éviter le retard de développement cérébral et de prévenir l’apparition des altérations cognitives. Enfin, nous combinerons le traitement pharmacologique à un enrichissement environnemental dans le but de corriger les altérations à plus long terme.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe pas de traitement pour les patients atteints syndrome de Coffin-Lowry. Compte tenu de la sévérité des altérations cognitives, la qualité de vie pour ces patients et leurs familles est profondément impacté. Au niveau expérimental chez la souris modèle, la description des altérations moléculaires nous permet aujourd’hui d’envisager de développer des stratégies thérapeutiques basées sur la délivrance d’agents pharmacologiques. Les traitements proposés ont déjà été testés chez d'autres souris modèles et s’avèrent bénéfiques sur certains comportements. Pour information, le traitement proposé est déjà utilisé dans la recherche clinique chez des patients, adultes et enfants, c’est pourquoi nous souhaitons commencer nos expérimentations avec ce candidat médicament. Dans ce contexte, notre projet testera pour la 1ère fois si ce traitement permet aussi de réduire, voire restaurer les altérations cognitives chez la souris modèle du Syndrome de Coffin Lowry.

Procédures

Pour le projet, tous les animaux recevront des injections quotidiennes du traitement ou de solution saline en intrapéritonéale. Après différents délais, ces souris seront mises à mort afin d'analyser leurs cerveaux. Une partie des animaux effectuera en plus des tâches comportementales. La locomotion et l’exploration sera évaluée dans une boite appelée open-field (durée 10 minutes) ou dans un labyrinthe en croix ((durée 10 minutes), ce qui ne génère aucune nuisance. La mémoire de reconnaissance s’effectue dans l’openfield préalablement exploré dans lequel on ajoute des objets à explorer. Pour ce test, les souris sont placées dans cet openfield pendant 10 minutes, 1 à 2 fois par jour pendant 5 jours maximum. La mémoire spatiale sera évaluée avec le test de la piscine de Morris qui génère un léger stress en début de protocole. Le protocole a une durée de 10-12 jours, à raison de 6-8 essais par jour (2 blocs de 3-4 essais successifs). Chaque essai comprend 1 minute de nage et 1 minute de repos sur une plateforme.

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les souris recevront des injections quotidiennes en intra-péritonéale pendant 5 jours à 6 semaines, selon les procédures expérimentales. Les tests comportementaux pourraient générer une légère réactivité émotionnelle chez les animaux en tout début de test.

Devenir

à l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin d'étudier leur cerveau.

Remplacement

Notre projet de recherche consiste à évaluer les bénéfices d’un traitement visant à réduire / compenser les altérations comportementales et cognitives associées à la déficience intellectuelle (retard d’apprentissage, déficits de mémoire). Bien que certaines cascades moléculaires peuvent être décrites sur des cultures neuronales en conditions basales, il est ensuite absolument nécessaire de valider les bénéfices du traitement sur les processus cognitifs chez un animal vivant qui se comporte dans différentes tâches comportementales.

Réduction

Le nombre d’animaux correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. Sur la base des études publiées et de notre expérience, 4-8 souris par groupe expérimental pour les analyses biochimiques et analyses cérébrales, et 8-15 souris par groupe pour les études de comportement sont nécessaires. Des tests de puissance de nos analyses statistiques seront effectués au cours de nos analyses (à partir de n=4), afin de détecter si des comparaisons suffisamment fiables sont dejà atteintes sans avoir à aller, pour chaque expérience, jusqu'à l'effectif maximum envisagé. Si cette valeur est atteinte, il ne sera pas nécessaire d’augmenter les effectifs jusqu'a à 8 pour les analyses cérébrales ou jusqu'à 15 pour les analyses comportementales. De plus, afin de réduire encore le nombre d’animaux nécessaires, les mêmes souris seront réutilisées dans plusieurs tests successifs, les premiers tests d’exploration ne durant que 10 minutes par jour et par souris.

Raffinement

Limiter la souffrance des animaux, s’assurer de leur bien-être et de leur santé, fait partie de nos préoccupations majeures et conditionne véritablement le bon déroulement de nos études, et la fiabilité de nos résultats. En effet, nos études comportementales doivent, pour les animaux, impérativement s’effectuer en l’absence de stress, anxiété et douleur afin d’être viables. Ainsi, avant de les soumettre aux premières injections ou aux tâches comportementales, l’expérimentateur manipule les souris pour limiter stress et anxiété et les habituer à sa présence. Afin de s’assurer que l’administration du traitement n’altère en rien la santé et le bien-être des souris, la mise en place de points limites permettra de réduire de potentielles souffrances. Pour cela, une grille d’évaluation sera utilisée.

