Rongeurs

Tuées à la fin du projet pour que leurs muscles plantaires soient prélevés et analysés, 72 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs leur sectionnent des tendons au cours d'une chirurgie de dix minutes sous anesthésie, afin de mettre le muscle plantaire en surcharge, et le porteur admet des douleurs modérées et un inconfort possibles les jours suivants. Six groupes reçoivent ensuite une injection quotidienne, pendant trois ou dix jours selon le groupe. Le projet cherche à comprendre pourquoi certaines fibres musculaires rapides ne grossissent jamais, et le porteur écarte les cultures cellulaires au motif qu'il reste "encore impossible" d'obtenir des fibres musculaires adultes in vitro.

Objectifs

Les muscles adultes peuvent être plus ou moins forts, et plus ou moins résistants à la fatigue, lors d’activités d’endurance. Ces caractéristiques dépendent de leur composition. En effet, il existe quatre types de fibres musculaires qui ont chacune des fonctions différentes : les fibres de type I ont une bonne résistance à la fatigue, tandis que les fibres IIb apportent de la force aux muscles. Les fibres IIa et IIx ont des capacités intermédiaires en termes de force et de résistance à la fatigue. Notre étude s’intéresse aux fibres IIb et IIx car ces fibres ne grossissent jamais beaucoup, même à l’entraînement. De plus, avec l'âge ou dans certaines maladies graves comme la sclérose latérale amyotrophique ou l’amyotrophie spinale infantile, ces fibres s'affaiblissent et disparaissent rapidement, entrainant une grande perte de force. Comprendre pourquoi ces deux fibres sont sensibles à l'affaiblissement et peu réactives à l'augmentation de volume est très important, notamment dans la lutte contre les effets du vieillissement. A la suite d’une surcharge d'activité sur le muscle plantaire, les fibres de type I et IIa grossissent, mais pas les fibres IIb. A sept jours de surcharge, deux substances sont libérées qui se lient à des récepteurs sur les différents types de fibres musculaires et pourraient aider à augmenter la masse musculaire. L’objectif de ce projet est de déterminer si ces molécules jouent un rôle clé dans le contrôle de la masse musculaire en bloquant leurs récepteurs dans les muscles soumis à un effort intense.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le contrôle de la masse et de la fonction musculaire impliqués dans plusieurs pathologies et d’améliorer la prise en charge des patients pour permettre à plus long terme d’améliorer la qualité de vie (favoriser le bien vieillir et l’autonomie). De manière plus large, nous nous intéressons à la résistance à l’hypertrophie des fibres musculaires glycolytiques à contraction rapide qui sont également touchées préférentiellement au cours du jeûne, dans les cachexies cancéreuses, la sclérose latérale amyotrophique, les insuffisances cardiaques.

Procédures

Les souris sont divisées en 6 groupes (G1,G2, G3, G4, G5, G6) et seront soumises aux interventions suivantes : - une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie d'une durée de 10 min (tous les Groupes) - Une injection 1 fois par jour d'une durée de 1 minute pendant 10 jours (G1, G2 et G3), et pendant 3 jours (G4, G5 et G6)

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une douleur légère liée et de courte durée liée aux injections. Les animaux opérés pourront ressentir des douleurs modérées et de l’inconfort liées à la lésion des tendons, la surcharge du muscle plantaire ainsi qu’à l’inflammation les jours suivant l’opération.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du projet afin de récupérer les muscles plantaires et réaliser des analyses d'anatomie et de biologie moléculaire

Remplacement

Compte tenu du fait qu'il est encore impossible d'obtenir des fibres musculaires adultes en culture, le modèle animal reste indispensable pour étudier les effets de médicaments sur des organes.

Réduction

Les effectifs ont été calculés en utilisant une étude statistique garantissant la validité des données obtenues et l’utilisation d’un nombre réduit d’animaux. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris sont opérées sous anesthésie, analgésique pré et post opératoire. Les souris sont placées sur un plateau chauffant (37°C) pendant la période de réveil post opératoire. Une grille de score adaptée a été mise en place afin d’assurer cette surveillance durant toute toute la période du protocole. Un enrichissement sous forme de tubes et de maisons sera mis dans les cages. Les souris sont hébergées par groupe de 4 par cages et une visite par jour est effectuée entre les jours J0 et J13 puis une fois tous les 2 jours entre les jours 14 et 21.

Choix des espèces

L’hypertrophie musculaire induite par la surcharge d'activité est bien démontrée dans le modèle souris et il retrace ce qu'on observe chez l'homme. Les animaux sont utilisés à l'âge adulte (8 semaines) pour s’acquitter de l'effet de croissance chez des souris plus jeune qui sont encore en train de grandir.

Apporter aux autorités sanitaires les preuves d'innocuité exigées avant la mise sur le marché de dispositifs médicaux censés reconstituer le collagène de la peau : 300 rats sains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leur peau. Le dos rasé, chaque animal reçoit le même jour jusqu'à six injections d'hydrogels différents en sous-cutané ou en intradermique, sous anesthésie et après administration d'un analgésique opiacé. Le porteur présente cette accumulation de six produits sur un même individu comme une mesure de réduction qui divise par six le nombre d'animaux utilisés. Il énumère les limites des modèles de peau humaine, explants qui ne survivent que sept à huit jours et échantillons d'abdominoplastie au derme épaissi, pour conclure que l'évaluation chez l'animal reste "nécessaire".