Choix des espèces

Il n’y a pas d’autre modèle animal présentant des mutations équivalentes dans le gène ciblé pour ce projet. Le modèle murin inclus dans notre projet est déjà élevé au laboratoire et permettra de mener de manière rigoureuse notre étude. Les études passées ont montré que ces souris sont des modèles reproduisant des déficits cognitifs associés à la pathologie humaine (retard d’apprentissage, déficit de mémoire). Dans notre projet, une partie des expérimentations seront effectuées à l’âge adulte (>56 jours) afin de montrer les effets potentiellement bénéfiques de notre traitement sur des fonctions cognitives altérées. L’autre partie des expérimentations sera effectuée chez des souris juvéniles (de 14 à 35 jours). En agissant au cours de cette période de développement, nous souhaitons corriger au plus tôt le retard de développement cérébral et éventuellement éviter les altérations cognitives à plus long terme.

Tuées à la fin du protocole pour l'analyse de leurs organes et tissus, 396 souris mâles et femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules de cancer du sein sous la peau, puis six jours d'injections de chimiothérapie par anthracyclines, avec cinq semaines d'échographies cardiaques hebdomadaires sous anesthésie et des prises de sang dans le sinus derrière l'œil. Le porteur indique que la tumeur "pourrait être douloureuse" et que la chimiothérapie peut causer des douleurs, et les souris qui restent au-delà des points limites sont "exclues de l'expérience", sans autre précision sur leur sort. Pour justifier le choix de l'espèce, il cite l'homologie avec l'humain et des souris "relativement peu coûteuses à élever".

Objectifs

Depuis longtemps la cardio-toxicité des agents chimiothérapiques est établie chez l'Homme, cependant la chronologie et les facteurs aggravant de la maladie ne sont pas connus. Aussi, aucune stratification des patients n’est réalisable en amont du traitement car les mécanismes précis de cette cardiotoxicité restent complexes et imparfaitement étudiés. L’objectif du projet est de déterminer l’impact de notre protéine, une protéine fréquemment surexprimée dans différents cancers, sur le devenir des animaux traités aux anthracyclines , un des traitement de base du cancer du sein. Ce qui nous intéresse tout particulièrement sera la capacité du coeur à se contracter lorsque nous initierons le traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples : 1. De valider l’hypothèse que les effets toxiques de la tumeur sur le coeur pré-traitement sont médiés par la protéine retrouvé dans la circulation 2. De confirmer l’intérêt d’utiliser la protéine dans la circulation comme biomarqueur prédictif de cardiotoxicité associée à la chimiothérapie 3. De prévenir la cardiotoxicité associée aux anthracyclines par l’utilisation d'un anticorps dirigé contre notre protéine.

Procédures

Pose de bague d'identification à l'oreille: 1 fois au moment du sevrage à 21 jours. Biopsie de 2mm à l'oreille au moment du sevrage à 21 jours. Anesthésies par voie intrapéritonéales: 1/semaine pendant 5 semaines, durée 15 minute. Prélèvements rétroorbitaires sur animaux anesthésiés: 1/ deux semaines pendant 5 semaines, durée 2 min. Injection rétro-orbitaires 1 fois à la 4ème semaine, durée 1 min. Injection sous cutané 1 fois en début de protocole, durée 2 min.

Impact sur les animaux

Concernant la méthode de prélèvement pour le génotypage : inconfort ponctuel lors de la pose de la bague auriculaire et du prélèvement de tissu (2mm à l'oreille). A la suite de l’injection sous-cutanée des cellules cancéreuses, les souris développeront une tumeur, et cette croissance de la tumeur pourrait être douloureuse. La chimiothérapie utilisée peut elle aussi engendrer des douleurs pour l’animal.

Devenir

L'euthanasie de tout les animaux à la fin de la procédure permettra une analyse histologique des organes d'intérêts, ainsi qu'une analyse protéique et génétique de divers tissus selon les groupes d'appartenance des animaux.

Remplacement

Les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant. L'effet d'un traitement sur une monocouche de cellules cancéreuses in vitro nous permet de montrer l'efficacité de ce traitement sur ce type cellulaire mais le traitement devra être étudié in vivo pour être sûr de son efficacité dans un organisme vivant complexe qui contient une multitude de tissus et organes qui peuvent être touchés.