Objectifs

Les traitements contre le diabète, l’obésité (anti-GLP1) ou l’infection par le virus du SIDA (VIH) ont pour effets secondaires une atrophie des tissus adipeux sous-cutanés (lipoatrophie) et un vieillissement cutané (perte de collagène) accéléré. L’infection par d’autres virus chroniques ainsi que certains troubles métaboliques peuvent aussi être à l’origine de ces effets. La perte de collagène est une cause sous-jacente majeure du vieillissement cutané observé chez ces patients. Il est donc nécessaire de développer des thérapies susceptibles de stimuler la régénération cutanée (production de collagène, régénération du tissu adipeux dermique) et de combler les zones atrophiées afin de limiter l’impact structurel. Ces effets secondaires présentent également un impact psychologique délétère qui dégrade fortement la qualité de vie de ces patients. Ce programme de recherche s’intéresse à caractériser chez le rat la régénération tissulaire et la stimulation de la fabrication naturelle de collagène grâce à de nouvelles formulations ou composés (efficacité), et vérifier l’absence de réactions inflammatoires délétères autour du site d’injection (innocuité). Ces études consistent à injecter, en une seule fois, par voie sous cutanée ou intradermique, plusieurs composés sous forme d’hydrogel à potentiel régénérateur de collagène, sur des sites différents d’un même animal, dans le but d’évaluer la réponse induite par la stimulation sur la peau. Afin d’évaluer et de caractériser cette réponse, des prélèvements post mortem de peau, seront ensuite réalisés tout au long de l’étude afin de suivre la régénération tissulaire dans le temps et de comparer la stimulation induite par différents composés ou formulations (augmentation du collagène, élastine et autres protéines de la matrice extracellulaire). Des prélèvements sanguins longitudinaux seront également possibles pour suivre certains biomarqueurs de l’activité tissulaire. La production de collagène supplémentaire est étudiable chez l’animal sain, et ces études seront donc réalisées sur animaux sains, en amont d’éventuelles études sur animaux présentant des anomalies cutanées comparables à celles observées chez les patients. Cela permettra donc de cribler au mieux plusieurs composés avec le minimum d’impact sur le bien-être animal, avant d’envisager des études plus impactantes pour le bien-être animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles formulations et composés pour une utilisation dont l’innocuité et l’efficacité doivent être testées avant des essais cliniques. Les expériences menées chez le rat, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettront l’introduction en clinique de nouvelles stratégies pour la régénération tissulaire cutanée dans le cadre des lipoatrophies. Un bénéfice supplémentaire sera de sélectionner un nombre réduit de composés candidats qui seront testés sur des modèles pathologiques plus complexes.

Procédures

Les animaux (rats) seront exposés à des composés multiples. Les zones à injecter seront rasées (manipulation de 5 minutes) ce qui pourrait créer une légère rougeur transitoire. Les animaux recevront le même jour et une seule fois dans toute la procédure, plusieurs injections successives en sous-cutané ou intradermique de produits non dispersibles sur des sites différents localisés sur le dos de l’animal (maximum 6 sites = 6 injections pour le rat) en respectant le volume d’administration maximum recommandé par la SBEA sur une journée (ex : rat en sous cutané). Pour les traitements multiples et pour les intradermiques une administration préalable d’un analgésique opiacé en sous cutané sera réalisée (30 min avant) et l’administration des composés sera ensuite réalisée sous anesthésie à l’isoflurane. Les traitements seront administrés sous anesthésie d’un total d’enviton 30 minutes. Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au minimum 1 fois par semaine (manipulation de 5 minutes). Le site d’injection sera observé sur les quelques jours suivant l’administration pour surveiller l’absence de réactions dans la zone (par ex. irritation, pétéchie, œdème, érythème…), effets cependant extrêmement peu probables, et l’état général des animaux sera vérifié. Lorsqu’ils sont nécessaires, les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible (manipulation de 5 minutes sans anesthésie ou anesthésie d’un total de 30 minutes). En fin de projet, les animaux seront euthanasiés. Un prélèvement de sang terminal en intracardiaque pourra être réalisé sous anesthésie générale profonde puis des prélèvements d’organes pourront être effectués après mise à mort.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, aucun effet sur l’évolution du poids des animaux n’est attendu. Les animaux seront rasés au niveau des sites d’injection. Une rougeur pourra être présente juste après le rasage. Les animaux recevront plusieurs traitements en une seul occurrence sur des sites différents . Des douleurs transitoires aux différents sites d’injection peuvent être observés, nécessitant administration d’un analgésique. Nous n’attendons pas d’effets nuisibles au site d’injection, cependant nous surveillerons l’apparition éventuelle de signes d’irritation de la peau, de lésions cutanées, pétéchies, d’érythèmes, nécroses cutanées, d’œdèmes ou toute autre altération macroscopique de la peau. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés principalement pour des mesures de poids qui pourront entraîner un stress que l’on peut considérer comme faible. Le jour de la formation des groupes, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress modéré de 1-2 jours. Lorsqu’ils sont nécessaires, les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre la récupération de différents échantillons biologiques d’intérêt (notamment peau).

Remplacement

Des modèles in vitro permettent d’étudier certains processus de régénération tissulaire et sont utilisés pour pré-sélectionner les composés les plus intéressants. Ces études sont réalisées en amont dans nos laboratoires. Cependant, aucune ne reproduit la complexité observée in vivo, et les meilleurs composés sélectionnés in vitro doivent être évalués in vivo. En effet, il est possible de travailler dans un premier temps avec des modèles 3D de peau, des cultures de cellules de tissu adipeux et des échantillons de peau humaine mais ceux-ci présentent plusieurs limites : - Toxicité des gels sur cellules isolées du fait de l’absence de matrice extra-cellulaire - Modèles incomplets ne récapitulant pas tous les effets (par exemple inflammation) - Origine de la peau : les échantillons proviennent de chirurgies de type abdominoplasties et présentent donc en général un derme hypertrophié et non hypotrophié (patients en surpoids) - Durée de vie des explants : les échantillons de peau ne peuvent survivre qu’environ 7-8 jours, ne permettant pas une évaluation sur le long terme De plus, s’agissant de dispositifs médicaux, des preuves d’innocuité et d’efficacité doivent être apportées aux autorités sanitaires avant essais cliniques et mise sur le marché. C’est pourquoi l’évaluation chez l’animal de la régénération tissulaire par biostimulation de composés chimiques ou biologiques est nécessaire, pour sélectionner le meilleur composé avant un passage en phase clinique chez l’Homme.

Réduction

Dans les études de ce projet, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux (en général de 6 à 8 animaux) selon le poids en début d’étude (randomisation). Grace à l’injection de plusieurs composés sur un même animal (maximum 6, sous forme de matrices hydrogel restant au niveau de l’emplacement d’injection sous-cutanée), le nombre d’animaux utilisé en est d’autant réduit. En pratique, le nombre d’animaux utilisés est divisé par 6 si on ne se limite pas à un produit par animal. Le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été estimé sur la base de tests statistiques.

Raffinement

Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes (comportement, masque facial de douleur). Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les traitements simultanés sur plusieurs sites en sous-cutané ou intradermique sur un même animal sont réalisés sous anesthésie générale précédé d’une analgésie (30 minutes minimum avant). Pour l’administration intradermique, la zone sera préalablement stérilisée. La possibilité de réaliser les intradermiques par « microneedling » sera évaluée, afin de répartir le volume au niveau des sites d’injection ID . De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie (nids, jouets en bois, niche). Des graines de tournesol pourront être utilisées comme enrichissement positif après la manipulation des animaux. Lorsqu’ils sont nécessaires, les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible. Les volumes et fréquences d’administration et de prélèvement sont conformes aux bonnes pratiques et aux recommandations de la SBEA. Toutes les techniques sont réalisées par du personnel formé et compétent. Les prélèvements d’organes/tissus sont réalisés après mise à mort de l’animal. En cas d’apparition de signes cliniques indésirables, les animaux seront observés quotidiennement et des mesures seront mises en œuvre pour arrêter, minimiser ou diminuer la souffrance et/ ou détresse de l’animal.

Choix des espèces

Les études à l’aide des rongeurs, notamment les rats, sont utilisées pour l’exploration de la régénérescence tissulaire ou l’évaluation de l’efficacité de tout nouveau composé stimulateur de la régénérescence, qu’il soit d’origine chimique, issu de la biotechnologie ou naturel. La connaissance de la peau des rongeurs et de son organisation extracellulaire, conduit à une meilleure connaissance du même système chez l’Homme et permet d’explorer de nouvelles pistes pour la médecine. Les animaux seront immunocompétents pour répondre à l’objectif du projet et se rapprocher le plus possible du phénomène de régénérescence tissulaire humaine. De plus, le rat en raison de sa taille, est l’espèce la plus adaptée à ce projet pour la co-implantation de plusieurs matrices simultanées (réduction). Les rats sont par ailleurs de loin l’espèce la plus utilisée dans la littérature pour ce type d’évaluation, permettant de comparer les données obtenues avec la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines minimum lors de leur première manipulation). Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adultes et afin qu’ils présentent une peau et un système immunitaire matures.

Trente-trois séances de contention dans le noir, la queue glissée dans un manchon de mesure, répétées trois jours d'affilée toutes les quatre semaines de la douzième à la cinquante-deuxième semaine de vie : 4 864 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Certains groupes reçoivent une alimentation très riche ou très pauvre en sel, ou un glucocorticoïde dans l'eau de boisson, pendant deux semaines. Le projet porte sur le rôle de trois gènes dans la fonction de la glande surrénale et l'hypertension artérielle, que le porteur juge "impossible à analyser in vitro". L'effectif par groupe double, de huit à seize souris, parce que la surrénale est trop petite pour être coupée en deux et fournir assez de matériel.

Objectifs

L’hypertension artérielle est un facteur de risque cardiovasculaire qui affecte jusqu’à 45% de la population. Bien qu’il existe un large arsenal thérapeutique, le contrôle optimal de la pression artérielle n’est pas atteint chez quasiment deux tiers des patients. Ces dernières années des gènes responsables d’hypertension ont été identifiés ainsi que des gènes de prédisposition au développement de formes secondaires d’hypertension artérielle. L’étude du rôle de ces gènes est indispensable pour mieux comprendre les causes de cette hypertension artérielle et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques plus efficaces. L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle de trois nouveaux gènes et de l’interaction de deux de ces gènes identifiés comme jouant un rôle dans le développement d’hypertension artérielle et dans la réponse physiologique de la glande surrénale à des modification de l’apport sodé ou en glucocorticoïdes.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre le rôle de différents gènes identifiés comme impliqués dans l’hypertension dans la réponse adaptative aux variations des apports sodés ou des apports en glucocorticoïdes. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables du développement de certaines formes d’hypertension artérielle permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et ainsi d’améliorer la prise en charge de patients.