Réduction

Nous avons effectué un calcul nous permettant d’avoir le nombre précis de souris nécessaire à l’étude. En utilisant les résultats d’une précédente étude de notre laboratoire sur un projet relativement similaire, nous sommes arrivés au chiffre de 12 souris par groupe en début de protocole. Enfin, le suivi par échographie cardiaque permet également une réduction du nombre d'animaux car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans mise à mort à des temps intermédiaires.

Raffinement

Les animaux disposeront d’une période d'acclimatation de 5 jours et seront observés quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie ainsi que par l'expérimentateur. Différents points limites seront particulièrement surveillés et seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux. Les animaux âgés de 12 à 18 semaines recevront une injection sous cutanée de 100 microlitres de cellules cancéreuses du sein. A cette occasion, ils seront surveillés de manière visuelle (fréquence respiratoire) pendant 1h après injection. Deux semaines après l'injection de la tumeur, les animaux, mâles et femelles, recevront une injection intrapéritonéale de chimiothérapie tous les jours pendant 6 jours, laquelle peut engendrer des douleurs et donc une analgésie adaptée sera administrée en cas de besoin. Chaque semaine pendant 5 semaines, l’échocardiographie et le prélèvement sanguin (fait une semaine sur deux en l'occurence pour éviter un excès de prélèvement de sang) seront faits l’un après l’autre pour limiter le nombre d’anesthésie hebdomadaire. Nous évaluerons la fonction cardiaque par échographie sous anesthésie générale, puis nous ferons des prélèvements sanguins via le sinus rétro-orbitaire, environ 100 microlitres à chaque prélèvement, 5 min après l'application d'un anesthésique locale. Une pommade ophtalmique afin de réhydrater l'oeil de l'animal sera utilisée post prélèvement. La même procédure aura lieue pour l'injection de notre médicament candidat. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement, l’apparence physique et la gêne pour sedéplacer. En cas d’atteinte des points limites, les souris concernées auront alors un suivi adapté avec analgésie quotidienne, nourriture en gelée dans la cage, et si les points limite persistent, elles seront alors exclues de l'expérience.

Choix des espèces

La souris est utilisée en sciences expérimentales pour plusieurs raisons essentielles. Tout d’abord les souris partagent une grande homologie génétique et physiologique avec les humains, ce qui permet de mieux comprendre les processus biologiques et les maladies chez l’humain. Ensuite, les souris se reproduisent rapidement et sont relativement peu coûteuses à élever, ce qui permet d'obtenir rapidement des cohortes expérimentales. Troisièmement, les souris peuvent être facilement génétiquement modifiées pour étudier l'impact de gènes spécifiques sur les processus biologiques, offrant ainsi des informations précieuses sur la fonction des gènes. Pour notre étude, nous avons choisis des souris mâles et femelles C57Bl/6. Ces souris sont utilisées fréquemment dans la recherche en cancérologie et en cardiologie pour leur robustesse, leur survie malgré de forte dose de chimiothérapies, leur facilité de manipulation génétique, et d’après des recherches bibliographiques la croissance tumorale est la même pour les deux sexes, ce qui nous permettrait donc de comparer les effets du PCZ selon le sexe. Les animaux seront agés de 12 à 18 semaines dans un but de prendre des souris adultes, car le cancer du sein est une maladie fortement liée à l'âge. Prendre des animaux plus jeunes risquerait de masquer certaines observations, et ne serait pas cliniquement relevant lorsque nous voudrions transposer les résultats à l'homme. Prendre des animaux plus agés risquerait d'augmenter la probabilité de morts liés aux traitements, ainsi que la survenue de comorbitidés ou d'autres tumeurs spontanées chez nos souris. Par ailleurs, le cancer du sein triple négatif touche particulièrement les jeunes femmes, donc nous avons choisis des souris dans la première moitié de leur vie.

Une partie des souris de ce projet est nourrie d'un régime riche en gras pour reproduire obésité et dyslipidémie, avant des infections pulmonaires bactériennes ou virales. 3 264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, de l'âge de 8 semaines à environ 8 mois. Toutes subissent sept prises de sang par incision au bout de la queue, et jusqu'à quatre administrations par voie respiratoire, le porteur annonçant sous régime gras des "effets négatifs plus marqués" qu'il ne détaille pas. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leurs organes.

Objectifs

L’obésité et la dyslipidémie (c’est-à-dire un taux de lipides inhabituellement élevé dans le sang) sont décrits comme des facteurs de risque de développement de maladies cardiovasculaires. Ils sont également associés avec une sensibilité accrue aux infections bactériennes ou virales, et une augmentation des risques de maladies inflammatoires. Ils sont aussi décrits comme des facteurs de risque pour des formes sévères d’infections pulmonaires virales, notamment liées au virus de la grippe. Nous souhaitons approfondir la compréhension des mécanismes impliqués lors d’une infection pulmonaire dans un contexte de dyslipidémie et d’obésité. Au cours de nos précédentes recherches, nous avons mis en évidence l’augmentation d’une population de cellules immunitaires, les neutrophiles, dans les poumons de souris nourries avec un régime riche en gras par rapport à des souris sous régime alimentaire normal. Un apport plus important de lipides dans l’alimentation entrainerait donc une inflammation globale, même sans infection bactérienne. Lors d’une pneumonie, l’augmentation de la population de neutrophiles est encore plus marquée, surtout lors des premières phases de l’infection. L’objectif de notre projet est de déterminer l’origine de cette population de neutrophiles, et leur rôle dans les infections pulmonaires dans un contexte d’obésité et de dyslipidémie.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de comprendre comment la dyslipidémie influence la réponse immunitaire des poumons pendant la pneumonie et le rôle des neutrophiles dans ce contexte spécifique, ce qui contribuera à améliorer les soins aux patients souffrant d’obésité et d'infections respiratoires. En caractérisant les réponses immunitaires, il mettra en lumière les interactions complexes entre les troubles métaboliques et les infections pulmonaires, ce qui pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux de ce projet seront soumis à 7 prélèvements de sang après anesthésie locale. Un lot de souris recevra 3 injections, réalisées sur animaux vigiles. Un autre lot recevra 6 injections sur animaux vigiles puis sous anesthésie générale : 1 injection et 1 administration par voie respiratoire. Pour tous les animaux restants, les gestes seront réalisés sous anesthésie générale. Une partie des animaux recevra une à plusieurs administrations par voie respiratoire (4 au maximum), le reste des animaux recevront une à plusieurs injections (4 au maximum) et une à plusieurs administrations par voie respiratoire (4 au maximum). Tous les gestes sont de courte durée (au maximum 1 minute) et les souris sont anesthésiées pendant 1 à 5 minutes maximum. En fonction de l’état général des souris et si nécessaire, une ou plusieurs administrations d’analgésiques peuvent être réalisées.

Impact sur les animaux

Les modèles d’inflammation respiratoire aigüe induisent des effets indésirables transitoires 2-3 jours après une infection bactérienne ou 8-9 jours après une infection virale, dans le cadre d’un régime normal. Des effets négatifs plus marqués peuvent être observés dans le cadre d’un régime riche en gras. Les différentes administrations peuvent entraîner une légère gêne aux animaux. Une petite douleur peut survenir lors des prélèvements de sang, suite à l’incision minime à l’extrémité de la queue. Le geste de contention peut entrainer un léger stress aux animaux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications cardiovasculaire et immunologiques.

Remplacement

Dans ce projet, l'utilisation de modèles animaux est essentielle car les paramètres étudiés ne peuvent pas être remplacés efficacement par des procédures in vitro. Les interactions complexes entre la réponse immunitaire pulmonaire pendant et après la pneumonie et l'obésité nécessitent une approche globale que seul un modèle animal peut fournir. Les modèles animaux sont donc indispensables à une compréhension approfondie de ces phénomènes.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Le nombre indiqué est un nombre maximum de souris et toutes ne seront pas forcément utilisées. Une partie des analyses sera conditionnée aux résultats obtenus sur l’étape d’avant.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux dans des cages de taille normalisée, enrichies en frisottis, avec un tunnel et un dôme, et en carrés de cellulose suivant leur nombre. Le nombre de souris par cage est adapté à leur poids, et les souris isolées sont évitées autant que possible. Dans l’éventualité où une souris est seule, sa cage sera placée au milieu des autres cages de façon à lui permettre de voir et d’entendre ses congénères. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement, et un tableau d’évaluation par scoring des points limites adapté aux modèles a été mis en place. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections d’analgésiants seront réalisées. De façon à limiter les gênes consécutives aux administrations et aux prélèvements de sang, des analgésiques locaux seront utilisés. Dans ces conditions, les gestes réalisés n’entrainent pas de douleur résiduelle.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les données déjà générées dans ce projet de recherche. De plus, le modèle murin est le modèle de choix et utilisé de longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la régulation du métabolisme des lipides et des maladies cardiovasculaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte : ils auront 8 semaines au début des procédures et environ 8 mois à la fin. À ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables et le système immunitaire est mâture. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.