Procédures

Des mesures de pression artérielle sur souris vigile seront réalisées toutes les 4 semaines chez des souris de 12 à 52 semaines : L’animal sera placé dans un dispositif de contention, dans le noir. La queue de l’animal sera placée dans le manchon (« capteur de pouls ») afin d’enregistrer la pression. L’ensemble du protocole dure environ 15 minutes et est répété 3 jours d’affilé. Ce geste sera répété toutes les 4 semaines, soit 33 fois au cours de la vie de l'animal. Certains groupes d’animaux recevront une alimentation riche ou pauvre en sel ou un glucocorticoîde dans l’eau de boisson pendant 2 semaines. Un prélèvement unique de sang sera réalisé sous anesthésie profonde. Ce geste dure 1 minute). L’injection du mélange anesthésique sur souris vigile, réalisé avant le prélèvement de sang dure moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

La contention de l’animal lors des mesures de pression artérielle peut engendrer un stress. L’injection du mélange anesthésique peut entrainer une douleur et un stress de courte durée. Le prélèvement de sang ainsi que la contention pré anesthésie peuvent occasionner une douleur et un stress de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes qui seront analysés par différentes approches.

Remplacement

Bien que des approches in vitro aient été développées pour étudier la fonction de gènes impliqués dans le développement de l’hypertension ou de gènes de prédisposition au développement de l’hypertension, le modèle animal seul permet de reproduire la complexité des réactions mises en jeu dans le développement de l’hypertension.

Réduction

A partir de données de la littérature, de l’expérience du laboratoire et des analyses de puissance statistique, il a été déterminé un nombre minimum de 8 souris par groupe expérimentale. Cependant la taille de la surrénale ne permet pas de couper le tissu en deux pour réaliser toutes les expériences souhaitées sur un même tissu. Il est donc nécessaire de prévoir 16 animaux par lot au lieu de 8 pour avoir assez de matériel et garantir une analyse statistique fiable. Les analyses observationnelles seront complétées et vérifiées par les approches in vitro.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d’hébergement et d’élevage sons standardisées et contrôlées durant toute la vie de la souris. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par l’utilisation d’analgésiques adaptés. Une surveillance journalière sera mise en place et une grille d’évaluation établie afin de permettre de mettre fin à l’expérimentation de façon anticipée. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les expérimentateurs ou par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes de souffrance ou de mal-être.

Choix des espèces

La souris (Mus Musculus) est un modèle de choix, en raison de ses caractéristiques génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Ce raisonnement s'applique tout particulièrement à l'étude de l’hypertension artérielle, maladie complexe et impossible à analyser in vitro. Afin de pouvoir suivre le développement post-natal de la glande surrénale ainsi que l’effet de différents régimes sodés ou de l’apport en glucocorticoïdes, il est nécessaire d’utiliser des animaux jeunes, entre 2 et 9 semaines. Au-delà, un cycle complet de transdifférenciation du cortex de la surrénale a eu lieu et les analyses sont donc moins pertinentes. Le développement d’une hypertension artérielle est un processus long, justifiant de suivre les souris sur plusieurs mois (jusqu’à l’âge de 52 semaines).

Deux à quatre injections dans les muscles des pattes arrière, pratiquées sur des rats dont les muscles sont déjà lésés par une dystrophie de Duchenne, avec un antalgique renouvelable toutes les douze heures pendant deux à trois jours. 52 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour analyses génétiques, histologiques et moléculaires. Le porteur écrit pourtant qu'"aucun effet indésirable significatif n'est attendu" et que la méthode n'a montré ni toxicité ni effet secondaire. Le bénéfice visé, renforcer assez la force des bras et des doigts pour manipuler un fauteuil roulant, reste un objectif de long terme conditionné à la confirmation des résultats précliniques.

Objectifs

Les dystrophies musculaires constituent un groupe de maladies génétiques rares et graves pouvant affecter différents tissus, principalement le muscle squelettique. L’une des formes les plus sévères, la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), est causée par des anomalies du gène codant la dystrophine, une protéine essentielle au bon fonctionnement des fibres musculaires. En l’absence de cette protéine, les muscles s’affaiblissent progressivement, entraînant d’abord une perte de la capacité à marcher, puis des complications respiratoires et cardiaques. À ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible, bien que plusieurs pistes thérapeutiques soient activement explorées. Certaines approches visent la réparation ciblée des mutations génétiques, afin de corriger le gène défectueux. Dans ce contexte, le système CRISPR-Cas9, souvent appelé « ciseaux moléculaires », offre une capacité puissante pour modifier l’ADN de manière précise, en supprimant ou insérant des fragments de séquence afin de corriger les mutations responsables. L’une des principales difficultés demeure la délivrance efficace et sûre de cet outil dans les cellules musculaires. Ce projet propose d’évaluer une méthode innovante d’administration du CRISPR-Cas9, reposant sur l’introduction directe et transitoire de la protéine Cas9 – ainsi que d’autres composants d’édition génétique – dans les cellules musculaires, de façon non toxique et sécurisée. L’objectif est de tester l’efficacité de cette approche chez un modèle animal présentant des symptômes et caractéristiques similaires à ceux des patients, afin de déterminer si cette méthode permet de restaurer la production de dystrophine à différents stades de la maladie. Le protocole inclura également l’évaluation de l’impact des administrations successives (deux injections) en comparaison avec une administration unique. Bien que ce type de thérapie ne constitue pas une guérison définitive, il peut être envisagé comme une option complémentaire aux traitements existants. L’objectif à long terme est de développer cette approche comme une thérapie permettant, par exemple, de renforcer la force des bras pour manipuler les fauteuils roulants, ou celle des doigts pour saisir des objets et utiliser les commandes des fauteuils, améliorant ainsi l’autonomie quotidienne et la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider l’efficacité et la sécurité d’une méthode innovante d’administration des outils d’édition génique directement dans les cellules musculaires, dans un modèle de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’objectif principal est de démontrer que cette approche, appliquée à des muscles spécifiques, permet de restaurer la production de dystrophine et d’induire une amélioration de la force musculaire, contribuant ainsi à renforcer la fonction motrice. Un avantage majeur de cette méthode, selon les données préliminaires, est qu’elle n’active pas le système immunitaire, ce qui permet des administrations répétées pour renforcer l’effet thérapeutique sur un même muscle ou pour traiter différents muscles. De plus, la stratégie sera testée à différents stades de la maladie (précoce et avancé), afin d’évaluer son efficacité tout au long de l’évolution de la dystrophie. Cela ouvre la possibilité d’une application chez des patients d’âges variés, y compris ceux présentant une forme avancée de la maladie. En ciblant des muscles spécifiques plutôt qu’en diffusant le traitement de manière systémique, cette approche se positionne comme un traitement complémentaire, visant à améliorer l’autonomie et la qualité de vie des patients. À long terme, si les résultats précliniques se confirment, cette stratégie pourrait ouvrir la voie à des essais cliniques chez l’humain, avec l’objectif d’aider les patients à renforcer la force des bras pour manipuler les fauteuils roulants, ou celle des doigts pour saisir des objets et utiliser les commandes, facilitant ainsi les activités quotidiennes et l’indépendance. Ainsi, ce projet pourrait poser les bases d’une thérapie innovante et sûre, capable d’améliorer durablement la qualité de vie des patients et de leurs familles.

Procédures

Dans ce projet, le traitement sera administré par injection dans un muscle de chacune des pattes arrière, soit deux injections par animal, ou quatre dans le cas de doses répétées. Toutes les injections seront réalisées sur des animaux préalablement traités avec un médicament contre la douleur. Ce traitement pourra être répété toutes les 12 heures pendant deux à trois jours, uniquement si des signes de douleur sont observés. À la fin de la procédure, un prélèvement sanguin sera effectué sur des animaux complètement endormis (anesthésiés au moyen d’une injection). Ce prélèvement sera réalisé une seule fois pour chaque animal. Chaque injection sera effectuée en moins d’une minute, et le prélèvement sanguin en moins de trois minutes. Au total : - 36 animaux, chacun recevant 2 à 7 injections d’un médicament contre la douleur et 2 injections du traitement, une dans chaque patte. - 16 animaux, avec 3 à 13 injections d’un médicament contre la douleur et 4 injections avec le traitement, deux dans chaque patte.

Impact sur les animaux

Des études antérieures utilisant cette méthode ont montré l’absence d’effets toxiques ou secondaires liés à l’administration du traitement. Par conséquent, aucun effet indésirable significatif n’est attendu chez les animaux dans le cadre de ce projet. L’administration dans le muscle peut toutefois provoquer une légère gêne ou douleur, en particulier chez des animaux présentant déjà des lésions musculaires. Deux types des interventions seront réalisées : 1. L’administration d’un médicament anti-douleur, qui ne devrait pas entraîner de gêne notable. 2. L’administration du traitement dans un muscle de chaque patte arrière. Ces interventions peuvent provoquer une douleur locale transitoire. Ils seront effectués chez des animaux âgés de 4, 12 et 16 semaines, à un stade où les muscles sont peu (4 semaines) ou modérément (12 et 16 semaines) affectés, avec un impact très limité ou plus marqué respectivement, selon l’âge. Les animaux seront suivis jusqu’à un âge compris entre 3 et 6 mois, avant l’apparition des symptômes les plus graves de la maladie (vers 9 mois), afin de limiter autant que possible leur souffrance liée à l’évolution naturelle de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les échantillons nécessaires aux analyses génétiques, histologiques et moléculaires.

Remplacement

La dystrophie musculaire de Duchenne touche plusieurs organes interconnectés (muscle, cœur, cerveau, tube digestif), mais le muscle squelettique est l’un des plus affectés. La méthode thérapeutique proposée est une approche innovante d’administration des outils d’édition génique dans les cellules musculaires, permettant de corriger de manière précise le gène défectueux responsable de cette maladie. Aucun produit n'est testé chez nos animaux sans qu’un mécanisme et un effet biologique robustes aient été préalablement établis. Avant les essais précliniques sur les animaux issus de nos lignées modèles, l’efficacité et la sécurité de cette thérapie ont été testées sur des cultures de cellules musculaires (in vitro), avec des résultats très encourageants : la méthode montre une forte efficacité pour modifier le gène défectueux, sans altérer la santé ni le fonctionnement normal des cellules. De plus, afin d’évaluer l’efficacité et la toxicité dans un organisme entier, cette stratégie a été testée in vivo sur un modèle animal de plus petite taille, confirmant que la méthode permet d’introduire efficacement les outils de réparation dans les fibres musculaires, sans toxicité, sans effets secondaires visibles et sans déclencher de réponse immunitaire chez les animaux traités. Le présent projet cherche à valider cette stratégie (en termes d’efficacité et d’innocuité) chez un organisme mammifère sévèrement atteint par la maladie, plus proche de la réalité humaine, et présentant des signes cliniques similaires à ceux observés chez les patients (perte musculaire, faiblesse et évolution progressive de la maladie), y compris dans la complexité de la réponse de l’organisme à l’administration du traitement.

Réduction

Lors des essais précliniques, le traitement de moins de 10 individus permet généralement d’obtenir des données suffisantes pour confirmer ou infirmer un effet majeur d’un candidat médicament sur l’évolution de la maladie. Des analyses statistiques ont été réalisées, permettant de réduire le nombre moyen d’animaux nécessaires pour répondre aux questions biologiques posées lors des expérimentations. Pour les objectifs de ce projet, nous avons mis en place des procédures pilotes et en cascade, permettant de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire selon la progression du projet. Le nombre d’animaux témoins pour les procédures pilotes a été réduit au minimum, tout en permettant que leurs données soient analysées et intégrées dans notre banque d’échantillons.

Raffinement

Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à des manipulations douces et régulières. Ils sont hébergés par groupes de deux ou plus, dans un environnement enrichi afin de prévenir l’ennui et le stress. Pour anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage, yeux), leur comportement (mobilité) et leur état général (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont mises en place : surveillance renforcée biquotidienne et administration de médicaments visant à atténuer ou supprimer la douleur. Dans le but de prévenir toute souffrance animale, des points limites ont été établis et feront l’objet d’un suivi rigoureux, avec application immédiate de procédures préétablies. Par ailleurs, pour réduire au maximum le stress lié aux manipulations ou aux tests, les animaux sont préhabitués et familiarisés avec l’expérimentateur 2 à 3 jours avant le début des procédures, afin d’éviter toute réaction de peur ou de stress lors des manipulations scientifiques.

Choix des espèces

Le rat est un mammifère appartenant à la même classe que l’être humain. Cette proximité évolutive en fait un modèle particulièrement apprécié pour la recherche biomédicale. Il partage de nombreux aspects anatomiques et physiologiques avec l’homme, notamment la constitution et le fonctionnement des organes ainsi que les processus métaboliques. Grâce aux outils génétiques récents, le rat est devenu un modèle de choix pour l’étude des troubles musculaires. Les modèles de rat reproduisent de manière très fidèle ce type de maladies humaines, tout en conservant les avantages des rongeurs : courte durée de gestation, taille raisonnable et longévité compatible avec l’évaluation à long terme des médicaments sur des individus âgés. Le rat constitue ainsi un excellent complément aux autres modèles animaux, permettant de mieux comprendre la physiopathologie et d’évaluer l’efficacité et la sécurité de nouvelles thérapies. Les animaux seront âgés de 1 et 3 mois au moment de la procédure, correspondant aux stades précoce et avancé de la maladie. Ces stades permettent d’explorer les muscles et d’évaluer l’effet de la thérapie à la fois fonctionnellement et morphologiquement, en tenant compte des différents degrés de progression pathologique.

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids sont mises à mort, le poids n'étant relevé qu'une fois par mois. 57 souris déficientes en lipase hormono-sensible vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser l'expression de leurs gènes. Vigiles, elles subissent des évaluations comportementales et motrices de cinq à trente minutes chacune sur quatre jours, avec préhension d'une à cinq minutes et stimulations électriques, sans qu'aucun test soit nommé. Le porteur qualifie le stress lié à ces dispositifs de "léger à modéré", et écrit ailleurs que les mêmes tests génèrent "peu de stress".

Objectifs

La quantité et la distribution de la masse grasse évolue au cours de l’âge. Les souris déficientes en HSL présentent moins de masse grasse répartie différement que les souris contôles. L’objectif est de déterminer les liens entre masse grasse (caractéristiques du tissu adipeux) et le déclin fonctionnel lié au vieillissement par phénotypage comportemental. Ces travaux peuvent déboucher sur l’identification de nouveaux biomarqueurs de fragilité.

Bénéfices attendus

Au cours du vieillissement, les tissus adipeux sont affectés précocémment par les phénomènes de sénescence cellulaire. Cette étude permettra d’avoir une compréhension plus fine des processus de vieillissement dans les tissus adipeux, de déterminer l’importance de l’évolution de la masse grasse dans les complications liées à l’âge et d’identifier des marqueurs et des facteurs de risque précoces.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à une série d'évaluations comportementales et motrices, d'une durée de 5 à 30 minutes chacune, et réparties sur 4 jours non consécutifs.

Impact sur les animaux

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent un certains niveau de stress : préhension de une à cinq minutes lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement ainsi que des stimulations électriques. Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent un stress léger à modéré lié notamment à la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement et l'exploration d'un nouvel environnement non familier.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les tissus seront récupérés afin de réaliser des analyses d’expression des gènes.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l'impact de la masse grasse sur les capacités globales des individus âgés, notamment les fonctions physiques et mentales. Pour répondre à cette question, l'étude nécessite un organisme vivant et intact capable d'intégrer des processus physiologiques complexes (métabolisme, vieillissement) et de manifester des comportements. Or, les tests comportementaux utilisés pour évaluer ces processus ne peuvent être reproduits par des approches sur cultures cellulaire. L’utilisation d’un modèle animal demeure indispensable pour cette étude, car il n’existe à notre connaissance aucun modèle alternatif reproduisant les effets du vieillissement et permettant une comparaison avec des modifications de la répartition des tissus graisseux (lipodystrophie). Le modèle de la souris a été choisi en raison de son espérance de vie plus courte et de la similarité de ses processus physiologiques avec l'Homme. Cette approche in vivo est la seule manière fiable et peu invasive d'étudier l'interaction entre la masse grasse et le déclin fonctionnel.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum en se basant sur les données de la littérature et ce nombre a été corrigé par un calcul de puissance statistique.

Raffinement

Les tests expérimentaux utilisés pour cette étude génèrent peu de stress (préhension lors de la mise en place des animaux dans les dispositifs de comportement). Une habituation aux gestes de manipulation sera effectuée avant chaque lot de tests pour limiter le stress généré par l’expérimentateur. De plus, Les animaux seront suivis quotidiennement afin d'identifier le plus précocement possible tout signe de souffrance ou de stress. Si l’animal présente des signes de détresse, comme une diminution modérée du poids corporel (en 10 et 20%), ou une aggressivité inhabituelle ou une prostration, l’animal sera placé en surveillance rapprochée. Des mesures de renforcement de l’enrichissement peuvent être mis en place comme la nourriture liquide, nidification supplémentaire. Si les signes persistent ou s’aggravent, l’animal sera temporairement exclu de l’étude et recevra si nécéssaires des soins adaptés. Si l’animal présentent des singes cliniques critiques ou irréversibles comme l’apathie, la perte de poids >20% (poids mesurés tous les mois), difficultés de déplacements, alors l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Lors de ce projet, nous cherchons à étudier les capacités d’un individu d’âge avancé en fonction de la quantité de masse grasse. Cela nécessite de l’étudier sur des organismes vivants, humains ou modèles animaux. La souris semble un choix plus approprié pour cette étude grâce à l’espérance de vie plus courte et des processus physiologiques similaires à l’Homme. Pour étudier la fragilité et les processus de vieillissement, une évaluation initiale sera effectuée à l'âge adulte (12 mois). L'objectif est d'identifier des marqueurs précoces liés à ces phénomènes.

Jusqu'à six injections par animal, des tests de suspension et d'agrippement répétés treize fois sur quatre mois, puis une chirurgie de vingt minutes sans réveil pour mesurer la contractilité du muscle : 1 008 souris porteuses d'une mutation myopathique vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyses moléculaires et histologiques des muscles injectés. Le projet vise à optimiser une thérapie génique que l'équipe dit avoir déjà validée dans le muscle, l'administration par voie sanguine ayant échoué lors des essais antérieurs. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de poursuivre dans ce modèle et que seule l'injection dans le sang permettra de vérifier l'effet à l'échelle d'un "organisme entier". La lignée fait l'objet d'une autorisation d'élevage pour phénotype dommageable, alors que le même document décrit des souris au comportement locomoteur, au poids, à la longévité et à la fertilité comparables à ceux des souris non modifiées.

Objectifs

Nous développons des approches thérapeutiques pour une maladie génétique rare du muscle, causée par des mutations dans un gène codant une protéine impliquée l’entrée et le transport de vésicules à l’intérieur de la cellule. Nous avons démontré que l'injection dans le muscle d’un virus thérapeutique exprimant une molécule ciblant la forme mutée de la protéine permet de restaurer la structure et la fonction du muscle dans un modèle murin de la maladie, lorsqu’elle est administrée à l’âge d’un mois. Cependant, le traitement est moins efficace chez les souris plus âgées qui présentent une atteinte musculaire plus prononcée. Par ailleurs, les essais d’administration systémique visant à traiter l’ensemble des muscles via la circulation sanguine se sont révélés inefficaces, même chez les souris âgées d’un mois. L’expression de la molécule thérapeutique dans la cellule par l’intermédiaire d’un vecteur viral est dépendante de son entrée dans la cellule et de son transport jusqu’au noyau. Nos travaux antérieurs ont montré que le vecteur est moins bien acheminé chez les souris malades et que ce phénomène s’empire avec la progression de la maladie. Ainsi la pathologie elle-même, semble compromettre l’efficacité de l’administration du traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer des stratégies thérapeutiques alternatives permettant d’acheminer efficacement la molécule de thérapie génique, notamment à travers l’utilisation de différentes combinaisons de vecteurs viraux ou non viraux.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’une maladie neuromusculaire rare et invalidante (prévalence estimée inférieure à 1 pour 100 000 naissances), pour laquelle aucun traitement curatif n’est actuellement disponible. La faiblesse musculaire progressive entraîne une perte d’autonomie, altérant significativement la qualité de vie des patients et nécessitant une prise en charge pluridisciplinaire. La réussite de ce projet représentera une avancée cruciale dans l’évaluation préclinique de notre molécule et permettra d’envisager le développement de traitements qui, à ce jour, n’existent pas pour les patients atteints de cette maladie. Par ailleurs, ce travail enrichira notre compréhension des différentes voies d’administration (virale et non virale) de thérapies géniques dans un contexte où la transduction virale est altérée. Les stratégies optimisées et les données générées pourront être extrapolées à d’autres pathologies caractérisées par des défauts similaires de délivrance du vecteur, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques

Procédures

Toutes les souris participant à cette étude recevront une thérapie via différentes voies d’injections (entre 1 à 6 injections maximum par souris selon le protocole suivi) réparties sur plusieurs semaines. Suivant la voie, les animaux seront vigiles ou anesthésiés. L’acte technique dure 2 minutes maximum et sera répété 6 fois maximum. Afin d’évaluer la force musculaire des animaux et donc l’efficacité des thérapies testées, certains animaux suivront des tests de force non invasifs (capacité à s’agripper ou à se suspendre). Les animaux seront vigiles lors de ces tests, chaque test pourra durer 5 minutes maximum et ils seront répétés 13 fois maximum sur 4 mois. Tous les animaux auront une chirurgie en phase terminale sans réveil afin de tester la contractilité musculaire. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie et durera 20 minutes. Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La lignée de souris présente un phénotype dommageable. Les souris hétérozygotes développent progressivement une atrophie et une faiblesse musculaire (mais sur certain muscle uniquement et après mesure spécifique de la force). Elles n’ont pas d’autre signe clinique, et présentent un comportement locomoteur, un poids, une longévité et une fertilité comparables à ceux des souris non génétiquement altérées. Les manipulations nécessaires aux différentes procédures peuvent provoquer un léger stress chez l’animal. Les différentes injections dureront quelques minutes et sont susceptibles d’occasionner une douleur au moment de l’injection et, secondairement, un saignement et/ou hématome, une inflammation locale et rarement une infection. Les administrations répétées comportent un faible risque de péritonite. L’anesthésie gazeuse utilisée peut entraîner une perturbation de la thermorégulation et, dans de rares cas, une détresse cardio respiratoire. Les tests comportementaux de 5 minutes maximum pourront engendrer de la fatigue musculaire. Enfin, une chirurgie sans réveil sera effectuée sur certains animaux, l'anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de protocole selon la réglementation en vigueur pour études moléculaires et analyses histologiques des muscles injectés.

Remplacement

L’efficacité et l’absence de toxicité de notre approche thérapeutique ont été démontrées au préalable sur des cellules de patients en culture. La validité du modèle de souris de la maladie est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons préalablement démontré l’efficacité et l’innocuité de l’approche dans le muscle de souris du modèle en utilisant un vecteur de type virus thérapeutique. Le but de ce projet est l’optimisation de cette thérapie dans le modèle de souris en testant différent véhicule pour délivrer le médicament dans tout l’organisme. Il est indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude dans ce modèle. Seule l’administration du traitement dans le système sanguin permettra de vérifier son efficacité et sa potentielle toxicité à l’échelle d’un organisme entier.

Réduction

Le nombre maximal théorique de souris impliquées si toutes les procédures sont réalisées est de 1008. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et nos études précédentes afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. La réalisation des procédures et des étapes à l’intérieur des procédures seront réalisées de manière successive et adaptative, dans un ordre permettant de limiter le nombre d’animaux en fonction des résultats positifs ou négatifs. Les organes et tissus de souris issus de ce projet seront conservés en banque pour d’autres projets de l’équipe, évitant ainsi de nouveau prélèvements. Grâce à ces mesures de réduction, nous limitons au strict nécessaire le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant la validité statistique et scientifique de chaque protocole.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Un enrichissement de leur environnement est mis place avec au moins 2 éléments aux choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’entretien des animaux ainsi que les expériences seront réalisés par un personnel titulaire des autorisations et formations nécessaires. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse pour éviter toute douleur ou gêne, elles durent moins d’une minute par souris. Une analgésie sera pratiquée avant certaines injections pour éviter toute gêne. L’anesthésie gazeuse est réalisée en maintenant la thermorégulation en utilisant un tapis chauffant. Les jours suivants les injections une surveillance renforcée des souris sera exercée par l’animalier en charge de la lignée ou les personnes en charge des protocoles. Les mesures de forces sont non invasives et seront réalisés entre 1 et 13 fois maximum par souris afin de limiter un stress répété. Les mesures de forces en fin de projet seront réalisées sous anesthésie et analgésie et sans réveil. Les animaux ne développent habituellement pas de phénotype conduisant à une diminution de leur locomotion mais le cas échéant, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. La lignée fait l’objet d’une autorisation d’élevage pour phénotype dommageable. Dans toutes les procédures, des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur excessive (retrait ou vocalisation excessive à la manipulation, prostration ou agitation anormale) seront considérées comme points limites et critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduira à l’euthanasie des animaux concernés.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé est le plus adapté pour développer et tester notre traitement, car la molécule étudiée cible précisément la mutation génétique présente chez ces animaux. Il s’agit du plus petit modèle de mammifère reproduisant cette myopathie, reconnu par les experts du domaine et largement utilisé dans des études publiées et présentées lors de congrès internationaux. Nous avons déjà montré que le vecteur viral thérapeutique que nous utilisons est sûr et efficace dans le muscle de ces souris. Il est donc indispensable, à ce stade du développement préclinique, de poursuivre les tests dans ce modèle afin d’optimiser l’efficacité du traitement et de vérifier l’absence d’effets indésirables sur l’ensemble de l’organisme, après une injection dans le sang. Les souris de ce modèle développent progressivement des symptômes musculaires à partir d’un mois, qui s’aggravent jusqu’à environ huit mois. Cependant, leur déplacement, leur fertilité et leur durée de vie restent normaux. Nos travaux précédents ont montré qu’entre un et deux mois, un défaut apparaît dans le transport du vecteur thérapeutique à l’intérieur des cellules, et que ce défaut s’accentue avec la progression de la maladie. Les procédures seront réalisées sur des souris adultes âgées de 1 à 6,5 mois. Les souris âgées d’un mois serviront à évaluer la capacité de nos approches à améliorer la diffusion du traitement dans tout l’organisme, tandis que celles de trois mois, présentant des signes intermédiaires de la maladie, permettront de mesurer l’efficacité du traitement pour stopper ou inverser son évolution.